Das Neuroblastom (NB) zählt zu den therapieresistentesten Tumoren des Kleinkindalters. Besonders NB-Patienten mit MYCN-Amplifikation sind mit einer schlechten Prognose konfrontiert. Neuere Studien legen nahe, dass eine spezifische aktive Immuntherapie gegen MYCN ein vielversprechender Ansatz zur Bekämpfung dieser malignen Erkrankung darstellen könnte. Zur Untersuchung dieser Hypothese wurde ein sogenanntes Minigen-Vakzin, welches für drei ausgewählte Epitope aus der MYCN-AS-Sequenz kodiert, generiert. Die Auswahl der Minigen-Epitope erfolgte mit dem MHC-Liganden-Vorhersageprogramm syfpeithi, welches drei starke H2-Kk-Liganden lieferte. Außerdem wurden zwei weitere Vakzine hergestellt: als Negativkontrolle MYCNLow, dessen MYCN-Peptide laut syfpeithi schlechte MHC-Klasse-I-Liganden darstellen und ein cDNA-Vakzin auf Basis der gesamten MYCN-cDNA-Sequenz. Zur Applikation der Vakzine wurden attenuierte Salmonella typhimurium SL7207 verwendet, die eine zusätzliche Stimulierung des mukosalen Immunsystems hervorrufen. Für die Untersuchung der Impfstoffe in vivo wurden zwei neuartige immunkompetente NB-Mausmodelle etabliert. Dazu wurden die syngenen NXS2/C1300 A/J-Mausmodelle soweit modifiziert, dass sie über eine induzierbare MYCN-Expression verfügten. Nach Auswahl und Charakterisierung geeigneter Transfektanten in vitro und in vivo wurde in diesen Modellen die Wirksamkeit der Vakzine untersucht. In diesen Versuchen konnte mit Hilfe der Vakzine das Primärtumorwachstum von NXS2-MYCN in geimpften Tieren signifikant im Vergleich zu Kontrollen reduziert und die Metastasierung durch C1300-MYCN Zellen signifikant verzögert werden. Mit den in-vivo-Versuchen anschließenden Analysen wurde schließlich bewiesen, dass die Immunantwort durch tumorinfiltrierende MYCN-spezifische zytotoxische CD8+ T-Zellen vermittelt wird. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine MYCN-DNA-Vakzinierung erfolgreich zur Behandlungen MYCN-exprimierender NB im Mausmodell eingesetzt werden kann. / High-level expression of MYCN protein caused by amplification of the gene characterizes a malignant phenotype of neuroblastoma (NB). Recent studies suggest that MYCN might be a promising target for immunotherapy. Therefore, we investigated the efficacy of three MYCN-specific DNA vaccines. Two minigene vaccines were generated; each encoded for three selected epitopes of the MYCN protein sequence with the highest, or as a control lowest, predicted affinity to MHC-Class-I Molecules. The third vaccine based on the cDNA of MYCN. Salmonella typhimurium SL7207 were used as oral application vehicle for the vaccines in in vivo experiments to induce an additional stimulation of the immune system. To investigate the immunotherapeutic approach NXS2- and C1300-cells syngeneic to immunocompetent A/J-mice were stably transfected with a tetracycline inducible vector system coding for MYCN. The transfectants were characterized and established in vitro and in vivo. In the MYCN-overexpressing models vaccination with the MYCN-DNA-vaccines resulted in significant reduced primary tumor growth or decelerated metastasis spread. The immune responses in the in vivo experiments followed by orally applied MYCN-DNA vaccines was mediated by tumor infiltrating cytotoxic CD8+ and CD4+ T cells. MYCN specificity of infiltrating lymphocytes was verified by MYCN-specific cytolytic activity and IFN-gamma secretion ex vivo. Finally, we showed that blocking of MHC-class I molecule H2-Kk approbated cytotoxicity mediated by CD8+ T cells, indicating MYCN specificity of the induced immune response. In summary, we showed that a MYCN based DNA vaccination strategy is effective against MYCN-expressing NB in vivo. In light of the description of MYCN-specific T cells in NB patients, the lytic action of autologous T cells on MYCN-expressing cells and the results of this study underline the possible potential of an active immunotherapy against MYCN as an alternative therapeutic approach to treat NB.

MHC-Klasse-I präsentierte Epitope werden überwiegend durch den proteasomalen Abbau von Poly-Ubiquitin markierten Proteinen und defekten ribosomalen Produkten (DRiPs) generiert. Die post-proteasomale Prozessierung durch zytosolische Exo- und Endopeptidasen führt jedoch hauptsächlich zur Epitop-Zerstörung und nur ein sehr geringer Anteil der Peptide entkommt der Degradation. Bisher ist noch unklar, wie die enzymatischen Aktivitäten des heterogenen Peptidase-Pools im Zytosol die finale Epitop-Prozessierung beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurden heteromere Interaktionen von zytosolischen Peptidasen analysiert und ihre Wirkung auf die Prozessierung und Präsentation von proteasomal generier-ten Vorläuferpeptiden in Bezug auf die HCMVpp65495-503 Epitop-Generierung untersucht. Glycerolgradientenzentrifugationen und Immunpräzipitationsexperimente zeigten, dass die zytosolischen Peptidasen Nardilysin (NRDc) und Aminopeptidase-B (AP-B) in den gleichen Fraktionen sedimentieren und zu heteromeren Komplexen interagieren. Die siRNA- abhängige Reduktion der Proteinexpression beider Peptidasen hatte einen positiven Effekt auf die HCMVpp65 spezifische CTL-Antwort. Demnach vermindert der Peptidase-Komplex die HCMVpp65-spezifische Epitop-Präsentation auf der Zelloberfläche. Im Gegensatz dazu bewirkte ein in vitro rekonstituierter trimerer Peptidase-Komplex jedoch die verstärkte HCMVpp65 Epitop-Generierung aus einem proteasomal generierten Vorläuferpeptid. Auf der anderen Seite führte gereinigte AP-B zu der anhaltenden Zerstörung des Epitops. Die Ergeb-nisse deuten somit darauf hin, dass sowohl einzelne als auch verschiedene Interaktionen von zytosolischen Peptidasen die Prozessierung und Präsentation des HCMVpp65-Epitops unterschiedlich modulieren und somit die HCMVpp65-spezifische antivirale Immunantwort beeinflussen. / MHC class I presented antigens are generated by the degradation of poly- ubiquitinated pro-teins and defective ribosomal products (DRiPs) by a major protease, the 26S proteasome. However, the post- proteasomal processing by cytosolic exo-and endopeptidases mainly leads to epitope destruction and only a very small proportion of the peptides escape degradation. So far, it is still unclear how the enzymatic activity of the heterogeneous pool of peptidases in the cytosol affects final epitope processing and therewith immune response. In the present work heteromeric interactions of cytosolic peptidases and their effect on pro-cessing and presentation of proteasomal generated peptides were analysed with regard to HCMVpp65495-503 epitope generation. Glycerol gradient centrifugation and immunoprecipitation experiments indicate that the cyto-solic peptidases Nardilysine (NRDc) and Aminopeptidase B (AP-B) sediment in the same fractions and interact to heteromeric complexes. The siRNA dependent reduction of protein expression of these two peptidases had a positive effect on the HCMVpp65 specific CTL re-sponse. Thus the peptidase complex reduces HCMVpp65 epitope presentation on the cell sur-face possibly due to epitope destruction. In contrast to the findings of the CTL assays, an in vitro reconstituted trimeric peptidase complex resulted in the increased generation of HCMVpp65 epitopes from a proteasomal generated peptide precursor. On the other hand pu-rified AP-B led to the ongoing destruction of the epitope. The findings obtained show that single cytosolic peptidases and various interactions of cytosolic peptidases regulate the pro-cessing and presentation of the HCMVpp65 epitope differently, thereby influencing the HCMV-specific antiviral immune response.

Das Wechselspiel zwischen Viren und ihren Wirtszellen beginnt meist an pattern recognition-Rezeptoren (PRRs), die für die Erkennung unterschiedlichster Pathogene anhand bestimmter Strukturen, sogenannten pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), zuständig sind. Nach Detektion lösen die PRRs über verschiedene Signalkaskaden eine antivirale Antwort aus, die zur Expression antiviraler Gene führt. RIG-I und MDA5 sind zytoplasmatisch lokalisierte PRRs und erkennen RNA-Strukturen, die insbesondere während der viralen Replikation und Transkription verfügbar sind. Hantaviren sind humanpathogene RNA-Viren mit einem einzelsträngigen, segmentierten Genom. Die Konsequenzen hantaviraler Infektionen auf molekularer Ebene wurden bereits detailliert untersucht, aber die Mechanismen, die zur Induktion der Immunantwort führen, wie auch mögliche Immunevasionsstrategien, die wahrscheinlich in Zusammenhang mit der Pathogenität des jeweiligen Hantavirusstamms variieren, konnten bisher nicht identifiziert werden. Da Hantaviren im Cytoplasma ihrer Wirtszellen replizieren, stellen RIG-I und MDA5 potentielle Detektoren dar. In dieser Doktorarbeit wird die Bedeutung von RIG-I und MDA5 für die Erkennung von Hantavirus-Infektionen untersucht. Wachstumskinetiken zeigten, daß RIG-I die Replikation von pathogenen wie auch apathogenen Hantaviren beeinträchtigt. Außerdem konnte die RNA hantaviraler Nukleocapsid- (N-) ORFs als eine virale Komponente identifiziert werden, die Typ I Interferon über RIG-I induziert. Das Ausmaß der Interferon-Aktivierung korrelierte hierbei tendenziell mit dem Virulenzgrad der Virusstämme und war für die nicht-pathogenen Hantaviren nicht nachweisbar. Unterschiede in der Aktivierungsstärke können anhand vorläufiger Daten wahrscheinlich auf noch nicht identifizierte Motive zurückgeführt werden, die am 3’-Ende der N ORFs liegen. Im Gegensatz dazu wurde keine Interferon-Aktivierung durch hantavirale Komponenten über MDA5 festgestellt. / Host-virus interaction is usually initated by pattern recognition receptors (PRRs) which are responsible for the recognition of various pathogens based on so-called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Upon detection, PRRs trigger an antiviral immune response through different signalling cascades that lead to the expression of antiviral genes including interferon genes. RIG-I and MDA5 are cytoplasmically localised PRRs and recognise RNA patterns that are particularly available during viral replication and transcription. Hantaviruses are RNA viruses with single-stranded segmented genomes. The consequences of hantaviral infections have been analysed in detail, but the mechanisms that lead to the induction of the innate immune response as well as immune evasion strategies depending on the pathogenicity of the respective hantavirus strains have not been identified yet. Since hantaviruses replicate in the cytoplasm of their host cells, RIG-I and MDA5 represent potential PRRs for hantaviral detection. This thesis investigates the impact of RIG-I and MDA5 on recognition of hantaviral infections. Growth kinetics show that RIG-I impairs the replication of pathogenic as well as non-pathogenic hantaviruses. Furthermore, the RNA of hantaviral nucleocapsid protein (N) ORF could be identified as a viral component responsible for the induction of RIG-I signalling. It is shown that the degree of interferon promotor activation correlates with the virulence of the hantavirus strain from which the N ORF was derived. Based on preliminary data, differences in activation strength may be attributed to not yet identified motifs at the 3’ end of the ORF. In contrast, no interferon activation through MDA5 could be observed.

Toxoplasma gondii ist ein weit verbreiteter, obligat-intrazellulärer, einzelliger Parasit, der die lebensbedrohliche Krankheit Toxoplasmose in Menschen und Tieren hervorrufen kann. Der schnell replizierende Parasit benötigt erhebliche Mengen an Phospholipiden zur Biogenese intra- und extrazellulärer Membranen. Phosphatidylethanolamin (PtdEtn) ist ein wichtiges und ubiquitäres Phospholipid in Pro- und Eukaryoten und das zweithäufigste Lipid in T. gondii. Dieses kann de novo über den CDP-Ethanolamin Stoffwechselweg oder durch Decarboxylierung von Phosphatidylserin synthetisiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Expression von zwei distinkten Phosphatidylserin Decarboxylasen (PSDs) in T. gondii nachgewiesen werden: TgPSD1pv ist partiell löslich und wird über Dichte Granula in die Parasitophore Vakuole sekretiert, während sich TgPSD1mt im Mitochondrium von Tachyzoiten befindet. TgPSD1mt ist in der Lage einen Ethanolamin-auxotrophen S. cerevisiae Stamm zu komplementieren. Ein Knock-down von TgPSD1mt in T. gondii verursacht eine verlangsamte Parasitenreplikation, welche zu einem verminderten in vitro Wachstum führt. Der PtdEtn-Gehalt in der Mutante bleibt unverändert, was auf eine stringente Homöostase des zellulären PtdEtn Reservoirs durch alternative Lipidbiogenesewege hindeutet. Tatsächlich verfügt T. gondii zusätzlich über einen aktiven CDP-Ethanolamin Stoffwechselweg im Endoplasmatischen Retikulum, welcher den Verlust von TgPSD1mt partiell kompensieren kann. Das zweite, sekretierte TgPSD1pv-Enzym hingegen scheint für das Parasitenwachstum in vitro entbehrlich zu sein. Infektionsversuche mit radioaktiv markierten Wirtszellen zeigten zudem eine Aufnahme von PtdEtn oder PtdEtn-Derivaten in intrazellulär replizierenden Tachyzoiten. Diese Ergebnisse demonstrieren eine außergewöhnliche Kompartmentalisierung und Plastizität der PtdEtn-Synthese in T. gondii. / Toxoplasma gondii is a remarkably successful and widespread obligate intracellular protozoan parasite, which can cause the potentially life threatening disease Toxoplasmosis in humans and animals. The fast proliferating parasite requires a significant amount of phospholipids for biogenesis of organelles and enclosing vacuolar membranes. Phosphatidylethanolamine (PtdEtn) is one of the most ubiquitous phospholipids and the second most abundant lipid in T. gondii. It can be produced de novo by the CDP-ethanolamine pathway or by decarboxylation of phosphatidylserine. This work revealed the expression of two distinct PtdSer decarboxylase (PSD) enzymes in T. gondii: One of which is Coccidia-specific and partially soluble and secreted into the parasitophorous vacuole via dense granules (TgPSD1pv), and a second enzyme that localizes in the mitochondrion (TgPSD1mt) of tachyzoites. The mitochondrial PSD can complement a S. cerevisiae mutant auxotrophic for ethanolamine. A conditional knockdown of the TgPSD1mt gene impairs the parasite growth in vitro. Surprisingly, the mutant displayed an unaltered total PtdEtn content, which suggests a stringent homeostasis of the cellular PtdEtn pool by alternative routes of lipid biogenesis. Consistently, the parasite encodes an active CDP-ethanolamine pathway in the endoplasmic reticulum. Metabolic labeling of the TgPSD1mt mutant displayed an increased utilization of ethanolamine into PtdEtn, indicating an upregulation of the de novo CDP-ethanolamine pathway. Likewise, exogenous ethanolamine partially restored the growth phenotype of the mutant. In contrast, the TgPSD1pv enzyme is dispensable for the parasite growth. Host cell pre-labeling with radioactive ethanolamine indicated a potential uptake of host-derived PtdEtn or PtdEtn-derivates by intracellular parasites. Taken together, these results demonstrate an exceptional compartmentalization and plasticity of the PtdEtn synthesis in T. gondii.

Das Ubiquitin Proteasom System generiert die Mehrheit der antigenen Peptide, die zusammen mit MHC Klasse I Molekülen präsentiert werden, wobei durch Kooperation mit alternativen proteolytischen Systemen die Vielfalt der möglichen MHC I Liganden erhöht wird. In diesem Zusammenhang, insbesondere im Rahmen einer Immunantwort, ist die Rolle von Aminopeptidasen bislang nur ungenügend charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wurde der modulatorische Einfluss von zytosolischen und im ER lokalisierten Aminopeptidasen auf die Generierung des HCMV pp65495-503 Epitops durch Prozessierung von proteasomal generierten Peptidprodukten untersucht. Dafür wurde in pp65 exprimierenden Zellen die Expression einzelner Aminopeptidasen mittels siRNA inhibiert und der Effekt auf die Epitoppräsentation über die Aktivierung pp65495-503 spezifischer CTL bestimmt. Es zeigte sich, dass TPPII, LAP, AP-B und POP limitierend auf die Epitoppräsentation wirken. Damit wurden die Peptidasen AP-B und POP erstmalig in direkten Zusammenhang mit der MHC Klasse I Antigenprozessierung gebracht. Analysen weiterer zytosolischer Peptidasen wie TOP, BH und PSA zeigten keinen signifikanten Effekt auf die Epitoppräsentation, so dass diese Peptidasen an der zellulären Prozessierung des pp65 Antigens nicht beteiligt sind. Die Trimmaktivität von ERAPI und ERAPII im ER hingegen hatte einen bedeutenden Anteil an der pp65495-503 Epitopgenerierung. In Immunpräzipitationsexperimenten konnte zudem die Interaktion der ER Aminopeptidasen mit dem peptide-loading complex zum ersten Mal nachgewiesen werden. Die vorliegenden Daten geben Hinweise darauf, dass die Interaktion von ERAPI und ERAPII mit dem Komplex unabhängig von dessen vollständiger Assemblierung mit dem TAP Transporter stattfinden kann und vermutlich über Tapasin vermittelt wird. Da diese Assoziation durch IFNgamma induziert wird, könnte sie zu einer effizienteren Antigenprozessierung und -Präsentation, vor allem unter Infektionsbedingungen, beitragen. / The ubiquitin proteasome system is responsible for the generation of the majority of MHC class I presented antigenic peptides. By cooperation with alternative proteolytic systems the diversity of MHC class I ligands is increased. In this context, especially during immune response, the role of aminopeptidases is barely characterised. In this project the effect of cytosolic and ER-resident aminopeptidases on processing of proteasomal generated peptides was investigated with regard to HCMV pp65495-503 epitope generation. Therefore, expression level of single aminopeptidases was down regulated by siRNA in pp65 expressing cells and the effect of down regulation on epitope presentation was analysed by activation of pp65495-503 specific CTLs. It could be demonstrated that TPPII, LAP, AP-B and POP have negative effects on pp65 epitope presentation. With AP-B and POP two additional cytosolic aminopeptidases with a functional role in epitope processing were identified. Other aminopeptidases, that have been characterised as part of the antigen processing machinery, namely TOP, BH and PSA, did not affect pp65 epitope generation. In contrast, trimming by ERAPI and ERAPII in the ER resulted in an efficient epitope presentation. For the first time, experimental evidence was provided that the two ER-resident peptidases interact with the MHC class I peptide-loading complex (PLC). The obtained results indicate that this association takes place independently of the assembly of the entire complex including TAP and is probably mediated by tapasin. The observation that this complex formation is inducible by IFNgamma suggests that the association of ERAPI and ERAPII to the PLC accounts for a better antigen processing and presentation mainly at the site of infection.

Im Rahmen dieser Dissertation wurden Experimente zur Wechselwirkung von schnellen Atomen mit Oberflächen von Oxidkristallen, Metallkristallen und ultradünnen Oxidfilmen auf Metalloberflächen durchgeführt und modellhaft beschreiben. Die Experimente wurden im Regime der streifenden Streuung für Energien im keV-Bereich durchgeführt. Diese Streugeometrie bietet den Vorteil einer außerordentlich hohen Oberflächensensitivität und somit die Möglichkeit, die kristallographischen Eigenschaften der obersten Atomlage zu untersuchen. Darüber hinaus wurden Experimente zur Bestimmung des Energieverlustes der an den verschiedenen Oberflächen gestreuten Projektile und zur, durch diese Projektile induzierten, Elektronenemission durchgeführt. Die Anregungsenergie für die Elektronenemission und Exzitonen wurde an der Alumina/NiAl(110)- und der SiO2/Mo(112)- Oberfläche für die Streuung von He bestimmt. Durch die Bestimmung der Anzahl von emittierten Elektronen in Abhängigkeit des azimutalen Winkels konnten die Strukturen von obersten Lagen von Adsorbaten mit der Methode der Ionenstrahltriangulation bestimmt werden. / In the framework of the present dissertation the interactions of fast atoms with surfaces of bulk oxides, metals and thin films on metals were studied. The experiments were performed in the regime of grazing incidence of atoms with energies of some keV. The advantage of this scattering geometry is the high surface sensibility and thus the possibility to determine the crystallographic and electronic characteristics of the topmost surface layer. In addition to these experiments, the energy loss and the electron emission induced by scattered projectiles was investigated. The energy for electron emission and exciton excitation on Alumina/NiAl(110) and SiO2/Mo(112) are determined. By detection of the number of projectile induced emitted electrons as function of azimuthal angle for the rotation of the target surface, the geometrical structure of atoms forming the topmost layer of different adsorbate films on metal surfaces where determined via ion beam triangulation.

Die Anaphylaxie, eine potentiell lebensbedrohliche Reaktion, kann durch Kofaktoren beeinflusst werden. ACE-Inhibitoren, ß-Blocker und Acetylsalicylsäure (ASS) werden häufig in der Therapie von Herz-Kreislauferkrankungen eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob diese anaphylaktische Reaktionen begünstigen. Das Modell der passiv systemischen Anaphylaxie (PSA) wurde speziell angepasst, um die Behandlung einer Herz-Kreislauf-Therapie nachzubilden. Die orale Gabe von Metoprolol oder Ramipril verstärkte die Anaphylaxie geringfügig. Die Kombination der Medikamente steigerte die Anaphylaxie deutlich, was im Modell der passiv kutanen Anaphylaxie (PCA) bestätigt werden konnte. Gleichzeitig waren Mastzellmediatoren im Serum der Tiere erhöht. Die Inkubation muriner Mastzellen (MZ) mit den Medikamenten, steigerte die FcεRI-vermittelten Histaminfreisetzung in vitro. ASS-Vorbehandlung der Mäuse verstärkte die Ausprägung der PSA und der PCA, was mit einer Steigerung von MZ-Mediatoren im Serum assoziiert war. Die FcεRI-induzierte Histaminfreisetzung muriner MZ wurde hingegen nach ASS-Inkubation gehemmt, was auf einen indirekten Mechanismus hinweist. Die Reduktion der Prostaglandine (PG) durch ASS ist mit einer gesteigerten Leukotriensynthese verbunden. Der Leukotrienantagonist Montelukast konnte die, durch ASS verstärkte, PSA nicht mildern, was zeigt, dass dieser Effekt unabhängig von Leukotrienen ist. PGE2 kann die MZ-Degranulation über EP1-EP4-Rezeptoren modulieren. Tatsächlich schwächten EP3- und EP4-Rezeptoragonisten die durch ASS gesteigerte Anaphylaxie ab. PGE2 nimmt somit eine wichtige Rolle in der pro-anaphylaktischen Wirkung von ASS ein. Zusammenfassend wurde erstmals gezeigt, dass Metoprolol und Ramipril die Anaphylaxie über eine Steigerung der MZ-Reaktivität verstärken. ASS hingegen erhöht anaphylaktische Reaktionen über einen indirekt steigernden Effekt auf die MZ. PGE2 ist zumindest teilweise an der pro-anaphylaktischen Wirkung von ASS beteiligt. / Cofactors contribute to the severity of anaphylaxis, a potential life-threatening hypersensitivity reaction. ACE-inhibitors, ß-blockers and acetylsalicylic acid (asa) are frequently used drugs in cardiovascular therapy. Whether they affect systemic anaphylactic reactions has been addressed within this thesis. To this aim, the passive systemic anaphylaxis model (PSA) was employed here and specially designed to mimic a long term treatment in cardiovascular therapy. The data demonstrate that oral treatment of mice with ramipril or metoprolol alone slightly aggravated anaphylaxis. However, the combination clearly potentiated anaphylactic reactions, which was also confirmed in the passive cutaneous anaphylaxis model (PCA). In line with this, elevated amounts of mast cell (MC) mediators were detected in mice sera upon combined drug treatment. In vitro, FcεRI-mediated histamine release of murine MCs was likewise enhanced by the respective drugs. Pre-treatment of mice with asa aggravated the symptoms of PSA and PCA; simultaneously MC-mediators in sera were elevated. In contrast, FcεRI-mediated histamine release of MCs was reduced by asa in vitro, pointing to an indirect mechanism. Asa reduces prostaglandins (PGs) and increases leukotriene synthesis. The leukotriene antagonist montelukast failed to attenuate PSA, aggravated by asa, suggesting that the pro-anaphylactic effect of asa might be independent of leukotrienes. PGE2 can modulate MC degranulation via EP1-EP4 receptor. Indeed, EP3 and EP4 receptor agonists alleviated anaphylaxis enhanced by asa. Therefore PGE2 might play an important role in the pro-anaphylactic effect of asa. In conclusion, the data demonstrate for the first time that metoprolol and ramipril exacerbate anaphylactic symptoms by a direct increase in MC reactivity. In contrast, asa aggravates anaphylactic reactions by priming MCs through an indirect mechanism. PGE2 is at least partly involved in this process.

PixD (Slr1694) ist ein Photorezeptor, der den sensors of blue light using FAD (BLUF) Proteinen zugeordnet wurde. Die Übertragung des Stimulus auf das Apoprotein erfolgt in dieser Proteinfamilie über eine Neuordnung des Wasserstoffbrückennetzwerkes um den Kofaktor, in das die strikt konservierten Reste Tyrosin-8 (Y8), Glutamin-50 (Q50) und möglicherweise das semi-konservierte Tryptophan-91 (W91) involviert sind. Ziel dieser Arbeit war es, weitere Hinweise auf die Wasserstoffbrückenkonfiguration der Flavinbindetasche in Dunkel- und Lichtzustand zu erhalten, um eine bessere Vorstellung von der Stabilisierung des Lichtzustandes zu bekommen und mögliche Wege der Signaltransduktion an die Proteinoberfläche einzugrenzen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass sich lichtaktivierte Interaktionsänderungen zwischen Apoprotein und Chromophor auf die Neubildung einer Wasserstoffbrücke zum Flavin C4-Carbonyl beschränken. In Übereinstimmung zu früheren Analysen liegt das Q50 im Dunkelzustand in seiner Amid-Form vor. Sein Seitenkettencarbonyl ist im Lichtzustand vermutlich zu Y8 ausgerichtet, wobei Hinweise auf eine Amid-Imidsäure-Tautomerisierung des Glutamins in PixD gefunden wurden. Eine selektive Isotopenmarkierung des Tryptophan-91 zeigte Anzeichen für eine Verlängerung des β5-Stranges, die wahrscheinlich ein zentrales Element der Signalweiterleitung an die Proteinoberfläche darstellt. Möglicherweise erstreckt sich das Wasserstoffbrückennetzwerk dabei bis in die über dem beta5-Strang liegende alpha-Helix. Wird es gestört, scheint das Proteininnere für Imidazol zugänglich gemacht zu werden, wo es die Aktivierungsenergie für die Rückkehr in den Dunkelzustand beeinflusst. Auch Substitutionen des H73 im gegenüberliegenden Eckstrang des beta-Faltblattes beeinflussten die Geschwindigkeit der Dunkelrelaxation von PixD. Sie veränderten die IR-Absorption gegenüber dem Wildtyp jedoch nicht und unterstützen die Theorie einer Protonenleitung über das benachbarte H72. / The photoreceptor PixD (Slr1694) belongs to the sensors of blue light using FAD (BLUF) protein family. These photoreceptors propagate the signal by a rearrangement of hydrogen bonds surrounding the cofactor, involving the highly conserved residues tyrosine-8 (Y8), glutamine 50 (Q50) and perhaps the semi-conserved tryptophan-91 (W91). One aim of the presented work was to gain a deeper insight into the hydrogen bond configuration of the flavin binding pocket in the light and dark state conformations. Thereby, knowledge of the stabilization mechanisms for the light state and the signal propagation to the protein surface could be acquired. The results indicate a restriction of light induced changes in hydrogen bonding of the flavin to its C4 carbonyl. In agreement with former studies, the Q50 forms the amide isomer in the dark state. Its side chain carbonyl group most likely points towards Y8 in the active protein. Besides, the results support an amide-imidic acid-tautomerization of Q50 in PixD. A selective isotope labeling of the tryptophan-91 localized at the beginning of an edge strand of the beta sheet indicates an elongation of the secondary structure that may represent a central element of the signal propagation to the protein surface. The secondary structure is possibly connected with an alpha helix located above the beta5 strand by hydrogen bonds. A disturbance of this interaction probably allows the base catalyst imidazole to enter the protein core. Substitutions of H73 in the opposing edge beta strand changed the rate of the PixD dark relaxation as well. However, they had no visible effect on the infrared absorbance compared to the wild type and hence support a putative involvement of the neighbouring H72 in proton transfer reactions.

Das 20S Proteasom bildet den Protein degradierenden Teil des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) und ist damit an wichtigen zellulären Prozessen wie Genexpressionskontrolle, Zellzykluskontrolle, Apoptose, Peptidgenerierung zur MHC Klasse I Präsentation und Degradation fehlgefalteter Proteine beteiligt. Die einzelnen Schritte der Biogenese des 20S Proteasoms in Eukaryoten sind bisher nur in Ansätzen verstanden. In dieser Arbeit wird die Untereinheitenzusammensetzung von Biogeneseintermediaten und ihre subzelluläre Lokalisation und Organisation in humanen Zelllinien untersucht. Durch die Etablierung eines in vitro Systems konnten distinkte Assemblierungsintermediate humaner Proteasomen generiert werden und ein (-Ring als früheres Intermediat im in vitro System nachgewiesen werden. Aufschluss über den weiteren Vorgang der Assemblierung wurden durch in vivo Experimente mit radioaktiv markierten HeLa Zellextrakten gewonnen. So konnten vor allem neu synthetisierte und zuletzt eingebaute Untereinheiten identifiziert werden. Hierzu gehören die Untereinheiten ?1 und (7, die aufgrund ihrer in trans agierenden C-terminalen Verlängerungen einen Dimerisierungsprozess zweier Halbproteasom-Vorläuferkomplexe forcieren. Darüber hinaus kann die Untereinheit (1 aufgrund der gewonnen Erkenntnisse als die wahrscheinlich den (-Ring schließende Untereinheit im Vorläuferkomplex postuliert werden. Proteasomale Assemblierungsintermediate konnten außerdem durch immuncytochemische und biochemische Methoden am ER von humanen Zelllinien lokalisiert werden. Dabei scheint dem Assemblierungsfaktor POMP eine Schlüsselrolle zuzukommen, da dieser eine Assoziation der Vorläuferkomplexe mit dem ER erst ermöglicht. In dieser Arbeit sind weitere Schritte des komplexen Biogenese-Vorgangs konstitutiver 20S Proteasomen in humanen Zelllinien aufgeklärt worden und es konnte erstmals die subzelluläre Lokalisation für Assemblierungsintermediate in humanen Zellen beschrieben werden. / The 20S Proteasom represents the protein degrading part of the Ubiquitin- Proteasom- System and is therefore a participant in important cellular processes like gene expression, cell cycle control, apoptosis, peptide generation for MHC class I presentation and degradation of misfolded proteins. Only the beginnings of the individual steps of the 20S proteasome biogenesis in eucaryotes are so far understood. Tis work examines the subunit composition of assembly intermediates and their subcellular localisation and organisation in eucaryotic cells. Distinct assembly intermediates of human proteasomes have been generated by establishing an in vitro system. As an earlier intermediate in the in vitro system an (-ring could be identified. In vivo experiments using radioactive marked total lysates of HeLa cells shed light on the following sequence of assembly. Thus new synthesised and finally incorporated subunits could be indentified. Two of this subunits are (1 and (7 which could force the dimerisation process of two half-proteasome-precursor by their trans acting c-terminal extensions. Furthermore the (1 subunit has been identified as the (-ring completing subunit in the precursor complex. In addition it was possible to detect proteasomal assembly intermediates through immuncytochemical and biochemical methods on the ER of human cell lines. Thereby the assembly factor POMP plays a key role as it allows in the first place the precursor association with the ER. This work clarifies further steps of complex procedure of biogenesis of constitutive 20S proteasomes in human cell lines and allows the characterisation of the subcellular localisation of assembly intermediates in human cells for the first time.

Bei bhPIV3 handelt es sich um ein bovines Parainfluenzavirus Typ 3 (bPIV3), dessen Ober-flächenproteingene gegen jene des humanen Parainfluenzavirus Typ 3 (hPIV3) ausgetauscht wurden. Dieses ursprünglich als experimenteller Impfstoff gegen hPIV3 entwickelte Virus wurde darüber hinaus als Impfvektor zur Expression anderer viraler Antigene verwendet. Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden die ersten bhPIV3-basierten Vektoren für nicht-virale Antigene hergestellt und in einem ersten Versuch evaluiert. Dazu wurden ein reverses Genetiksystem zur Herstellung rekombinanter bhPIV3 in einem neuen Labor aufgebaut und fünf neue rekombinante Viren erhalten, welche zusätzlich Antigene des Mycobacterium tuberculosis (M. tb.) exprimieren. Balb/c-Mäuse wurden intranasal mit den bhPIV3-Vektoren infiziert, so dass sowohl deren Replikation als auch der induzierte protektive Effekt gegenüber M. tb.-Neuinfektionen getestet werden konnte. In einem ersten Versuch zeigte sich, dass eine Immunisierung mit den rekombinanten Viren allein keine Schutzwirkung entfaltet. Als Boost-Impfung nach Gabe des Bacille Calmette Guérin (BCG) zeigten einige Vektoren jedoch einen signifikanten protektiven Effekt. In einem Folgeversuch konnten diese Beobachtungen jedoch bislang nicht bestätigt werden, so dass weitere Versuche durchzuführen sind, bevor eine endgültige Aussage bezüglich des hervorgerufenen Schutzeffektes getroffen werden kann. In einem weiteren Tierversuch wurde gezeigt, dass die Baumwollratte ein Tiermodell darstellt, in dem bhPIV3 erheblich schlechter repliziert als hPIV3. Trotz der eingeschränkten Replikation induzierte bhPIV3 neutralisierende Antikörpertiter gegen hPIV3, die mit durch hPIV3 induzierten Titern vergleichbar waren. Mit Hilfe eines neu generierten rekombinanten Virus, welches das grün fluoreszierende Protein EGFP exprimiert, konnte ein Weg aufgewiesen werden, die Bestimmung neutralisierender Antikörpertiter deutlich zu vereinfachen. / The initial objective of this project was to establish a reverse genetic system for generation of recombinant bovine/human parainfluenza virus type 3 (bhPIV3), a bovine PIV3 (bPIV3) in which the bhPIV3 glycoprotein genes are replaced by their counterparts of human PIV3 (hPIV3). In addition, methods needed to characterise virus infectivity, genetic integrity and relevant in vitro phenotypes were established. The reverse genetics system was used to add individual mycobacterium tuberculosis (M. tb.) open reading frames (ORFs) as supernumerary gene units to the bhPIV3 genome and to rescue bhPIV3 vectors that expressed M. tb. antigens. In addition, a similar vector expressing the enhanced green fluorescent protein (EGFP) was constructed. Following the in vitro characterization of the derived viral vectors, the M. tb. vectors were evaluated for their efficacy to protect against M. tb. aerosole challenge in the Balb/c mouse model for tuberculosis. Although, in a single experiment, vaccination with bhPIV3 vectors alone did not confer any protection against M. tb. challenge, a boost with selected bhPIV3 vectors after Bacille Calmette Guérin (BCG) priming was successful in conferring protective efficacy against M. tb. challenge. A repeat of this challenge study could not confirm the initial observation, and further experiments are needed to determine whether the observed protection can be reliably reproduced. Evaluation of the bhPIV3 vectors in the cotton rat model showed that this small animal model is suitable to evaluate the attenuation phenotype of bhPIV3 compared to human parainfluenza virus type 3 (hPIV3). Although replication of bhPIV3 was highly restricted compared to hPIV3, hPIV3 neutralizing antibody titers induced by bhPIV3 infection were similar to those induced by hPIV3 infection. Studies with bhPIV3 expressing EGFP led to a new fluorescence based assay to determine hPIV3 neutralizing antibody titers. This assay could save time and resources in hPIV3 serology.