La protéine précurseur du peptide amyloïde (APP) est un élément central dans l'apparition et le développement de la maladie d'Alzheimer. L'APP possède deux voies de maturations distinctes. La maturation dite amyloïdogénique, via la béta-sécrétase, a principalement lieu au niveau des endosomes et entraine la production de peptides béta-amyloïdes neurotoxiques au-delà d'un certain seuil. La voie non-amyloïdogénique, via l'alpha-sécrétase, a quant à elle lieu au niveau de la membrane plasmique et entraîne la libération de fragments solubles sAPP alpha; neuroprotecteurs. Dans un premier temps, nos travaux ont mis en évidence que le récepteur de la sérotonine de type 4 (5-HT4R), l'alpha-sécrétase ADAM10 et l'APP forment un complexe protéique et que le récepteur 5-HT4 est capable de moduler à la fois l'adressage membranaire de l'alpha-sécrétase ADAM10 et de l'APP mais aussi leur maturation. Par cette modulation, le récepteur 5-HT4 peut favoriser de façon constitutive la libération de sAPP alpha. Dans un second temps, nous avons mis en place une approche protéomique, basée sur la recherche de protéines interagissant avec ce complexe et pouvant influencer le trafic cellulaire de l'ADAM10 ou de l'APP et favoriser la voie non-amyloïdogénique. Ces travaux nous permettent d'émettre des hypothèses originales quant aux mécanismes communs de régulation, à la fois de l'endocytose et du trafic du récepteur 5-HT4, de l'ADAM10 et de l'APP. Ces mécanismes mettent en cause le complexe AP-2 et un autre complexe protéique impliqué dans le trafic intracellulaire du précurseur de la protéine amyloïde. / The amyloid precursor protein (APP) is the key element in the appearance and the development of Alzheimer's disease (AD). Basically, APP can be processed following two maturation pathways. The fist one, named the amyloidogenic pathway, involves a secretase, occurs mostly in the endosomes and leads to the release ofbeta-amyloïd peptides that are neurotoxics if overproduced. The second one, named the non-amyloidogenic pathway, involves analpha-secretase, occurs mostly at the plasma membrane and leads to the release of soluble APP alpha fragments that are neuroprotective. First, our work demonstrated that a serotonin receptor, the 5-HT4 receptor (5-HT4R), is able to form a protein complex with the alpha-secretase ADAM10 and APP and that this receptor could modulate ADAM10 and APP trafficking and maturation. By this way, the 5-HT4 receptor is able to increase ADAM10 and APP cell surface localization and to constitutively promote sAPP alpha release. In a second time, using an unbiased proteomic approach, we focused on the quest of protein partners able to interact with this complex and to promote the non-amyloïdogenic pathway. This work allowed us to propose original hypothesis about shared mechanisms able to regulate 5-HT4R, APP and ADAM10 endocytosis and trafficking. These mechanisms involve the AP-2 complex and another protein complex involved in the cellular trafficking of the amyloid precursor protein.

No / The effect of the selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine was examined on the 5-HT4 receptor-mediated relaxation in the rat isolated ileum. Fluoxetine unsurmountably antagonized the relaxation to exogenous 5-HT with abolition of the response at 10 ¿M. Fluoxetine (10 ¿M) also caused a gradual loss of the resting tension. These effects of fluoxetine were prevented by a prior addition of the 5-HT4 receptor selective antagonist GR113808 (100 nM), which itself caused a contraction of the tissues when administered alone. Fluoxetine (10 ¿M) also failed to prevent the relaxation due to exogenous 5-HT and the 5-HT4 receptor agonist 5-methoxytryptamine in tissues taken from the rats treated with para-chlorophenylalanine (300 mg kg¿1) for 3 and 6 days, which reduced the 5-HT level in the mucosa by 88 and 97.5% respectively. The contraction of the tissues with GR113808 indicates the presence of an endogenous 5-HT tone at the 5-HT4 receptor in the rat ileum. It is hypothesized that in the presence of fluoxetine, the concentration of endogenous 5-HT at the receptor was increased sufficiently to reduce or abolish the relaxation to 5-HT added exogenously. The inability of fluoxetine to prevent the relaxation to 5-HT in the presence of GR113808 or after the p-CPA treatment supports this hypothesis. The effect of the selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine was examined on the 5-HT4 receptor-mediated relaxation in the rat isolated ileum. Fluoxetine unsurmountably antagonized the relaxation to exogenous 5-HT with abolition of the response at 10 ¿M. Fluoxetine (10 ¿M) also caused a gradual loss of the resting tension. These effects of fluoxetine were prevented by a prior addition of the 5-HT4 receptor selective antagonist GR113808 (100 nM), which itself caused a contraction of the tissues when administered alone. Fluoxetine (10 ¿M) also failed to prevent the relaxation due to exogenous 5-HT and the 5-HT4 receptor agonist 5-methoxytryptamine in tissues taken from the rats treated with para-chlorophenylalanine (300 mg kg¿1) for 3 and 6 days, which reduced the 5-HT level in the mucosa by 88 and 97.5% respectively. The contraction of the tissues with GR113808 indicates the presence of an endogenous 5-HT tone at the 5-HT4 receptor in the rat ileum. It is hypothesized that in the presence of fluoxetine, the concentration of endogenous 5-HT at the receptor was increased sufficiently to reduce or abolish the relaxation to 5-HT added exogenously. The inability of fluoxetine to prevent the relaxation to 5-HT in the presence of GR113808 or after the p-CPA treatment supports this hypothesis. The effect of the selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine was examined on the 5-HT4 receptor-mediated relaxation in the rat isolated ileum. Fluoxetine unsurmountably antagonized the relaxation to exogenous 5-HT with abolition of the response at 10 ¿M. Fluoxetine (10 ¿M) also caused a gradual loss of the resting tension. These effects of fluoxetine were prevented by a prior addition of the 5-HT4 receptor selective antagonist GR113808 (100 nM), which itself caused a contraction of the tissues when administered alone. Fluoxetine (10 ¿M) also failed to prevent the relaxation due to exogenous 5-HT and the 5-HT4 receptor agonist 5-methoxytryptamine in tissues taken from the rats treated with para-chlorophenylalanine (300 mg kg¿1) for 3 and 6 days, which reduced the 5-HT level in the mucosa by 88 and 97.5% respectively. The contraction of the tissues with GR113808 indicates the presence of an endogenous 5-HT tone at the 5-HT4 receptor in the rat ileum. It is hypothesized that in the presence of fluoxetine, the concentration of endogenous 5-HT at the receptor was increased sufficiently to reduce or abolish the relaxation to 5-HT added exogenously. The inability of fluoxetine to prevent the relaxation to 5-HT in the presence of GR113808 or after the p-CPA treatment supports this hypothesis.

En plus d'être clivée par les β- et les γ-sécrétases lors du processus amyloïdogénique de la maladie d'Alzheimer, l'APP (Amyloid Precursor Protein) peut également subir un clivage grâce à l'α-sécrétase qui conduit à la libération des fragments d'APP soluble α (sAPPα)(voie non-amyloïdogénique) prévenant ainsi l'accumulation des peptides β-amyloïdes pathogènes. Les études sur le clivage de l'APP par l'α-sécrétase ont montré que l'activité de cette enzyme était constitutive mais aussi régulée. Lors de mon travail de thèse, nous avons montré que l'expression du récepteur de la sérotonine de type 4 (R 5-HT4) favorise la coupure constitutive de l'APP par l'α sécrétase ADAM10 et la libération des fragments non-amyloïdogéniques, sAPPα, aussi bien dans les cellules HEK-293 que dans les neurones corticaux en culture primaire. Ce mécanisme est totalement indépendant de la production d'AMPc, mais reste dépendant d'une interaction entre le R 5-HT4, l'APP et la forme mature de l'ADAM10. Le R 5-HT4, contrairement à d'autres récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) décrits pour promouvoir la libération de sAPPα, est en effet capable d'interagir physiquement avec l'α-sécrétase ADAM10 et son substrat, l'APP. Cette interaction, directe ou indirecte, favorise l'adressage de l'ADAM10 et de l'APP à la membrane plasmique, là où la coupure en α est majoritaire. Toute rétention du R 5-HT4 à l'intérieur de la cellule retient également l'APP et l'ADAM10 sous sa forme inactive et annule la production de sAPPα. La régulation de l'α-sécrétase est toujours dépendante de l'activation du R 5-HT4 par un agoniste. Cet effet étant cette fois dépendant de la voie de signalisation de l'AMPc et de la protéine Epac comme cela avait déjà été démontré. Ces résultats décrivent pour la première fois un mécanisme par lequel un RCPG stimule le clivage constitutif de l'APP par l'α sécrétase et fournit de nouvelles perspectives pour la régulation de l'APP et le contrôle de l'adressage de l'α-sécrétase ADAM10. / In addition to the amyloidogenic pathway of Alzheimer's disease whereby Amyloid Precursor Protein (APP) is cleaved by β- et γ-secretases, the substrate can also be cleaved by α secretases, producing soluble APP alpha (sAPPα)(non-amyloidogenic pathway) and thus preventing the generation of pathogenic Amyloid-beta peptides. Despite, intensive research, the mechanisms regulating APP cleavage by α-secretases remain poorly understood. In this study, we tried to elucidate how 5-HT4Rs stimulate the release of sAPPα. We show that expression of serotonin type 4 receptors (5-HT4Rs) constitutively induces APP cleavage by the α-secretase ADAM10 and release of non-amyloidogenic fragments, sAPPα, in HEK-293 cells and cortical neurons. This effect is fully independent of cAMP production and relies on the transport of the 5-HT4R/APP/mature ADAM10 complex to the plasma membrane. Indeed, 5-HT4Rs but not other G protein-coupled receptors (GPCRs) known to activate sAPPα release, physically interact, directly or indirectly, with ADAM10 and APP to promote their targeting to the plasma membrane. Stimulation of 5 HT4Rs by an agonist further increases sAPPα fragments release and this effect is mediated through cAMP/Epac signalling. These findings describe a new mechanism whereby a GPCR stimulates the cleavage of APP by α-secretases and provide novel insights into the regulation of APP and α-secretase sorting.

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative touchant près d’un million de personnes en France et dont les perspectives actuelles laissent suggérer une forte augmentation dans les années à venir. Si les mécanismes biochimiques responsables des symptômes sont connus, aucun traitement curatif n’est aujourd’hui disponible. Parmi les cibles incrimées, le récepteur sérotoninergique 5-HT4 a fait l’objet de nombreuses études et de nombreux ligands ont été synthétisés dans l’optique de trouver un traitement efficace. Cependant, en raison de sa complexité et de sa sensibilité, une étude approfondie du cerveau en conditions fonctionnelles s’avère délicate. C’est pourquoi, l’utilisation des techniques d’imagerie médicale constitue une méthode non invasive et prometteuse pour améliorer les recherches sur ce récepteur en conditions physiologiques et physiopathologiques. Dans la continuité des travaux réalisés au laboratoire depuis plus d’une vingtaine d’années, une nouvelle génération de ligands iodés, a lipophilie réduite, basés sur un système diazaphénanthridine, a été synthétisée. Différentes fonctions hydrophiles ont été introduites et 25 nouveaux composés ont été obtenus et évalués biologiquement. Les meilleurs candidats ont été envoyés en radiomarquage et les images ont montré la capacité de ces ligands à déplacer le radiotraceur de référence in vitro sur coupe de cerveau humain.En parallèle de cette étude, suite aux difficultés rencontrées pour préparer les précurseurs de radiomarquage, une nouvelle technique de radioiodation par activation C-H a été investiguée. Après une mise au point sur les N-tosylbenzamides comme groupement directeur, cette réaction a été exemplifiée sur une quinzaine de groupements directeurs et appliquée à des molécules biologiquement actives plus complexes. / Alzheimer’s disease is a neurodegenerative disorder affecting almost 50 millions people in the world. Even if the biological mechanisms implied on this pathology are known, no treatments stop or reverse its progression. Serotoninergic receptor 5-HT4R is one of the incriminated target and many ligands have been synthesized in order to develop an efficient treatment but a functionnal study of the brain is impossible. That’s why, development of efficient radiotracers is essential for the in vivo evaluation of new drugs targeting 5-HT4R and also for investigation of the receptor involvement in a variety of neurodegenerative and neuropsychiatric disorders. Starting from previsous studies made in the laboratory, a new generation of ligands, focused on diazaphenanthridine scaffold and with reduced lipophilicity, have been designed. Various hydrophilic functions have been introduced and 25 new ligands have been synthesized and biological assays have been realised. Five of this compounds have been radiolabeled and the in vitro imaging experiments on human slice brain showed the ability of the new « hit » compound to move the radioligand of reference and to label the 5-HT4R.Due to the difficulties encountered to the synthesis of tin precursors for the radiolabeling, a new strategy of radioiodation has been developed based on palladium mediated C-H activation. Using first N-tosylbenzamide as directing group for the proof of concept, the scope of this methodology have been enhanced to about fifteen directing groups. Finally, the C-H radioiodation have been applied to more complex biological molecules.

La dépression majeure peut être très dommageable pour le 8% des Nord-Américains qui en souffriront au moins une fois durant leur vie. Les traitements actuels de la dépression ont été créés grâce à la compréhension de l'hypothèse de la monoamine; où les transporteurs de la sérotonine ou les enzymes sont bloqués ou inhibés afin de maintenir le neurotransmetteur (NT) dans la fente synaptique. Sur une période de plusieurs semaines, cette augmentation de NT encourage la plasticité synaptique, ce qui augmente la sensibilité de réponse de 5-HT dans la fente synaptique. Cette forme de traitement est efficace chez 40% des patients, tandis que les 60% restants ont une réponse partielle ou nulle. Dans les modèles de dépression chez la souris des changements dans les niveaux de phosphorylation de CREB sont corrélés aux effets antidépresseurs (AD). Dans le cas RS67333, des effets AD apparaissent après 2 à 3 jours de traitement. Les effets anti-anhédoniques sont démontrés par la réponse au traitement. RS67333 est un agoniste spécifique du récepteur 5-HT4, un récepteur couplé à la protéine G (GPCR) qui est généralement situé, après synapses, dans les régions du système limbique. Il existe d'autres ligands qui sont également spécifiques au récepteur 5-HT4: 5-HT, Zacopride, Prucalopride et ML10302, mais les mêmes effets anti-anhédoniques constatés lors de RS67333 n’ont pas été observés. Comment RS67333 est-il différent des autres en termes de signalisation? Nous avons utilisé le transfert d’énergie par résonnance de bioluminescence (BRET) pour étudier les interactions 5-HT4R avec les sous-unités, α β γ de la protéine G et nous avons comparé ces associations avec d'autres agonistes connus de 5-HT4. Nous avons constaté que RS67333 est un agoniste partiel et qu’il active un changement conformationnel de la protéine Gαs, mais n’active pas un changement conformationnel de la protéine Gαo. Prucaloride, 5-HT et Zacopride induisent aussi un changement de conformation du complexe Gαs, mais pas ML10302. Pour la formation de Gαo, Prucalopride, ML10302 et 5-HT agissent comme des agonistes, mais pas zacopride ni RS67333. Nous avons utilisé un test de dosage immuno-enzymatique sur support solide (ELISA) pour mesurer l’intériorisation induite par les ligands pour étudier la régulation des récepteurs. Nous avons constaté que RS67333 et ML10302 n’induisent pas l'internalisation du récepteur, tandis que zacopride, prucalopride et 5-HT sont très efficaces. L'efficacité sous-optimale des ADs actuels met l’accent sur la nécessité de développer des médicaments avec d'autres mécanismes d'action. RS67333 a des effets persistants anti-anhédoniques après une courte période de temps, et d'autres études de ses propriétés de signalisation pourraient donner lieu à une nouvelle génération d’antidépresseurs rapides de longue durée d’action. / Major Depression can be very damaging on the 8% of North Americans that will have it at least once within their lifetime. Current treatments of depression have been developed through the understanding of the monoamine hypothesis; whereby serotonin (5-HT) transporters or enzymes are blocked or inhibited in order to maintain the neurotransmitter in the synaptic cleft. Over a period of several weeks this increase in NT induces synaptic plasticity which increases the response sensitivity of 5-HT in the synaptic cleft. This form of treatment is effective on 40% of patients, while the remaining 60% have partial or no response. In mouse models of depression, changes in phosphorylation levels of CREB correlated to antidepressants (AD) effects. In the case of RS67333 AD effects appear within 2-3 days of treatment. The response can be evidenced as anti- anhedonic. RS67333 is specific agonist for 5-HT4 receptor, a G protein coupled receptor (GPCR) that is typically located post synaptically, in limbic regions. There are other ligands that are also specific to receptor 5-HT4: 5-HT, Zacopride, prucalopride and ML10302, but have not been observed to have the same anti-anhedonia effects of RS67333. How does RS67333 differ from the others in terms of signaling? We used bioluminescence resonance energy transfer (BRET) to study the interactions of 5-HT4R with the α β γ subunits of the G protein and we compared these associations with other known 5-HT4 agonists. We found that RS67333 was a partial agonist and activated a conformational change of the Gαs protein but did not activate a conformational change of Gαo protein. Prucaloride, 5-HT and Zacopride also induced a conformational change of the Gαs complex but not ML10302. For the formation of Gαo, Prucalorpide, ML10302 and 5-HT acted as agonists, but not Zacopride. We used an ELISA assay to measure ligand induced internalization to study receptor regulation. We found that RS67333 and ML10302 did not induce receptor internalization, while Zacopride, Prucalopride and 5-HT were very effective. The suboptimal efficacy of current ADs stresses the need to develop drugs with other mechanisms of action. RS67333 has persistent anti-anhedonia effects after a short period of time and further studies of its signalling properties may open up a new generation of fast and long acting antidepressants.

Pour comprendre comment le cerveau inhibe l'appétit en dépit d'un besoin énergétique, nous avons étudié les mécanismes neuronaux qui sous-tendent l'effet hypophagique induit par la 3,4-N-méthylén édioxyméthamphétamine (MDMA : « ecstasie ») et le stress (immobilisation forcée) car ces facteurs réduisent la faim d'un animal, même s'il est affamé. Nous montrons que la stimulation intracérébrale des récepteurs 5-HT4 de la sérotonine (R5-HT4), ou leur plus forte expression (ectopique, physiologique) dans une aire de la récompense (noyau accumbens : NAc), réduit la faim en augmentant l'action anorexigène d'un peptide de l'addiction : CART. A l'encontre de l'équilibre énergétique, l'effet anorexigène induit par la stimulation des R5-HT4 dans le NAc s'accompagne d'une hyperactivité motrice, souvent décrite chez l'humain souffrant d'anorexie mentale. En supposant qu'un effet récompensant prévaut sur le danger d'un déséquilibre énergétique, nous montrons, qu'effectivement, l'injection d'un antagoniste des R5-HT4 dans le NAc réduit les effets anorexigène, hyperlocomoteur et récompensant de la MDMA. S'il est alors récompensant de se priver d'aliments, une souris surexprimant les R5-HT4 dans le NAc, devrait, après une faible et transitoire restriction alimentaire, continuer à s'auto-priver d'aliments même si l'aliment est fourni ensuite ad libitum. La réponse est positive. En revanche, les R5-HT4 du NAc ne contribuent pas, à priori, à l'hypophagie due au stress. Puisque le système de la récompense est inclut dans celui de la prise de décision contrôlée par le cortex préfrontal médian (CPFm), nous avons supposé que l'effet hypophagique provoqué par le stress utilise les R5-HT4 corticaux. L'injection de traitements nucléiques (siRNA, virus), dans le CPFm de souris sauvages et privées des R5-HT4, montre que seule l'activation des R5-HT4 du CPFm est à l'origine de l'effet hypophagique du stress. Nos résultats suggèrent que [1] le stress active les R5-HT4 du CPFm et réduit la densité du transporteur de capture de la 5-HT, favorisant [2] l'augmentation du taux de la 5-HT extracellulaire dans le noyau d u raphé dorsal d'où, [3] un contrôle inhibiteur de l'activité des neurones 5-HT par le R5-HT1A permettant d'éviter que l'hypophagie ne se prolonge en conduite anorexigène. L'ensemble de nos résultats étayent la possibilité que le réseau neuronal de l'addiction et de la prise de décision de manger après stress inclut celui de la conduite anorexigène, avec jusqu'alors, une contribution évidente des R5-HT4. / To understand how the brain inhibits appetite despite an energy demand, we study the neuronal mechanisms, which underlie the hypophagic effect induced by the 3,4-N-methylenedioxymethamphetamine (MDMA: « Ecstasy ») and stress (forced immobilization) because these factors reduce appetite in animals, even starved. We show that stimulating serotonin 4 receptors (5-HTR4), or their overexpression (ectopic, physiological) in a brain reward area (nucleus accumbens: NAc), reduced hunger in increasing the appetite-suppressant effect of an addiction peptide: CART. Against the energy balance, the appetite-suppressant effect induced by stimulating 5-HTR4 in the NAc comes along with hyperactivity, often described in human suffering from anorexia nervosa. Supposing that a rewarding effect prevails over the danger of an energy imbalance, we show indeed that injecting 5-HTR4 antagonist in the NAc reduced the appetite-suppressant effect, the hyperactivity and the rewarding effect provoked by MDMA. If food deprivation is rewarding, mouse overexpressing 5-HTR4 in the NAc, after a low and transient diet period, should continue to self-imposed food refusal even in the presence of food ad libitum. The answer is positive. In contrast, 5-HTR4 in the NAc does not contribute, à priori, to stress-induced hypophagia. Because the reward system is included in the neuronal network of the decision-making, mainly controlled by the medial prefrontal cortex (mPFC), we postulated that hypophagia following stress uses cortical 5-HTR4. Injecting nucleic treatments (siRNA, virus), in the mPFC of wild-type or 5-HTR4 null mice, shows that only the stimulation of 5-HTR4 in the mPFC sparks off the hypophagic effect of stress. Our results suggest that [1] stress activates 5-HTR4 in the mPFC and reduces density of the 5-HT transporter, promoting [2] increase of the extracellular 5-HT level in the dorsal raphe nucleus and thus [3] an inhibitory control of t he activity of 5-HT neurons by 5-HTR1A allowing to avoid that the period of food restriction persists (anorexia-like behavior). Colectively, our findings support the the neuronal network of addiction and decision-making to eat after stress include the neuronal pathway related to anorexia, with so far, a clear contribution of 5-HTR4.

Les inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine (ISRS), agonistes indirects des récepteurs de la sérotonine (5-HT), ont un début d'effet antidépresseur retardé de plusieurs semaines. Des travaux antérieurs suggèrent que le récepteur 5-HT4 de la sérotonine serait une cible directe pour traiter la dépression et un nouvel espoir pour traiter plus rapidement ces pathologies anxio-dépressives. Toutefois, l'hypothèse « 5-HT4 » doit encore être validée dans des modèles animaux d'anxiété/dépression. Les questions posées étaient : la stimulation des récepteurs 5-HT4 centraux est-elle nécessaire aux effets comportementaux des ISRS ? la neurogenèse hippocampique adulte contribue-t-elle à ces effets ? En utilisant le modèle de stress chronique à la corticostérone (CORT) chez la souris, nous avons évalué les effets sur ces paramètres d’un traitement chronique avec un agoniste du récepteur 5-HT4 (RS67333, 1,5 mg/kg/jour pendant 4 semaines) comparé à un traitement à la fluoxétine (18 mg/kg/jour). Nous avons ensuite utilisé ce modèle murin combiné à l’ablation de la neurogenèse hippocampique par rayons-X afin d’examiner si la neurogenèse est nécessaire aux effets comportementaux d’un traitement subchronique (7 jours) ou chronique (28 jours) avec le RS67333. Nous avons également évalué le blocage des effets de la fluoxétine par un antagoniste du récepteur 5-HT4 (GR125487, 1 mg/kg/jour). Le traitement chronique avec RS67333, comme celui de la fluoxétine, induit une activité anxiolytique/antidépressive et stimule la neurogenèse hippocampique adulte. Cependant, contrairement à la fluoxétine , les effets anxiolytiques du RS67333 sont déjà présents après 7 jours de traitement, sans nécessité l’activation de la neurogenèse. Le traitement chronique avec le GR125487 empêche les deux effets anxiolytique/antidépresseur et neurogènique de la fluoxétine, indiquant que l'activation du récepteur 5-HT4 est nécessaire à ces effets de l’ISRS. Nous avons ensuite cherché à savoir si le court délai d’action antidépresseur du RS67333 peut être prédit par l'expression d'un biomarqueur périphérique. Des données de la littérature indiquent que la cascade de signalisation de β-arrestine 1 (impliquée dans la désensibilisation et l’internalisation du récepteur 5-HT4) serait un biomarqueur potentiel pré-clinique/clinique des états dépressifs et des effets d’un traitement antidépresseur. À cette fin, nous avons développé une nouvelle méthode d’évaluation des taux de protéines circulantes grâce à une analyse par immunoblot des leucocytes (PBMC) isolés à partir du sang total de souris. Les taux de β-arrestine 1 sont diminués dans les leucocytes des souris pré-traitées à la CORT. Il faut 7 jours de traitement avec le RS67333, mais 28 jours avec la fluoxétine chez ces animaux pour restaurer un taux de β-arrestine 1 comparable à celui des animaux contrôles. Ces résultats suggèrent que le taux sanguin de β-arrestine 1 est un biomarqueur de la rapidité de la réponse antidépressive. Enfin, l'activation du récepteur 5-HT4 dans le cerveau peut représenter une approche thérapeutique innovante d’apparition pour traiter plus rapidement des symptômes dépressifs associés à l’anxiété. / Selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) display a delayed onset of action of several weeks. Past work demonstrated evidence that the 5-HT4 receptor may be a direct target for treating depression and a new hope for fast acting antidepressant treatment. However, the 5-HT4 hypothesis still needs to be validated in models of anxiety/depression.We decided to investigate whether 5-HT4 receptor stimulation was necessary for the effects of SSRIs in a mouse model of anxiety/depression and whether hippocampal neurogenesis contributed to these effects. Using the mouse corticosterone model of anxiety/depression, we assessed whether chronic treatment with a 5-HT4 receptor agonist (RS67333, 1.5 mg/kg/day) had effects on anxiety and depression-related behaviors as well as on hippocampal neurogenesis in comparison to chronic fluoxetine treatment (18 mg/kg/day). Then, using our model combined with ablation of hippocampal neurogenesis, we investigated whether neurogenesis was necessary for the behavioral effects of subchronic (7-days) or chronic (28-days) RS67333 treatment. We also assessed whether a 5-HT4 receptor antagonist, (GR125487, 1 mg/kg/day) could prevent the behavioral and neurogenic effects of fluoxetine. Chronic treatment with RS67333, similar to fluoxetine, induced anxiolytic/antidepressant-like activity and stimulated adult hippocampal neurogenesis. However, unlike fluoxetine, the anxiolytic effects of RS67333 were already present after 7 days and did not require hippocampal neurogenesis. Chronic treatment with GR125487 prevented both anxiolytic/antidepressant-like and neurogenic effects of fluoxetine, indicating that 5-HT4 receptor activation is necessary for these effects of SSRIs. We then explored whether the fast onset of action of the 5-HT4 receptor agonist RS67333 could be predicted by expression of a peripheral biomarker. The β-arrestin-signaling cascade which is involved in 5-HT4 receptor desensitization and internalization, has recently gained attention as a potential pre-clinical/clinical bridging biomarker for depressive states and treatment effects. To this end, we developed a new method to assess levels of circulating proteins through immunoblot analyses of mouse PBMCs isolated from whole blood of anesthetized animals. While we did not detect any change in β-arrestin 1 in mouse leukocytes after 7 days of fluoxetine in corticosterone-treated animals, a short term treatment with RS67333, restored the level of this protein to control levels. In fluoxetine-treated animals, a restoration was only observed in the corticosterone model after a longer exposure. These results suggest that blood levels of β-arrestin 1 may be a useful biomarker to predict antidepressant/anxiolytic activities. Finally, the activation of 5-HT4 receptors in the brain may represent an innovative and rapid onset therapeutic approach to treat depression with comorbid anxiety.

L'anorexie mentale est une maladie mortelle liée à une privation volontaire d'aliments en dépit d'un besoin énergétique. La compréhension des causes biologiques des anomalies alimentaires requiert un niveau d'analyse simplifié. Ainsi l'utilisation de modèles animaux a permis d'identifier l'une des premières cibles thérapeutiques potentielles de l'anorexie : le récepteur 5-HT4 de la sérotonine (R5-HT4). La stimulation des R5-HT4 dans le noyau accumbens (NAc) active la voie de signalisation AMPc/PKA/CART et inhibe la faim, alors que l'inhibition de son activité constitutive par un agoniste inverse spécifique inhibe cette voie et provoque une hyperphagie. La transfection d'un R5-HT4 muté (R5-HT4ASSL), insensible à la sérotonine et dont l'activité constitutive est plus forte que celle du récepteur natif, dans le NAc chez la souris sauvage ou privée des R5-HT4, réduit la motivation à consommer des aliments, en activant la voie AMPc/PKA/CART de façon indépendante de la sérotonine. Ces résultats constituent un des rares cas connus d'implication de l'activité constitutive d'un récepteur couplé à une protéine G dans une fonction physiologique, la prise alimentaire. Dans ce contexte, nous décrivons un nouveau facteur de régulation du taux d'AMPc sous le contrôle des R5-HT4 dans le NAc : le complexe « A-kinase anchoring protein/Protein kinase A » (AKAP/PKA). La liaison de la PKA à l'AKAP inhibe l'augmentation du taux d'AMPc et d'ARNm codant le peptide CART, induite par la stimulation pharmacologique des R5-HT4, dans le NAc. Cet effet s'accompagne d'une diminution de la prise alimentaire. Ce rétrocontrôle négatif du complexe AKAP/PKA sur l'activité des R5-HT4 permet de diminuer le taux d'AMPc dans le NAc et de réguler la prise alimentaire. Ces résultats suggèrent qu'une trop forte activité constitutive des R5-HT4 induit une augmentation anormale d'AMPc dans le NAc qui peut conduire à des anomalies alimentaires comme l'anorexie mentale. Nous avons ainsi identifié un mécanisme moléculaire capable de réguler l'activité des R5-HT4 et qui pourrait servir de cible pour le traitement de l'anorexie. / Anorexia nervosa is a deadly mental disease related to a voluntary deprivation of food despite an energy requirement. Understanding of the biological causes of food anomalies requires a level of simplified analysis. And the use of animal models has previously allowed us to identify one of the first potential therapeutic targets of anorexia : serotonin 4 receptors (5-HT4Rs). Stimulation of 5-HT4Rs in the nucleus accumbens (Nac) activates the cAMP/PKA/CART signaling pathway and inhibits hunger, while the inhibition of its constitutive activity by a specific inverse agonist inhibits this pathway and causes hyperphagia. Transfection of a mutated 5-HT4R (5-HT4RASSL) insensitive to serotonin and whose constitutive activity is stronger that the native receptor, in the NAc in mice, reduces motivation for consuming food while activating the cAMP/PKA/CART pathway independently of serotonin. These results are one of the few known cases of involvement of the constitutive activity of G protein coupled receptor to a physiological function, the intake of food.In this context, we describe a new factor regulating cAMP levels under the control of 5-HT4Rs in the NAc: the A-kinase anchoring protein/Protein kinase A (AKAP/PKA) complex. The binding of PKA to AKAPs inhibits the increase in cAMP levels and mRNA encoding the peptide CART induced by pharmacological stimulation of 5-HT4Rs, in Nac. This effect is accompanied by a decrease in food intake The negative feedback of AKAP/PKA complex on the activity of 5-HT4Rs reduces the cAMP levels in the NAc and controls food intake.These results suggest that a too strong constitutive activity of 5-HT4Rs induces cAMP abnormal increase in the Nac and leads to eating abnormalities such as anorexia nervosa. We identified a molecular mechanism that regulates the activity of 5-HT4Rs and could serve as a target for the treatment of anorexia.

Chez les rongeurs, la mémoire procédurale est préservée alors que la mémoire « déclarative » est profondément altérée au cours du vieillissement normal ou pathologique.L’injection d’un agoniste partiel des récepteurs 5-HT4 (SL 65.0155. 0.01mg/kg) permet aux rongeurs de récupérer leurs facultés dans une tâche de discrimination olfactive, le labyrinthe olfactif par exemple.L’activation des récepteurs 5-HT4 par un agoniste pourrait être utilisée pour lutter contre les dysfonctionnements mnésiques rencontrés dans certaines pathologies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer. L’injection d’un agoniste partiel des récepteurs 5-HT4 (SL 65.0155. 0.01mg/kg) permet aux rongeurs de récupérer leurs facultés dans une tâche de discrimination olfactive, le labyrinthe olfactif par exemple.L’activation des récepteurs 5-HT4 par un agoniste pourrait être utilisée pour lutter contre les dysfonctionnements nésiques rencontrés dans certaines pathologies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer. / In normal aging or pathological brain diseases in rodents procedural memory is spared while reference memory is deeply impaired.Injection of a partial selective 5-HT4 agonist (SL65.0155. 0.01mg/kg) enabled complete recovery of association learning performance in an olfactory associative discrimination task, the olfactory tubing maze for exemple.Activation of 5-HT4 receptors by a selective agonist could be useful for the symptomatic treatment of memory dysfunctions related to pathological aging such as Alzheimer’disease.

La conduite alimentaire n'obéit pas nécessairement au besoin physiologique de consommer des aliments (la faim) ou à la satiété suggérant qu'un système nerveux volontaire de la restriction (anorexie) et de la consommation excessive d'aliments (boulimie, « binge-type eating ») inhibe le système nerveux autonome. Ces deux anomalies affectent plus fréquemment, et souvent à la fois, la femme que l'homme. Si l'utilisation de modèles animaux permet l'étude d'une part des bases neuronales en cause, ceux possiblement responsables de l'alternance « anorexie / boulimie » restent encore à identifier. Dans ce contexte, nous avons ainsi centré nos analyses sur l'étude de l'implication de récepteurs cérébraux couplés aux protéines G ; les récepteurs 4 de la sérotonine (R5-HT4) car leur stimulation dans le noyau accumbens (NAc), une structure du système de la récompense, inhibe la faim y compris après la mise à jeun de souris, par l'action AMPc/PKA dépendante d'un peptide de l'addiction ; « cocaine- and amphetamine-regulated transcript » (CART). Nous montrons que le maintien d'une plus forte expression (ectopique ou physiologique) des R5-HT4 dans le NAc a réduit plus durablement la faim que sa seule stimulation et augmente l'activité locomotrice. En incluant dans notre raisonnement l'activité constitutive des R5-HT4 (e.g. accumulation de la forme active R*), nous montrons que l'injection d'un agoniste inverse (inhibition de l'activité constitutive : accumulation de la forme inactive, R) spécifique des R5-HT4 dans le NAc entraîne une baisse du taux d'AMPc et de CART tout en augmentant celui des ARNm codant le NPY d'autant plus que l'hyperphagie est élevée. Les effets induits par l'injection de l'agoniste inverse ne sont pas observés lorsqu'il est adjoint à un antagoniste des R5-HT4. Ces résultats suggèrent une implication physiologique de l'activité constitutive des R5-HT4 dans la régulation de la conduite alimentaire; son inhibition (agoniste inverse) dans le NAc augmente la prise et reprise alimentaire après un jeûne. L'ensemble de ces résultats rend probable que la plus forte activité des R5-HT4, à la base d'une association « anorexie /hyperactivité locomotrice », souvent décrite comme paradoxale au plan énergétique dans le syndrome de l'anorexie mentale, représente plutôt un mécanisme de compensation globale d'une valeur énergétique à perdre en conséquence d'une trop forte consommation d'aliments. Puisque la densité des R5-HT4 peut varier selon un taux variable de 5-HT après stress, lequel aggrave les anomalies alimentaires, nous avons étudié plus avant l'implication des R5-HT4 dans l'effet anorexigène du stress (immobilisation forcée) chez des souris femelles privées de leur gène : l'hypophagie induite par le stress n'a pas été observée chez les souris privées des R5-HT4 qui présentent une possible hyperactivité de l'axe hypothalamo-hypophysaire corticosurrénalien vraisemblablement compensée par un plus fort rétrocontrôle négatif. Il est donc probable que les R5-HT4 contribuent à réduire les conséquences du stress et que la modification de l'équilibre de leur activité contribue à une part de la symptomatologie de patients atteints d'anorexie / boulimie. / Feeding behavior does not necessarily obey to the physiological need to eat (hunger) or to satiety, suggesting that voluntary nervous system of the restriction (anorexia) and overeating (bulimia, binge-type eating) inhibits the autonomic nervous system. These two anomalies affecting more frequently, and often both, the woman than man. If animal models are used to study a part of neural bases involved, those possibly responsible for the oscillation of"anorexia / bulimia" remain to be identified. In this context, we thus focused our analysis on the study of the involvement of brain receptors coupled to G proteins ; serotonin 4 receptors (5-HTR4) because their stimulation in the nucleus accumbens (NAc), a brain reward area, inhibits hunger even after a food deprivation, by the action ofcAMP / PKA, dependent of an addiction peptide, "cocaine-and amphetamine-regulated transcript" (CART). Weshow that maintaining a higher expression (ectopic or physiological) of 5-HTR4 in the NAc, reduced hunger more longer than the acute stimulation and increased locomotor activity. Including in our reasoning the constitutive activity of 5-HTR4 (e.i. accumulation of the active form R*), we show that injecting a specific inverse agonist of the5-HTR4 (inhibition of constitutive activity: accumulation of inactive form, R ) in the NAc induced a decrease incAMP and CART levels, while increasing NPY mRNA level, especially when binge is high. The effects induced by the injection of the inverse agonist are not observed when a 5-HTR4 antagonist was coadministrated. These results suggest a physiological involvement of the constitutive activity of 5-HTR4 in the regulation of feeding behavior ; its inhibition (inverse agonist) in the NAc increases the food intake in fed or food-deprived mice. All of these results makes it likely that the highest activity of 5-HTR4, at the base of the association "anorexia /locomotor hyperactivity", often described as paradoxical in terms of energy, in the syndrome of anorexia nervosa,represent rather a global compensation mechanism of energy to be lost as a result of an excessive consumption of food. Since the density of the 5-HTR4 may vary depending on a variable rate of 5-HT following stress, which aggravates the feeding disorders, we further investigated the involvement of 5-HTR4 in the appetite-suppressant effect of stress (forced immobilization) in female mice deprived of their gene: stress-induced hypophagia was not observed in mice deprived of 5-HTR4 who present a possible hyperactivity of the hypothalamic-pituitary adrenocortical axis likely offset by a stronger negative feedback. It is therefore likely that the 5-HTR4 contribute to reduce the effects of stress and that the modification of the balance of their activities contribute to a part of the symptoms of patients with anorexia / bulimia.