Les xarxes complexes serveixen als ec olegs per a estudiar les interaccions de pollinitzaci o a nivell comunitari. Actualment, es necessari construir xarxes que siguin representacions m es realistes del proc es de pol.linitzaci o per tal d'incrementar la seva utilitat pr actica. Per aix o, aquesta tesi es centra en incorporar a les xarxes la variaci o interindividual i informaci o sobre la magnitud i el signe (positiu, neutre o negatiu) dels efectes de les interaccions sobre la reproducci o de les plantes. Les esp ecies consten de poblacions d'individus amb fenotips, genotips i comportaments diferents, que per tant poden diferir en les interaccions. Aquesta variaci o intraespec ca es rellevant per molts processos ecol ogics i evolutius, per o no s'ha tengut en compte en la majoria d'estudis de xarxes planta-pol.linitzador. En els cap tols 1 i 2 s'estudien les c arregues pol.l niques d'exemplars d'insectes pol.linitzadors en dues comunitats de muntanya a Mallorca i es construeixen xarxes on els nodes dels pol.linitzadors representen individus en lloc d'esp ecies. Aquesta aproximaci o permet considerar la variaci o interindividual i aporta una nova perspectiva sobre l'estructura de les xarxes i els mecanismes que determinen les interaccions. Les xarxes de transport de pol.len a nivell d'individu tenen una densitat d'interaccions, connect ancia, grau d'anidament i diversitat d'interaccions m es baixa que les mateixes xarxes a nivell d'esp ecies, i per contra una modularitat major. Es troben aquestes difer encies perqu e les esp ecies de pol.linitzadors generalistes estan formades per individus especialistes i heterogenis en l' us de recursos. El grau d'especialitzaci o individual est a associat a la intensitat de compet encia inter- i intraespec ca. Per a que les xarxes planta-pol.linitzador representin millor les implicacions funcionals, han d'incloure mesures dels efectes de les interaccions sobre les esp ecies o de la magnitud real en qu e les esp ecies depenen d'aquestes interaccions. La freq u encia d'interacci o es considera una estimaci o v alida de la magnitud de l'efecte del pol.linitzador sobre l' exit reproductiu de la planta, per o no aporta cap informaci o del seu signe. Per exemple, en plantes amb mecanismes de producci o de llavors que no depenen d'insectes (e.g. autog amia, anemog amia), les interaccions poden tenir efectes neutres sobre la reproducci o. En el cap tol 3, per diferents plantes de dues comunitats d'estudi (costa i muntanya) es quanti ca el seu grau de depend encia dels pol.linitzadors, comparant experimentalment la producci o de llavors amb i sense insectes. L'objectiu es determinar si les esp ecies que s on m es depenents dels pol.linitzadors s on tamb e les que estan m es connectades en les xarxes de visites orals, es a dir si tenen major centralitat, nombre i diversitat d'interaccions. Nom es en una de les dues comunitats estudiades es troba aquesta relaci o, fet que suggereix que pot dependre del contexte comunitari. D'altra banda, hi ha interaccions que poden causar m es efectes negatius que positius sobre l' exit reproductiu de les plantes. Aix o pot passar quan els pol.linitzadors depositen pol.len conespec c en els estigmes, per o alhora tamb e pol.len heterospec c. La transfer encia interespec ca de pol.len es relativament comuna, perqu e sovint les esp ecies de oraci o simult ania comparteixen pol.linitzadors, i pot tenir efectes perjudicials per les plantes (e.g. p erdua de pol.len, obstrucci o dels estigmes). En el cap tol 4, s'estudien les transfer encies de pol.len interespec ques en tres comunitats andines al llarg d'un gradient altitudinal. Es construeixen xarxes dirigides representant la transfer encia de pol.len des de les esp ecies donants a les receptores i a cada interacci o de la xarxa s'hi associa un signe per representar l'efecte. Aquest signe s'obt e de la relaci o entre el pol.len conespec c i heteroespec c depositat sobre els estigmes. En totes les comunitats estudiades, les interaccions positives i neutres s on predominants, particularment en la comunitat de major altitud. Aquesta troballa suggereix que la facilitaci o entre plantes d'una comunitat pot augmentar quan les condicions pel servei de pol.linitzaci o es tornen menys favorables. / Las redes complejas sirven a los ec ologos para estudiar las interacciones de polinizaci on a nivel comunitario. Actualmente, para incrementar su utilidad pr actica, es necesario construir redes que sean representaciones lo m as realistas posibles del proceso de polinizaci on. Por este motivo, esta tesis se centra en incorporar a las redes la variaci on interindividual y informaci on sobre la magnitud y el signo (positivo, neutro o negativo) de los efectos de las interacciones sobre la reproducci on de las plantas. Las especies constan de poblaciones de individuos con fenotipos, genotipos y comportamientos distintos, que por tanto pueden diferir en sus interacciones. Esta variaci on intraespec ca es relevante para muchos procesos ecol ogicos y evolutivos, pero no se ha considerado en la mayor a de estudios de redes plantapolinizador. En los cap tulos 1 y 2 se estudian las cargas pol nicas de ejemplares de insectos polinizadores en dos comunidades de monta~na en Mallorca y se construyen redes donde los nodos de los polinizadores representan individuos en lugar de especies. Esto permite incorporar la variaci on interindividual y aportar una nueva perspectiva sobre la estructura de las redes y los mecanismos que determinan las interacciones. Las redes de transporte de polen a nivel de individuo tienen una densidad de interacciones, conectancia, anidamiento y diversidad de interacciones m as baja que las mismas redes a nivel de especies, pero una modularidad mayor. Estas diferencias ocurren porque las especies de polinizadores generalistas est an formadas por individuos especialistas y heterog eneos en la utilizaci on de recursos. El grado de especializaci on individual est a asociado a la intensidad de competencia inter- e intraespec ca. Para que las redes planta-polinizador sean m as representativas de las implicaciones funcionales deben incluir medidas de los efectos de las interacciones sobre las especies o de la magnitud real en que las especies dependen de estas interacciones. La frecuencia de interacci on se considera una estimaci on v alida del efecto del polinizador sobre el exito reproductivo de la planta, aunque no aporta informaci on sobre su signo. Por ejemplo, en plantas con mecanismos de producci on de semillas independientes de los insectos (e.g. autogamia, anemogamia), las interacciones pueden tener efectos neutros sobre la reproducci on. En el cap tulo 3, para diferentes plantas de dos comunidades de estudio (costa y monta~na) se cuanti ca el grado de dependencia de polinizadores comparando experimentalmente la producci on de semillas con y sin insectos. El objetivo es determinar si las especies m as dependientes de polinizadores son tambi en las m as conectadas en las redes, con mayor centralidad, n umero y diversidad de interacciones. S olo en una de las comunidades de estudio se encuentra esta relaci on, sugiriendo que es variable en funci on del contexto comunitario. Por otro lado, hay interacciones que pueden causar efectos m as negativos que positivos sobre el exito reproductivo de las plantas. Esto puede pasar cuando los polinizadores depositan polen conespec co y heterospec co en los estigmas. La transferencia interespec ca de polen es relativamente com un, porque a menudo las especies de oraci on simult anea comparten polinizadores, y puede tener efectos perjudiciales para las plantas (e.g. p erdida de polen, obstrucci on de estigmas). En el cap tulo 4, se estudian las transferencias de polen interespec cas en tres comunidades andinas a lo largo de un gradiente altitudinal. Se construyen redes dirigidas que representan la transferencia de polen desde las especies donantes a las receptoras y a cada interacci on se le asocia un signo mostrando el efecto. Este signo se obtiene de la relaci on entre el polen conespec co y heteroespec co depositado sobre los estigmas. En todas las comunidades estudiadas, predominan las interacciones positivas y neutras, particularmente en la comunidad de mayor altitud. Esto sugiere que la facilitaci on en una comunidad puede aumentar cuando las condiciones para la polinizaci on se vuelven menos favorables. / Ecologists use network analysis to study pollination interactions at a communitywide level. The construction of plant-pollinator networks which are realistic representations of the pollination process is fundamental to increase their usefulness and ecological meaning. For that reason, this thesis focuses on incorporating to such networks individual variation and information about the magnitude and sign (positive, neutral or negative) of interaction e ects on plant reproduction. Species consist of populations of phenotypically, genetically and behaviourally diverse individuals which thus di er in their interactions and foraging decisions. Despite its relevance for many ecological and evolutionary processes, intraspeci c variation has been overlooked in most plant-pollinator network studies. In chapters 1 and 2, pollen loads of insect pollinator individuals are studied in two mountain communities of Mallorca, and networks where pollinator nodes depict individuals instead of species are built. Such approach (network downscaling) permits to account for the variation within species and provides new insights on network interaction patterns and their causal mechanisms. Pollen-transport networks at the individual level had lower linkage density, connectance, nestedness and interaction diversity, than the same networks at the species level, but higher modularity. These di erences occur because generalist pollinator species are composed of heterogeneous specialist individuals in the use of resources. The degree of individual specialization is associated with inter- and intraspeci c competition. Plant-pollinator networks which represent more accurately functional implications should include measures of interaction e ects on species or estimates of the actual degree to which species depend on such interactions. In general, interaction frequency is considered a good surrogate of the magnitude of interaction e ects, although it does not give any information about the e ect sign. For instance, in plant species with mechanisms for producing seeds independently of pollinators (e.g. autogamy, anemogamy), interactions may have a neutral reproductive e ect. In chapter 3, the degree of reproductive dependence on pollinators is quanti ed for several plant species in two study communities (coast and mountain), comparing seed set with and without insects. The objective is to determine whether plant species which depend more on pollinators are also more connected in ower-visitation networks, i.e. have high centrality, number and diversity of interactions. Such relationship is only found in one of the two study communities, which suggests that it is community-context dependent. On the other hand, there are interactions which may cause more negative than positive e ects on plant reproductive success. This may happen when owervisitors deposit both conspeci c and heterospeci c pollen on stigmas. Such interspeci c pollen transfer is common because co- owering plants often share pollinators, and can have detrimental e ects on plant tness (e.g. pollen loss and stigma clogging). In chapter 4, interspeci c pollen transfers are studied in three high-Andean communities along a mountain altitudinal gradient. Directed networks depicting pollen transfers from donor to receptor species are constructed, and a sign is associated to each network link to represent the e ect. This sign is obtained from the study of the relationship between conspeci c and heterospeci c pollen deposited on stigmas. In all study communities, facilitative and neutral pollinator-mediated interactions among plants prevail over competition, particularly in the highest elevation community. This nding suggests that pollination facilitation in communities can increase under less favourable conditions for the pollination service, supporting previous predictions of higher incidence of facilitative interactions in stressful environments.

There is increasing evidence that the presence of many emerging pollutants in aquatic ecosystems may have detrimental effects on aquatic biota. Of special concern are those emerging pollutants that may act as putative endocrine disrupters in non-vertebrate species, causing unexpected effects. In chapters 2, 3 and 4, I assessed the effects of two pharmaceuticals belonging to the group of "SSRIs": fluoxetine and fluvoxamine, used to treat depression; and the detergent 4-nonylphenol. SSRIs and 4-nonylphenol, increased offspring production and SSRIs also increased the juvenile developmental rates at limiting but not at high food ration levels. SSRIs increased juvenile development rate, clutch size, and decrease offspring size at low and intermediate levels of food rations, changing the perception of food levels making them to behave like they grew at higher food levels. Enhanced reproductive effects of SSRIs were reversed by the presence of the 5-HT antagonist cyproheptadine, indicating that in D. magna SSRIs targeted serotonin metabolic paths like in humans. Physiological assays showed that adult females exposure to SSRIs increased oxygen consumption rates and decreased carbohydrate levels. These changes did not affect survival under starving conditions, but they significantly affected the capacity of the exposed animals to survive under anoxic conditions. 4-nonylphenol increased offspring number but decreased offspring size. These responses have detrimental fitness effects since smaller offspring takes longer to mature and reproduce and having less offspring directly affects population growth rates. The analysis of the D. magna transcriptome showed that serotonin metabolism, neuronal developmental processes, carbohydrates and lipid metabolism pathways appeared as selectively affected by SSRIs treatment, whereas 4-nonylphenol deregulated genes from the carbohydrate metabolism and the ecdysone regulatory pathway. SSRIs show a MoA consistent with its pharmacological effect in humans while 4-nonylphenol effect seems to be performed through changes in the ecdysone regulatory pathways. In chapter 5 I evaluated the extent to which different forms of nano-TiO2 aggregate with microalgae, edible particle concentration. Effects were assessed using different assays. Assays included standard chronic reproduction 21-day tests, but also custom designed tests. The latter included two exposure scenarios: semi-static and re-suspension of algae. Results indicated the aggregation of nanoparticles. Nanoparticle aggregates interacted with the algae cells, forming clusters. Large TiO2-algae agglomerates settled readily, dramatically depleting the concentration of available food for Daphnia with dramatic effects on reproduction and fitness. These results indicate that nano-TiO2 may affect the transfer of energy throughout the planktonic aquatic food webs increasing the settlement of edible particles from the water column. In chapter 6 I tried to characterize the presence and activity of the multixenobiotic resistance proteins (MXR) in D. magna. I sequenced new partial DNA sequences, coding for full transporters and studied their transcriptional pattern across lifestages and with juveniles exposed to MXR inducers. All the genes were transcribed early in embryos and some of them were induced in juvenile stages by pentachlorophenol and mercury. Associated efflux activity was monitored using three fluorescent substrate dyes that are specific of different mammalian transporter types, combined with specific MXR transporter inhibitors (chemosensitizers). Dye accumulation assays indicated that MXR is functional in juveniles and induced by pentachlorophenol, mercury and dacthal. Toxicity bioassays performed with model substrates of ABCB1 (mitoxantrone) and ABCC (chlorambucil) transporters applied in combination chemosensitizers showed synergic toxic effects. This means that the MXR system is active and plays an important role detoxifying contaminants. / El efecto negativo que los contaminantes emergentes presentes en ecosistemas acuáticos tienen sobre la biota, es cada vez más evidente. En los capítulos 2, 3 y 4 se han evaluado los efectos sobre D. Magna del detergente 4-nonilfenol y de dos fármacos pertenecientes al grupo de los inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina (ISRS): fluoxetina y fluvoxamina, empleados en el tratamiento de la depresión. Cuando la disponibilidad de alimento es intermedia o se reduce al límite, la presencia de ISRS o de 4-nonilfenol produce un aumento en la descendencia. Además, los ISRS también aceleran el desarrollo de los juveniles. La presencia de ISRS modifica la percepción de los niveles de comida, provocando que D. magna se comporte como si dispusiera de abundante alimento. Este incremento en la tasa de reproducción se invirtió en presencia de Ciproheptadina, un antagonista de los receptores 5-HT, indicando que, al igual que en humanos, los ISRS afectaban a las rutas metabólicas de la serotonina. Ensayos fisiológicos mostraron que las hembras adultas expuestas a ISRS aumentaban su consumo de oxígeno y que los niveles de carbohidratos descendían. Estos cambios no afectaron la supervivencia, pero si la capacidad de los animales expuestos a sobrevivir en condiciones anóxicas. 4-nonilfenol produce un aumento en el número de descendientes, mas éstos tienen menor tamaño y por tanto tardan más en madurar y reproducirse. El análisis del transcriptoma de D. magna muestra que el metabolismo de la serotonina, los procesos de desarrollo neural y el metabolismo de lípidos y carbohidratos están afectados por el tratamiento con ISRS, mientras que 4- nonilfenol desregula genes del metabolismo de los carbohidratos y provoca cambios en la ruta que regula la edicsona. En el Capítulo 5, se evalúa hasta qué punto diferentes formas de nano-TiO2 se agregan con microalgas y deste modo afectar la concentration de partículas comestibles.Se usaron diferentes ensayos para valorar los efectos. Dichos ensayos incluyen el test estándar de exposición crónica durante 21 días, así como otros tests diseñados específicamente para este estudio. Éstos últimos contemplan dos escenarios: exposición a algas de um modo semiestático y exposición a algas con resuspensin continua. Los resultados indican que las nanoparticulas se agregan y sus agregados interaccionan con las algas formando clusters. Los aglomerados TiO2-Alga de mayor tamaño sedimentan rápidamente, reduciendo drásticamente la concentración de alimento disponible y, por tanto, afectando gravemente a estado general y reproductivo de la Daphnia. Estos resultados alertan del efecto que el nano-TiO2 puede tener en los procesos de transferencia de energía a lo largo de toda la cadena alimentaria planctónica. En el capítulo 6 se caracteriza la presencia y actividad MXR en D. Magna. Se secuenciaron RNA, que codifican para estos transportadores y se estudiaron los patrones transcripcionales a lo largo de diferentes estadios de D. magna y, también, con juveniles expuestos a inductores de MXR. Los resultados mostraron que ya en los embriones se observa transcripción de todos los genes, y algunos de éstos se inducían en juveniles expuestos a pentaclorofenol y mercurio. Mediante el uso de tres sustratos fluorescentes específicos a distintos tipos de transportadores, se monitorizó la actividad de expulsión del pigmento combinada con inhibidores específicos del transportador MXR. Los ensayos de acumulación de estos sustratos indican que MXR es funcional en juveniles y que es inducido por pentaclorofenol, mercurio y Dacthal. Los ensayos de toxicidad realizados con sustratos modelo de los transportadores ABCB1 (mitoxantrona) y ABCC (clorambucil) en combinación con chimiosensibilizadores, demostraron efectos tóxicos sinérgicos. Estos resultados indican que el sistema MXR está activo y juega un papel muy importante en los procesos de detoxificación

Master of Science / Department of Biochemistry / Dolores J. Takemoto / Spinocerebellar ataxia type 14 (SCA14) is a rare, autosomal dominant neurodegenerative disease caused by mutations in the gene encoding for protein kinase Cγ (PKCγ). These mutations affect the translocation and activation of the protein and are particularly damaging to the Purkinje cells of the cerebellum. This translocation and activation leads to the down regulation of gap junction activity by direct phosphorylation on the C-terminal tail of connexin proteins. This process is necessary in terminating the propagation of apoptotic signaling and is disrupted by SCA14-type mutations. Gap junctions allow the passive diffusion of small molecules from one adjoining cell to another. Gap junctions function as electrical synapses in neuronal tissue and are formed from connexin proteins. The connexin family of proteins contains approximately 20 members, each of which is expressed in a tissue dependent manner. One of the dominant connexin proteins expressed in Purkinje cells is connexin 57 (Cx57). Here, I have tested if Cx57 is regulated by PKCγ. This thesis shows that activation of PKC and PKCγ caused internalization of Cx57 gap junction plaques in HT-22 cell culture. PKC and PKCγ activation led to the phosphorylation of Cx57 primarily on serine residues. Furthermore, the expression of SCA14-type PKCγ led to increased sensitivity to oxidative stress, resulting decreased cell viability.

Tradicionalment, el disseny de fàrmacs s’ha basat en utilitzar molècules per tractar dianes biològiques clau o en una via metabòlica concreta, típicament proteïnes. No obstant, aquest paradigma està evolucionant de forma que el problema a resoldre no es troba només en entendre l’activació o inactivació de proteïnes sinó en controlar la maquinària interna que utilitza la cèl·lula per produir aquestes proteïnes. De la mateixa manera, les malalties conegudes com a minoritàries tenen els seus orígens en la genètica, i la utilització de proteïnes com a diana terapèutica ha esdevingut insuficient. L’ARN presenta una importància fonamental en els éssers vius degut al seu paper en multitud d’esdeveniments de regulació i control. La unió de molècules a l’ARN pot permetre el silenciament gènic o sobrexpressió d’un gen en concret. Fins la data, pocs fàrmacs amb la capacitat d’unir-se a l’ARN han tingut un impacte clínic significatiu pel que és imperatiu identificar nous esquelets químics que superin les dificultats associades al reconeixement d’aquesta macromolècula. Tanmateix, s’ha observat que el tractament per inhibir l’expressió gènica de determinats patògens és una estratègia prometedora ja que universalitza la seva activitat virucida. El factor limitant actual es troba en la manca de metodologies que permetin identificar de forma ràpida i efectiva potencials fàrmacs per tractar aquest tipus de patologies. Per aquest motiu, la present tesi es basa en la recerca de noves metodologies computacionals per al reconeixement de potencials fàrmacs per al tractament de dues malalties ARN-dependents com són la distròfia miotònica de tipus 1 (DM1) i el virus de la immunodeficiència humana (VIH-1). Gran part d’aquestes metodologies es basen en l’estructura del receptor pel que és fonamental una millor comprensió de les particularitats estructurals de l’ARN en un entorn dinàmic. Per aquest motiu, en el present treball s’han aplicat protocols de dinàmica molecular i models de xarxes elàstiques a fi d’investigar la promiscuïtat estructural d’aquests ARNs. Aquestes tècniques han permès obtenir informació per a refinar la modelització de noves famílies de compostos amb activitat biològica en models in cellulo. De la mateixa manera, s’ha realitzat una racionalització de l’activitat biològica de pèptids i peptoids actius en front de DM1 i VIH-1 per a poder-ne millorar la seva activitat en futures modificacions. Finalment, s’ha estudiat la dinàmica d’una proteïna essencial per al desenvolupament muscular, la desregulació de la qual està involucrada en múltiples malalties minoritàries, i especialment en DM1. Aquesta proteïna (MBNL1) està involucrada en múltiples processos de regulació i l’estudi realitzat en aquesta tesi proposa que el seu comportament dinàmic condiciona les seves propietats d’unió a certs transcrits d’ARN per a expressar o silenciar determinats gens. / Tradicionalmente, el diseño de fármacos se ha basado en usar moléculas para tratar dianas biológicas clave o una vía metabólica concreta, típicamente proteínas. No obstante, este paradigma está evolucionando de forma que el problema a resolver no se encuentra sólo en la activación o inactivación de proteínas sino en controlar la maquinara interna que usa la célula para producir estas proteínas. Del mismo modo, las enfermedades conocidas como minoritarias tienen sus orígenes en la genética, i la utilización de proteínas como diana terapéutica es, a día de hoy, insuficiente. El ARN presenta una importancia fundamental en los seres vivos debido a su papel en multitud de procesos de regulación y control. La unión de moléculas al ARN potencialmente permite el silenciamiento o sobreexpresión de un gen en concreto. Hasta la fecha, pocos fármacos con capacidad de unirse al ARN han tenido un impacto clínico significativo por lo que es imperativo identificar nuevos esqueletos químicos que superen las dificultares asociadas al reconocimiento de esta macromolécula. Igualmente, se ha observado que el tratamiento para inhibir la expresión génica de determinados patógenos es una estrategia prometedora ya que universaliza su actividad virucida. El factor limitante actual se encuentra en la falta de nuevas metodologías que permitan identificar de forma rápida y efectiva potenciales fármacos para tratar este tipo de patologías. Por este motivo, la presente tesis se basa en la prospección de nuevas metodologías computacionales para el reconocimiento de potenciales fármacos para el tratamiento de dos enfermedades ARN-dependientes como son la distrofia miotónica de tipo 1 (DM1) i el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1). La mayor parte de estas metodologías se basan en la estructura del receptor por lo que es fundamental una mejor comprensión de las particularidades estructurales del ARN en un entorno dinámico. Por este motivo, en el presente trabajo se han aplicado protocolos de dinámica molecular y modelos de redes elásticas con el fin de investigar la promiscuidad estructural de estas estructuras. Estas técnicas han permitido obtener información para refinar la modelización de nuevas familias de compuestos con actividad biológica en modelos in cellulo. Del mismo modo, se ha realizado una racionalización de la actividad bilógica de péptidos y peptodies activos frente a DM1 i VIH-1 para poder mejorar su actividad en futuras modificaciones. Finalmente, se ha estudiado la dinámica de una proteína esencial para el desarrollo muscular, cuya desregulación está involucrada en múltiples enfermedades minoritarias, especialmente en DM1. Esta proteína (MBNL1) está involucrada en múltiples procesos de regulación i el estudio realizado en esta tesis propone que su comportamiento dinámico condiciona las propiedades de unión a ciertos transcritos de ARN para expresar o silenciar determinados genes. / Traditionally, drug design has focused on using molecules for treating biological targets or a specific metabolic pathway, typically proteins. However, this model is changing in such a way that the problem to be resolved is not only to be found in the activation or inactivation of proteins but also in controlling the internal cellular machinery that regulates these proteins. Similarly, the new generation of diseases known as genetic or ‘rare’ diseases is rooted in genetics, and the use of proteins as a therapeutic target is, today, insufficient. RNA has a fundamental importance in life and it plays a role in multiple processes of regulation and control. Small molecules that bind RNA can potentially silence or promote gene expression. To date, few drugs that potentially bind RNA had a significant clinical impact so it is essential to identify new chemical scaffolds that are able to overcome the inherent difficulties of this macromolecule recognition. Equally important, it the observation that inhibition of gene expression of certain pathogens is a promising strategy due to their universal virucidal activity. The current limiting factor is the lack of alternative methodologies to quickly and effectively identify potential drugs to treat such diseases. Therefore, this thesis is based on the exploration of new computational methodologies for identifying potential drugs for the treatment of two RNA-dependent diseases such as myotonic dystrophy type 1 (DM1) and the human immunodeficiency virus (HIV-1). Most of these methods are based on the receptor’s structure which is why a better understanding of the structural characteristics of RNA in a dynamic environment is essential. Therefore, in this thesis in order to investigate the structural promiscuity of these targets molecular dynamics and elastic network model protocols have been applied. These techniques have provided important information to refine the modeling of new families of compounds with biological activity on in cellulo models of DM1. Similarly, a rationalization of the biological activity of peptides and peptoids active against DM1 and HIV-1 based on structure has been conducted to improve their potency in future modifications. Finally, the dynamics of an essential protein for muscle development, whose deregulation is involved in many rare diseases, especially in DM1, has been studied. This protein (MBNL1) is involved in many regulatory processes and the study in this thesis proposes that its dynamic behavior determines its binding properties in order to bind specific RNA transcripts to enhance or silence gene expression.

Vitis vinifera L. és una de les moltes espècies que està sotmesa a una important erosió genètica. Un primer pas per a la preservació d’aquesta espècie és conèixer bé la seva biodiversitat, és per això que el present treball aborda l’estudi de la caracterització molecular de 449 accessions de Vitis vinifera L. procedents de 23 països mitjançant la tècnica dels microsatèl•lits. Prèviament a la caracterització, es fonamental fer una bona extracció d’ADN, ja que sinó, es pot veure compromès el procés d’amplificació. En aquesta tesi s’han dissenyat dues metodologies d’extracció d’ADN. La més polivalent es caracteritza per poder extraure ADN pur de diferents tipus de mostres (tan de fulla jove com adulta, sarment (fusta) i de llavor) en unes 2 h 30 minuts (sent ràpida com un “kit” comercial, però aquest només pot extreure a partir de teixit foliar). La segona metodologia és més ràpida, donat que en només 90 minuts es realitza l’extracció d’ADN, però queda restringida per a mostres de fulla, tan jove com adulta. Posteriorment s’aborda l’estudi de caracterització varietal on s’han identificat 340 varietats diferents, quedant palesa la problemàtica dels errors comesos en denominació de les accessions. Aquests resultats han servit per establir els fonaments per a la creació d’una Base de Dades de Microsatèl•lits d’identificació varietal de Vitis vinifera L. de la Universitat Rovira i Virgili. Finalment, els resultats obtinguts en l’estudi de l’estructura genètica suggereixen l’existència de 4 nous centres de domesticació: 2 localitzats al nord-est i al centre sud-oest de la Península Ibèrica, i 2 més localitzats al sud-est i nord-est de França. / La Vitis vinifera L. es una de las muchas especie que se encuentra sometida a una importante erosión genética. Un primer paso para la preservación de esta especie es conocer bien su biodiversidad, es por ello que el presente trabajo aborda el estudio de la caracterización molecular de 449 accesiones de Vitis vinifera L. procedentes de 23 países mediante la técnica de los microsatélites. Previamente a la caracterización, es fundamental realizar una buena extracción de ADN, ya que si no, se puede ver afectado el proceso de amplificación. En esta tesis se han diseñado dos metodologías de extracción de ADN. La más polivalente se caracteriza por poder extraer ADN puro de distintos tipos de muestra (tanto de hoja joven como adulta, sarmiento (madera) y de semilla) en unas 2 h y 30 minutos (siendo rápida como un “kit” comercial, pero éste sólo puede extraer a partir de tejido foliar). La segunda metodología es más rápida, dado que en sólo 90 minutos se realiza la extracción de ADN, pero queda restringida para muestra de hoja, tanto joven como adulta. Posteriormente se aborda el estudio de caracterización varietal donde se han identificado 340 variedades distintas, siendo clara la problemática de los errores en la denominación de las accesiones. Estos resultados han servido para sentar las bases para la creación de un Base de Datos de Microsatélites de identificación varietal de Vitis vinifera L. de la Universidad Rovira i Virgili. Finalmente, los resultados obtenidos en el estudio de la estructura genética sugieren la existencia de 4 nuevos centros de domesticación: 2 localizados al noreste y al centro suroeste de la Península Ibérica, y 2 más localizados al sureste y noreste de Francia. / Vitis vinifera L. is one of the species which is subject to important genetic erosion. A first step for the preservation of this species is to know its biodiversity, for this reason this paper deals with the study of the molecular characterization of 449 accessions of Vitis vinifera L. from 23 countries by the microsatellites analysis. Prior the characterization, it is essential to carry out a good DNA extraction. In this thesis two methods of DNA extraction have been designed. The most versatile extracts pure DNA from different types of samples (both young and adult leaf, stem (wood) and seed) in about 2 hours and 30 minutes (fast like a commercial kit, but this only useful to extract DNA from leaf. The second method is faster, because in just 90 minutes the DNA extraction is performed, but is restricted to leaves, both young and adult. Subsequently, it is tackled the study of varietal characterization, 340 different varieties are identified; being present the problems of mislabeling. These results are the groundwork for the creation of a Vitis vinifera Microsatellite Database of the Universitat Rovira i Virgili. Finally, the results obtained in the study of the genetic structure suggest the existence of 4 new Centers of Domestication: 2 are located in the northeast and centre-southwest of the Iberian Peninsula, and 2 more are located in the southeast and northeast of France.

L'apoptosi s'ha considerat un factor important en el control del balanç entre proliferació cel·lular, diferenciació i mort durant el desenvolupament. La regulació de l'apoptosi és un factor clau per aconseguir aquest balanç, eliminant cèl·lules innecessàries o malmeses que, d'altra manera, podrien tenir efectes adversos per l'organisme. Durant la darrera dècada, molts treballs han demostrat que la senyalització per apoptosi té una funció vital per la morfogènesi del cor. Malgrat això, existeix controvèrsia sobre la implicació de les caspases en la mort dels cardiomiòcits en l'individu adult. Així, l'anàlisi de la regulació de l'apoptosi des d'una perspectiva de desenvolupament podria millorar el nostre coneixement sobre la funció de l'apoptosi al cor. Per tant, els nostres principals objectius han estat caracteritzar la regulació de l'expressió dels gens apoptòtics durant el desenvolupament cardíac i la identificació de les vies alternatives implicades al dany del teixit cardíac. Vàrem analitzar l'expressió de proteïnes implicades al control de la via de mort cel·lular dependent de caspases en teixits provinents de rates de diferents edats entre l'embrió i l'estadi adult. Els gens implicats en l'activació de l'apoptosi es troben fortament silenciats al cor adult i, la major part d'ells, també al cervell, però no al fetge. Les excepcions varen ser Caspasa-2, l'expressió de la qual es reprimeix a tots els teixits estudiats durant la fase embrional, i Bax i Bak, que es silencien en tots els teixits durant el període perinatal. L'expressió de la caspasa iniciadora Caspasa-9 i les caspases executores Caspasa-3 i Caspasa-7 es troba reprimida al cor i cervell postnatals. En relació amb els gens anti-apoptòtics, Bcl-2 es silencia al cor i el cervell durant el desenvolupament i no es va detectar al fetge, mentre que Bcl-XL s'expressa a tots els teixits fins l'estadi adult. Mitjançant l'anàlisi per RT-PCR semiquantitativa vàrem poder observar que la reducció en l'abundància de les proteïnes apoptòtiques durant el desenvolupament té lloc de forma paral·lela amb la reducció en els nivells dels seus mRNA. Durant la isquèmia experimental o el tractament amb la droga pro-apoptòtica estaurosporina, l'activació de la caspasa executora Caspasa-3 va observar-se només als cardiomiòcits embrionaris, però no als cardiomiòcits postnatals o adults. A més a més, la isquèmia va induir fragmentació de l'ADN que no es va poder evitar afegint inhibidors de caspases a cardiomiòcits postnatals en cultiu, que ja expressen nivells molt baixos d'aquests gens. Per continuar amb la investigació sobre la mort dels cardiomiòcits postnatals i el canvi d'una via dependent de caspases a una via independent de caspases durant el desenvolupament del cor, vàrem analitzar el possible rol de diverses DNAses que podrien estar implicades al dany a l'ADN durant la isquèmia. La repressió experimental en cultiu del gen Endonucleasa G (EndoG), que codifica per una nucleasa mitocondrial, va bloquejar la degradació de l'ADN durant la isquèmia, demostrant que EndoG té una funció molt important en aquest esdeveniment, de forma independent a les caspases. La sortida d'EndoG del mitocondri és un pas important per a la fragmentació de l'ADN als cardiomiòcits. Hem demostrat que Bcl -XL és capaç de bloquejar i Bnip3 contribueix a l'alliberament d'EndoG del mitocondri i, així, tenen efectes contraposats en la fragmentació de l'ADN durant la isquèmia als cardiomiòcits diferenciats. També vàrem iniciar l'anàlisi dels mecanismes que controlen l'expressió i silenciament dels gens apoptòtics al cor. Vàrem analitzar la contribució de dos candidats, E2F i les proteïnes d'unió a tractes de polipirimidines (PTB). Al cor, l'expressió d'E2F i PTB es redueix durant el desenvolupament, de forma paral·lela als gens apoptòtics. Malgrat això, l'anàlisi de l'expressió de gens apoptòtics a ratolins deficients per E2F1, E2F2 o tots dos gens no va mostrar cap canvi en relació amb els nivells d'expressió als seus respectius animals control ni durant l'estadi embrional ni durant el desenvolupament postnatal. Aquests resultats varen descartar que E2F tinguin una funció rellevant en el control de l'expressió dels gens apoptòtics al cor, a diferència del que s'ha observat en línies cel·lulars tumorals. D'altra banda, vàrem trobar que, en cardiomiòcits neonatals, que expressen nivells molt baixos de PTB, la sobrexpressió de PTB1 o PTB4 va induir la reexpressió de molts gens apoptòtics, incloent Apaf-1, les caspases-9 i -3, i Bid. A més a més, els cardiomiòcits sobre-expressors de PTB varen patir major dany a l'ADN durant la isquèmia que els cardiomiòcits control i aquest increment podia ser inhibit mitjançant inhibidors de caspases fins a nivells similars als de cèl·lules no sobreexpressores. Això suggereix que la recuperació de l'expressió de PTB, probablement implicant l'increment de l'expressió de gens apoptòtics, va induir un canvi a un mecanisme implicant les caspases. La re-expressió de PTB va induir un increment en la quantitat de proteïnes apoptòtiques sense afectar els nivells dels seus respectius mRNA. Els assaigs luciferasa (Luc) en cardiomiòcits normals i sobre-expressors de PTB, utilitzant plàsmids bicistrònics en els quals es va integrar la regió 5'-no codificant (5'-UTR) dels transcrits d'Apaf-1 o Caspasa-3 entre LucRenilla i LucFirefly, varen demostrar un increment en l'activitat LucFirefly quan qualsevol de les dues 5'-UTR es trobava present, comparat amb els nivells control. Aquests resultats suggereixen que PTB indueixen traducció per la via Internal Ribosolmal Entry Site (IRES), que requereix certes seqüències a les regions 5'-UTR dels gens implicats.

El present treball està dedicat a les aplicacions pràctiques de diversos mètodes teòrics i de simulació incloent la dinàmica molecular, Montecarlo i la mitjana dels càlculs del camp per entendre les propietats físiques del sistema bicapa lipídica, així com la interacció dels objectes a escala nanomètrica en contacte amb lípids desenvolupament i bicapes. En particular, el treball es tracten els següents temes: 1. Optimització i equilibri de propietats bicapes lipídiques utilitzant única cadena de la teoria de camp mig. 2. El desenvolupament del model i estudiar les propietats d'equilibri de bicapes de lípids oxidats amb camp mitjà i els mètodes de dinàmica molecular 3. Estudi de les propietats d'equilibri de doble capa amb nanopartícules utilitzant camp mitjà i els mètodes de Montecarlo. Optimització de polímer translocacional través de la tècnica 5. Mètodes estadístics GPU membrana utilitzats per a les propietats superficials de micro fulles d'alteració bicapes lipídiques. / El presente trabajo está dedicado a las aplicaciones prácticas de varios métodos teóricos y de simulación incluyendo la dinámica molecular, Monte Carlo y la media de los cálculos del campo para entender las propiedades físicas del sistema bicapa lipídica, así como la interacción de los objetos a escala nanométrica en contacto con lípidos desarrollo y bicapas. En particular, el trabajo se tratan los siguientes temas: 1. Optimización y equilibrio de propiedades bicapas lipídicas utilizando única cadena de la teoría de campo medio. 2. El desarrollo del modelo y estudiar las propiedades de equilibrio de bicapas de lípidos oxidados con campo medio y los métodos de dinámica molecular 3. Estudio de las propiedades de equilibrio de bicapa con nanopartículas utilizando campo medio y los métodos de Monte Carlo. Optimización de polímero translocacional través de la técnica 5. Métodos estadísticos GPU membrana utilizados para las propiedades superficiales de micro cuchillas de alteración bicapas lipídicas. / Present work is devoted to the development and practical applications of several theoretical and simulation methods including Molecular dynamics, Monte Carlo and Mean field calculations to understand the physical properties of the lipid bilayer system as well as the interaction of nano-scale object in contact with lipid bilayers. In partcular, the work covers the following topics: 1. Optimization and equilibrium properties of lipid bilayers using Single Chain Mean Field theory. 2. Developing the model and study the equilibrium properties of bilayers with oxidized lipids with mean field and molecular dynamics methods 3. Study the equilibrium properties of bilayer with nanoparticles using mean field and Monte Carlo methods4. Optimization of translocational polymer through membrane GPU technique 5. Statistical methods used to the surface properties of micro blades disrupting lipid bilayers.

Cancer can be defined as a family of complex disease characterized by a cellular hyperproliferation and the capacity of the cell to invade surrounding tissue and metastasize to other organs in the body. The development and progression of cancer is a complex multistep process in which cells gradually acquire mutations altering the cellular mechanisms until the cell becomes malignant. Cancer develops and progresses through the acquisition of the above mutations or alterations across biological levels. Downstream of these alterations are expression changes in many genes at each stage of the disease. Sets of genes (also called signatures whose differential expression or profiles have prognostic or predictive (in terms of prediction of drug-response) values have been identified for almost every type of cancer. In some cases, several signatures have proved to be useful in independent evaluations, although, intriguingly, their overlap in gene identities was minimal. Then, integrative approaches using different types of gene and protein relationships have demonstrated the existence of biological convergence among apparently disparate gene sets. Moreover, integrating data from he network of known protein-protein interactions (hereafter interactome network) has been shown to improve the reproducibility and accuracy of prognostic signatures. However, in this scenario, the network topological patterns linked to the dynamic molecular alterations that characterize cancer development and progression, and treatment response, remain unknown. Several key genetic, transcriptomic and molecular determinants of cancer therapeutic response have been identified in recent years. Specific genetic alterations have been demonstrated to mediate the existence and/or promote the acquisition of therapeutic resistance. In addition, sets of transcripts have been identified whose profiles have predictive value for prognosis and/or treatment benefit. Successively, the integration and modeling of data from different types of molecular interactions has been shown to enhance understanding of the mechanisms of cancer progression and therapy response. In this scenario, however, cancer patients all too frequently show no or only modest benefit from a given therapy. The persistence of this fundamental clinical problem has been partially attributed to the lack of specific biomarkers. However, the identification of a comprehensive measure of cancer cell activity may support the interpretation of therapy efficacy. At a cancer system level, several studies have shown extensive molecular rewiring and increased signaling entropy, which may endorse the characteristic robustness of cancer. Given these observations, an a priori understanding of therapeutic response should be supported by an integrated measure of cancer network activity. In this study, firstly, we hypothesized that the features of dynamism and robustness intrinsic to cancer should also be present at different biological levels and, in particular, evident within the topology of he interactome network. To assess this hypothesis we analyzed the impact of cancer-related expression changes- including cancer development, progression, response to treatments, and targeted perturbation-in the interactome network using the concept of cascading failures. The results of these analyses associate robustness with cancer and identify autophagy as an opposite condition. Next, we hypothesized that a comprehensive measure of cancer cell status or function applicable to predicting therapy response should integrate and/or partially reflect the fundamental hallmarks of cancer. To address these questions, we have developed a novel weighted network score, which is used to show that cancer network activity is associated with therapeutic response and synergism. / El càncer és una família de malalties complexes que es caracteritzen per una proliferació cel·lular descontrolada i il·limitada i la capacitat de les cèl·lules d'invadir teixit veí i metastatitzar cap a teixit i òrgans llunyans. El desenvolupament i progressió d'un càncer és un procés complex de diversos passos en els quals les cèl·lules pateixen i acumulen mutacions gèniques. Aquestes mutacions alteren els mecanismes cel·lulars fins que la cèl·lula cancerosa ha acumulat les alteracions necessàries per proliferar de manera descontrolada i adquirir la capacitat de colonitzar teixits o òrgans llunyans. Les mutacions que pateixen les cèl·lules durant el procés de la carcinogènesi afecten a diferents nivells del sistema cel·lular. Aquestes mutacions alteren els perfils d'expressió gènica i produeixen canvis quantitatius i qualitatius en el producte gènic (ARN i proteïna) que poden alterar les xarxes complexes cel·lulars per les quals es regulen els mecanismes cel·lulars. En els darrers anys, diverses anàlisis, que han integrat dades d'expressió gènica, han sigut útils per identificar signatures de gens pel pronòstic del càncer o determinar teràpies pel seu tractament. Tanmateix, a causa de la diversitat biològica de la cèl·lula, signatures de gens identificades mitjançant estudis independents sovint tenen pocs o cap gen en comú. Amb la integració de dades d'expressió gènica i d'interaccions entre proteïnes, s'ha pogut explicar la diversitat biològica que capturen aquestes anàlisis mitjançant la identificació de signatures aparentment diferents. Malgrat que la xarxa d'interaccions entre proteïnes (xarxa de l'interactoma) aporta informació addicional del sistema, la relació amb la dinàmica molecular del càncer roman desconeguda. Les cèl·lules canceroses sovint responen a la teràpia generant resistència, ja sigui per la pròpia heterogeneïtat de la cèl·lula cancerosa o adquirint noves mutacions o alteracions en els seus mecanismes. Els canvis adquirits poden afectar a processos biològics o vies de senyalització immerses en les xarxes complexes moleculars ---desregulant-les o modificant la seva activitat--- augmentant la robustesa característica del càncer. En aquest sentit, el desenvolupament d'eines per capturar l'activitat de les xarxes moleculars i per les vies que la cèl·lula adquireix resistència o per les quals pot ser vulnerable, pot ser de gran utilitat per identificar teràpies específiques dirigides a dianes moleculars concretes. En aquest treball, per explorar la relació entre la xarxa de l'interactoma i la dinàmica molecular del càncer, s'ha realitzat una anàlisi toplògica de la xarxa de l'interactoma respecte dels estadis del càncer, pertorbació de gens centrals en el càncer i la resposta al tractament. Per fer-ho, s'ha implementat un model de cascada de fallades que modelitza la propagació de càrrega proteica a través de la xarxa. Els resultats obtinguts mostren que la xarxa de l'interactoma és robusta respecte de les condicions del càncer. Per altra banda, per explorar l'activitat de la xarxa de les cèl·lules canceroses i la seva relació a la sensibilitat de les cèl·lules respecta al tractament, s'ha definit una mesura de l'activitat de la xarxa i s'ha aplicat a les xarxes de diferents càncers. Tot seguit, s'han comparat les mesures obtingudes amb la resposta de les cèl·lules canceroses al tractament de diversos fàrmacs. Els resultats obtinguts, mostren que aquesta mesura diferencia fàrmacs segons les seves característiques, per exemple si són citotòxics o tenen dianes específiques, i que prediu combinacions de fàrmacs amb un efecte sinèrgic.

Les intoxicacions alimentàries degudes a toxines marines suposen un problema de salut públic i té un gran impacte econòmic sobre el sector pesquer. Els nivells de toxines marines que estan permesos en els productes pesquers i els mètodes d'anàlisi d'aquestes estan regulats a nivell europeu. Fins ara el mètode més emprat per a l'anàlisi de toxines era el bioassaig en ratolí. No obstant això, a causa de les noves regulacions en qüestió d'ètica animal i els avenços en tècniques més fiables i específiques per a la detecció de toxines marines, l'EFSA (European Food Safety Authority) ha determinat la progressiva substitució del bioassaig en ratolí per mètodes alternatius en tot el territori de la Unió Europea. Aquesta tesi proposa l'ús d'assajos basats en cèl•lules (CBAs) com a mètodes de detecció de toxines, complementaris a mètodes analítics. L'ús de CBAS permet realitzar un cribratge de les mostres a estudiar, previ a l'anàlisi analític confirmatori. A més, algunes d'aquestes microalgues, no causant intoxicacions alimentàries, poden produir substàncies bioactives de gran interès farmacològic. Aquesta tesi demostra que els cultius cel•lulars són aplicables també per caracteritzar el mecanisme d'acció d'aquest tipus de compostos. En aquests treballs es van usar cultius primaris de cèl•lules granulars de cerebel (CGC) de rata per estudiar l'efecte sobre l'homeòstasi de calci de les substàncies aïllades a partir de extractes de cultius de microalgues. Els resultats presentats en aquesta tesi tenen un impacte directe sobre la seguretat alimentària i aporta dades substancials que permeten caracteritzar el risc real que suposen les toxines avaluades per al consumidor. / Las intoxicaciones alimentarias debidas a toxinas marinas suponen un problema de salud público y tiene un gran impacto económico sobre el sector pesquero. Los niveles de toxinas marinas que están permitidos en los productos pesqueros y los métodos de análisis de éstas están regulados a nivel europeo. Hasta ahora el método más empleado para el análisis de toxinas era el bioensayo en ratón. Sin embargo, debido a las nuevas regulaciones en cuestión de ética animal y los avances en técnicas más fiables y específicas para la detección de toxinas marinas, la EFSA (European Food Safety Authority) ha determinado la progresiva sustitución del bioensayo en ratón por métodos alternativos en todo el territorio de la Unión Europea. Esta tesis propone el uso de ensayos basados en células (CBAs) como métodos de detección de toxinas, complementarios a métodos analíticos. El uso de CBAs permite realizar un cribado de las muestras a estudiar, previo al análisis analítico confirmatorio. Además, algunas de estas microalgas, no causando intoxicaciones alimentarias, pueden producir sustancias bioactivas de gran interés farmacológico. Esta tesis demuestra que los cultivos celulares son aplicables también para caracterizar el mecanismo de acción de este tipo de compuestos. En estos trabajos se usaron cultivos primarios de células granulares de cerebelo (CGC) de rata para estudiar el efecto sobre la homeostasis de calcio de las sustancias aisladas a partir de extractos de microalgas cultivadas en el laboratorio. Los resultados presentados en esta tesis tienen un impacto directo sobre la seguridad alimentaria y aporta datos substanciales que permiten caracterizar el riesgo real que suponen las toxinas evaluadas para el consumidor. / Food poisoning due to marine toxins pose a public health problem and has a great economic impact on the fishing sector. Marine toxin levels that are permitted in fish products and the methods of analysis of these products are regulated at the European Community level. So far the most used method for analysis of marine toxin was the mouse bioassay. However, due to new regulations within animal ethics and advances in new reliable and specific techniques for the detection of marine toxins, EFSA (European Food Safety Authority) has established the progressive replacement of the mouse bioassay for alternative methods in the European Union. This thesis proposes the use of cell-based assays (CBAs) as toxin detection methods, complementary to analytical methods. The use of CBAs allows the screening of samples, prior to confirmation by analytical techniques. Furthermore, some dinoflagellates which are not usually involved on food intoxication can produce bioactive substances with high pharmacological interest. This work proves that cell cultures are accurate to characterize the mechanism of action of these compounds. In these studies primary cultures of rat cerebella granule cells (CGC) were used to study the effect of microalgae products on the CGC calcium homeostasis. The tested products were isolated from microalgae cultures at the laboratory. The results presented in this thesis have a direct impact on food safety and provides substantial data to characterize the actual risk that poses the tested toxins for consumers.

No description available.