Primera, estudiar los efectos de un extracto de cacahuete rico en polifenoles y de compuestos bioactivos (alfa-tocoferol) en modelos celulares a nivel de inflamación (células monocíticas THP-1) y disfunción endotelial (células endoteliales de aorta humana; HAEC), respectivamente. Segunda, optimizar el volumen sanguíneo caracterizando el perfil de metabolitos acuosos y lipídicos, la composición de ácidos grasos, la detección de subclases de lipoproteínas y de polifenoles en plasma y glóbulos rojos. El extracto de cacahuete ejerce efectos anti-inflamatorios mediante la inhibición de la proteína del TNF-α extracelular, a través de la inhibición de la activación del factor de transcripción c-Jun. El alfa-tocoferol mejora la función endotelial mediante la inhibición de la VCAM-1 y en menor grado sobre la E-selectina e ICAM-1. El plasma y glóbulos rojos aportan información metabolómica complementaria y se elegirá uno u otro en función del objetivo de los estudios en humanos. / The thesis addresses two major issues. Firstly: The study the effects of polyphenol-rich peanut extract and bioactive compounds (alpha-tocopherol) in cellular models of inflammation (monocytic cells; THP-1) and on endothelial dysfunction (human aortic endothelial cells; HAEC), respectively. Secondly: The optimisation of blood sampling for human studies to characterise the profile of aqueous and lipid metabolites, fatty acid composition, lipoprotein subclasses, and polyphenol content of plasma and red blood cells. Peanut extract exerts anti-inflammatory effects by inhibiting extracellular TNF-α protein via the inhibition of c-Jun transcription factor activation. Alpha-tocopherol improves endothelial function by inhibiting VCAM-1 and, to a lesser extent, E-selectin and ICAM-1. Analyses of metabolites in plasma and red blood cells generate complementary information. The measurements may need to be performed in either, or both, matrices, depending on the objectives of the study.

Las células malignas deben adquirir un potencial de replicación ilimitado (inmortalidad celular) para la formación de tumores avanzados. La adquisición de inmortalidad celular depende de la reactivación de la telomerasa, una enzima que permite compensar el problema de replicación terminal del ADN asociado a cada división celular. En una serie de estudios presentados en esta tesis, se demuestra:1. La telomerasa es una enzima regulable en células tumorales humanas.2. Los tumores humanos expresan actividad telomerasa y su expresión se asocia a estadío tumoral, índice proliferativo y diferenciación3. La telomerasa es una diana antitumoral atractiva. / Malignant cells have to acquire a limitless replicative potential (immortality) to be able to form an advanced tumor. The acquisition of cellular imortality is linked to the reactivation of telomerase, an enzyme that has the potential to overcome the DNA end replication problem that occurs during each round of cell división. In a series of studies presented in this thesis, it has been shown:1. Telomerase is a regulable enzyme in human tumor cells.2. Human tumors express telomerase activity and this expresión is asóciate to tumor stage, proliferative index and maturation.3. Telomerase is an attractive anticancer targe._

El sulfonato de perfluorooctano (PFOS) es un compuesto orgánico ampliamente utilizado en la industria como agente surfactante. Varios estudios ambientales han mostrado que el PFOS es un contaminante global, persistente y bioacumulativo, cuyos niveles en la población y en el medio ambiente son en la actualidad un riesgo potencial. Sin embargo, los efectos tóxicos del PFOS no han sido aún bien caracterizados. Se considera que este compuesto es un posible disruptor endocrino con efectos sobre los niveles de hormonas tiroideas y glucocorticoides. Por otra parte, se ha demostrado que el estrés materno produce efectos adversos sobre la madre y el desarrollo pre y postnatal de la descendencia, estos incluyen alteraciones en el aprendizaje en machos y alteraciones en el comportamiento en respuesta a situaciones estresantes. No obstante, el patrón de efectos derivados de la exposición a estrés durante la gestación depende del periodo de exposición y el tipo/intensidad del estresor. Son varias las investigaciones que demuestran que algunas sustancias químicas pueden modular los efectos del estrés materno, y a la inversa, el estrés materno puede modificar los efectos de ciertas sustancias químicas, en especial cuando estas se administran a dosis relativamente elevadas. Por lo tanto, el estrés y el PFOS podrían compartir mecanismos de acción comunes, lo que podría incrementar el riesgo de interacciones toxicológicas entre estos dos factores. El objetivo de la presente tesis es evaluar los efectos del PFOS, del estrés prenatal y de una posible interacción entre ambos factores sobre la toxicidad materna, el desarrollo pre y postnatal y la conducta de la descendencia, además de valorar la conducta en sujetos adultos tras la exposición a PFOS. Se utilizaron ratones albinos, cepa CD1. Con el objetivo de determinar la toxicidad materna y embriofetal, se administró 0, 1.5, 3 ó 6 mg/kg/día de PFOS vía oral (Días de Gestación 6-18) a hembras que mostraron presencia de tapón vaginal. La mitad de animales de cada grupo fue expuesta a estrés por inmovilización 30 minutos, 3 veces al día. Con el objetivo de determinar la toxicidad sobre el desarrollo postnatal y el comportamiento a largo plazo, se administró vía oral 0 ó 6 mg/kg/día a hembras con tapón vaginal durante los DG 12-18. La mitad de animales de cada grupo fue sujeta, a la vez, a estrés por inmovilización durante 30 minutos, 3 veces al día, durante el mismo periodo.Con el objetivo de determinar los efectos del PFOS sobre el comportamiento en la edad adulta, se administró 0, 3 ó 6 mg/kg/día de PFOS vía oral a ratones machos adultos durante 4 semanas consecutivas. Los resultados de la presente tesis muestran que la exposición a PFOS y a estrés por inmovilización produce efectos maternotóxicos. No existen efectos de potenciación entre estos dos factores sobre la toxicidad materna. Se observó que el PFOS aumenta la mortalidad prenatal. El estrés materno, a su vez, incrementó la mortalidad prenatal en el grupo expuesto a la dosis de PFOS más baja. La exposición simultánea a PFOS y estrés por inmovilización durante la gestación produce efectos opuestos sobre el desarrollo postnatal de la descendencia. Estos efectos consisiten en una tendencia hacia un retraso general en la maduración, por parte del PFOS, y un patrón de maduración general acelerada, por parte del estrés prenatal. A pesar de que la interacción entre la administración de PFOS y estrés prenatal no causó efectos adversos sobre la maduración física o el desarrollo neuromotor, esta causó alteraciones en el comportamiento en la edad adulta. El efecto más remarcable, producido tras la administración de PFOS a ratones adultos, fue el deterioro en la retención de una tarea espacial. / Perfluorooctane sulfonate (PFOS) is a persistent and bioaccumulative pollutant that can be released from several fluorochemicals by. The surfactant properties of this chemical have made it desirable for extensive use in industrial and commercial applications including surface protection, paper and food- package treatment, and lubricants. A number of recent studies have shown the presence of PFOS in blood samples from occupationally and non-occupationally exposed humans. Studies focused on the developmental effects of oral PFOS during pregnancy have shown dose-dependent adverse effects in rodents. Maternal and developmental toxicity were observed as reductions in maternal weight gain, reductions in fetal body weight, and delays in developmental landmarks and neuromotor maturation. Prenatal and postnatal mortality have been also reported. The toxicological profile of PFOS in adult rodents shows a significant weight loss accompanied by hepatotoxicity and reduced levels of serum cholesterol and triglycerides. However, the potential toxicity of PFOS has not been completely characterized yet. On the other hand, it has been established that gestational stress during a critical period of the embryonic development may modify gestational parameters and produce longlasting alterations in the behavior of the offspring. The presence and persistence of such adverse effects depend on factors such as the exact timing of exposure to stress of the dam and the type and intensity of stressor.It has been reported that some chemicals can alter the effects of maternal stress and, conversely, maternal stress can modify the potential adverse effects of some contaminants, in particular when they have been administered at high doses. The purpose of the present study was to evaluate whether maternal stress can modify the potential adverse effects of prenatal oral exposure to PFOS in mice.In order to assess the maternal and developmental toxicity of combined exposure to restraint stress and perfluorooctane sulfonate in mice, four groups of plug-positive female mice were orally exposed to PFOS at 0, 1.5, 3 and 6 mg/kg/day during gestation days 6-18. Four additional groups of plug-positive animals received the same PFOS doses being restrained during 30 min three times per day. Cesarean sections were performed on Day 18 of gestation and fetuses were weighed and examined for external, internal and skeletal malformations and variations. Before sacrifice of the dams, blood was collected and serum samples were prepared for thyroid hormones (total and free T3 and T4) and corticosterone analyses. In order to assess the combined effects of maternal restraint stress and (PFOS) on postnatal development and behavior of the offspring, thirty-four plug positive females were randomly divided into two groups. Animals were given by gavage 0 and 6 mg PFOS/kg/day on gestation days 12-18. One-half of the animals in each group was subjected to restraint stress (30 min per session, three sessions per day) during the same period. At 3 months of age, the offspring was evaluated for general activity in an open-field, and for learning and memory in a water maze task. After behavioral testing, serum was collected for corticosterone analyses. In order to assess the behavioral effects of PFOS on adult mice, thirty adult mice were divided into three groups. Animals were given by gavage 0, 3, and 6 mg PFOS/kg/day for four consecutive weeks. After the treatment period, mice were evaluated for several skills by testing motor and sensory function by means of a functional observation battery (FOB), general activity and exploratory behavior in an open-field, and learning and memory in a water maze task. One week after behavioral testing, serum was collected for corticosterone analyses. The results of the present study show that both PFOS and restraint stress induced maternal toxicity. PFOS-induced adverse effects on maternal and fetal toxicity in mice were observed at lower doses than those previously reported. Pups of dams exposed to 6 mg/kg of PFOS showed a reduced body weight. Moreover, PFOS exposure induced some delay in developmental landmarks and neuromotor maturation. The current results indicate that concurrent exposure to PFOS and restraint stress during pregnancy induces opposite effects on developmental parameters in the pups. These effects consist in a general delayed maturation trend induced by PFOS exposure, and a general accelerated maturation pattern induced by prenatal stress. Our results suggest interactive deleterious effects between PFOS and maternal stress on the behaviour of the offspring. Our results indicate that PFOS exposure induced only slight behavioral effects in adult male mice. In the retention test, a deleterious effect of PFOS was noted.

El objetivo principal de este trabajo es mostrar como se puede explicar la evolución cultural en un marco darwinista naturalisticamente aceptable. Para hacer esto, he considerado en primer lugar las principales teorías que se proponen el mismo objetivo: la sociobiología y la memética. En relación a la primera, he mantenido la idea de que los fenómenos culturales dependen a largo plazo de un condicionamiento biológico. En relación a la segunda, he aceptado que existe un sentido en el que la adaptación no es simple incremento de fitness. Mi segundo objetivo es explicar por qué ciertos fenómenos culturales, las maladaptaciones, no son adaptativas como "incremento de fitness", y presentar y aplicar un esquema explicativo que justifique los fenómenos culturales en un nuevo sentido adaptativo. Para articular estas tesis, he utilizado los trabajos de Boyd y Richerson y he introducido la distinción propia entre adaptaciones de primer y de segundo orden. / The main objective of this work is to show how can we explain culture within a general Darwinian, naturalistically acceptable framework. To do so, I first reconsider the two main theories that have been proposed with a similar goal: sociobiology and memetics. Concerning the first one, I preserve the idea that every cultural event depends in the long run on a pure biological conditioning. Regarding the latter, I accept that there is a sense of adaptation different from simple development of fitness. My second task is to explain why certain cultural phenomena, maladaptations, are not adaptive in the "increase of fitness" sense, and present and apply an explanatory scheme that accounts for cultural phenomena in a new adaptative manner. In order to articulate these theses in a new proposal, I make use of some work by Boyd and Richerson and introduce the main distinction between first and second order adaptations.

En els darrers anys, les millores tant a nivell de maquinari com a nivell de programari han suposat un gran avenç, per la química computacional, ajudant-la a estar cada vegada més a prop dels problemes reals de la química i la bioquímica.Així doncs, si fins fa uns anys per descriure un sistema només es podia fer amb un nombre molt limitat d'àtoms, actualment la millor eficiència dels mètodes de mecànica quàntica (QM) i la possibilitat de fer càlculs híbrids (QM/MM), barrejant la mecànica quàntica amb la molecular (MM), fan créixer enormement les possibilitats de càlcul.En aquesta tesi es recullen alguns exemples d'aplicacions dels mètodes QM i QM/MM de la química computacional en diferents situacions de sistemes orgànics (estabilitat dels 4-ehlicens, síntesi assimètrica de 5-helicenoquinones i l'ús de salts de guanidini com a catal·litzadors ens organocatàl·lisi) i de sistemes bioinorgànics (estudi de les format deshidrogenases per entendre l'efecte del seleni i el metall en el centre actiu). / The application of computational chemistry has been expanding in recent years. It is due the huge increase of the available computer resources and the improvement of more effective software. It helps the computational chemistry to become increasingly closer to understand and solve key chemical problems.Some years ago, only small systems with a reduced number of atoms can be studied. Nowadays, the better efficiency of the quantum mechanics methods (QM) plus the possibility to work with hybrid (QM/MM), mixing quantum mechanics and molecular mechanics methods, implies a huge increment of possibilities.In this thesis, some applications of QM and QM/MM are summarized and different organic (thermal stability of 4-helicenes, asymmetric synthesis of 5-helicenequinones and the application of guanidinium salts derivatives as organocatalyst) and bioinorganic (study the role of selenium and molybdenum or tungsten in the active center of the formate dehydrogenases enzymes) have been studied.

La inflamació s’ha considerat tradicionalment com un mecanisme de defensa, molt lligat a la supervivència de l’espècie, per la seva capacitat de combatre les infeccions o restaurar el dany produït. No obstant, un estat d’inflamació crònic produeix un efecte totalment contrari, que s’associa a un mal funcionament de teixits i òrgans. L’objectiu d’aquest treball és l’estudi de la proteïna quimioatraient de monòcits-1 (MCP-1), una proteïna descrita per la seva funció en l’atracció de monòcits a la lesió arterioscleròtica, i que pot tenir un paper rellevant en el metabolisme. Els resultats mostren que MCP-1 està implicada en el control del metabolisme dels lípids i de la glucosa, i que l’expressió hepàtica de MCP-1 està sobre-expressada per la dieta i que contribueix al desenvolupament i progressió de l’esteatosi hepàtica en el model LDLr-/-. Precisament, l’últim treball demostra que l’estudi dels canvis metabolòmics en el teixit hepàtic ens pot ajudar a entendre aquesta patologia / Inflammation has been traditionally regarded as a defense mechanism, closely linked to the survival of the species for their ability to fight infections or restore the damage. However, a state of chronic inflammation produced a completely opposite effect, which is associated with tissue and organ malfunction. The aim of this work is the study of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), a protein described by its role in attracting monocytes to atherosclerotic lesions, which may also play an important role in metabolism. The results show that MCP-1 is involved in the control of lipids and glucose metabolism. Hepatic MCP-1 is over-expressed by diet and contributes to the development and progression of fatty liver disease (NASH) in LDLr-/- model. Indeed, the latest study shows that metabolomic changes in the liver can help us to understand the NASH progression.

Se estudiaron los géneros Scedosporium, Acremonium, Phialemonium, Lecythophora y Paecilomyces. En Scedosporium se seleccionó la mejor herramienta para la tipificación de S. aurantiacum y S. prolificans. En los otros géneros se estudiaron la identificación morfológica y molecular para establecer el espectro de especies y sus relaciones filogenéticas. Los resultados indican que el sistema basado en la secuenciación multilocus es la mejor metodología para la tipificación de Scedosporium. Se ha establecido el espectro de las especies asociadas a muestras clínicas de los Estados Unidos, siendo Acremonium kiliense, el complejo Acremonium sclerotigenum-Acremonium egyptiacum, Acremonium implicatum, Phialemonium obovatum, Phialemonium curvatum, Lecythophora hoffmannii, Cephalotheca foveolata y Lecythophora mutabilis las especies más encontradas. Se propone el nuevo género Phialemoniopsis. Se transfiere Sarcopodium oculorum y Phialemonium curvatum a Phialemoniopsis, y Acremonium atrogriseum y Taifanglania inflata a Phialemonium. Se proponen las nuevas especies: Phialemoniopsis cornearis, Phialemoniopsis pluriloculosa, Phialemonium globosum, Lecythophora luteo-rubra, Lecythophora cateniformis y Paecilomyces lavendulus. / Scedosporium, Acremonium, Phialemonium, Lecythophora and Paecilomyces were studied. In Scedosporium, the study has focussed on choosing the best tool for the characterization of S. aurantiacum and S. prolificans. As for the other genera, studies have focussed on morphological and molecular identification. The results showed that the system based on multilocus sequencing is the best methodology for the characterization of Scedosporium. By correlating the results obtained by morphological and molecular techniques, we have been able to establish the species associated with clinical samples from the United States, Acremonium kiliense, complex Acremonium sclerotigenum-Acremonium egyptiacum, Acremonium implicatum, Phialemonium obovatum, Phialemonium curvatum, Lecythophora hoffmannii, Cephalotheca foveolata and Lecythophora mutabilis being the most found species. We proposed Phialemoniopsis as a new genus. We transferred Sarcopodium oculorum and Phialemonium curvatum to Phialemoniopsis, and Acremonium atrogriseum and Taifanglania inflata to Phialemonium. We proposed the new species: Phialemoniopsis cornearis, Phialemoniopsis pluriloculosa, Phialemonium globosum, Lecythophora luteo-rubra, Lecythophora cateniformis and Paecilomyces lavendulus.

El principal objetivo de la Tesis Doctoral es el estudio en profundidad de poblaciones de Pseudomonas presentes en el ambiente. Para ello se ha realizado una prospección de los aislamientos de Pseudomonas procedentes de diversos hábitats. Se han analizado muestras en suelos agrícolas, arenas de la zona intermareal, aguas freáticas y aguas de ríos. Los aislados de Pseudomonas aeruginosa procedentes de muestras ambientales, se han comparado con los aislados clínicos procedentes del Hospital Universitario Son Dureta. Se han aplicado distintas metodologías en el análisis de estos estudios. Métodos dependientes de cultivo, basados en metodología tradicional, y métodos independientes de cultivo basados en nuevos métodos moleculares. Estos últimos incluyen: tipado de secuencias multilocus, secuenciación con cebadores específicos y análisis de DNA total procedente de muestras ambientales por clonación y pirosecuenciación con cebadores específicos. Esta última metodología se ha aplicado por primera vez en muestras ambientales de la manera realizada en esta Tesis. La genómica comparativa se ha aplicado para evaluar la diversidad intraclonal. Se ha estimado el potencial de nuevas metodologías moleculares como la clonación, pirosecuenciación, y estudio de genomas, aplicándolo al análisis de la diversidad de las especies de Pseudomonas. Los datos obtenidos nos permiten tener una amplia perspectiva de estos métodos aplicados a la ecología y taxonomía del género Pseudomonas. En el primer capítulo, se ha analizado la estructura y microdiversidad de 53 aislamientos de muestras ambientales y clínicas de Mallorca (España), mediante el análisis de secuencias multilocus (MLST). Patrones de multiresistencia a distintos antibióticos, solo se hallaron en aislamientos de origen clínico. El elevado número de nuevos alelos y secuencias tipo, halladas en una misma área, refleja la gran diversidad de las poblaciones de P. aeruginosa. A todo ello deben sumarse los índices de diversidad que también indicaron la alta diversidad de la población estudiada. Los tests de clonalidad demostraron que la recombinación juega un papel esencial en la distribución de los alelos. La secuencia tipo ST-1146 fué la única secuencia hallada en los dos tipos de muestras, tres aislamientos en muestras ambientales y un aislado clínico con distinto perfil de resistencia a antibióticos. En el segundo capítulo, los cuatro genomas de los aislados ST-1146 fueron secuenciados y ensamblados de novo. Los resultados indicaron que el número de genes propios del aislado clínico (SD9) era superior al de los aislados de origen ambiental (P37, P47 y P49). Genes relacionados con el bacteriófago Pf1 y otros relacionados con los bacteriófagos F116 y H66 solo se hallaron en SD9 pero no en las otras cepas del ST-1146 de origen ambiental. Los genes relacionados con el bacteriófago Pf1 de SD9 presentaron un elevado número de mutaciones respecto a los aislados de origen ambiental. La comparación genómica demostró que los aislados ST-1146 están estrechamente relacionados y los genes relacionados con la patogenicidad estudiados estaban conservados. El número de alelos exclusivos de SD9 fue 2,5 y 3,6 veces superior a los aislados de origen ambiental, al compararse todos ellos con los genomas de referencia de las cepas P. aeruginosa PAO1-UW y UCBPP-PA14. En el tercer capítulo, el río Woluwe se tomó como hábitat modelo para el estudio de la diversidad de las especies del género Pseudomonas. Una muestra de agua no contaminada se analizó por métodos dependientes e independientes de cultivo. La identificación de los aislados de Pseudomonas se analizó por secuenciación y análisis de los cebadores del gen rpoD. Los métodos independientes de cultivo se basaron en la clonación y pirosecuenciación del amplicón del gen rpoD obtenido con los cebadores selectivos para dicho gen en Pseudomonas: PsEG30F-PsEG790R. Cabe destacar el elevado número de cepas de Pseudomonas obtenidas en las muestras por los tres métodos de análisis: 26 especies distribuidas en 13 grupos o subgrupos filogenéticos. La pirosecuenciación ha sido el mejor método de los utilizados; las secuencias obtenidas correspondieron a 24 de las especies totales observadas, con la excepción de P. stutzeri y P. simiae. El grupo filogenético predominante fue Pseudomonas fluorescens. En todos los métodos de análisis se halló un gran número de posibles nuevas especies indicando una enorme diversidad del género, no descrita hasta el momento. En el cuarto capítulo, se aislaron cepas de Pseudomonas de muestras ambientales procedentes de suelos y zonas intermareales. En el proceso de identificación algunos de estos aislamientos no han podido ser asignados a especies conocidas de Pseudomonas considerándose como posibles nuevas especies. En el análisis de secuencias multilocus se incluyeron cepas procedentes de nuestra colección del laboratorio de Microbiología de la “Universitat de les Illes Baleares”. El análisis de secuencias multilocus demostró que varios aislados podrían corresponder a 3 nuevas especies (6, 5 y 1 aislados de cada especie). La confirmación de estos resultados requerirá posteriores análisis. Otros cuatro aislados fueron estudiados mediante su caracterización morfológica, fisiológica, bioquímica, quimiotaxonómica y genómica. Estos estudios demostraron que los aislados no podían ser asignados a ninguna especie conocida de Pseudomonas por lo que se han propuesto dos cepas nuevas: Pseudomonas aestusnigri (cepa VGXO14T = CECT 8317 T = CCUG 64165 T) y Pseudomonas terricola (cepa S58 T = CECT 8389 T = CCUG 64415 T). / The main goal of the present work is a thorough study of the diversity of Pseudomonas populations present in several habitats. In chapter one, the population structure and microdiversity of 53 Pseudomonas aeruginosa isolates from environmental samples and clinical specimens obtained in Mallorca (Spain) has been analyzed by a multilocus sequence typing approach (MLST). Antibiotic multiresistance to several antibiotics was only found in isolates of clinical origin. The high number of new alleles and new sequence types found in a limited area reflects the great diversity of P. aeruginosa populations and the high plasticity of a paradoxically phylogenetic conserved genome of P. aeruginosa. The calculated genetic diversity index also demonstrated the high diversity of the population under study. Clonality tests demonstrated that recombination plays a key role in the distribution of alleles. The ST-1146 was the only one found in both kind of samples, 3 environmental isolates (from the same site isolated at 2 different dates) and 1 clinical isolate, with differences in its antibiotic susceptibility profile. For this reason, the 4 genomes of newly described sequence type ST-1146 have been sequenced and analyzed. In the second chapter, the four genomes of ST-1146 were obtained and the sequences assembled de novo and compared with the CD-HIT program. Results showed that the number of isolate-specific genes was higher in the clinical isolate (SD9) than in environmental isolates (P37, P47 and P49). Some genes related to phage Pf1 and to other phages similar to bacteriophages F116 and H66 were found in isolate SD9 but not in the other isolates of ST-1146. The bacteriophage Pf1 region in isolate SD9 accumulated the highest number of mutations in comparison with the environmental isolates. Comparative genomic methods indicated that the isolates of ST-1146 are closely related, and most genes implicated in pathogenicity are highly conserved in the environmental isolates, suggesting the genetic potential for infectivity similar to that of the clinical isolate. Moreover, the four genomes were mapped against the reference genomes of P. aeruginosa PAO1-UW and UCBPP-PA14. A mutational profile was performed as a result of each comparison. The clinical isolate showed in both comparisons a number of exclusive alleles 2.5 and 3.6 times greater than the environmental isolates. These results suggest that the mutation pressure is not the same in the environmental isolates than in the clinical one. In the third chapter, the River Woluwe has been taken as a model habitat for the study of the diversity of species in the genus Pseudomonas. A water sample from a non-contaminated site at the source of the river was analyzed by culture-dependent and –independent methods. Identification of the Pseudomonas isolates was performed by sequencing and analysis of their rpoD sequence. Culture-independent methods consisted of a cloning and pyrosequencing of a specific rpoD amplicon obtained from total DNA extracted from the same sample and amplified by Pseudomonas rpoD primer set EGPsF340-EGPsR 780. It was remarkable the number of known species detected in the sample by the three different methods: 26 species distributed in 13 phylogenetic groups or subgroups within the genus. Pyrosequencing was the more powerful analysis; sequences obtained represented the 24 species with the exception of P. stutzeri and P. simiae. The predominant phylogenetic group within the Pseudomonas genus was Pseudomonas fluorescens group in the cultures and in the culture-independent analysis. In all analysis a high number of putative novel species were found indicating the enormous diversity not described yet. In the fourth chapter, several Pseudomonas strains have been isolated from environmental samples, from soil and intertidal habitats. In the identification process, some of these strains have not been assigned to known Pseudomonas species and were considered members of putative novel species. In their phylogenetic characterization by MLSA we found that strains in the culture collection of our laboratory were close-related and therefore they were also included in the taxonomic characterization of these putative novel species. MLSA demonstrated that 3 putative novel species were represented by 6, 5 and 1 strains respectively, which will be the subject of additional studies. Four other strains were deeply studied by a taxonomic polyphasic approach, including morphological, physiological, biochemical, chemotaxonomic and genomic characterizations. These studies demonstrated that the four strains cannot be assigned to any of the known Pseudomonas species and we propose the creation of two novel species, Pseudomonas aestusnigri (strain VGXO14T = CECT 8317 T = CCUG 64165 T) and Pseudomonas terricola (strain S58 T = CECT 8389 T = CCUG 64415 T).

En esta Tesis Doctoral, hemos caracterizado el papel de un conjunto de estructuras de la superficie de Haemophilus influenzae (HiNT) como factores de virulencia implicados a distintos niveles del proceso infeccioso, mediante el empleo de mutantes generados en el laboratorio y de aislados clínicos. Hemos analizado la heterogeneidad fenotípica de aislados clínicos de HiNT respecto a su resistencia al ataque bactericida de péptidos antimicrobianos, a su interacción con superficies abióticas y epiteliales, y a mecanismos moleculares de subversión del epitelio respiratorio empleados por el patógeno durante los procesos de adhesión e invasión epitelial. Asimismo, el análisis de este repertorio de fenotipos asociados a virulencia en una batería de cepas mutantes que carecen de estructuras superficiales del patógeno, incluyendo modificaciones del lipopolisacárido y adhesinas de naturaleza proteíca, nos ha permitido establecer una asociación directa entre moléculas bacterianas y elementos de la inmunidad innata del hospedador. Por otra parte, hemos diseccionado la implicación de un conjunto de moléculas eucariotas en la invasión del epitelio respiratorio humano por HiNT, mediante la infección de células epiteliales humanas en cultivo en combinación con la interferencia de moléculas eucariotas ad hoc. Mediante esta disección, presentamos un modelo que integra un conjunto de eventos moleculares, incluyendo receptores y elementos de cascadas de señalización eucariota con un papel esencial en la invasión epitelial por este patógeno respiratorio. En conjunto, la identificación de moléculas, tanto bacterianas como celulares, implicadas en la infección por HiNT nos ha permitido ampliar nuestro conocimiento sobre la patogénesis de HiNT, así como la identificación de potenciales dianas terapeúticas para combatir la infección por este patógeno respiratorio.

Water availability is one of the biggest constraints limiting the plant growth and species distribution around the world. This is the case in the Mediterranean region where, moreover, the frequency and amount of rainfall will decrease due to global warming. This will provoke longer periods of drought and a general decrease of water availability. In this context, one of the most vulnerable crops is grapevine. This crop has been traditionally rain-feed, although in recent years it’s becoming an irrigated crop. This increases the demand to regulate the water use by more precise irrigation techniques based on the plant water status. A good physiological indicator that allows knowing the plant water status is stomatal conductance. Although it is widely known the importance of the stoma, there is not an accurate model to predict their behavior as many physiological and environmental parameters co-regulate it. The aims of this thesis are to: a) study the physiological mechanisms regulating stomatal conductance, b) apply a process-based model to predict the behavior of stomatal conductance c) use this model as tool to better understand the physiological stomatal regulation along the canopy. Results show that stoma has a strong regulation by hydraulic conductance being a key physiological parameter regulating water use. In addition, abscisic acid and osmotic adjustment are also playing an important role in their regulation. On the other hand, the mechanistic model of stomatal conductance has been validated predicting with a good accuracy the variations throughout the day and season in well water and water stress conditions. At time, because this model is based on physiological parameters permits to infer about the relevance of those physiological parameters under water stress, predicting that hydraulic conductance has a main role on the regulation of stomatal conductance in different parts of the canopy.