Le récepteur 5-HT6 de la sérotonine, un des derniers récepteurs de la sérotonine à avoir été découvert, est une des cibles les plus prometteuses pour traiter les déficits cognitifs de la schizophrénie et de la maladie d’Alzheimer. Les antagonistes 5-HT6 exercent des effets pro-cognitifs dans de nombreux paradigmes expérimentaux de cognition chez les rongeurs et plusieurs d’entre eux sont en développement clinique (phase III) dans la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer. Exclusivement exprimé dans le système nerveux central, le récepteur 5-HT6 est présent dès les phases précoces du développement neural et est impliqué dans différents processus neuro-développementaux. Plusieurs études ont ainsi démontré que le récepteur jouait un rôle clé dans la migration des neurones (interneurones et neurones pyramidaux) du cortex cérébral (Riccio et al. Mol Psychiatry 14(3):280-90, 2009 ; Transl Psychiatry 11;1:e47, 2011 ; Jacobshagen et al. Development in revision). Grâce à un crible interactomique, notre équipe a récemment identifié un réseau de protéines recrutées par le domaine carboxy-terminal du récepteur, comprenant la cyclin-dependent kinase (Cdk)5 et certains de ses substrats et connues pour leur implication dans la migration neuronale, la pousse neuritique et la synaptogénèse. Nous avons également démontré que le récepteur stimulait la pousse neuritique de façon agoniste-indépendante par un mécanisme impliquant la phosphorylation du récepteur par Cdk5 et l’activation de la Rho GTPase Cdc42 (Duhr et al. Nature Chem. Biol., en révision). Cette étude a mis pour la première fois en évidence une activation constitutive d’un récepteur couplé aux protéines G dépendant de sa phosphorylation par une kinase associée. Des études préliminaires réalisées par l’équipe indiquent également que l’activation du récepteur 5-HT6 induit une diminution du nombre d’épines dendritiques et une modification de leur morphologie dans des cultures primaires de neurones d’hippocampe. Le projet de thèse aura pour objectif la caractérisation des mécanismes moléculaires impliqués dans cet effet. Une attention particulière sera portée sur le rôle de Cdk5 et de son substrat WAVE1, une protéine induisant la formation des épines dendritiques grâce à sa capacité à activer le complexe Arp2/3 (également identifié dans l’interactome du récepteur 5-HT6) et à promouvoir la polymérisation de l’actine. La phosphorylation de WAVE1 par Cdk5 inhibant son activité et la formation des épines, ce mécanisme pourrait être à l’origine de la diminution du nombre d’épines induite par le récepteur 5-HT6. Ces études seront réalisées in vitro, sur des cultures primaires de neurones d’hippocampe et in vivo, en utilisant un modèle (en cours de génération) de souris knock-in exprimant le récepteur 5-HT6 fusionné à une étiquette GFP. Grâce à ce modèle, un crible interactomique sera également réalisé afin d’identifier de nouveaux partenaires du récepteur potentiellement impliqués dans la différentiation neuronale dans un contexte tissulaire authentique. Ce projet sera réalisé à l’Institut de Génomique Fonctionnelle (IGF) au sein de l’équipe « Neuroprotéomique et signalisation des maladies neurologiques et psychiatriques » sous la co-direction de Philippe Marin et Séverine Chaumont-Dubel. Il permettra de caractériser de nouveaux substrats cellulaires potentiellement impliqués dans les déficits cognitifs de la schizophrénie de plus en plus considérée comme une pathologie du développement et d’identifier de nouvelles cibles pour le traitement précoce de ces déficits particulièrement invalidants et insuffisamment pris en en charge par l’arsenal antipsychotique existant. / The serotonin 5-HT6 receptor, one of the most recently cloned serotonin receptors, is a promising target for the treatment of cognitive deficits of both schizophrenia and Alzheimer’s disease. 5-HT6 receptor blockade by antagonists exerts pro-cognitive effects in a wide range of models of cognitive impairment in rodents and some of them are in phase III of clinical trials in schizophrenia and Alzheimer’s disease. The 5-HT6 receptor is exclusively expressed in the central nervous system, where it is detected at early phases of brain development. Studies have shown that 5-HT6 receptors have a key influence upon migration of both pyramidal neurons and interneurons of the cerebral cortex (Riccio et al. Mol Psychiatry 14(3):280-90, 2009 ; Transl Psychiatry 11;1:e47, 2011; Jacobshagen et al. Development, in revision). Using a proteomic strategy, our team recently identified a network of proteins interacting with the carboxy-terminal domain of the receptor. These include Cyclin-dependent kinase (Cdk)5 and some of its substrates, which are known to control neuro-developmental processes such as neuronal migration, neurite growth and dendritic spine morphogenesis. We have also demonstrated that the expression of the 5-HT6 receptor elicits neurite growth in an agonist-independent manner through a mechanism involving receptor phosphorylation at a serine residue by associated Cdk5 and engagement of the Rho GTPase Cdc42 (Duhr et al. Nature Chem. Biol., in revision). These studies show for the first time a constitutive activation of a G protein-coupled receptor mediated by its phosphorylation by an associated protein kinase. Preliminary experiments performed by the team also revealed that 5-HT6 receptors activation decreases the number of dendritic spines and modify spine morphology in hippocampal neurons in primary culture. This thesis project aims at characterizing the signalling mechanisms underlying the control of dendritic spine morphogenesis by the 5-HT6 receptors. Particular attention will be paid to Cdk5 and its substrate WAVE1, a protein known to induce neurite growth via the activation of the Arp2/3 complex (also identified in the 5-HT6 receptor interactome), which promotes actin polymerization. As phosphorylation of WAVE1 by Cdk5 inhibits its activity, we hypothesize that Cdk5-elicited phosphorylation of WAVE1 in the receptor-associated complex might underlies its control of spine morphogenesis. This project will combine in vitro studies performed on primary cultured hippocampal neurons and in vivo studies using transgenic mice expressing GFP tagged 5-HT6 receptors (this mouse line is currently being generated). We will also take advantage of this model to perform a novel interactomics screen to identify in an authentic tissue context novel receptor partners potentially involved in dendritic spine formation. This project should reveal novel cellular targets for the alleviation of the currently untreated and strongly debilitating cognitive deficits of schizophrenia, which are thought to result from abnormalities of brain development. It will be realized at the Institute of Functional Genomics in the “Neuroproteomics and signaling of neurodegenerative and psychiatric disorders” team under the supervision of Philippe Marin and Séverine Chaumont-Dubel.

A depressão na adolescência pode ser ocasionada devido à presença de estresses sociais, como o bullying, mas não se sabe por que apenas alguns indivíduos apresentam a depressão. Mudanças na neurotransmissão serotoninérgica relacionam-se a distúrbios comportamentais, sendo que alterações na expressão do receptor 5-HT6 poderiam desempenhar funções na cognição, memória e alterações do humor. O objetivo deste trabalho foi verificar a participação de alterações na expressão cerebral do receptor 5-HT6 na resiliência e suscetibilidade aos efeitos negativos do estresse psicossocial em camundongos machos e adolescentes. Nossos dados comportamentais demonstraram anedonia e esquiva social em apenas uma parcela dos animais subjugados socialmente (~50-60%). A expressão proteica do receptor 5-HT6 não diferiu em nenhuma das áreas cerebrais analisadas. A expressão gênica apresentou redução em ambos os subgrupos, no estriado e apenas nos suscetíveis, no hipotálamo. A localização cerebral do receptor 5-HT6 ocorreu no núcleo paraventricular do hipotálamo e no tubérculo olfatório. / Depression in adolescence may be caused due to social stresses, like bullying, but the reasons in which just a part of these individuals are affected by depression are unknown. Changes in serotoninergic neurotransmission are related with several behavioral disorders, and changes in the 5-HT6 receptor could have an important role on cognition, memory and mood disorders. The aim of this work was verify the participation of brain expression changes of 5-HT6 serotoninergic receptor in the resilience and susceptibility under the negative effects of the psychosocial stress in adolescent male mice. Our behavioral data showed anhedonia and social avoidance in one part of the subjugated animals (~50-60%). The protein expression of the 5-HT6 receptor did not differ in any brain areas that was studied. The gene expression showed a decrease in both subgroups, in the striatum, and a decrease only in the susceptible subgroup, in the hypothalamus. The brain localization of 5-HT6 receptor was in the hypothalamus paraventricular nucleus and in the olfactory bulb.

Le développement de radiotraceurs (18F) des récepteurs de la sérotonine 5-HT6 et 5-HT7 pour l'imagerie TEP (tomographie par émission de positons) permettrait d'étudier la fonction et l'implication de ces récepteurs dans des maladies neurodégénératives telles que la schizophrénie ou la maladie d'Alzheimer. A partir des structures et pharmacophores déjà décrits dans la littérature, nous nous sommes orientés vers des dérivés pyrrolidiniques pour les récepteurs 5-HT7 et quinolines pour les récepteurs 5-HT6. 7 radioligands des récepteurs 5-HT7 marqués au fluor 18 ont pu être étudiés par autoradiographie et imagerie μTEP sur le rat et ont montrés des fixations intéressantes, mais avec une sélectivité moyenne du récepteur. 16 ligands du récepteur 5-HT6 ont été synthétisés et 4 d'entre eux ont été radiomarqués afin d'identifier le 2FNQ1P comme radioligand sélectif vis-à-vis du récepteur 5-HT2A (principal récepteur en compétition). Les premières images TEP réalisées sur le chat ont montrées un marquage sélectif dans les zones cérébrales riches en 5-HT6. La poursuite des études biologiques menées en collaboration avec le CERMEP – Imagerie du vivant permettront d'approfondir les caractéristiques de ces nouveaux radioligands synthétisés / Development of fluorine 18 labeled radiotracer of 5-HT6 and 5-HT7 receptors for PET imaging (positron emission tomography) allows the study of those receptors in various neurodegenerative diseases such as schizophrenia and Alzheimer disease. Description of structures and pharmacophores in literature led to pyrrolidine derivatives for 5-HT7 receptors and quinolones for 5-HT6. After their synthesis, 7 radioligands of 5-HT7 receptors have been studied by autoradiography and μPET. These radioligands have shown interesting binding on rat, with more or less selectivity for the receptor. 14 ligands of 5-HT6 receptors have been synthesized and 4 have been radiolabeled to select 2FNQ1P as a selective radioligand toward 5-HT2A. First PET images on cat have shown a selective binding in 5- HT6 rich area in brain. Pursue of biological studies, in collaboration with CERMEP – Imagerie du vivant will give more information on those new radioligands

La sérotonine est impliquée dans de nombreuses fonctions physiologiques comme la régulation de l’appétit, du sommeil, de la douleur, de l’humeur et de la cognition. Elle agit par l’intermédiaire de différents récepteurs dont la plupart sont couplés aux protéines G. Parmi ceux-ci, les récepteurs 5-HT2A et 5-HT6 suscitent un intérêt particulier car ils sont la cible de nombreux agents thérapeutiques, comme les antidépresseurs et les antipsychotiques de dernière génération. Ces molécules administrées pour traiter la schizophrénie ont des effets bénéfiques sur les symptômes positifs (hallucinations, délires) et négatifs (manque de motivation). Cependant, ils n’ont que peu d’effets sur les déficits cognitifs (troubles de la mémoire de travail, de l’attention, asociabilité) qui compromettent l'intégration sociale et professionnelle des patients ainsi que leur qualité de vie. Ces déficits sont en grande partie retrouvés chez les consommateurs chroniques de cannabis durant l’adolescence suggérant des mécanismes pathologiques communs. La découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter ces déficits cognitifs constitue donc un enjeu de santé publique majeur.Au cours de mon travail de thèse, j’ai étudié le rôle des récepteurs de la sérotonine, en me focalisant sur les récepteurs 5-HT2A et 5-HT6, dans la modulation de la transmission et la plasticité synaptique au niveau du cortex préfrontal. En combinant des approches biochimiques à des analyses électrophysiologiques et comportementales, j’ai dans un premier temps démontré l'implication des récepteurs 5-HT2A exprimés au niveau des synapses thalamocorticales dans l’induction de la plasticité synaptique et dans la mémoire associative. Dans un deuxième temps, j’ai déterminé les bénéfices du blocage précoce des récepteurs 5-HT6 sur les déficits cognitifs induits dans un modèle neurodéveloppemental de schizophrénie et un modèle de consommation chronique de cannabis durant l’adolescence. Cette étude permet ainsi d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir l’apparition des déficits cognitifs observés dans les maladies psychiatriques, notamment chez les sujets à risque. / Serotonin is involved in many physiological functions, such as the control of appetite, sleep, pain, mood and cognition. This major neuromodulator acts via different receptors, which are, for the most part, coupled to G-proteins. Among these, 5-HT2A and 5-HT6 receptors are of particular interest since they are the target of many therapeutic drugs, such as antidepressants and last-generation antipsychotics. These are administered to treat schizophrenia and have beneficial effects on positive (hallucinations, delusions) and negative (lack of motivation) symptoms. Nevertheless, they poorly control cognitive deficits (impaired working memory, decreased attention, alteration in social cognition) which severely compromise the social integration of patients and their quality of life. These deficits are also found in chronic cannabis users during adolescence, suggesting common pathological mechanisms. Therefore, the discovery of new therapeutic strategies to treat these cognitive deficits is a major public health issue.During my thesis work, I studied the role of serotonin receptors, focusing on 5-HT2A and 5-HT6 receptors, in the modulation of synaptic transmission and plasticity in the prefrontal cortex. By combining biochemical approaches with electrophysiological and behavioral analyses, I initially demonstrated that 5-HT2A receptors expressed at thalamocortical synapses play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and in associative memory. Secondly, I demonstrated the benefits of early blockade of 5-HT6 receptors for preventing cognitive deficits induced in a neurodevelopmental model of schizophrenia and a model of chronic cannabis abuse during adolescence. These studies offer new therapeutic strategies to prevent the emergence of cognitive deficits and conversion to schizophrenia in at-risk subjects.

L'imagerie TEP des récepteurs 5-HT1A a montré des modifications de la fixation hippocampique du radioligand antagoniste [18F]MPPF chez des patients souffrant de maladie d'Alzheimer (MA). Si les antagonistes se fixent indistinctement sur les récepteurs fonctionnels et non fonctionnels, les agonistes 5-HT1A, comme le ligand TEP [18F]F15599, ciblent les récepteurs fonctionnels (couplés aux protéines G). Notre objectif est de montrer que le ratio entre les récepteurs 5-HT1A couplés et non couplés varie avec l'évolution de la MA. Ainsi, l'analyse post-mortem d'hippocampes de patients à différents stades de la MA a montré une diminution significative du marquage au [18F]F15599 dès les stades précoces de la MA. Puis nous avons précisé le profil pharmacologique de trois agonistes 5-HT1A : le 8-OH-DPAT, le F13714 et le F15599. L'imagerie IRM fonctionnelle lors de stimuli pharmacologiques (IRMph) permet l'exploration de réseaux neuronaux activés par une molécule. Nous avons comparé chez le rat les cartes d'activation des trois agonistes 5-HT1A et d'un antagoniste, le MPPF. Chaque molécule présente un schéma d'activation spécifique, ouvrant le champ à un ciblage distinct, tant pour la thérapeutique que pour l'imagerie. Enfin, nous avons travaillé à la mise au point d'un radioligand TEP des récepteurs 5-HT6, également impliqués dans la MA. En collaboration avec une équipe de chimistes, nous avons évalué in vitro et in vivo trois radioligands 5-HT6 potentiels. Nous montrons que le radioligand [18F]2FNQ1P est le premier à montrer un ciblage spécifique des récepteurs 5-HT6 in vivo / PET imaging using 5-HT1A radiotracers shows a modified expression of this serotonin receptor in the hippocampus of Alzheimer’s disease (AD) patients. However, these antagonists PET radioligands bind indiscriminately to the functional and the non-functional states of 5-HT1A receptors. The comparison of a PET agonist, binding selectively to the functional receptors, with a PET antagonist would therefore provide original information on 5-HT1A receptor impairment during AD. We found that [18F]F15599 in vitro binding decreased in dentate gyrus of AD patients. In contrast, binding of [18F]MPPF was unchanged. These results support the concept of functional PET imaging using agonist radiotracers in clinical studies. Then, we compared with functional MRI (PhMRI) the pharmacological profile of three 5-HT1A agonists (8-OH-DPAT, F13714 and F15599) and one antagonist (MPPF). PhMRI revealed that each molecule has its specific activation pattern, opening new ways in pharmacology or imaging. Finally, we developed in collaboration with chemists several 5-HT6 radioligand-candidates and evaluated their characteristics for PET imaging. Three radiotracers were evaluated in vitro and in vivo in rodent and feline models. We concluded that [18F]2FNQ1P is the first radioligand with suitable characteristics for PET imaging of 5-HT6 receptors, justifying further evaluations

The development of novel selective 5-HT6 and 5-HT7 receptor antagonists is an ever-growing area of interest among medicinal chemists. The potential of developing a therapeutic agent useful as an antipsychotic or antidepressant, as well as the possibility to develop a drug for Alzheimer’s disease and obesity has led to an increase in synthesis of possible lead compounds. The synthesis of unfused biheteroaryl derivatives is described within. The derivatives have been evaluated for binding affinity at 5-HT2A, 5-HT6 and 5-HT7 receptors. The most potent 5-HT6 receptor antagonists include a benzene ring, a hydrophobic group and a protonated nitrogen atom. The most potent and selective compound synthesized is 1-[3-butyl-5-(thienyl)phenyl]-4-methylpiperazine. The binding site of the 5-HT7 receptor is similar to that of the 5-HT6 receptor and the most selective and potent 5-HT7 receptor antagonist also contains a potonated nitrogen atom and a hydrophobic group. The difference in selectivity between the 5-HT6 and 5-HT7 receptor antagonists is the aromatic ring. The most potent 5-HT7 receptor antagonist synthesized contains a pyridine ring instead of benzene, as in the 5-HT6 receptor antagonist. The most potent and selective 5-HT7 receptor antagonist is 1-[4-(3-furyl)-6-methylpyridin-2-yl]-4-methylpiperazine. The need to increase selectivity for both 5-HT6 and 5-HT7 receptors has led to the synthesis of flexible-chain linked derivatives and the results are described within.

The development of novel selective 5-HT6 and 5-HT7 receptor antagonists is an ever-growing area of interest among medicinal chemists. The potential of developing a therapeutic agent useful as an antipsychotic or antidepressant, as well as the possibility to develop a drug for Alzheimer’s disease and obesity has led to an increase in synthesis of possible lead compounds. The synthesis of unfused biheteroaryl derivatives is described within. The derivatives have been evaluated for binding affinity at 5-HT2A, 5-HT6 and 5-HT7 receptors. The most potent 5-HT6 receptor antagonists include a benzene ring, a hydrophobic group and a protonated nitrogen atom. The most potent and selective compound synthesized is 1-[3-butyl-5-(thienyl)phenyl]-4-methylpiperazine. The binding site of the 5-HT7 receptor is similar to that of the 5-HT6 receptor and the most selective and potent 5-HT7 receptor antagonist also contains a potonated nitrogen atom and a hydrophobic group. The difference in selectivity between the 5-HT6 and 5-HT7 receptor antagonists is the aromatic ring. The most potent 5-HT7 receptor antagonist synthesized contains a pyridine ring instead of benzene, as in the 5-HT6 receptor antagonist. The most potent and selective 5-HT7 receptor antagonist is 1-[4-(3-furyl)-6-methylpyridin-2-yl]-4-methylpiperazine. The need to increase selectivity for both 5-HT6 and 5-HT7 receptors has led to the synthesis of flexible-chain linked derivatives and the results are described within.

Les difficultés actuelles du diagnostic précoce de la Maladie d'Alzheimer (MA) rendent l'exploration cérébrale par imagerie moléculaire particulièrement pertinente et performante. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont développé les méthodologies de l'imagerie TEP (tomographie par émissions de positons) dans cette optique.<br />Une première partie, méthodologique, a consisté à automatiser et à optimiser la radiosynthèse du [11C]PIB, un radiotraceur pouvant détecter l'accumulation des peptides amyloïdes dans le cerveau de patients atteints de la MA. <br />Dans une seconde partie, nous nous sommes intéressés à l'imagerie TEP de la neurotransmission sérotoninergique. Les antagonistes des récepteurs 5-HT6 ont démontré des propriétés procognitives et des études post-mortem ont montrées leur modification dans la MA. Cependant, aucun centre ne dispose encore d'un radiotraceur spécifique. Nous rapportons l'évaluation biologique d'un radiotraceur antagoniste des 5-HT6, le [18F]12ST05. D'autre part, une étude récente en imagerie TEP au [18F]MPPF, un antagoniste des récepteurs 5-HT1A, a révélé une diminution de sa fixation chez des patients Alzheimer alors qu'une augmentation pouvait être constatée chez des patients MCI. Nous sommes parvenus à reproduire une surexpression transitoire des 5-HT1A dans un modèle animal de la MA et nous proposons différents mécanismes compensatoires à l'origine de cette augmentation. Ces résultats apportent des hypothèses sur la nature des phénomènes compensatoires précoces stimulés et pourraient avoir des conséquences sur les thérapeutiques ciblant les 5-HT1A.

Una de las principales cuestiones en farmacología molecular de los GPCR es entender los mecanismos estructurales de las siete hélices transmembrana (TM) que se producen para estabilizar ya sea Rg o los diferentes estados R*. Para entender el mecanismo que cambia el equilibrio del conjunto a un estado activo R* se construyeron tres de los receptores de la serotonina (5-HT4, 5-HT6, y 5 HT7) sobre la base de su información más reciente de cristalografía de rayos X. Dando lugar a dos modelos de cada receptor: una inactiva y otra activa. Los modelos, mejorados y evaluados con la ayuda de datos farmacológicos y químicos se utilizaron principalmente para comprender la interacción entre un ligando y su receptor y su mecanismo de acción. Estos hallazgos estructurales pueden a su vez resultar útiles para el diseño de nuevos fármacos más eficaces y selectivos. / One of the main questions in G protein coupled receptors (GPCRs) molecular pharmacology is to understand the structural arrangements of the seven transmembrane (TM) helices that occur to stabilize either the ground state (Rg) or different active states (R*) of the receptors. In order to understand the mechanism that shift the equilibrium of the ensemble to an active R* state models of the inactive and the active state of three serotonin receptors (5-HT4, 5-HT6, and 5-HT7) were built based on the latest information from X-ray crystallography. The resulting models were mainly used to understand the interaction between a ligand and its receptor and the mechanism of action. With the help of pharmacological and chemical data these models and complexes were improved and evaluated. These findings may prove valuable for structural based drug discovery efforts and facilitate the design of more effective and selective pharmaceuticals.