No / The effect of the selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine was examined on the 5-HT4 receptor-mediated relaxation in the rat isolated ileum. Fluoxetine unsurmountably antagonized the relaxation to exogenous 5-HT with abolition of the response at 10 ¿M. Fluoxetine (10 ¿M) also caused a gradual loss of the resting tension. These effects of fluoxetine were prevented by a prior addition of the 5-HT4 receptor selective antagonist GR113808 (100 nM), which itself caused a contraction of the tissues when administered alone. Fluoxetine (10 ¿M) also failed to prevent the relaxation due to exogenous 5-HT and the 5-HT4 receptor agonist 5-methoxytryptamine in tissues taken from the rats treated with para-chlorophenylalanine (300 mg kg¿1) for 3 and 6 days, which reduced the 5-HT level in the mucosa by 88 and 97.5% respectively. The contraction of the tissues with GR113808 indicates the presence of an endogenous 5-HT tone at the 5-HT4 receptor in the rat ileum. It is hypothesized that in the presence of fluoxetine, the concentration of endogenous 5-HT at the receptor was increased sufficiently to reduce or abolish the relaxation to 5-HT added exogenously. The inability of fluoxetine to prevent the relaxation to 5-HT in the presence of GR113808 or after the p-CPA treatment supports this hypothesis. The effect of the selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine was examined on the 5-HT4 receptor-mediated relaxation in the rat isolated ileum. Fluoxetine unsurmountably antagonized the relaxation to exogenous 5-HT with abolition of the response at 10 ¿M. Fluoxetine (10 ¿M) also caused a gradual loss of the resting tension. These effects of fluoxetine were prevented by a prior addition of the 5-HT4 receptor selective antagonist GR113808 (100 nM), which itself caused a contraction of the tissues when administered alone. Fluoxetine (10 ¿M) also failed to prevent the relaxation due to exogenous 5-HT and the 5-HT4 receptor agonist 5-methoxytryptamine in tissues taken from the rats treated with para-chlorophenylalanine (300 mg kg¿1) for 3 and 6 days, which reduced the 5-HT level in the mucosa by 88 and 97.5% respectively. The contraction of the tissues with GR113808 indicates the presence of an endogenous 5-HT tone at the 5-HT4 receptor in the rat ileum. It is hypothesized that in the presence of fluoxetine, the concentration of endogenous 5-HT at the receptor was increased sufficiently to reduce or abolish the relaxation to 5-HT added exogenously. The inability of fluoxetine to prevent the relaxation to 5-HT in the presence of GR113808 or after the p-CPA treatment supports this hypothesis. The effect of the selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine was examined on the 5-HT4 receptor-mediated relaxation in the rat isolated ileum. Fluoxetine unsurmountably antagonized the relaxation to exogenous 5-HT with abolition of the response at 10 ¿M. Fluoxetine (10 ¿M) also caused a gradual loss of the resting tension. These effects of fluoxetine were prevented by a prior addition of the 5-HT4 receptor selective antagonist GR113808 (100 nM), which itself caused a contraction of the tissues when administered alone. Fluoxetine (10 ¿M) also failed to prevent the relaxation due to exogenous 5-HT and the 5-HT4 receptor agonist 5-methoxytryptamine in tissues taken from the rats treated with para-chlorophenylalanine (300 mg kg¿1) for 3 and 6 days, which reduced the 5-HT level in the mucosa by 88 and 97.5% respectively. The contraction of the tissues with GR113808 indicates the presence of an endogenous 5-HT tone at the 5-HT4 receptor in the rat ileum. It is hypothesized that in the presence of fluoxetine, the concentration of endogenous 5-HT at the receptor was increased sufficiently to reduce or abolish the relaxation to 5-HT added exogenously. The inability of fluoxetine to prevent the relaxation to 5-HT in the presence of GR113808 or after the p-CPA treatment supports this hypothesis.

Background: The 5-hydroxytrptamine receptor 4 (5-HT4 receptor) is heavily expressed on colonic epithelial cells and has been targeted as a therapeutic for functional bowel symptoms and pain; however, adverse cardiac events related to 5-HT4 agonist treatment limited their therapeutic use. Previous studies in the Mawe laboratory have demonstrated that intraluminal application of a 5-HT4 agonist exerts protective epithelial actions in animal models of colitis, and accelerates recovery from colitis. The aim of this study was to test the effects of a luminally restricted 5-HT4 agonist in a mouse model of experimental colitis. Methods: The luminally restricted 5-HT4 agonist (Takeda Pharmaceuticals; 10 mg/kg) was administered to mice during active dextran sodium sulfate (DSS) induced colitis. Colitis activity was evaluated using disease activity index, a fecal lipocalin-2 assay, and histological damage scoring. Epithelial proliferation and colonic motility were also measured as readouts of the potential protective actions and colonic function, respectively. Results: Oral gavage and intracolonic delivery of this luminally restricted 5-HT4 agonist had no detectable effect on recovery from colitis or colonic motility as compared to vehicle. Additionally, in positive control experiments, we failed to see an effect of the 5-HT4 agonist, tegaserod, on colitis severity or colonic motility in any of the measures tested. Conclusions: In conclusion, it is unclear if the luminally restricted 5-HT4 agonist has any effect on recovery from DSS colitis. Given inconsistencies with the model and lack of an effect of tegaserod, additional studies will be required, possibly involving different doses and time points, to fully assess the actions of this luminally restricted compound in colitis recovery.

La protéine précurseur du peptide amyloïde (APP) est un élément central dans l'apparition et le développement de la maladie d'Alzheimer. L'APP possède deux voies de maturations distinctes. La maturation dite amyloïdogénique, via la béta-sécrétase, a principalement lieu au niveau des endosomes et entraine la production de peptides béta-amyloïdes neurotoxiques au-delà d'un certain seuil. La voie non-amyloïdogénique, via l'alpha-sécrétase, a quant à elle lieu au niveau de la membrane plasmique et entraîne la libération de fragments solubles sAPP alpha; neuroprotecteurs. Dans un premier temps, nos travaux ont mis en évidence que le récepteur de la sérotonine de type 4 (5-HT4R), l'alpha-sécrétase ADAM10 et l'APP forment un complexe protéique et que le récepteur 5-HT4 est capable de moduler à la fois l'adressage membranaire de l'alpha-sécrétase ADAM10 et de l'APP mais aussi leur maturation. Par cette modulation, le récepteur 5-HT4 peut favoriser de façon constitutive la libération de sAPP alpha. Dans un second temps, nous avons mis en place une approche protéomique, basée sur la recherche de protéines interagissant avec ce complexe et pouvant influencer le trafic cellulaire de l'ADAM10 ou de l'APP et favoriser la voie non-amyloïdogénique. Ces travaux nous permettent d'émettre des hypothèses originales quant aux mécanismes communs de régulation, à la fois de l'endocytose et du trafic du récepteur 5-HT4, de l'ADAM10 et de l'APP. Ces mécanismes mettent en cause le complexe AP-2 et un autre complexe protéique impliqué dans le trafic intracellulaire du précurseur de la protéine amyloïde. / The amyloid precursor protein (APP) is the key element in the appearance and the development of Alzheimer's disease (AD). Basically, APP can be processed following two maturation pathways. The fist one, named the amyloidogenic pathway, involves a secretase, occurs mostly in the endosomes and leads to the release ofbeta-amyloïd peptides that are neurotoxics if overproduced. The second one, named the non-amyloidogenic pathway, involves analpha-secretase, occurs mostly at the plasma membrane and leads to the release of soluble APP alpha fragments that are neuroprotective. First, our work demonstrated that a serotonin receptor, the 5-HT4 receptor (5-HT4R), is able to form a protein complex with the alpha-secretase ADAM10 and APP and that this receptor could modulate ADAM10 and APP trafficking and maturation. By this way, the 5-HT4 receptor is able to increase ADAM10 and APP cell surface localization and to constitutively promote sAPP alpha release. In a second time, using an unbiased proteomic approach, we focused on the quest of protein partners able to interact with this complex and to promote the non-amyloïdogenic pathway. This work allowed us to propose original hypothesis about shared mechanisms able to regulate 5-HT4R, APP and ADAM10 endocytosis and trafficking. These mechanisms involve the AP-2 complex and another protein complex involved in the cellular trafficking of the amyloid precursor protein.

En plus d'être clivée par les β- et les γ-sécrétases lors du processus amyloïdogénique de la maladie d'Alzheimer, l'APP (Amyloid Precursor Protein) peut également subir un clivage grâce à l'α-sécrétase qui conduit à la libération des fragments d'APP soluble α (sAPPα)(voie non-amyloïdogénique) prévenant ainsi l'accumulation des peptides β-amyloïdes pathogènes. Les études sur le clivage de l'APP par l'α-sécrétase ont montré que l'activité de cette enzyme était constitutive mais aussi régulée. Lors de mon travail de thèse, nous avons montré que l'expression du récepteur de la sérotonine de type 4 (R 5-HT4) favorise la coupure constitutive de l'APP par l'α sécrétase ADAM10 et la libération des fragments non-amyloïdogéniques, sAPPα, aussi bien dans les cellules HEK-293 que dans les neurones corticaux en culture primaire. Ce mécanisme est totalement indépendant de la production d'AMPc, mais reste dépendant d'une interaction entre le R 5-HT4, l'APP et la forme mature de l'ADAM10. Le R 5-HT4, contrairement à d'autres récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) décrits pour promouvoir la libération de sAPPα, est en effet capable d'interagir physiquement avec l'α-sécrétase ADAM10 et son substrat, l'APP. Cette interaction, directe ou indirecte, favorise l'adressage de l'ADAM10 et de l'APP à la membrane plasmique, là où la coupure en α est majoritaire. Toute rétention du R 5-HT4 à l'intérieur de la cellule retient également l'APP et l'ADAM10 sous sa forme inactive et annule la production de sAPPα. La régulation de l'α-sécrétase est toujours dépendante de l'activation du R 5-HT4 par un agoniste. Cet effet étant cette fois dépendant de la voie de signalisation de l'AMPc et de la protéine Epac comme cela avait déjà été démontré. Ces résultats décrivent pour la première fois un mécanisme par lequel un RCPG stimule le clivage constitutif de l'APP par l'α sécrétase et fournit de nouvelles perspectives pour la régulation de l'APP et le contrôle de l'adressage de l'α-sécrétase ADAM10. / In addition to the amyloidogenic pathway of Alzheimer's disease whereby Amyloid Precursor Protein (APP) is cleaved by β- et γ-secretases, the substrate can also be cleaved by α secretases, producing soluble APP alpha (sAPPα)(non-amyloidogenic pathway) and thus preventing the generation of pathogenic Amyloid-beta peptides. Despite, intensive research, the mechanisms regulating APP cleavage by α-secretases remain poorly understood. In this study, we tried to elucidate how 5-HT4Rs stimulate the release of sAPPα. We show that expression of serotonin type 4 receptors (5-HT4Rs) constitutively induces APP cleavage by the α-secretase ADAM10 and release of non-amyloidogenic fragments, sAPPα, in HEK-293 cells and cortical neurons. This effect is fully independent of cAMP production and relies on the transport of the 5-HT4R/APP/mature ADAM10 complex to the plasma membrane. Indeed, 5-HT4Rs but not other G protein-coupled receptors (GPCRs) known to activate sAPPα release, physically interact, directly or indirectly, with ADAM10 and APP to promote their targeting to the plasma membrane. Stimulation of 5 HT4Rs by an agonist further increases sAPPα fragments release and this effect is mediated through cAMP/Epac signalling. These findings describe a new mechanism whereby a GPCR stimulates the cleavage of APP by α-secretases and provide novel insights into the regulation of APP and α-secretase sorting.

Les inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine (ISRS), agonistes indirects des récepteurs de la sérotonine (5-HT), ont un début d'effet antidépresseur retardé de plusieurs semaines. Des travaux antérieurs suggèrent que le récepteur 5-HT4 de la sérotonine serait une cible directe pour traiter la dépression et un nouvel espoir pour traiter plus rapidement ces pathologies anxio-dépressives. Toutefois, l'hypothèse « 5-HT4 » doit encore être validée dans des modèles animaux d'anxiété/dépression. Les questions posées étaient : la stimulation des récepteurs 5-HT4 centraux est-elle nécessaire aux effets comportementaux des ISRS ? la neurogenèse hippocampique adulte contribue-t-elle à ces effets ? En utilisant le modèle de stress chronique à la corticostérone (CORT) chez la souris, nous avons évalué les effets sur ces paramètres d’un traitement chronique avec un agoniste du récepteur 5-HT4 (RS67333, 1,5 mg/kg/jour pendant 4 semaines) comparé à un traitement à la fluoxétine (18 mg/kg/jour). Nous avons ensuite utilisé ce modèle murin combiné à l’ablation de la neurogenèse hippocampique par rayons-X afin d’examiner si la neurogenèse est nécessaire aux effets comportementaux d’un traitement subchronique (7 jours) ou chronique (28 jours) avec le RS67333. Nous avons également évalué le blocage des effets de la fluoxétine par un antagoniste du récepteur 5-HT4 (GR125487, 1 mg/kg/jour). Le traitement chronique avec RS67333, comme celui de la fluoxétine, induit une activité anxiolytique/antidépressive et stimule la neurogenèse hippocampique adulte. Cependant, contrairement à la fluoxétine , les effets anxiolytiques du RS67333 sont déjà présents après 7 jours de traitement, sans nécessité l’activation de la neurogenèse. Le traitement chronique avec le GR125487 empêche les deux effets anxiolytique/antidépresseur et neurogènique de la fluoxétine, indiquant que l'activation du récepteur 5-HT4 est nécessaire à ces effets de l’ISRS. Nous avons ensuite cherché à savoir si le court délai d’action antidépresseur du RS67333 peut être prédit par l'expression d'un biomarqueur périphérique. Des données de la littérature indiquent que la cascade de signalisation de β-arrestine 1 (impliquée dans la désensibilisation et l’internalisation du récepteur 5-HT4) serait un biomarqueur potentiel pré-clinique/clinique des états dépressifs et des effets d’un traitement antidépresseur. À cette fin, nous avons développé une nouvelle méthode d’évaluation des taux de protéines circulantes grâce à une analyse par immunoblot des leucocytes (PBMC) isolés à partir du sang total de souris. Les taux de β-arrestine 1 sont diminués dans les leucocytes des souris pré-traitées à la CORT. Il faut 7 jours de traitement avec le RS67333, mais 28 jours avec la fluoxétine chez ces animaux pour restaurer un taux de β-arrestine 1 comparable à celui des animaux contrôles. Ces résultats suggèrent que le taux sanguin de β-arrestine 1 est un biomarqueur de la rapidité de la réponse antidépressive. Enfin, l'activation du récepteur 5-HT4 dans le cerveau peut représenter une approche thérapeutique innovante d’apparition pour traiter plus rapidement des symptômes dépressifs associés à l’anxiété. / Selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) display a delayed onset of action of several weeks. Past work demonstrated evidence that the 5-HT4 receptor may be a direct target for treating depression and a new hope for fast acting antidepressant treatment. However, the 5-HT4 hypothesis still needs to be validated in models of anxiety/depression.We decided to investigate whether 5-HT4 receptor stimulation was necessary for the effects of SSRIs in a mouse model of anxiety/depression and whether hippocampal neurogenesis contributed to these effects. Using the mouse corticosterone model of anxiety/depression, we assessed whether chronic treatment with a 5-HT4 receptor agonist (RS67333, 1.5 mg/kg/day) had effects on anxiety and depression-related behaviors as well as on hippocampal neurogenesis in comparison to chronic fluoxetine treatment (18 mg/kg/day). Then, using our model combined with ablation of hippocampal neurogenesis, we investigated whether neurogenesis was necessary for the behavioral effects of subchronic (7-days) or chronic (28-days) RS67333 treatment. We also assessed whether a 5-HT4 receptor antagonist, (GR125487, 1 mg/kg/day) could prevent the behavioral and neurogenic effects of fluoxetine. Chronic treatment with RS67333, similar to fluoxetine, induced anxiolytic/antidepressant-like activity and stimulated adult hippocampal neurogenesis. However, unlike fluoxetine, the anxiolytic effects of RS67333 were already present after 7 days and did not require hippocampal neurogenesis. Chronic treatment with GR125487 prevented both anxiolytic/antidepressant-like and neurogenic effects of fluoxetine, indicating that 5-HT4 receptor activation is necessary for these effects of SSRIs. We then explored whether the fast onset of action of the 5-HT4 receptor agonist RS67333 could be predicted by expression of a peripheral biomarker. The β-arrestin-signaling cascade which is involved in 5-HT4 receptor desensitization and internalization, has recently gained attention as a potential pre-clinical/clinical bridging biomarker for depressive states and treatment effects. To this end, we developed a new method to assess levels of circulating proteins through immunoblot analyses of mouse PBMCs isolated from whole blood of anesthetized animals. While we did not detect any change in β-arrestin 1 in mouse leukocytes after 7 days of fluoxetine in corticosterone-treated animals, a short term treatment with RS67333, restored the level of this protein to control levels. In fluoxetine-treated animals, a restoration was only observed in the corticosterone model after a longer exposure. These results suggest that blood levels of β-arrestin 1 may be a useful biomarker to predict antidepressant/anxiolytic activities. Finally, the activation of 5-HT4 receptors in the brain may represent an innovative and rapid onset therapeutic approach to treat depression with comorbid anxiety.

Résumé : les benzodiazépines (BZD) et les antidépresseurs sont efficaces pour réduire l’anxiété, mais devant les effets indésirables que les BZD induisent et face au délai d’action des antidépresseurs, le développement de nouvelles stratégies constitue un besoin primordial. Récemment, il a été montré que l’activation du récepteur 5-HT4 (5-HT4R) pouvait représenter une cible d’action prometteuse. Bien qu’un certain nombre d’études ait évalué l’activité anxiolytique des agonistes du 5-HT4R, après une administration chronique, aucune étude n’a examiné leurs effets après une administration unique, ni même le circuit cérébral à la base de cette réponse comportementale. Nous avons donc cherché à savoir si l’activation aiguë du 5-HT4R via le recrutement des terminaisons neuronales glutamatergiques du cortex préfrontal médian (CPFm) se projetant sur le noyau du raphé dorsal (NRD), un circuit impliqué dans les processus émotionnels, induisait des effets anxiolytiques rapides, grâce à des outils pharmacologiques, électrophysiologiques et optogénétiques. L’administration unique par voie systémique ou intra-CPFm d’un agoniste du 5-HT4R a produit des effets anxiolytiques rapides chez la souris, associés à une augmentation de l’activité des neurones sérotoninergiques du NRD. L’activation des projections glutamatergiques du CPFm vers le NRD a permis de réduire l’anxiété des souris, alors que l’inhibition de ces projections a bloqué les effets anxiolytiques induits par l’injection unique intra-CPFm d’une BZD (diazépam) ou d’un agoniste du 5-HT4R (RS 67333). Toutefois, ces effets ne sont que partiellement bloqués après l’administration par voie systémique de ces composés, suggérant que le circuit cortex-raphé est un carrefour nécessaire mais non suffisant à l’activité anxiolytique du diazépam et du RS 67333. Enfin, l’administration prophylactique d’un agoniste du 5-HT4R avant l’induction d’un stress a prévenu le développement d’un phénotype anxio-dépressif chez la souris, laissant penser que cette molécule pourrait renforcer la résilience au stress des populations à risque. / Benzodiazepines (BZD) and antidepressants are effective in reducing anxiety, but adverse effects of BZD and the delayed onset of action of antidepressants emphasize the need to develop fast-acting new drugs. Recent studies indicated that activation of 5-HT4 receptor (5-HT4R) could be a promising target. Although a number of studies have assessed 5-HT4R agonist anxiolytic activity after chronic treatment, few of them have neither evaluated their anxiolytic profile acutely, neither the brain circuits involved in this behavioral activity. Here, we evaluated whether acute 5-HT4R activation in glutamatergic axon terminals arising from the medial prefrontal cortex (mPFC) to the dorsal raphe nucleus (DRN), a circuit involved in emotional processes, induced fast anxiolytic effects, using pharmacologic, electrophysiologic and optogenetic tools. Acute systemic administration and intra-mPFC infusion of 5-HT4R produced fast anxiolytic effects in mice and increased DRN serotonin cell firing. Optogenetically activating mPFC terminals targeting the DRN reduced anxiety in mice whereas silencing this circuit blocked BZD (diazepam) and 5-HT4R agonist (RS 67333) mPFC infusion -induced anxiolytic effects. However, anxiolytic effects induced by an acute systemic administration of both molecules were partially blocked after optogenetically inhibiting cortical glutamatergic terminals in the DRN, suggesting that cortex-brainstem neural circuit is necessary but not sufficient for a rapid activity of diazepam and RS 67333. Finally, the prophylactic administration of a 5-HT4R agonist before stress prevented the development of an anxio-depressive phenotype in mice, suggesting that this molecule could reinforce the resilience of population at risk.

La dépression majeure peut être très dommageable pour le 8% des Nord-Américains qui en souffriront au moins une fois durant leur vie. Les traitements actuels de la dépression ont été créés grâce à la compréhension de l'hypothèse de la monoamine; où les transporteurs de la sérotonine ou les enzymes sont bloqués ou inhibés afin de maintenir le neurotransmetteur (NT) dans la fente synaptique. Sur une période de plusieurs semaines, cette augmentation de NT encourage la plasticité synaptique, ce qui augmente la sensibilité de réponse de 5-HT dans la fente synaptique. Cette forme de traitement est efficace chez 40% des patients, tandis que les 60% restants ont une réponse partielle ou nulle. Dans les modèles de dépression chez la souris des changements dans les niveaux de phosphorylation de CREB sont corrélés aux effets antidépresseurs (AD). Dans le cas RS67333, des effets AD apparaissent après 2 à 3 jours de traitement. Les effets anti-anhédoniques sont démontrés par la réponse au traitement. RS67333 est un agoniste spécifique du récepteur 5-HT4, un récepteur couplé à la protéine G (GPCR) qui est généralement situé, après synapses, dans les régions du système limbique. Il existe d'autres ligands qui sont également spécifiques au récepteur 5-HT4: 5-HT, Zacopride, Prucalopride et ML10302, mais les mêmes effets anti-anhédoniques constatés lors de RS67333 n’ont pas été observés. Comment RS67333 est-il différent des autres en termes de signalisation? Nous avons utilisé le transfert d’énergie par résonnance de bioluminescence (BRET) pour étudier les interactions 5-HT4R avec les sous-unités, α β γ de la protéine G et nous avons comparé ces associations avec d'autres agonistes connus de 5-HT4. Nous avons constaté que RS67333 est un agoniste partiel et qu’il active un changement conformationnel de la protéine Gαs, mais n’active pas un changement conformationnel de la protéine Gαo. Prucaloride, 5-HT et Zacopride induisent aussi un changement de conformation du complexe Gαs, mais pas ML10302. Pour la formation de Gαo, Prucalopride, ML10302 et 5-HT agissent comme des agonistes, mais pas zacopride ni RS67333. Nous avons utilisé un test de dosage immuno-enzymatique sur support solide (ELISA) pour mesurer l’intériorisation induite par les ligands pour étudier la régulation des récepteurs. Nous avons constaté que RS67333 et ML10302 n’induisent pas l'internalisation du récepteur, tandis que zacopride, prucalopride et 5-HT sont très efficaces. L'efficacité sous-optimale des ADs actuels met l’accent sur la nécessité de développer des médicaments avec d'autres mécanismes d'action. RS67333 a des effets persistants anti-anhédoniques après une courte période de temps, et d'autres études de ses propriétés de signalisation pourraient donner lieu à une nouvelle génération d’antidépresseurs rapides de longue durée d’action. / Major Depression can be very damaging on the 8% of North Americans that will have it at least once within their lifetime. Current treatments of depression have been developed through the understanding of the monoamine hypothesis; whereby serotonin (5-HT) transporters or enzymes are blocked or inhibited in order to maintain the neurotransmitter in the synaptic cleft. Over a period of several weeks this increase in NT induces synaptic plasticity which increases the response sensitivity of 5-HT in the synaptic cleft. This form of treatment is effective on 40% of patients, while the remaining 60% have partial or no response. In mouse models of depression, changes in phosphorylation levels of CREB correlated to antidepressants (AD) effects. In the case of RS67333 AD effects appear within 2-3 days of treatment. The response can be evidenced as anti- anhedonic. RS67333 is specific agonist for 5-HT4 receptor, a G protein coupled receptor (GPCR) that is typically located post synaptically, in limbic regions. There are other ligands that are also specific to receptor 5-HT4: 5-HT, Zacopride, prucalopride and ML10302, but have not been observed to have the same anti-anhedonia effects of RS67333. How does RS67333 differ from the others in terms of signaling? We used bioluminescence resonance energy transfer (BRET) to study the interactions of 5-HT4R with the α β γ subunits of the G protein and we compared these associations with other known 5-HT4 agonists. We found that RS67333 was a partial agonist and activated a conformational change of the Gαs protein but did not activate a conformational change of Gαo protein. Prucaloride, 5-HT and Zacopride also induced a conformational change of the Gαs complex but not ML10302. For the formation of Gαo, Prucalorpide, ML10302 and 5-HT acted as agonists, but not Zacopride. We used an ELISA assay to measure ligand induced internalization to study receptor regulation. We found that RS67333 and ML10302 did not induce receptor internalization, while Zacopride, Prucalopride and 5-HT were very effective. The suboptimal efficacy of current ADs stresses the need to develop drugs with other mechanisms of action. RS67333 has persistent anti-anhedonia effects after a short period of time and further studies of its signalling properties may open up a new generation of fast and long acting antidepressants.