Before 1910, the fish assemblage of Banyoles Lake (Catalonia, Spain) consisted of: eel (Anguilla anguilla), Mediterranean barbel (Barbus meridionalis), freshwater blenny (Bennius fluviatilis), three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus), chub (Leuciscus cephalus), and (perhaps introduced long time ago) tench (Tinca tinca). Presently, two of these species, i.e., three-spined stickleback and tench, seem to have disappeared and the remaining native fish are uncommon, mostly eel and barbel / Abans de 1910, la comunitat de peixos de l’Estany de Banyoles constava de: anguila (Anguilla anguilla), barb de muntanya (Barbus meridionalis), bavosa de riu (Bennius fluviatilis), espinós (Gasterosteus aculeatus), bagra comuna (Leuciscus cephalus) i, potser introduïda antigament, tenca (Tinca tinca). Actualment, dues d’aquestes espècies (espinós i tenca) sembla que han desaparegut i les altres autòctones són poc abundants, sobretot l’anguila i el barb de muntanya. La comunitat està molt dominada per les espècies introduïdes: d’origen nord-americà, com ara perca americana (Micropterus salmoides), peix sol (Lepomis gibbosus), gambúsia (Gambusia holbrooki); o d’origen europeu, com gardí (Scardinius erythrophthalmus), madrilleta vera (Rutilus rutilus), carpa (Cyprinus carpio) i perca (Perca fluviatilis)

El objetivo principal de esta tesis fue el de realizar una validación y caracterización de las posibles variables que pueden afectar la metodología empleada para identificar las isoformas presentes en algunas de las especies de EPO (uEPO, rEPO alfa, rEPO beta y el NESP) tras su identificación mediante la técnica de IEF e inmunodetección

The experiments described in this thesis report were aimed at studying the functions of Sox2 and Serrate1 during the development of the neurosensory elements of the inner ear. First, we have described the expression pattern of Sox2 during inner ear development and compared to that of Sox3 and Serate1. Secondly, we have shown the results of plasmid based in ovo electroporation experiments, designed to manipulate gene expression exogenously, and to study the gain of function of Sox2 and Serrate1. Effects on cell fate and downstream targets were assessed by in situ hybridization immunohistochemistry and quantitative real-time PCR (qRT-PCR).The results show that Sox2 is expressed in the neurosensory domain of the otic epithelium during the neurogenic period of otic development and, later on, during the development of the prosensory patches and sensory organs. As differentiation proceeds, Sox2 is excluded from differentiated neurones and hair cells, but remains expressed in the supporting cells of the sensory organs. Sox3 is co-expressed with Sox2 in the neurogenic domain of the otic cup. But Sox3 is then down-regulated and only Sox2 expression persists in the sensory precursors, where it is co-expressed with the Notch ligand Serrate1. The expression domain of Serrate1 is initially nested within Sox2, however, later in development Sox2 becomes restricted within the boundaries of Serrate1 expression, a process that is concomitant to the formation of the sensory patches. These expression patterns suggest: 1) that Sox2 correlates with neurosensory fate in the otic placode, 2) that neurogenesis is associated with Sox2 and Sox3 and 3) that sensory development is associated with Sox2 and Serrate1.Gain of function studies show that Serrate1 regulates prosensory fate and sensory organ development by maintaining Sox2 expression in restricted domains of the otocyst, without affecting neurogenesis. Serrate1 operates in a Notch-dependent manner, consistently with a mechanism of lateral induction that includes the induction of its own expression and downstream targets of the Notch signalling pathway Hes1, Hey1 and Hey2. Similar studies on Sox2 indicate that it specifies neurosensory fate in the otic epithelium. However, high concentrations of Sox2 suppress sensory fate and promote neuronal fate. Besides, Sox2 prevents cell differentiation though the cooperation with Notch and BMP signalling pathways.We like to propose a model in which an extended neural competence is early established in the otic placode with the early expression of Sox2 and Sox3 genes. The cooperation between Sox2 and Sox3 then provides a high concentration of SoxB1 protein and promote neuronal fate. In parallel, Serrate1 maintains Sox2 expression in restricted domains, after Sox3 down-regulation. These domains retain the neurosensory competence and thereby develop as sensory patches. / Los experimentos descritos en esta tesis tuvieron por objetivo estudiar la función de Sox2 y Serrate1 en el desarrollo de los elementos neurosensoriales del oído. En primer lugar describimos el patrón de expresión de Sox2 durante el desarrollo del oído y lo comparamos con el de Sox3 y Serrate1. En segundo lugar, mostramos los resultados de experimentos de electroporación in ovo, diseñados para manipular exógenamente la expresión génica y estudiar la ganancia de función de Sox2 y Serrate1. Los efectos sobre el destino celular y las dianas moleculares se analizaron mediante hibridación in situ, inmunocitoquímica y real-time PCR (qRT-PCR).Los resultados muestran que Sox2 se expresa en el dominio neurosensoerial del epitelio ótico durante la fase de neurogénesis y, más adelante, durante el desarrollo de los parches prosensoriales y los órganos sensoriales. Con la diferenciación, Sox2 es excluido de las neuronas diferenciadas y las células ciliadas, pero permanece expresado en las células de soporte. Sox3 se coexpresa con Sox2 en el dominio neurogénico de la copa ótica. Pero entonces, la expresión de Sox3 se reduce y sólo Sox2 persiste en los precursores sensoriales, en donde se co-expresa con el ligando de Notch Serrate1. El dominio de expresión de Serrate1 está inicialmente contenido en el de Sox2, sin embargo, más adelante, Sox2 se restringe dentro de los límites de Serrate1, un proceso que es concomitante con la formación de los parches sensoriales. Estos experimentos sugieren que : 1) Sox2 se correlaciona con el destino neurosensorial de la placoda ótica, 2) la neurogénesis está asociada con Sox2 y Sox3, y 3) el desarrollo sensorial está asociado a la expresión de Sox2 y Serrate1Los estudios de ganancia de función muestran que Serrate1 regula el destino prosensorial y el desarrollo de los órganos sensoriales mediante el mantenimiento de la expresión de Sox2 en dominios restringidos del otocisto, sin afectar a la neurogénesis. Serrate1 opera en un modo dependiente de Notch, consistente con un mecanismo de inducción lateral que comprende la inducción de su propia expresión y la de las dianas de Notch Hes1, Hey1 and Hey2. Estudios similares sobre Sox2 indican que Sox2 especifica el destino neurosensorial en el epitelio ótico. Sin embargo, las concentraciones altas de Sox2 suprimen el destino sensorial y promueven el destino neuronal. Además, Sox2 previene la diferencoiación celular mediante la cooperación con Notch y Bmp. Se propone un modelo en el cual la competencia neural se establece tempranamente en la placoda ótica mediante la expresión temprana de Sox2 y Sox3. La cooperación entre Sox2 y Sox3 provee una alta concentración de factores SoxB1 que promueven el destino neuronal de los progenitores. En paralelo, Serrate1 mantiene la expresión de Sox2 en dominios restringidos tras la supresión de Sox3. Estos dominios, retienen el potencial neurosensorial y, más adelante, se desarrollan como parches sensoriales.

La transició epiteli-mesènquima (TEM) és un procés en què cèl lules epitelials, immòbils i amb polaritat apico-basal transiten cap un fenotip mesenquimal o fibroblàstic. L'expressió del factor de transcripció snail1 és suficient per induir TEM en cèl lules en cultiu i és necessari per la majoria de les TEM fisiològiques descrites. Snail1 és un membre de la família de proteïnes amb dits de Zinc que reprimeix gens epitelials (com l'E-cadherina) a través de la unió directa a seqüències especifiques dels promotors anomenades caixes E i posterior reclutament de corepressors. La TEM també es caracteritza per l'activació de gens mesenquimals, però el mecanisme pel qual snail1 indueix l'expressió d'aquests és poc conegut. En aquest treball demostrem que snail1 actua a nivell transcripcional per incrementar els nivells dels marcadors mesenquimals FN1 (fibronectina) i LEF1 (de l'anglès, lymphoid enhancer-binding factor 1) a través d'un mecanisme nou per aquesta proteïna de dits de Zn que no requereix ni caixes E ni unió directa a l'ADN. A més a més, mostrem que, per a dur a terme l'activació, snail1 coopera amb dos factors de transcripció ja descrits en relació a la TEM: beta-catenina i NF-kappa-B. Els nostres resultats també proven que l'expressió forçada de la E-cadherina evita aquesta cooperació i conseqüent activació gènica. A banda d'aquest mecanisme, també hem descrit que el factor de transcripció TFCP2c, que no havia estat prèviament relacionat amb TEM, és necessari per l'activació del gen FN1 induïda per snail1. / Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a cellular process by which no motile epithelial, apico-basal-polarized cells transit towards a motile mesenchymal front-backpolarized phenotype. Expression of the transcription factor snail1 is sufficient to induce EMT in cultured cells and it is required for most of the physiological EMTs described. Snail1 is a member of the Zn finger protein family that represses epithelial genes (such as E-cadherin) by directly binding to specific promoter sequences called E-boxes and subsequent recruitment of corepressors. EMT is also accompanied by activation of mesenchymal genes, however, little is known of how snail1 induces their expression.In this work we provide evidence that snail1 acts at the transcriptional level to increase the levels of the mesenchymal FN1 (fibronectin) and LEF1 (lymphoid enhancer-binding factor 1) genes through a novel mechanism for this Zn finger protein that does not require neither E-boxes nor direct binding to DNA. Furthermore, we describe a cooperative action in such mechanism between snail1 and two transcription factors previously related to EMT: beta-catenin and NF-kappaB. Our results also show that restoration of E-cadherin levels prevents such cooperation and subsequent activation. In addition, we also demonstrate that TFCP2c, which had not been previously linked to EMT, is also required for snail1-induced transcriptional activation of the FN1 gene.

La 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA, éxtasis) es una anfetamina sustituida de consumo frecuente y abusivo. La enzima principal que participa en el metabolismo de fase I de la MDMA, la isoforma 2D6 (CYP2D6) del citocromo P450, resulta también inhibida por la MDMA. Además, ésta es a la vez metabolizada por otras isoformas de CYP, por ejemplo la CYP1A2. La contribución de esta enzima y los posibles cambios en su actividad tras una administración de MDMA nunca han sido estudiados in-vivo. En consecuencia, se realizó un ensayo clínico donde los marcadores, dextrometorfano y cafeína se administraron tras una dosis oral de MDMA. En base a la farmacocinética de ambos marcadores se evaluaron posibles cambios en la actividad de las enzimas. En base al ratio metabólico urinario de dextrometorfano i dextrorfano (MR) se calculó la vida-media de degradación de CYP2D6. Tras una dosis de MDMA, el Cmax i AUC del dextrometorfano aumentó aproximadamente 10 veces con la correspondiente disminución en los parámetros farmacocineticos de dextrorfano. Se aumentó el MR casi 100 veces después de una dosis de MDMA, con un 67% de los sujetos superando la antimoda de 0.3 para la asignación del fenotipo de metabolizador lento de CYP2D6. La actividad de CYP2D6 se recuperó después de 10 días con una vida media de degradación de CYP2D6 de 46.6 h. La farmacocinética de la cafeína y sus metabolitos no fue afectada por la MDMA. Se debería avisar los consumidores de MDMA de las consecuencias de tal inhibición. A pesar de que hay muchas evidencias en animales sugiriendo que el MDMA es una neurotoxina serotonergica, todavía hay mucho debate sobre cuál es la causa de estos cambios cerebrales a largo plazo. La investigación apunta a la producción excesiva de especies reactivos de oxigeno (ROS) en el cerebro después de la administración de MDMA. La MDMA induce hipertermia, la liberación excesiva de dopamina cerebral y lleva a la desregulación energética del metabolismo. Conjuntamente, el metabolismo de MDMA produce un catecol reactivo, cuyos productos causan neurotoxicidad serotonergica en ratas. Cualquiera de los factores anteriores podrían ser la causa de la excesiva producción de ROS y los consecuentes cambios serotonergicos. A tenor de estas hipótesis, se investigó si diferentes temperaturas corporales afectarían el metabolismo de MDMA. Se administró MDMA a ratas a tres temperaturas ambientales distintas con el fin de prevenir o exacerbar la hipertermia inducida por MDMA. Se determinaron las concentraciones plasmáticas de MDMA y sus metabolitos principales durante las 6 h posteriores a la administración de la droga. Después de siete días, se sacrificaron los animales y se determinaron las cantidades de índoles cerebral. La administración de MDMA a 15ºC bloqueó la respuesta hipertermica y la disminución a largo plazo de 5-HT encontrada en ratas administradas a 21.5 ºC. A 15ºC, las concentraciones plasmáticas de MDMA aumentaron significativamente mientras que las concentraciones de sus metabolitos disminuyeron en comparación con ratas administradas a 21.5ºC. En contraste, la hipertermia y las deficiencias de indoles fueron exacerbadas en ratas tratadas a 30ºC. Se observó que las concentraciones plasmáticas de metabolitos de MDMA aumentaron significativamente en estos animales. La depleción a largo plazo de 5-HT no estuvo potenciada por la perfusión intrastriatal de MDMA después de una dosis sistémica de MDMA. Además, la interferencia del metabolismo de MDMA con la administración del inhibidor de catecol-o-metiltransferasa, entacapona, potenció la neurotoxicidad de MDMA, indicando que los metabolitos que son sustratos para este enzima podrían contribuir a la neurotoxicidad. Estos resultados tienen implicaciones tanto con el papel de la temperatura en el mecanismo del desarrollo de la neurotoxicidad del MDMA como en el abuso en humanos donde la hipertermia esta asociado con casos de toxicidad aguda. Se ha sugerido también que la causa de la depleción de 5-HT por MDMA es debido a un aumento de niveles de tirosina en el cerebro, cuyo hidroxilación no enzimática conduce a la formación de radicales libres derivados de la dopamina. En consecuencia, se propuso que el metabolismo de MDMA en compuestos pro-oxidantes fuera el paso limitante del proceso. En una serie de experimentos se encontraron niveles más altos de hipertermia aguda, concentraciones plasmáticas de tirosina, MDMA y sus metabolitos después de una dosis toxica de MDMA (15 mg/kg i.p.) versus una dosis no-toxica (7.5 mg/kg i.p.). La administración de una dosis no-toxica de MDMA (7.5 mg/kg i.p.) en conjunto con L-tirosina (0.2 mmol/kg i.p.) produció un aumento similar de niveles de tirosina en el suero con los niveles encontrados tras una dosis toxica de MDMA, sin embargo, los niveles de 5-HT cerebral permanecieron en niveles normales. Una dosis no-toxica de MDMA en combinación con una dosis alta de tirosina (0.5 mmol/kg i.p.) causó depleciones a largo plazo en ratas administradas a 21.5ºC pero no a 15ºC, condiciones conocidas por disminuir el metabolismo de MDMA. Al mismo tiempo, la perfusión estriatal de MDMA en combinación con tirosina (0.5 mmol/kg i.p.) en ratas hipertermicas no causaron depleciones de 5-HT. En contraste, se observaron reducciones significativas en 5-HT cerebral tras la administración de una dosis no-toxica de MDMA en ratas en condiciones de hipertermia en combinación con entacapona o acivisina, compuestos capaces de interferir con el metabolismo de MDMA o aumentar la disponibilidad de sus metabolitos en el cerebro, respectivamente. En conjunto estos datos indican que a pesar de que la tirosina y la hipertermia pueden contribuir a la neurotoxicidad inducida por la MDMA, el metabolismo de la droga parece ser el paso limitante.

Recientemente, el uso de técnicas de manipulación genética ha abierto la puerta a la obtención de microorganismos con fenotipos mejorados, lo que a su vez ha llevado a unas mejoras significativas en la síntesis de algunos productos bioquímicos. Sin embargo, la mutación y selección de estos nuevos organismos se ha llevado a cabo, en la mayoría de casos, por ensayo y error. Es de esperar que estos procesos puedan ser mejorados si se usan principios de diseño cuantitativos para guiar la búsqueda hacia el perfil enzimático ideal. Esta tesis está dedicada al desarrollo de un conjunto de herramientas de optimización avanzadas para asesorar en problemas de ingeniería metabólica y otras cuestiones emergentes en biología de sistemas. Concretamente, nos centramos en problemas en qué se modelan las redes metabólicas usando expresiones cinéticas. La utilidad de los algoritmos desarrollados para resolver tales problemas es demostrada por medio de varios casos de estudio. / In recent years, the use of genetic manipulation techniques has opened the door for obtaining microorganisms with enhanced phenotypes, which has in turn led to significant improvements in the synthesis of certain biochemical products. However, mutation and selection of these new organisms has been performed, in most cases, in a trial-and-error basis. It is expected that these processes could be further improved if quantitative design principles were used to guide the search towards the ideal enzymatic profiles. This thesis is devoted to developing a set of advanced global optimization tools to assess metabolic engineering problems and other questions arising in systems biology. In particular, we focus on problems where metabolic networks are modeled making use of kinetic expressions. The usefulness of the algorithms developed to solve such problems is demonstrated by means of several case studies.

Monoterpene secoiridoid biosynthesis contributes the terpene component of terpenoid indole alkaloids produced in the medicinal plant Catharanthus roseus. The thesis focuses on the development of fundamental knowledge and methodology to reconstruct the monoterpene secoiridoid pathway in tobacco plants using metabolic engineering. The thrust of the thesis concentrated on remaining challenges to engineer complex secondary metabolic pathways in plants. We focused on the early part of the pathway and we recovered a population of transgenic tobacco plants expressing different combinations of transgenes. Analysis at metabolomic and transcriptomic levels provided novel insights into remaining bottlenecks for the effective engineering of secondary metabolic pathways in plants. The experimental part of the thesis is complemented by the development of a systematic patent search to create an IP database with all relevant patents related with the engineering of terpenoid indole alkaloid pathway in plants. / La biosíntesi dels monoterpens secoiridoïdes aporta el compost terpè dels terpens índole alcaloides produïts per la planta medicinal Catharanthus roseus. La tesi es centra en el desenvolupament dels coneixements fonamentals i la metodologia per reconstruir la ruta metabòlica dels monoterpens secoiridoïdes en plantes de tabac mitjançant enginyeria metabòlica. La idea central de la tesi enfoca els reptes pendents de l'enginyeria de rutes metabòliques complexes en plantes. Centrant-nos en la primera part de la ruta, es va regenerar una població de plantes de tabac transgèniques expressant diferents combinacions de transgens. L'anàlisi a nivell metabolòmic i transcriptòmic ens proporciona nous coneixements per resoldre les dificultats que encara hi ha en l’enginyeria efectiva de les rutes metabòliques secundàries a les plantes. La part experimental de la tesi es complementa amb el desenvolupament d'una recerca sistemàtica de patents, per crear una base de dades de IP, amb totes les patents pertinents relacionades amb l'enginyeria de la ruta metabòlica dels terpens índole alcaloides en plantes. / La biosíntesis de monoterpenos secoiridoides aporta el compuesto terpeno de los terpenos índole alcaloides producidos por la planta medicinal Catharanthus roseus. La tesis se centra en el desarrollo de los conocimientos fundamentales i la metodología para reconstruir la ruta metabólica de los monoterpenos secoiridoides en plantas de tabaco mediante ingeniería metabólica. La idea central de la tesis enfoca en los retos pendientes de la ingeniería de rutas metabólicas complejas en plantas. Centrándonos en la primera parte de la ruta, regeneramos una población de plantas de tabaco transgénicas expresando diferentes combinaciones de transgenes. El análisis a nivel metabolómico y transcriptómico nos proporciona nuevos conocimientos para resolver las dificultades que todavía encuentra la ingeniería efectiva de las rutas metabólicas secundarias en las plantas. La parte experimental de la tesis se complementa con el desarrollo de una búsqueda sistemática de patentes, para crear una base de datos de IP, con todas las patentes pertinentes relacionadas con la ingeniería de la ruta metabólica de los terpenos índole alcaloides en plantas.

The effect of an imposed magnetic field on the thermal convection between rigid plates heated from below under the influence of gravity is numerically simulated in a computational domain with periodic horizontal extent. The numerical technique is based on solenoidal basis functions satisfying the boundary conditions for both velocity and induced magnetic field. The expansion bases for the thermal field are also constructed to satisfy the boundary conditions. The governing partial differential equations are reduced to a system of ordinary differential equations governing the time evolution of the expansion coefficients under Galerkin projection onto the subspace spanned by the dual bases. In the process, the pressure term in the momentum equation is eliminated. The system validated in the linear regime is then used for some numerical experiments in the nonlinear regime.

Segmentation of sub-cortical Gray Matter (GM) structures in magnetic resonance brain images is crucial in clinic and research for many purposes such as early diagnosis of neurological diseases, guidance of surgical operations and longitudinal volumetric studies. Unfortunately, the algorithms that segment the brain into 3 tissues usually suffer from poor performance in the sub-cortical region. In order to increase the detection of sub-cortical GM structures, an evolutionary hierarchical region merging approach, abbreviated as EHRM, is proposed in this study. Through EHRM, an intensity based region merging is utilized while merging is allowed to proceed among disconnected regions. Texture information is also incorporated into the scheme to prevent the region merging between tissues with similar intensity but different texture properties. The proposed algorithm is tested on real and simulated datasets. The performance is compared with a popular segmentation algorithm, which is also intensity driven: the FAST algorithm [1] in the widely used FSL suite. EHRM is shown to make a significant improvement the detection of sub-cortical GM structures. Average improvements of 10%, 36% and 22% are achieved for caudate, putamen and thalamus respectively. The accuracy of volumetric estimations also increased for GM and WM. Performance of EHRM is robust in presence of bias field. In addition, EHRM operates in O(N) complexity. Furthermore, the algorithm proposed here is simple, because it does not incorporate spatial priors such as an atlas image or intensity priors. With these features, EHRM may become a favorable alternative to the existing brain segmentation tools.

En esta tesis se establece un sistema de clasificación de los estuarios del Nordeste Atlántico europeo a través de una metodología jerárquica que permite identificar tipologías ecológicas a una escala regional y local y, a un mayor nivel de detalle, biotopos dentro de un mismo estuario. Dicha metodología se basa en un conjunto de descriptores abióticos que determinan la distribución de las comunidades biológicas del estuario en función de la escala espacial de trabajo. A escala regional se utilizan variables latitudinales y geográficas mientras que a escala local se emplean indicadores de detalle de la morfología e hidrología del estuario. La aproximación para clasificar los biotopos a varios niveles de detalle consiste en un procedimiento de integración jerárquica de diferentes variables ambientales. A partir de la caracterización biológica de los biotopos se definen ecotopos específicos del estuario, los cuales constituyen modelos predictivos de la distribución potencial de las especies. / In this thesis, a classification system of the estuaries located in the North-East Atlantic European region is established. A hierarchical approach is proposed to identify ecological typologies at a regional and local scale and, at a higher level of detail, biotopes within an estuary. This methodology is based on a set of abiotic descriptors that determine the distribution of the biological communities in estuaries depending on the spatial scale. Latitudinal and geographic variables are proposed in order to classify estuaries at a regional scale, while indicators of morphology and hydrology of these systems are used at a local scale. The approach to classify biotopes at different levels of detail consists of a hierarchical integration of environmental variables representative of the corresponding spatial scale. The biological characterization of biotopes allows defining ecotopes, which are predictive models of the potential distribution of species within estuaries. / modelos predictivos