Noch immer gibt es trotz neuester medizinischer Operationstechniken Patienten, bei denen eine Fraktur zu einer verzögerten Heilung führt oder gar nicht heilt. Indizien häufen sich, dass das Immunsystem, seine Zellen und Zytokine eine wichtige Rolle im Prozess der Heilung einer Fraktur spielen könnten. In dieser Arbeit wurde der Einfluss des adaptiven Immunsystems auf die Fraktur-heilung untersucht. Dazu wurde der Heilungsverlauf in Wildtyp Mäusen mit RAG1-/- Mäusen, Mäusen ohne reife B- und T-Lymphozyten, verglichen. Histologische, immunhistologische sowie Mikroarray Analysen der verschiedenen Tierstämme lassen darauf schließen, dass T-Lymphozyten einerseits der Schlüssel für ein gutes Heilungsergebnis sind, andererseits ihr Fehlen maßgeblich zu einer Veränderung der Heilung führt. Diese resultierte darin, dass die Knorpelphase verkürzt war und eine ungeordnete Bildung von Geflechtknochen einsetzte. / Despite of advanced methods in trauma surgery some patients suffer from a delayed healing or a non-union one. There is more and more evidence that the immune system with its cells and mediators could play an important role in such healing situations. Hence this thesis investigated the role of the adaptive immune system in the process of fracture healing comparing healing in wildtype mice and RAG1-/- mice. RAG1-/- mice do not have mature B- and T-lymphocytes. Histological, immunohistological and microarry analyses of different mice strains reveal that T lymphocytes are the key cell for a normal healing outcome. Their absence leads to a different healing outcome with a diminished cartilage phase and an irregular distribution of woven bone in the whole callus region.

Im Fokus der Dissertation stand die Evaluierung molekularer Möglichkeiten zur Findung geeigneter Biomarker für das Prostatakarzinom (PCa). Zunächst wurde die epigenetische Promotormethylierung der Gene GSTP1, RARbeta2, APC und PITX2 im Hinblick eines möglichen Methylierungsfeldeffektes untersucht. Die RARβ2-Promotormethylierung konnte als potentieller Marker zur Tumorvorhersage im histologisch normal erscheinenden Gewebe bestimmt werden. GSTP1 zeigte eine äußerst spezifische Tumormethylierung, was dessen diagnostisches Potenzial unterstreicht. Die Methylierung korrelierte zudem mit pathologischen Parametern. Ein Screening im Array-Format identifizierte weitere Gene, deren Promotormethylierung diagnostisch interessant sein könnten. Des Weiteren wurden Genexpressionsanalysen angiogenetischer und Endothel-assoziierter Faktoren durchgeführt, deren diagnostische und prognostische Aussagekraft für das PCa ermittelt wurden. Dabei konnte für Caveolin-1 (CAV1) eine signifikante Herunterregulierung der mRNA-Menge im Tumor gezeigt werden. Die Bisulfit-Sequenzierung von sieben CpG-Dinukleotiden im CAV1-Promotor ergab zwischen Tumor- und tumorangrenzendem Gewebe differenzielle Methylierungsmuster, die zu einer verminderten CAV1-Transkription führen könnten. Zudem führte eine 5-Aza-2-desoxycytidin-Behandlung der CAV1-defizienten LNCaP-Zelllinie zur Reexpression. Weiterhin assoziierte CAV1 invers mit pathologischen Parametern und zeigte prognostische und diagnostische Relevanz. Immunhistologisch wurde CAV1 z.T. deutlich verringert in Endothelzellen und Fibroblasten des Tumors nachgewiesen. Ko-Kultivierungsversuche von HUVEC mit konditionierten Zellmedien ergaben z.T. signifikant reduzierte CAV1-Mengen in HUVEC. Die Ergebnisse zeigen, dass epigenetische Veränderungen wertvolle Informationen zur Diagnostik, Prognostik und Progression des PCa liefern. Zudem konnte CAV1 als potentieller Marker des PCa identifiziert werden. / The focus of the thesis was to evaluate molecular possibilities to find suitable biomarkers for prostate cancer (PCa). First, the epigenetic promoter methylation patterns of several genes (GSTP1, RARbeta2, APC and PITX2, respectively) were investigated for a possible methylation field effect. The RARbeta2 promoter methylation could be determined as a possible marker for tumor prediction in histologically normal-appearing tissue. GSTP1 showed a highly specific tumor methylation, underlining its diagnostic potential. The methylation also correlated with pathological parameters. Screening in an array format identified other genes whose promoter hypermethylation could be diagnostically interesting. Furthermore, gene expression analysis of angiogenic and endothelial-associated factors was performed to determine their diagnostic and prognostic potentials for PCa. For CAV1, a significant down-regulation of its mRNA level could be determined in the tumor. Bisulfite sequencing of seven CpG dinucleotides in the CAV1 promoter showed different methylation patterns between tumor and tumor adjacent tissue that could cause a reduced transcription. Furthermore, treatment of the CAV1-deficient LNCaP cell line with 5-aza-2-deoxycytidine led to CAV1 reexpression. Additionally, CAV1 inversely associated with pathological parameters and showed prognostic and diagnostic relevance. Immunohistochemical analysis clearly demonstrated decreases in CAV1 protein expression in endothelial cells and fibroblasts of the tumor. Conditioned media of cultivated tumor cells partly induced downregulation of the CAV1 protein level in HUVEC. The results show that epigenetic and angiogenic processes play crucial roles and provide valuable information for diagnosis, prognosis and progression of PCa. Moreover, CAV1 could be identified as a potential marker of prostate cancer.

Es wird angenommen, dass das Influenzavirus-Glykoprotein Hämagglutinin (HA) für seine Funktion sowohl bei der Virusfreisetzung als auch bei der Fusion von viraler und zellulärer Membran mit Cholesterin- und Sphingolipidreichen Domänen, sogenannten Membran-Rafts, assoziiert sein muss. Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit die Membran-Raft-Affinität von HA in lebenden Zellen mittels FLIM-FRET gemessen werden. Dabei wurde mit Hilfe der Fluroreszenz-Lebenszeit-Messung (FLIM) der Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) von fluoreszenzmarkiertem HA auf einen etablierten Raft-Marker bestimmt. Diese Messungen zeigten, dass beide Proteine in gemeinsamen Klustern in der Plasmamembran vorkommen. Durch Cholesterinentzug und durch den Einsatz von Cytochalasin D, welches die Mikrofilamente zerstört, konnte diese Klusterbildung reduziert werden. Demnach tragen sowohl die Membran-Rafts als auch das Aktinnetzwerk zu dieser Klusterbildung bei. Mittels FLIM-FRET konnte zusätzlich bestätigt werden, dass die Signale für die Detergenslöslichkeit von HA in Triton-Extraktionsexperimenten, die Palmitylierung und die stark hydrophoben Aminosäuren zu Beginn der Transmembrandomäne (TMD), auch im lebenden System eine wichtige Rolle spielen. Zusätzlich konnten biochemische Experimente zeigen, dass die hydrophoben Aminosäuren zu Beginn der HA-TMD den intrazellulären Transport, nach der Trimerbildung, entscheidend verzögern. Diese Verzögerung ist vermutlich auf einer erschwerten Integration dieser Proteine in die Membran-Rafts begründet. Die virale Fusion mit der Wirtszellmembran wird durch eine pH5-Behandlung vermittelte Konformationsänderung von HA ausgelöst. FLIM-FRET-Messungen zeigten für die pH5-Konformation von HA eine verglichen mit der pH7-Konformation verringerte Klusterbildung mit dem Raft-Marker. Somit ist offensichtlich, dass die Membranfusion-vermittelnde HA-Konformation eine verringerte Raft-Affinität besitzt. Diese verringerte Raft-Affinität könnte eine wichtige Rolle bei der Störung der Lipide an der Fusionsstelle spielen und somit die Bildung und/oder Vergrößerung der Fusionspore erleichtern. / It has been supposed that the hemagglutinin (HA) of influenza virus is recruited to cholesterol- and sphingolipid-enriched domains, also named membrane-rafts, to accomplish its function in virus budding and membrane fusion. This study aimed at verifying the affinity of HA for membrane-rafts in living cells using fluorescence-lifetime imaging microscopy to measure Förster’s resonance energy transfer (FLIM-FRET). FLIM-FRET revealed strong clustering between a fluorescence-tagged HA-protein and a well-established raft-marker in CHO cells. Clustering was significantly reduced when rafts were disintegrated by cholesterol depletion and when microfilaments were disrupted with cytochalasin D. Thus, membrane-rafts as well as the actin meshwork contribute synergistically to clustering. Clustering was also reduced by the removal of the known signals for the association of HA with detergent-resistant-membranes, the palmitoylation and the first amino acids in the transmembrane region (TMR). Since these mutations are obviously important for the raft-association of HA their function during the transport through the ER and the Golgi-complex was studied. These investigations showed that the exchange of the first three amino acids of the HA-TMR led to a decelerated transport after trimer-formation of the protein, probably due to retarded integration of these proteins into membrane-raft domains. Mediating viral fusion with the host cell membrane requires an irreversible conformational change of HA. FLIM-FRET studies of this low pH conformation unveiled that the clustering with the raft-marker is decisively reduced compared to the pre-fusion conformation of the protein. It might be assumed that the fusion-mediating conformation of HA reduces the proteins affinity for membrane-rafts. Therefore it is likely that this reduced affinity for rafts after the conformational change is relevant to cause perturbation of lipids at the fusion site and thereby facilitating the formation and/or enlargement of the fusion pore.

Die Studie auf die diese Arbeit aufbaut untersuchte die Immunogenität einer Wilms-Tumorgenprodukt-1-(WT1)-Peptid-Vakzinierung bei Patienten mit einer WT1-exprimierenden akuten myeloischen Leukämie (AML) ohne weitere Behandlungsoption. Trotz dem initalen immunologischen, molekularen und vorläufigen Nachweis einer möglichen klinischen Effektivität bei AML-Patienten, konnte nur in wenigen Fällen eine längerfristige Wirksamkeit dokumentiert werden. Es ist bekannt, dass eine Krebs-Immuntherapie durch Immunevasions-Mechanismen des Tumors beeinträchtigt werden kann. Da Analysen zu Mutationen oder Verlust des WT1-Epitops oder Epitop-flankierender Sequenzen keine Auffälligkeiten zeigten, konnte eine reduzierte Präsentation oder Erkennung des Epitops ausgeschlossen werden. Aus diesem Grunde sollte diese Arbeit weitere mögliche Immunevasions-Mechanismen identifizieren. Als Grundlage wurden Tumor-assoziierte Effekte, immunmodulatorische Faktoren und funktionelle Einschränkungen der Immunzellen in den Mittelpunkt der Untersuchungen gestellt. Die ermittelten Daten zeigen, dass in unserem spezifischen Therapieansatz, der wiederholten Vakzinierung von AML-Patienten mit einem HLA-A201-restringierten WT1126–134 -Epitop in Kombination mit GM-CSF und KLH, eine eingeschränkte T-Zell-Funktionalität einen wesentlichen Grund für die beobachtete verminderte Therapieeffizienz darstellt. Immunresistenzmechanismen leukämischer Blasten spielen hierbei keine übergeordnete Rolle, individuelle Effekte können aber nicht ausgeschlossen werden. Ebenso scheint es, dass auch die Präsenz von immunregulatorischen Zellen wie Tregs oder MDSCs nicht durch die Vakzinierung manipuliert wird und dass diese keinen generellen Einfluss auf die Therapieeffizienz ausüben. / The foregoing study investigated the immunogenicity of Wilms’ tumor gene product 1 (WT1)-peptide vaccination in WT1-expressing acute myeloid leukemia (AML) patients without curative treatment option. Despite the first immunologic, molecular, and preliminary evidence of potential clinical efficacy in AML patients, only in a few cases long-lasting responses could be documented. It is known that enduring efficacy of cancer vaccines may be limited due to immune escape mechanisms. On this account, we chose to work on three front lines: Investigations of immune modulatory counter-attack-mechanisms of the tumor, functional deficiencies of the T cell compartment and the presence of immune regulatory cells. The generated data demonstrates that in our specific setting, in which AML patients received consecutive vaccinations with HLA-A201-restricted WT1126–134 epitope together with GM-CSF and KLH, impaired vaccine efficacy is mainly attributed to restricted T cell functionality. Immune resistance mechanism exerted by leukemic blasts do not generally influence clinical outcome in our setting, neither do inert immunoregulative mechanisms like Treg or MDSC, respectively.

Wenn Hefe in einer kontinuierlichen Kultur wächst, kommt es zu einer spontanen Synchronisation der Zellen resultierend in einer stabilen respiratorischen Oszillation. Sowohl weite Teile des Transkriptoms als auch des Metaboloms oszillieren in klaren Phasenbeziehungen zu dieser respiratorischen Aktivität. In dieser Arbeit wird das Phänomen sowohl von theoretischer als auch experimenteller Seite untersucht. Es wird die Dynamik des Lipidoms analysiert und gezeigt, dass dieses ebenfalls oszillatorisches Verhalten aufweist. Dabei gibt es eine Gruppe an Lipiden, die ihre höchsten Konzentrationen in der Phase hoher Sauerstoffaufnahme zeigt und eine andere Gruppe in der Phase niedriger Sauerstoffaufnahme. Zudem werden vier Szenarien betrachtet, die in biochemischen Netzwerken zu Oszillationen führen können. Es wäre möglich, dass es sich um einen rein mechanistischen Effekt ohne eine unmittelbare Funktion - beruhend auf einer negativen Rückkopplung und einer intrinsischen Zeitverzögerung - handelt. Weiterhin könnten diese Oszillationen die sich ändernen physiologischen Anforderungen eines Prozesses, der in einer gegebenen Ordnung abzulaufen hat, widerspiegeln. Unter Verwendung von Minimalsystemen und in-silico Evolution wird gezeigt, dass Oszillationen zu einem Fitnessvorteil auf Einzelzellebene führen können. Dieser beruht zum einen darauf, dass Oszillationen eine zeitliche Trennung der Produktion toxischer Nebenprodukte von der Produktion der durch sie geschädigten Komponenten ermöglicht. Zum anderen erlaubt oszillatorisches Verhalten das Ablaufen von Reaktionen in dem für sie jeweils günstigsten Reaktionsmilieu. Basierend auf den experimentell bestimmten Austauschraten für Glucose, O2 und CO2 wird mittels FBA untersucht, wie sich die optimalen Syntheseraten von Biomasse und die Vorläufer selbiger über den Zyklus hinweg ändern. Die Ergebnisse deuten auf eine Trennung von Biosynthese und Stressantwort hin, was eine mögliche Funktion dieser Zyklen darstellen könnte. / When grown in continuous culture, budding yeast tend to autosynchronize resulting in a stable respiratory oscillation. Thereby, respiration toggles between high and low oxygen uptake rates. In parallel with this toggling, most facets of cellular physiology oscillate with distinct phase relationships e.g the transcriptome and metabolome. In this work, the phenomenon is examined from a theoretical as well as an experimental point of view. It can be shown that also the lipidome is oscillatory whereby one group of lipids peaks in the phase of high oxygen uptake and the second group of lipids in the phase of low oxygen uptake. Furthermore, four scenarios are presented that might lead to oscillatory dynamics in biochemical networks: Oscillation might occur due to a negative feedback and an intrinsic time delay without bearing a certain function. They could further reflect the changing physiological requirements of a process that has to be performed in a certain order. Using generic models and in-silico evolution, it can be shown that oscillations can also be beneficial on a single cell level since they allow a temporal separation of the production of a toxic by-product and the synthesis of its target and also that reactions can occur in their respective favored reaction milieu. Using measured exchange rates for glucose, O2 and CO2 as constraints for FBA, it is examined how the optimal synthesis rates for biomass and its precursors vary over a cycle. The results suggest that there is a temporal separation of processes related to biosynthesis and stress response which might reflect a possible function of the yeast metabolic cycle.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung von Geschlechterunterschieden (GU) in der Expression von miRNAs im späten Stadium der Myokardhypertrophie, sowie der möglichen Rolle von ERbeta bei der Regulierung dieser GU. Unsere früheren Studien identifizierten ERβ als determinierenden Faktor für die beobachteten GU bei Druckbelastung. Unter anderem führte eine Deletion des ERbeta zur Aufhebung der zuvor beobachteten GU auf physiologischer und fibrotischer Ebene, sowie in der Genexpression. In dieser Studie wurden insgesamt 30 miRNAs mit Geschlechter- und/oder Geschlecht*Operation-Interaktionseffekten 9 Wochen nach TAC in WT Mäusen identifiziert. Die gleichen Effekte waren in ERbeta-/- Tieren nicht zu beobachten, teilweise aufgrund einer höheren Expression dieser miRNAs in ERbeta-/- Weibchen als bei den Männchen. Die vorliegende Studie zeigt eine Hemmung vieler miRNAs durch Östrogen (E2) und seine Rezeptoren in weiblichen Kardiomyozyten, welches somit die in vivo-Ergebnisse bestätigt und die protektive Rolle von E2 und ERβ im weiblichen Herzen unterstreicht. Sechs der miRNAs mit GU in WT-, aber nicht in ERbeta-/- Hypertrophie-Modellen wurden als mögliche Fibroseregulatoren identifiziert, da ihnen gemeinsame Inhibitoren des ERK-MAPK-Signalwegs als Zielgene vorhergesagt wurden. Die Expression dieser miRNAs, miR-106a, miR-106b, miR-21, miR-24, miR-27a und miR-27b, war in kardialen Fibroblasten durch E2 geschlechterabhängig reguliert. Zusammengefasst bestätigt diese Arbeit die schützende Rolle von E2 und ERbeta im weiblichen Herzen. E2 und seine Rezeptoren hemmen die Expression vieler miRNAs in weiblichen Kardiomyozyten und kardialen Fibroblasten, sowie in vivo. In männlichen Herzen und kardialen Fibroblasten scheint ERalpha der Hauptakteur zu sein, welcher insbesondere mögliche Fibrose-bezogene miRNAs reguliert. Die verschiedenen Rollen der ERs in weiblichen und männlichen Herzen sind ein bestimmender Faktor der beobachteten GU bei Myokardhypertrophie. / The present study aimed to identify sex-differently expressed miRNAs in a late stage of hypertrophy (9 weeks) and the possible role of ERs in the regulation of these differences. Our previous studies identified ERbeta as an important determinant factor of the observed sex differences in pressure overload, playing different roles in males and females. This report identified a total of 30 miRNAs with sex and/or sex*surgery interaction effect 9 weeks after TAC in WT mice. The same effects were not observed in ERbeta-/- animals partially due to the higher expression of these miRNAs in ERbeta-/- females than in their WT counterparts. This study reveals a repression of a number of miRNAs by estradiol and its receptors alpha and beta in female cardiomyocytes, confirming the in vivo results and accentuating the important protective role of oestrogen and ERbeta in the female heart. Six of the miRNAs with sex differences in WT but not in ERbeta-/- hypertrophy models were found to be possible fibrosis regulators by putatively targeting common ERK/MAPK pathway inhibitors. MiR-106a, miR-106b, miR-21, miR-24, miR-27a and miR-27b were subjected to a different regulation by estradiol in cardiac fibroblasts in a sex-dependent manner. In conclusion, this study reinforces the oestrogen and ERbeta protective roles in the female hearts. Estradiol and ERs repress many miRNAs’ expression in both female cardiomyocytes and cardiac fibroblasts, as well as in vivo. In male hearts and cardiac fibroblasts, ERalpha is apparently the major player, regulating in particular potential fibrosis –related miRNAs. The different roles of ERs in male and female hearts are a determinant factor of the observed sex differences in cardiac hypertrophy.

Proteasomen sind Protease-Komplexe, die im Nucleo- und Cytoplasma eukaryontischer Zellen vorkommen. 26S-Proteasomen bestehen aus einem proteolytisch aktiven 20S-Kernkomplex und zwei regulatorischen 19S-Komplexen. Die Regulatorkomplexe erkennen Proteinsubstrate und kontrollieren den Zugang der Substrate in den katalytisch aktiven 20S-Komplex. Die Assemblierung des 20S-Komplexes erfolgt über Halbproteasomen, in denen Ringe aus a-Untereinheiten mit pro-b-Untereinheiten assoziiert sind . Modellvorstellungen zufolge erfolgt die Dimerisierung zweier Halbproteasomen in ein kurzlebiges Intermediat, das naszierende 20S-Proteasom, bevor die aktiven b-Untereinheiten autokatalytisch prozessiert werden. Der konservierte Maturierungsfaktor Ump1 ist mit proteasomalen Vorläuferkomplexen assoziiert und wird nach der Dimerisierung der Halbproteasomen und der Prozessierung der katalytischen Untereinheiten im Inneren des naszierenden 20S-Proteasoms degradiert. Auch Ump1-assoziierte proteasomale Vorläuferkomplexe sind vorwiegend nukleär. Grundlage dieser Arbeit war die Identifizierung des Proteins Blm3 als Proteasomen-assoziiertes Protein in Kernextrakten aus S. cerevisiae. Fluoreszenzmikroskopisch konnte die nukleäre Lokalisation von Blm3 in vivo gezeigt werden. Durch Glycerin-Dichtegradientenzentrifugation und die Charakterisierung von durch native Gel­elektrophorese aufgetrennten Komplexen konnte gezeigt werden, dass Blm3 an Ump1-assoziierte proteasomale Vorläuferkomplexe gebunden vorliegt. Durch native Gelelektrophorese und GFP-Markierungstechniken wurden Ump1-assoziierte Vorläuferkomplexe in Halbproteasomen und naszierende Proteasomen fraktioniert. Es konnte gezeigt werden, dass Blm3 nicht mit Halbproteasomen, sondern mit naszierenden 20S-Proteasomen interagiert. Im Dblm3-Deletionsstamm wurde durch Pulse Chase-Analysen eine beschleunigte Kinetik der Prozessierung des naszierenden Proteasoms und eine beschleunigte Degradation des Maturierungsfaktors Ump1 beobachtet. Das Protein Blm3 verzögert die Reifung des naszierenden Proteasoms in das maturierte 20S-Proteasom. Blm3 übt vermutlich einen koordinierenden oder regulatorischen Effekt auf die Maturierung und letztlich auf die Aktivierung des 20S-Proteasoms aus. / Proteasomes are multisubunit protease complexes that occur in the nucleo- and cytoplasm of eucaryotic cells. They participate in a variety of biological processes. 26S proteasomes consist of a proteolytically active 20S core complex and two regulatory 19S complexes. The regulatory complexes recognize substrate proteins and control the substrate access into the catalytically active 20S complex. The hollow cylindrical 20S complex consists of four heptameric staggered rings. The two inner rings contain seven different b-subunits each, three of which are catalytically active. The two outer rings possess seven different catalytically inactive a-subunits each. The assembly of the 20S complex occurs via half proteasomes in which rings of a-subunits are associated with pre-b-subunits. According to models, the dimerization of two half proteasomes into a short-lived intermediate, the nascent 20S proteasome, takes place before the active b-subunits are processed autocatalytically. The conserved maturation factor Ump1 is associated to half proteasomes and is, after their dimerization and the processing of the catalytical subunits, degraded inside the nascent 20S proteasome. In yeast, proteasomes are essentially localized at the nuclear periphery. Ump1-associated half proteasomes are also predominantly nuclear. The protein Blm3 was found associated with the Ump1-associated half proteasome in nuclear extracts of S. cerevisiae. By fluorescence microscopy, the nuclear localization of Blm3 could be shown in vivo. Ump1-associated precursor complexes were fractionated into half proteasomes and nascent proteasomes by native gel electrophoresis and GFP labelling techniques. It could be shown that Blm3 interacts with nascent proteasomes but not with half proteasomes. In a Dblm3 deletion strain, an accelerated kinetics of processing of proteasomal precursor complexes as well as an accelerated degradation of the maturation factor Ump1 could be observed by pulse chase analysis. Accordingly, the protein Blm3 delays the maturation of the nascent proteasome into the mature 20S proteasome. As a coordinating protein, Blm3 presumably exerts a regulating effect onto the maturation and, finally, onto the activation of the 20S proteasome.

Das COP9-Signalosom (CSN) ist ein evolutionär konservierter Proteinkomplex. Er besteht aus acht Untereinheiten und wird als Paralog des Lid-Subkomplexes des 26S Proteasoms angesehen. Das CSN verfügt über diverse enzymatische Aktivitäten, die es zu einem regulatorischen Faktor des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) machen. Das UPS ist für den Abbau von einem Großteil der zellulären Proteine notwendig. Für die Proteolyse bestimmter Proteine werden diese mit einer Polyubiquitinkette markiert. Dies geschieht über eine Enzymkaskade von E1, E2s und E3-Ligasen, wobei die E3s die Substratspezifität bestimmen. Die Interaktion von E3s mit dem CSN ist für deren Assemblierung und Aktivität von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren bindet das CSN eine Vielzahl von proteasomalen Substraten und scheint deren Abbau direkt zu kontrollieren. In dieser Arbeit konnte eine Interaktion des CSN mit dem Mikrotubuli-bindenden Protein EB1 nachgewiesen werden. EB1 wirkt präferentiell an den (+)-Enden von Mikrotubuli und fördert die Polymerisierung und Stabilität von Mikrotubulifilamenten. EB1 bindet über die Untereinheit CSN5 an das CSN. Die Interaktion von EB1 mit dem CSN findet im Centrosom statt und führt zur Phosphorylierung und Stabilisierung von EB1. Eine verminderte Bindung von EB1 an das CSN oder eine reduzierte Phosphorylierung von EB1 führt zu einem beschleunigten Abbau. Die Funktion der Interaktion zwischen EB1 und dem CSN wurde in CSN-siRNA-Zelllinien untersucht. Dazu wurden die Untereinheiten CSN1, 3 und 5 in HeLa-Zellen permanent herunterreguliert. Die siRNAs gegen CSN1 und 3 (siCSN1, siCSN3) führen zur Reduktion des gesamten CSN Komplexes, der Knockdown von CSN5 (siCSN5) nur zur Verminderung von CSN5. In allen drei Zelllinien ist der Abbau von EB1 beschleunigt, was auf eine verminderte Bindung an, bzw. Phosphorylierung durch das CSN zurückzuführen ist. Dies hat Konsequenzen für die Stabilität von Mikrotubulifilamenten in siCSN1- und siCSN3-Zellen. Diese zeigen eine erhöhte Sensibilität gegenüber Nocodazol, welches die Polymerisierung von Mikrotubuli inhibiert. Des Weiteren konnte ein durch Nocodazol ausgelöster Zellzyklusarrest durch die Überexpression von EB1 oder CSN1 in HeLa-Zellen überwunden werden. / The COP9 signalosome (CSN) is an evolutionary conserved protein complex. It consists out of eight subunits and is a paralogue to the lid subcomplex of the 26S proteasome. The CSN posesses several activities, supporting its function as a regulator of the Ubiquitin Proteasome System (UPS). The UPS mediates the degradation of the majority of the cellular proteins. Prior to degradation, a poly-ubiquitin chain is attached to the proteins. This process is catalyzed by a cascade of E1, E2s and E3-ligases. The CSN is a regulator of the E3-ligases, which determine substrate selectivity of the ubiquitination. The CSN also directly binds and thereby controls degradation of several proteasomal substrates. In the present study a direct interaction between the CSN and the microtubule binding protein EB1 is shown, which is mediated by the subunit CSN5. EB1 binds preferentially to the (+)-ends of microtubules and thereby promotes polymerisation rates and enhances the stability of microtubule filaments. The interaction between the CSN and EB1 is localized to the centrosome and results in EB1 phosphorylation and stabilization. A compromised binding of EB1 to the CSN results in an accelerated degradation. For functional studies of the CSN-EB1 interaction in HeLa cells, siRNA mediated knockdowns of CSN subunits were used. The subunits CSN1, CSN3 and CSN5 were knocked down permanently resulting in a faster proteolysis of EB1. This was a result of decreased amounts of CSN complex in cells with downregulated CSN1 and CSN3. The knockdown of CSN5 affects only subunit CSN5 levels causing a compromised binding of EB1 to the CSN complex. An increased sensitivity to the microtubule disrupting agent nocodazole was observed in the CSN1 and CSN3 knockdown cells. A cell cycle arrest induced in HeLa cells by nocodazole treatment was rescued by overexpression of EB1 or CSN1. The data presented in this study suggest a functional relationship of EB1 and the CSN resulting in a stabilization of microtubule filaments.

Parasitische Würmer wie Filarien können das Immunsystem ihres Wirtes modulieren. Diese Immunmodulation schützt nicht nur den Parasiten, sondern kann auch den Wirt vor allergischen Reaktionen schützen. In der vorliegenden Arbeit konnte belegt werden, dass Filariencystatin, ein sezernierter Proteinaseinhibitor des Fadenwurms Acanthocheilonema viteae Th2-assoziierte Entzündungen und die daraus resultierende Atemwegserkrankung im murinen Asthmamodell supprimiert. Diese Effekte von Cystatin beruhen wahrscheinlich auf der Induktion von IL-10 sezernierenden Makrophagen. Dafür spricht, dass sowohl die Depletion von Makrophagen, als auch die Blockierung von IL-10 den schützenden Effekt von Cystatin aufhoben. In einem murinen Dermatitismodell konnte durch Cystatinapplikation die Entzündung der Haut ebenfalls unterbunden werden. Die Verbesserung der atopischen Dermatitis führte zu einem Anstieg von TGF-Beta in den Ekzemregionen. Zusammenfassend belegen die Daten, dass ein einzelnes rekombinantes Helminthenprotein den anti-allergischen Effekt einer Gesamtwurminfektion nachahmen kann. Des weiteren wurde untersucht, ob die Immunmodulation von Helminthen an die Biologie des Wurmes gebunden ist. Der Einfluss einer gastrointestinalen Wurminfektion mit Heligmosomoides polygyrus wurde in Modellen mucosa-assoziierter allergischer Atemwegsentzündung und nicht-mukosa-assoziierter, kutanen Dermatitis untersucht. Im Asthmamodell konnte eine Reduzierung der Inflammation beobachtet werden, im Dermatitis Modell keinerlei Verbesserung des klinischen Bildes. Die Wurminfektion führte zu erhöhten Werten von Foxp3+ regulatorischen T-Zellen (Treg) in peribronchialen Lymphknoten, im Gegensatz dazu konnten keine Treg Zellen in ekzematöser Haut nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind ein wichtiger Aspekt beim Einsatz von Helminthen zur Behandlung allergischer Erkrankungen, da die Lokalisation des Wurmes ein entscheidender Faktor in Richtung Verbesserung oder Verschlimmerung allergischer Erkrankungen zu sein scheint. / Parasitic worms, like filariae, have the intriguing capacity to modulate immune responses directed against them. This immunomodulation protects the parasite and was found to mediate a negative correlation between parasite infections and the prevalence of allergic disease. In the present study filarial cystatin (Av17), a secreted protease inhibitor of the filarial nematode Acanthocheilonema viteae, was found to suppress Th2-related inflammation and allergic airway responsiveness in mice. These effects of Av17 on allergic airway inflammation were probably due to induction of IL-10 secreting macrophages. Depletion of macrophages as well as blocking of IL-10 by application of anti-IL-10 receptor antibodies, prevented the curative effects and restored allergic airway inflammation. Treatment with cystatin in a model of allergic skin disease, suppressed inflammation, too. The protective effect on atopic dermatitis was accompanied by an increase of TGF-Beta in the eczema region. Hence, the data demonstrate that treatment with a single recombinant helminth protein can exert the anti-allergic effects of helminth infections. Furthermore this study investigated if immunomodulation by helminths is dependent on the biology of the worm. Infection with the gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus, was analyzed in models of mucosa-associated airway disease and non-mucosal, cutaneous atopic dermatitis. Infected mice showed reduced signs of allergic airway inflammation but no differences in phenotypical signs of dermatitis. Worm infection was associated with elevated numbers of Foxp3+ regulatory T cells (Treg) in peribronchial lymph nodes in the asthma model, whereas Treg cells were basically absent in eczematous skin. These findings might be an important aspect for future considerations of helminths for treatment of allergic diseases, as localisation of the parasites might be a crucial factor leading to amelioration or aggravation of allergic disease.

Die beständige Autoantikörperproduktion in Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes (SLE) suggeriert die Existenz eines autoreaktiven humoralen Gedächtnisses; die Häufigkeit selbstreaktiver Gedächtnis-B-Zellen in SLE wurde jedoch noch nicht ermittelt. Unter normalen Umständen exprimieren neu gebildete B-Zellen im Knochenmark Autoantikörper mit hoher Frequenz, darunter auch antinukleäre Antikörper. Diese autoreaktiven B Zellen unterliegen einer strengen Überwachung an zwei Kontrollpunkten für Selbsttoleranz, einer im Knochenmark und einer in der Peripherie. Im Gegensatz dazu steht SLE mit einem Defekt in Zusammenhang, der die Etablierung von B-Zell-Toleranz an diesen beiden Kontrollpunkten verhindert und somit einer hohe Anzahl selbstreaktiver naiver B-Zellen in der Peripherie. Das Ziel dieser Studie war die Bestimmung der molekularen Eigenschaften und Reaktivitäten von IgG Gedächtnis-B-Zell-Antikörpern in SLE. Mittels einer Einzelzell-PCR basierten Methode wurden 200 monoklonale Antikörper von einzelnen IgG+ Gedächtnis-B-Zellen vier unbehandelter SLE Patienten kloniert. Die generelle Häufigkeit an polyreaktiven und HEp-2 selbstreaktiven Antikörpern in dieser Population war vergleichbar mit der in gesunden Vergleichspersonen. 15% der Antikörper aus IgG+ Gedächtnis-B-Zellen eines Patienten mit Serum-Autoantikörpertitern derselben Spezifität waren hochreaktiv und spezifisch gegen die SLE-assoziierten löslichen Kernantigene Ro52 und La; nicht jedoch in den übrigen drei Patienten oder gesunden Vergleichspersonen. Die Keimbahnkonfigurationen dieser Antikörper gegen Kernantigen waren nicht-selbstreaktiv oder polyreaktiv mit schwacher Ro52-Bindung und untermauern die Theorie, dass somatische Mutationen zur Reaktivität und Spezifität von Autoantikörpern beitragen. Die Häufigkeitsvarianz, mit der Gedächtnis-B-Zellen SLE-assoziierte Antikörper exprimieren, legt nahe, dass dies eine wichtig Variable für den Erfolg von Therapien sein kann, die diese Population beseitigen. / Persistent autoantibody production in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) suggests the existence of autoreactive humoral immunological memory, but the frequency of self-reactive memory B cells in SLE has not been determined. Under normal circumstances, autoantibodies including antinuclear antibodies (ANAs) are frequently expressed by newly generated B cells in the bone marrow, but these autoreactive B cells are tightly regulated at two checkpoints for self-tolerance, in the bone marrow and the periphery, before maturation into naïve immunocompetent B cells. In contrast, SLE is associated with a failure to establish B cell tolerance at the two checkpoints leading to high numbers of autoreactive naïve B cells in the periphery. The aim of this study was to determine the molecular features and reactivities of IgG memory B cell antibodies expressed in SLE. A single-cell PCR based strategy was applied that allowed the cloning of the Ig heavy and Ig light chain genes of a single purified B cell and the in vitro expression of 200 recombinant monoclonal antibod-ies from single IgG+ memory B cells of four untreated SLE patients. The overall frequency of polyreactive and HEp-2 self-reactive antibodies in this compartment was similar to healthy controls (HC). 15% of IgG memory B cell antibodies were highly reactive and specific for SLE-associated extractable nuclear antigens (ENAs) Ro52 and La in one patient with serum autoantibody titers of the same specificity but not in the other three patients or healthy individuals. The germline forms of the ENA antibodies were non-self-reactive or polyreactive with low binding to Ro52 supporting the idea that somatic mutations contribute to autoantibody specificity and reactivity. Heterogeneity in the frequency of memory B cells expressing SLE-associated autoantibodies suggests that this variable may be important in the outcome of therapies that ablate this compartment.