Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes. Bei den zu Tode führenden Tumoren wird es im Jahre 2003 nach dem Bronchialkarzinom an 2. Stelle stehen. Diese Inzidenz zeigt, dass dringend neue diagnostische Marker und therapeutische Zielgene zur Behandlung von Prostatakrebs benötigt werden. Ziel dieser Dissertation war es, mit Hilfe der DNA-Chiptechnologie neue tumorrelevante Gene für eine Small-Molecule- und Antikörper-Basierte Therapie des Prostatakarzinoms zu identifizieren. Auf einen proprietären Tumor-Chip der Firma metaGen Pharmaceuticals GmbH wurde mikrodissektiertes Normal- und korrespondierendes Tumorgewebe von 52 Prostatatumorpatienten hybridisiert. Mit Hilfe bioinformatischer Analysen der Chipergebnisse konnte das Gen TRPM8 identifiziert werden, das in Prostatatumoren in mehr als 56% der Patienten überexprimiert ist. Northern-Blot, Dot-Blot und Chipexperimente zeigten, dass TRPM8 ungewöhnlich gewebespezifisch exprimiert wird. In mehr als 400 getesteten Tumorpatienten und in 23 Normalgeweben wurde TRPM8 ausschließlich in der Prostata und neuroendokrinen Tumoren nachgewiesen. TRPM8 gehört zur Familie der Transient Receptor Potential Channel Proteins. Es konnte hier erstmals in Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-Experimenten (FRET) gezeigt werden, dass TRPM8 Multi-Homomere bildet. Dies wurde bisher nur für Kanäle anderer TRP-Subfamilien (TRPV und TRPC) gezeigt. Weiterhin konnten erstmals mehrere Spleißvarianten von TRPM8 identifiziert werden. Quantitative RT-PCR Experimente zeigten, dass diese noch stärker in Prostatatumoren überexprimiert sind als TRPM8 selbst. Des Weiteren wurde ein neues Gen auf dem DNA-Gegenstrang von TRPM8 entdeckt, das mit Exon 11 von TRPM8 100% komplementär ist und an der Regulation von TRPM8 beteiligt sein könnte. Der Promotor von TRPM8 wurde durch eine in silico Analyse identifiziert und in vitro bestätigt. Obwohl eine starke androgenabhängige Expression von TRPM8 in LNCaP Zellen gezeigt werden konnte, wurden keine Bindungsstellen für androgenabhänginge Elemente gefunden. Allerdings ließen sich drei Bindungsstellen des androgenregulierten Homeoboxgens NKX3.1 identifizieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass TRPM8 und seine Isoformen aufgrund ihrer Gewebspezifität ausgezeichnete Angriffspunkte für eine zielgerichtete Prostatakrebstherapie sind. / Prostate cancer is the most commonly diagnosed malignancy in men in the Western World. In 2003 malignancies of the prostate will be the second most common fatal cancer in men after lung cancer as estimated by the American Cancer Society. Despite the tremendous efforts made in the past to improve the treatment of prostate cancer patients, there is still an urgent need for new markers and therapeutic targets for medication. The aim of this thesis was the identification of new genes relevant in prostate cancer, which could be used in a small-molecule or antibody based therapy of prostate cancers. Microdissected matched prostate cancer and normal tissues of 52 prostate cancer patients were hybridized to a proprietary high density Cancer-Chip based on Affymetrix GeneChip technology. Using a bioinformatic analysis, it was possible to identify TRPM8, which was highly overexpressed in 56% of prostate cancer patients. Northern blot, dot blot and gene chip experiments revealed that TRPM8 expression is extremely tissue specific. Of 400 patients and 23 tissues tested, TRPM8 expression could only be detected in the prostate and neuroendocrine tumors. Functionally, the protein belongs to the transient receptor potential channel family of non-voltage gated proteins. It could be shown for the fist time that TRPM8 subunits form homomers using FRET technology. Molecular characterization of TRPM8 transcription revealed multiple splice forms of TRPM8. Further, it was possible to identify a new mRNA present on the opposite strand of TRPM8, which was 100% complementary to exon 11 of TRPM8, thus it could possibly function as a regulatory RNA of TRP channel. All of these isoforms were found to be even higher overexpressed in prostate tumors than TRPM8 itself. The promoter region of TRPM8 was identified using in silico methods and confirmed in promoter reporter assays. Although a high androgen dependent transcriptional activation of TRPM8 could be found by RT-PCR in LNCaP cells, no androgen responsive elements was identifiable within the promoter region. On the other hand three binding sites for the androgen dependent homeobox gene NKX3.1 and several other homeobox genes were discovered. The results of the thesis show that TRPM8 and its isoforms are, due to their tissue specificity, ideal targets for the development of new therapeutic drugs for the treatment of prostate cancer.

Die Tryptophanhydroxylase (TPH) katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Synthese des wichtigen Neurotransmitters Serotonin. Kürzlich wurde ein zweites TPH-Isozym, die TPH2, entdeckt. Es stellte sich heraus, dass dieses Isozym für die Serotoninsynthese im Zentralnervensystem verantwortlich ist, wohingegen die TPH1 lediglich der Ausgangspunkt der Serotoninsynthese in den peripheren Geweben ist. Da Störungen im Serotoninstoffwechsel mit einer Vielzahl von psychiatrischen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden, rückt nun die als neuronales Enzym identifizierte TPH2 in den Fokus der Forschung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass TPH1 und 2 sich nicht nur in ihren Expressionsorten sondern auch in ihren grundlegenden biochemischen Eigenschaften voneinander unterscheiden. Die TPH1 stellte sich als aktiveres der beiden Enzyme heraus. Der N- und C-Terminus der TPH2 konnten als auf die Aktivität des Enzyms inhibierend bzw. aktivierend wirkende Strukturen identifiziert werden und stellen damit interessante Angriffspunkte für die pharmakologische Beeinflussung dar, wobei der N-Terminus als TPH2-spezifische Struktur eine gezielte Beeinflussung des serotonergen Systems im Zentralnervensystem ohne Auswirkungen auf das periphere System ermöglichen würde. In weiteren Projekten konnte die Existenz von mindestens zwei, die Enzymaktivität nicht beeinflussenden Proteinkinase A-Phosphorylierungsstellen in der TPH2 nachgewiesen werden, es konnte ein auf einem fluorometrischen Prinzip basierender High-Throughput-Assay zur Bestimmung der TPH-Aktivität entwickelt werden, Tubulin beta2A wurde als Interaktionpartner der TPH2 identifiziert, die Auswirkungen eines in vitro aktivitätssenkenden Tph2-SNPs auf die Serotoninlevel und das Verhalten verschiedener Mausstämme konnte durch die Generierung und Untersuchung von congenen Mäusen als unbedeutend eingestuft werden und die Expression von TPH1-mRNA wurde als Marker für endometriale Karzinome identifiziert. / Tryptophan hydroxylase (TPH) catalyzes the rate limiting step of the synthesis of the important neurotransmitter serotonin. Recently a new TPH isoenzyme, TPH2, was discovered. It turned out that this isoenzyme is responsible for the serotonin synthesis within the central nervous system, whereas the TPH1 is merely the starting point of serotonin synthesis in peripheral tissues. Since dysfunction in the metabolism of serotonin is related to a large number of psychiatric diseases, the neuronal TPH2 moved into the centre of interest. As a basis for the pharmacological manipulation of the central nervous serotonergic system, without influencing the periphery, the identification of differences between the two isoenzymes is essential. In this thesis it was shown that TPH1 and 2 not only differ in their expression sites but also in their basic biochemical characteristics. TPH1 turned out to be the more active enzyme. Furthermore it was shown that the N- and C-termini of TPH2 have an inhibitory respectively activating influence on the enzymatic activity. Therefore they became interesting targets for pharmacological interference, whereas the N-terminus as a TPH2 specific structure would facilitate the manipulation of the central nervous serotonergic system without exerting influence on the peripheral system. In further projects the existence of at least two protein kinase A phosphorylation sites could be verified, whereas the phosphorylation doesn’t seem to have any influence on the enzymatic activity, a high throughput assay for determination of TPH activity, based on a fluorometric principle, was developed, Tubulin beta2A was identified as a TPH2 interaction partner, the effect of a SNP in the Tph2 gene that decreases the TPH2 activity in vitro on the serotonin level and the behaviour of different mouse strains could be rated as insignificant by the generation of congenic mice und the expression of TPH1 mRNA was identified as a marker for endometrial cancer.

Das Humane Immundefizienzvirus (HIV) ist der Erreger von AIDS und als Zoonose von den Schimpansen (HIV-1) bzw. den Rauchmangaben (HIV-2) auf die menschliche Population übergesprungen. Diese Primatenspezies sind die natürlichen Wirte für die simianen verwand-ten Viren SIVcpz bzw. SIVsm. Die nicht-natürlichen Virus-Wirt-Beziehungen der Immundefizienzviren resultieren in einem pathogenen Verlauf, wie HIV im Menschen und SIVmac in Rhesusmakaken. Die natürlichen Wirte Rauchmangaben, Schimpansen, Afrikanische Grüne Meerkatzen (AGM) und viele mehr entwickeln hingegen kein simianes AIDS. Dies erfolgt trotz lebenslanger Infektion mit SIV und einer zur HIV-Infektion im Menschen äquivalenten Viruslast. Die natürlichen Wirte weisen darüber hinaus keine Immunantwort gegen das virale Kernprotein Gag (gruppen-spezifisches Antigen) auf, was ein früh und zahlreich gebildetes Protein während der Virusreplikation ist. Die fehlende humorale Immunantwort könnte die natürlichen Wirte vor Aktivierung des Immunsystems und dadurch auch vor sAIDS bewahren. Frühere Versuche in AGM mit injiziertem SIVagmGag-Protein zeigten zwar, dass die Induktion einer humoralen Immunantwort gegen SIVagmGag möglich ist, diese aber schon nach kurzer Zeit wieder absinkt. Des Weiteren bildete sich durch Infektion mit SIVagm in den Tieren keine anamnestische Immunantwort heraus, die für die Erkennung von gleichen Epitopen maßgeblich ist. Es scheint ein Unterschied in der Erkennung von exogenem injiziertem SIVagmGag-Protein zu endogenem, durch das Virus selbst gebildetem, Protein in den AGM zu bestehen. Folglich wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Immunisierung mit SIVagmGag-DNA unter Umgehung des Unterschieds in der Proteinprozessierung eine anamnestische Immunantwort in den AGM induziert. Um diese Hypothese zu testen und die Gag-Immunreaktion in Abwesenheit anderer viraler Gene bezüglich der Pathogenität zu evaluieren, wurden codonoptimierte SIVagmGag- und SIVmacGag-DNA Immunisierungsvektoren generiert. Die Proteinexpression wurde in vitro und die Immunogenität in Balb/c und C57Bl/6 Mäusen getestet. Jeweils eine Gruppe von vier AGM erhielt bioballistisch SIVagmGag-DNA bzw. SIVmacGag-DNA. Als Kontrollen dienten mit codonoptimierter DNA immunisierte Rhesusmakaken sowie mit Leervektor immunisierte Primaten beider Spezies. Als Kostimulanz wurde zusätzlich jeweils speziesspezifische gmcsf DNA verwendet. Im Gegensatz zu den Rhesusmakaken konnte in den AGM durch DNA-Immunisierung keine zelluläre und nur eine schwache, transiente humorale anamnestische Immunantwort nach Infektion induziert werden, obwohl beide Gag-Proteine endogen produziert wurden. Daher kann die fehlende anamnestische Immunantwort der AGM nach Immunisierung mit Gag-Protein vermutlich nicht auf Unterschiede in der Proteinprozessierung und -erkennung (endogen versus exogen) zurückgeführt werden. Die Ergebnisse dieser Studie deuten an, dass während der Infektion dieses natürlichen Wirtes eine aktive Unterdrückung der anti-Gag-Antikörperantwort stattfindet, möglicherweise induziert durch eine Anergie in Gag-spezifischen T-Helferzellen. / The causative agents of AIDS, the human immunodeficiency viruses (HIV-1 and HIV-2), were transmitted zoonotically to the human population from the natural hosts of the related simian immunodeficiency viruses SIVcpz (chimpanzees) and SIVsm (sooty mangabeys), respectively. In contrast to the outcome of infections in non-natural hosts (e.g. HIV in humans, SIVmac in rhesus macaques), the natural hosts of SIV do not develop simian AIDS-like symptoms despite life-long infection with virus loads matching those seen in HIV-infected humans. Many such natural host primates infected with SIV, such as SIVagm-infected African green monkeys (AGMs), fail to mount an antibody response to the intact viral core protein Gag (group-specific antigen), a protein produced extensively during infection. It has been postulated that this lack of an immune response to Gag could protect the natural hosts from immunopathological effects and therefore from simian AIDS. Previous studies in AGMs indicated that Gag protein produced endogenously during infection is ''seen'' by the immune system differently than that introduced exogenously by protein immunisation, possibly through differences in processing or through specific tolerance at the T-cell level. To address these possibilities, primate studies were performed in which the responses in the natural and non-natural hosts to endogenously produced Gag protein in the absence of other viral genes were compared and the influence of such endogenous priming on the immune response to infection was evaluated. This was achieved by bioballistic immunisation of AGMs and rhesus macaques with codon-optimised DNA coding for SIVagm or SIVmac Gag protein delivered together with DNA coding for the species-specific GM-CSF cytokine. Prior to the primate studies, the DNA constructs were evaluated in BALB/c and C57Bl/6 mice for immunogenicity and protein expression. In contrast to the rhesus macaques, SIVagmGag DNA immunisation of African green mon-keys generally failed to prime for an anamnestic cellular immune response and primed for only a weak, transient anamnestic humoral response to the protein upon infection, despite the proteins resulting from both immunisation and infection being produced endogenously. Differences in protein processing and recognition (endogenous versus exogenous) do not therefore appear to account for the lack of priming for an anamnestic immune response seen using a protein immunogen. Rather, the results seem to indicate that an active suppression of the anti-Gag immune response may occur during infection of this natural host of SIV, possibly by the induction of anergy in Gag-specific Th cells.

Die Zellreplikation ein kontrollierter Prozess aus sequentieller und zeitlich koordinierter Aktivierung und Abbau von Zyklinen, die einen schnellen Übergang zwischen den Zyklusphasen ermöglichen. Dabei ist der Erfolg bei der Ermittlung der wichtigsten Komponenten und Aufgliederung der Schaltmechanismen im Wesentlichen auf die gleichzeitige Anwendung von Modellsystemen wie Hefe, Frosch und Fliege zurückzuführen. Das heutige Verständnis des Zellzyklus muss erweitert werden, um zu überprüfen ob die Erkenntnisse auch auf in-vivo Modelle von Säugetieren wie der Maus zutreffen. Es existieren solche Modelle, die sich auf spezifische Kontrollpunkte oder Übergänge konzentrieren, allerdings noch kein integriertes Modell, in dem der Zellzyklus durch eine Verletzung im Säugetier induziert wird. Das Modellsystem der Leberregeneration bei Nagern wurde gewählt, da es sich durch das am höchsten verbreitete Phänomen der Synchronisation der Zellproliferation auszeichnet. Mit dem Fokus auf die Frage, wie die Zellen durch pro-inflammatorische Signale nach Verletzungen ins Priming in der G1/S Phase eintreten, gingen wir in einen durch Zytokine und Wachstumsfaktoren induzierten Säugetier-Zellzyklus über. Weiterhin wurden mitotische Ereignisse modelliert, die zum Alles-oder-Nichts G2/M Übergang und dem mitotischen Ausgang führen. Wir konzentrieren uns auf die vielversprechende Funktion von Cdh1 in der Zellzykluskontrolle, welches bekanntlich eine Schlüsselrolle in der G1 Phase spielt. Weiterhin haben wir dessen Rolle bei der Verzögerung der G2 Phase untersucht. Wir vermuten eine zentrale Rolle von Cdh1 im Zellzyklus durch die Kontrolle der Dynamik der Zykline. Das Modell ist ein Versuch, die Kernmechanismen der Zellzykluskontrolle bei Säugetieren zu verstehen. Besseres Verständnis der Mechanismen in der Säugetierzelle würde das Studium der Zellphysiologie im Hinblick auf Störungen der humanen Zellzyklusmaschinerie, welche zu Krankheiten wie Krebs führen. / Cell replication is a controlled process with sequential and timely activation and degradation of cyclins leading to swift transitions between the phases of the cell cycle. The essential achievement in identifying the key components and in dissecting the mechanisms of the cell cycle circuitry has been attributed to the simultaneous use of model systems like yeast, frogs, and flies. Present understanding of the cell cycle needs to be extended to investigate whether those findings also apply to mammalian in-vivo models like mice. We chose liver regeneration in mammals as the model system because it is the most synchronised cell proliferation phenomenon, where 95\% of the cells simultaneously enter cell cycle. The G1-S phase transition was modelled, focusing on how injury induced pro-inflammatory signals \textit{prime} the cells in G1 phase and consequently both cytokine and growth factor induced pathways lead to further cell cycle progression. The model was further extended to mitotic events leading to the all-or-none G2-M transition and mitotic exit. I focussed on the emerging role of Cdh1 in the mammalian cell cycle. Cdh1 known for its role in G1 phase was further investigated for its role G2 delay. Cdh1 was suggested to be at the core of the cell cycle machinery controlling cyclin dynamics. This model is an attempt in understanding core machinery of the mammalian cell cycle. Better understanding of the cell cycle control system in mammalian cells would enable understanding perturbations of the human cell cycle machinery which lead to diseases like cancers.

Zellkultursysteme mit Krebszelllinien werden seit Langem zur Untersuchung der Interakti-on zwischen Pathogenen und ihren Wirtszellen eingesetzt. Diese Systeme eignen sich aufgrund der reduzierten Komplexität für die Analyse einzelner Faktoren, spiegeln jedoch nicht den Zustand primärer Zellen oder die komplexe Gewebestruktur wieder. Um die Beschränkungen zu umgehen, wurden in dieser Arbeit neue Modelle etabliert auf der Grundlage von reversibel immortalisierten humanen Primärzellen und ex vivo Kultur von intaktem humanem Eileitergewebe. Infektionen mit dem humanpathogenen Bakterium Chlamydia trachomatis, welches chronische Schmerzen oder Unfruchtbarkeit auslösen kann, wurden in diesen Modellen untersucht. Reversible Immortalisierung wurde mit pri-mären human Eileiterzellen (FT Zellen) und humanen Nabelschnurzellen (HUVEC) durchgeführt. Das System basiert auf lentiviralem Gentransfer und dem Cre-lox-System. HUVEC Zellen wurden mit Kombinationen der Onkoproteine hTERT, SV40T und Bmi1 immortalisiert. Immortalisierung von FT Zellen wurde mit SV40T und Bmi1 erreicht. Eine Analyse der FT Zelllinien zeigte Veränderungen des Karyotyps durch die Immortalisie-rung. Bemerkenswerterweise konnten die Stammzellmarker CD44 und Oct4 in FT Zellen nachgewiesen werden. Ex vivo Gewebekultur humaner Eileiter wurde als stabiles Infekti-onsmodel für Chlamydia trachomatis etabliert. Mittels hochauflösender Konfokal-mikroskopie wurde gezeigt, dass die Infektion mit C. trachomatis tiefgreifende Verände-rungen im Epithel der Mukosa auslöst und zum Verlust der Zelladhäsion und Zellpolarität führt. Ein erhöhter Anteil apoptotischer Zellen wurde nach Infektion mit Serovar D beo-bachtet, einem klinischen Isolat des Genitaltraktes. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu Infektionen mit dem Laborstamm Serovar L2. Phänotypische Veränderungen in nicht infizierten Zellen weisen auf die Existenz parakriner Signalwege während der akuten In-fektion und Veränderung der epithelialen Homeostase hin. / Cell culture systems with cancer-derived cell lines have long been used to study the interaction between pathogens and their host cells. Due to reduced complexity these systems are convenient for the analysis of single factors; however, they do not represent the condition of primary cells or the complex tissue structure. To circumvent these limitations new models were established in this study on the basis of reversibly immortalized human primary cells and ex vivo culture of intact human fallopian tube tissue. Infections with the human pathogenic bacterium Chlamydia trachomatis, which can lead to chronic pain or infertility, were analyzed in these models. Reversible immortalization was applied to primary human fallopian tube (FT) cells and human umbilical vein cells (HUVEC). This system is based on lentiviral gene transfer and the Cre-lox-system. HUVEC cells were immortalized with a combination of two of the oncoproteins hTERT, SV40T and Bmi1. Immortalization of FT cells was achieved with SV40T and Bmi1. Analysis of FT cell lines revealed changes of the karyotype induced by immortalization. Remarkably, the stem cell markers CD44 and Oct4 were detected in FT cells. Ex vivo tissue culture of human fallopian tubes was established as stable and reliable infection model for Chlamydia trachomatis. Via high resolution confocal analysis the infection with C. trachomatis was discovered to trigger profound changes in the epithelial mucosa, causing loss of cell adhesion and polarity. Interestingly, an increase in the rate of apoptotic cells was observed after infection with serovar D, a clinical genital tract isolate. This finding is in contrast to infections with serovar L2, a laboratory strain. Phenotypic changes in non-infected cells suggest the existence of paracrine signalling during acute infection and change in epithelial homeostasis.

Legionella pneumophila ist ein Gram-negatives, ubiqitär verbreitetes Proteobakterium, das als Auslöser der Legionärskrankheit gilt. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass Serin eine wichtige Kohlenstoffquelle für Aminosäuren darstellt und dass L. pneumophila für die Aminosäuren Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin, Histidin, Prolin und Valin auxotroph ist. Innerhalb der Replikationsvakuole greift L. pneumophila auf Aminosäuren des Wirts zurück und inkorporiert diese in Proteine. Die untersuchte Spezies besitzt die Fähigkeit zur de novo-Biosynthese von Serin. Die vorliegende Arbeit zeigt zudem erstmals, dass Glukose für die Biosynthese von Aminosäuren sowie Polyhydroxybutyrat (PHB) verwendet wird. Der Entner-Doudoroff-Weg (EDW) kann als Haupt-Katabolismusroute von Glukose identifiziert werden. Ein Deletionsstamm des EDW zeigt gegenüber dem Wildtypstamm in nährstoffarmer Umgebung deutlich verminderte Fitness nach erfolgreicher Replikation innerhalb A. castellanii. Die Glukoamylase GamA wird in dieser Arbeit erstmals als verantwortliches Enzym für die Stärke- und Glykogenhydrolyse von L. pneumophila charakterisiert. Der putative Transkriptionsaktivator YozG bindet sowohl im 5’-DNA-Bereich von gamA als auch im eigenen putativen Promotorbereich und reguliert die Hydrolyseaktivität von GamA. Es werden zudem Argumente für die Hypothese erbracht, dass YozG auch als cis-aktives Element fungiert. Die Biosynthese von Polyhydroxybutyrat (PHB) aus Glukose findet während des spät-exponentiellen Wachstums statt und steigert sich in der stationären Phase. Eine verminderte PHB-Menge im EDW-Deletionsstamm wird als Erklärung für die verminderte Fitness in nährstoffarmer Umgebung diskutiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass L. pneumophila neben Aminosäuren auch Glukose sowie die natürlich vorkommenden Glukosepolymere Glykogen und Stärke als Kohlenstoffquellen zur Biosynthese von Aminosäuren und PHB nutzt und dass diese Synthese zur Fitness der Spezies beiträgt. / Legionella pneumophila is a Gram-negative proteobacterium causing Legionnaires’ disease. The results of this study confirm that serine is a carbon source for amino acids and that L. pneumophila is auxotrophic for the amino acids isoleucine, leucine, phenylalanine, tyrosine, histidine, proline, and valine. L. pneumophila uses amino acids of the host cells to incorporate them into proteins. Serine is synthesized de novo. Furthermore, this work demonstrates for the first time that glucose is used for the biosynthesis of amino acids and polyhydroxybutyrate (PHB). The Entner-Doudoroff pathway is identified as the predominant pathway for the catabolism of glucose. In a nutrient-depleted environment, after replication has taken place in A. castellanii, a deletion strain of the Entner-Doudoroff pathway exhibits strongly reduced fitness as compared to the wildtype. The glucoamylase GamA is characterized as the enzyme responsible for the starch and glycogen degrading activity of L. pneumophila for the first time. The putative transcription activator YozG binds to the 5’ region of gamA as well as to his own putative promoter region and regulates GamA activity. Furthermore, arguments are provided to support the hypothesis that YozG also acts as a cis-active element. The biosynthesis of polyhydroxybutyrate (PHB) from glucose starts in the late exponential phase and increases in the stationary growth phase. As an explanation for reduced fitness of the Entner-Doudoroff deletion strain in nutrient-depleted environment, a reduced amount of PHB is proposed. The results of this work prove that L. pneumophila uses not only amino acids but also glucose and the natural glucose polymers starch and glycogen as carbon sources for the biosynthesis of amino acids and PHB and that thereby the fitness of the species is increased.

Zelluläre Seneszenz beschreibt einen terminalen Zellzyklus-Arrest. Nach zellulärem Stress u. a. durch aktivierte Onkogene oder DNA-schädigende Chemotherapie wird Seneszenz induziert und kann so zur Tumorsuppression bzw. zum Behandlungserfolg beitragen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor NF-kappaB – welcher bisher vor allem durch seine onkogenen Funktionen mit Krebs in Verbindung gebracht wurde - bei der Seneszenz-assoziierten Zytokinausschüttung mitwirkt und den seneszenzten Phänotyp möglicherweise sogar verstärkt, wodurch NF-kappaB potentiell eine tumorsuppressive Rolle zukäme. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung des NF-kappaB-Signalweges in Seneszenz und Therapie. In der vorliegenden Arbeit zeige ich die deutliche Aktivierung von NF-kappaB nach Therapie-induzierter Seneszenz (therapy-induced senescence, TIS) und erhöhte Expression NF-kappaB-regulierter Zytokine. TIS ist vor allem in vivo mit starker Aktivität des NF-kappaB-Signalweges assoziiert und von selbiger abhängig. Primäre Eµ-myc-transgene Mauslymphome wurden nach ihrer endogenen NF-kappaB-Aktivität klassifiziert bzw. mit inhibierenden und aktivierenden NF-kappaB-Konstrukten modifiziert, welche auch in diffusen großzelligen B-Zell Lymphomen (diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) als natürlich vorkommende Mutationen gefunden wurden. Über einen neuartigen „Cross-Species“-Vergleich wurden Bcl2-hochexprimierende Keimzentrums-B-Zell-DLBCL (germinal center B-cell type, GCB) als klinisch relevante Gruppe identifiziert, welche nach NF-kappaB-Hyperaktivierung signifikant besser auf Therapie ansprach. Diese Ergebnisse zeigen eine kontextspezifische, d. h. von „onkogenen Netzwerken“ abhängige Rolle des NF-kappaB Signalweges unter Chemotherapie. Diese Information könnte für künftige klinische Studien bedeutsam sein, da sie Bedingungen aufzeigt, unter denen NF-kappaB als Vermittler einer erwünschten Therapie-induzierten Seneszenzantwort eher nicht inhibiert werden sollte. / Cellular senescence is a terminal cell-cycle arrest program that is executed in response to cellular stresses, such as activated oncogenes or DNA-damaging anti-cancer chemotherapy, where it serves as a tumor-suppressive mechanism or contributes to treatment outcome, respectively. Recently, transcription factor NF-kappaB which has long been linked to cancer development primarily through its oncogenic functions, has been postulated to participate in a senescence-associated and possibly senescence-reinforcing cytokine response, thereby suggesting a tumor-restraining role for NF-kappaB. The aim of my PhD project was to understand the role of the NF-kappaB pathway in senescence and cancer treatment outcome. In this thesis, I show markedly elevated NF-kappaB activity upon therapy-induced senescence (TIS), associated with strong upregulation of NF-kappaB-controlled cytokines. TIS is associated with and depends on hyper-activated NF-kappaB signaling. By characterization and genetic engineering of primary mouse lymphomas according to distinct NF-kappaB-related oncogenic networks reminiscent of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) subtypes, Bcl2-overexpressing germinal center B-cell-like (GCB) DLBCL were identified as a clinically relevant subgroup with significantly superior outcome when NF-kappaB is hyperactive. These results demonstrate the context-dependent role of NF-kappaB signaling in cancer therapy and unveil oncogenic scenarios in which NF-kappaB hyperactivity unexpectedly accounts for superior long-term outcome to therapy. This finding has significant ramifications for future clinical trials that aim at inhibiting NF-kappaB activity based on the assumption of its detrimental impact on treatment outcome.

Veränderungen in der lokalen Chromatinstruktur beeinflussen die dynamische Regulation von Genen, welche für die Differenzierung notwendig sind. PU.1 ist ein Master-Transkriptionsfaktor in der Hämatopoese und wird streng reguliert, um ein zelllinienspezifisches Expressionsmuster zu erzielen. Hohe Konzentrationen von PU.1 sind für myeloische Differenzierung erforderlich. In B-Zellen wird PU.1 mittelstark exprimiert und muss aktiv runterreguliert werden, um eine Ausdifferenzierung der multipotenten Vorläuferzellen zu T-Zellen zu ermöglichen. Derzeit ist wenig über die Regulierung von PU.1 in T-Zellen bekannt. Darüber hinaus wurde eine abnormale Expression von PU.1 in verschiedenen Leukämieerkrankungen beobachtet. Mittels eines genome-wide Chromatin-Interaktions-Screens konnten wir einen cis-Repressor mit insulierender Kapazität identifizieren, welcher mittels eines Chromatinloops die Promotoraktivität von PU.1 in T-Zellen, jedoch nicht in myeloischen oder B-Zellen blockiert. Sowie Looping als auch Insulation erfordern die Bindung des Chromatin-Regulatorprotein CTCF. Im Gegensatz zu normalen myeloischen Zellen finden wir, dass Krebszellen aus myeloischen Leukämie Patienten diese T-Zell-spezifische repressive Chromatinstruktur aufweisen, was einen räumlichen Kontakt des Insulator mit dem PU.1 Promotor ermöglicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit beschrieben das CTCF gesteuerte „long distance looping“ als ein neuer molekularer epigenetischer Mechanismus, um Transkriptionsfaktor PU.1 in T-Zellen runterzuregulieren, und zeigen zum ersten mal, dass Krebszellen die Chromatinstruktur anderer Zelllinien imitieren können, um die Expression von Differenzierungsgenen zu blockieren. / Alterations in the local chromatin structure orchestrate the dynamic regulation of differentiation promoting genes. PU.1 is a master transcription factor in hematopoiesis. PU.1 gene must be tightly regulated to achieve lineage specific expression pattern. High levels of PU.1 are required for myeloid commitment: it is expressed at intermediate level in B-cells and must be actively silenced to permit T cell development from early multipotent progenitors. However, little is known of how PU.1 is regulated in T-cells. Moreover, aberrant PU.1 expressions have been observed in multiple leukemias. Using a genome-wide chromatin interaction screen we identified a cis-repressor with insulating capacity that undergoes long-distant chromatin looping to block PU.1 promoter activity in T cells but not myeloid or B cells. Looping and repression requires binding of the chromatin regulator protein CTCF. In contrast to normal myeloid cells, we found that cancer cells from myeloid leukemia patients adopt the T cell specific repressive chromatin structure bringing the insulator into spatial contact with the PU.1 promoter. These results identify CTCF controlled long-distant insulator looping as a novel mechanism to silence lineage-opposing transcription factor expression, and reveal that cancer cells can mimic the chromatin confirmation of another lineage to block expression of differentiation driving genes.

Desmosomen sind hochorganisierte Zell-Zell-Verbindungen. Aufgrund ihrer hohen Adhäsivität sind sie für die mechanische Kopplung und strukturelle Stabilität stark beanspruchter Gewebe von essentieller Bedeutung. Die adhäsive interzelluläre Kernstruktur der Desmosomen wird durch die transmembranen Cadherine des Desmocollin und Desmoglein-Typs gebildet. Deren extrazelluläre Domänen stellen den Kontakt zwischen zwei benachbarten Zellen her. Dsc2 ist neben Dsg2 die prädominante Isoform und wird in allen Desmosomen-bildenden Geweben wie auch dem Herzen exprimiert. Ziel der Arbeit war es, die Rolle von Dsc2 bei der Etablierung und Aufrechterhaltung der desmosomalen Adhäsivität und Gewebeintegrität zu untersuchen. Hierfür wurde ein klassisches Knockout-Mausmodell für Dsc2 etabliert und sowohl basal als auch unter Belastungsbedingungen charakterisiert. Unsere Daten demonstrieren, dass der ubiquitäre Knockout keinen Einfluss auf die Morphogenese des Embryos und die postnatale Entwicklung hat. Dsc2-/- -Mäuse waren lebensfähig und wiesen keinen pathologischen Phänotyp auf. Zudem ließen sich in den Herzen adulter Tiere strukturell unveränderte Desmosomen nachweisen. Dahingegen konnte eine verminderte mechanische Beanspruchbarkeit der Dsc2-/- -Herzen aufgezeigt werden. Unter erhöhter Belastung zeigte sich bereits nach wenigen Tagen eine signifikante Reduktion der kardialen Funktion.Die vorliegende Arbeit zeigt somit erstmalig in vivo, dass Dsc2 entgegen der Lehrmeinung nicht essentiell für die Embryonalentwicklung und die Bildung strukturell intakter Desmosomen ist. Anhand des Funktionsverlustes der adulten Knockout-Herzen unter Belastungsbedingungen lässt sich jedoch eine mögliche Rolle von Dsc2 für die Adhäsivität der Desmosomen postulieren. / Desmosomes are highly organized adhesive intercellular junctions providing mechanical strength and structural stability to several tissues such as skin and heart. The adhesive core of desmosomes is formed by the transmembrane glycoproteins desmocollins (Dsc) and desmogleins (Dsg) which link neighbouring cells via interaction with their extracellular cadherin domains. Dsc2 and Dsg2 are the predominant isoforms ubiquitously expressed in all desmosome bearing tissues including the heart. To elucidate the role of Dsc2 for establishment and maintenance of desmosome adhesion and tissue integrity, we generated a constitutive knockout model of the mouse. The effect of gene inactivation was characterized under basal as well as under stress conditions, using two different stress models. Our data demonstrate that Dsc2 is not required for pre- and postnatal development. Dsc2-/- mice were viable and showed no pathological alterations at embryonic or adult stages. Consistently, Dsc2 deficient cardiomyocytes exhibited distinct and ultrastructural well organized desmosomes. However, mutant hearts displayed a decreased stress resistance. Increased mechanical pressure led to a significant reduction of cardiac function in Dsc2-/- animals. In summary, our results demonstrate for the first time in vivo that Dsc2 is not essential for embryonic development and for the establishment and maintenance of distinct and well organized desmosomes. However, the reduced cardiac function in stressed knockout-mice suggests a crucial importance of Dsc2 for desmosomal adhesive strength.

Die Neurone der Hirnrinde sind in Mikroschaltkreisen, Modulen und Arealen organisiert. In dieser Doktorarbeit habe ich die Neurobiologie und Hirnrindenstruktur der Etruskerspitzmaus - ein neues Modelltier für neurobiologische Forschung - und die modulare Struktur des entorhinalen Kortex der Ratte untersucht. Die geringe Größe des Gehirns der Etruskerspitzmaus bietet besondere Vorteile für das Verständnis kortikaler Aktivität von Zellgruppen. Die entorhinale Kortex enthält sowohl gut definierte funktionelle als auch anatomische Module und bietet daher eine einzigartige Gelegenheit für das Studium ihrer Wechselbeziehungen. Die Organisation der Hirnrinde der Etruskerspitzmaus reflektiert die Spezialisierung als schnelle, auf taktile Reize spezialisierte Jäger. Mehrere kortikale Regionen, die ein Drittel des kortikalen Volumens ausmachen, reagieren auf taktile Reize. Eine kortikale Hemisphäre enthält nur etwa eine Million Neuronen. Basierend auf der Zellarchitektur und histochemischen Färbungen haben wir 13 kortikale Regionen definiert - eine große Zahl angesichts der geringen Größe des Spitzmausgehirns. Pyramidenzellnester in Schicht 2 des medialen entorhinalen Kortex sind einfach zu identifizieren und eignen sich als Bezugssystem für die verschiedenen modulären Strukturen dieser Hirnregion. Diese Pyramidenzellen bündeln ihre Dendriten hin zu einem Punkt, der sich mit erhöhten Konzentrationen von präsynaptischen cholinergen Markern überschneidet. Cholinerge Transmission ist ein wichtiger Bestandteil des Theta-Rhythmus und unsere Ergebnisse zeigen, daß Pyramidenzellen im Vergleich zu Sternzellen doppelt so stark Theta-moduliert sind. Da fast alle Gitterzellen stark Theta-moduliert sind, ist anzunehmen dass Pyramidenzellen eine wichtige Rolle für die räumliche Navigation spielen. In dieser Arbeit wurden an der Hirnrinde der Etruskerspitzmaus sowie der entorhinalen Hirnrinde der Ratte modellhaft Struktur-Funktions-Beziehungen in der Großhirnrinde aufgeklärt. / Neurons of the cerebral cortex are collectively organized into microcircuits, modules and cortical areas. Here, I study the neurobiology and cortical structure of the Etruscan shrew - a new model animal for neurobiological research - and the modular structure of the entorhinal cortex of the rat. The small size of the Etruscan shrew''s brain offers particular advantages for understanding cortical activity at the multi-cell level, due to its small number of cortical neurons and its intrinsic advantages for optical imaging approaches. The entorhinal cortex contains well-defined functional and anatomical modules and provides a unique opportunity for studying their interrelation. The organization of the cerebral cortex of the Etruscan shrew reflects their behavioral specialization as fast touch-and-kill hunters. Several cortical areas comprising a third of the cortical volume respond to vibrissal touch. One cortical hemisphere contains only about 1 million neurons. Cytoarchitecture and histochemical staining revealed 13 cortical regions - a large number considering the small size of the shrew''s brain. Pyramidal cell clusters in layer 2 of medial entorhinal are reliably identifiable and thus provide common anatomical framework for entorhinal cortex modularity. These cells form geometrically arranged clusters and bundle their dendrites towards a common point overlapping with presynaptic markers of cholinergic inputs. Cholinergic drive is an important component of theta-rhythmicity which we found to be two-fold stronger in pyramidal than in stellate neurons. Since nearly all grid cells are strongly theta modulated, we suggest that pyramidal cells may play an important role in microcircuits for spatial navigation. In this work, we studied the areal architecture of the Etruscan shrew cortex and the modular architecture of the rat medial entorhinal cortex as contributions towards understanding structure-function relations in the cerebral cortex.