Se ist ein essentielles Spurenelement, das seine biologische Aktivität als Selenocystein in den katalytischen Untereinheiten von Selenoproteinen entfaltet. Es wird als Supplement in der Prävention und Therapie einiger Volkskrankheiten wie Autoimmunerkrankungen und Krebs eingesetzt. Die verfügbaren Ergebnisse der klinischen Studien deuten auf geschlechtsspezifische Unterschiede in der Wirksamkeit von Se. Aus diesem Grunde sollte in der vorliegenden Arbeit die Biosynthese von Selenoproteinen in männlichen und weiblichen Mäusen als Modellorganismus für höhere Säugetiere analysiert und verglichen werden. Die gewonnenen Ergebnisse belegen eindeutig, dass die mRNA Konzentrationen von Selenoprotein P, der 5''-Iodothyronin-Deiodase Typ 1 und der extrazellulären Glutathion-Peroxidase 3 geschlechtsspezifische Unterschiede aufweisen. Dieser Dimorphismus ist jedoch nicht konstant, sondern variiert von Gewebe zu Gewebe und zeigt überdies auch eine Abhängigkeit vom Se-Status der Tiere und dem untersuchten Mausstamm. Überraschenderweise korrelieren die resultierenden Proteinmengen nicht linear mit den Unterschieden der mRNA Konzentrationen. Besonders die 5''-Iodothyronin-Deiodase Typ 1 zeigt ausgeprägte Unterschiede in Leber und Niere, wobei sich die Geschlechtsdimorphismen auf mRNA- und Protein-Ebene unterschiedlich stark ausprägen und vom Se-Status beeinflusst werden. Zusammengenommen zeigt diese Arbeit, dass die Expression von Selenoproteinen auf zwei Kontrollebenen geschlechtsspezifisch reguliert wird: über steroidabhängige Gentranskription werden unterschiedliche mRNA Konzentrationen abhängig vom Mausstamm, Alter und Se-Status in den Geweben exprimiert, und über noch nicht eindeutig identifizierte Mechanismen wird die Effektivität, mit der diese Transkripte in die entsprechenden Selenoproteine übersetzt werden, geschlechtsspezifisch kontrolliert. Diese Se-abhängige Regulation der Biosyntheserate, die vermutlich über eine veränderte Translationseffizienz erfolgt, stellt ein sehr überraschendes Ergebnis dar. Sollte es sich in menschlichen Proben bestätigen, so könnten diese Ergebnisse helfen, die geschlechtsspezifischen Befunde in den klinischen Supplementationsstudien zu verstehen und entsprechend abgestimmte Empfehlungen für eine unterschiedliche Supplementation von Mann und Frau zu erarbeiten. / Selenium is an essential trace element and acts as Selenocystein in the catalytic entity of selenoproteins. It is currently in use as supplement in the prevention and therapy of a variety of diseases including autoimmune diseases and cancer. The epidemiological and clinical data indicate that the effectiveness of Se supplementations is sex-specific. Therefore, this thesis was initiated to analyse and compare the expression of selenoproteins in male and female mice as a suitable model organism for higher mammals. The experimental data clearly indicate that selenoprotein P, type I 5'' iodothyronine deiodinase and the secreted glutathione peroxidase 3 display sex-specific differences in mRNA concentrations. The sexual dimorphic expression patterns of these selenoproteins are not constant but depend on the tissue, the Se-status of the animals and the specific mouse strain analysed. Surprisingly, no direct correlation is observed when mRNA levels and expressed protein concentrations are compared. This becomes very obvious in the case of type I 5'' iodothyronine deiodinase in liver and kidney. Both mRNA and protein levels differ between the sexes in a discordant and Se-dependent manner. Taken together, this thesis indicates that selenoprotein expression is regulated in a sex-specific manner by two different mechanisms. First of all, steroid-dependent gene transcription gives rise to sexually dimorphic mRNA levels in the different tissues. Mouse strain, age and Se-status influence this process. Secondly, the sexes differ profoundly with respect to the efficiency of selenoprotein biosynthesis from a given number of transcripts. Presumably, this process involves Se-dependent translational control mechanisms that have not been described before. Under the assumption that these results can be verified with human samples, it is conceivable that this new mechanism might help to explain some of the enigmatic sex-specific effects observed in human supplementary studies and that sex-specific supplementation regimen need to be worked out in the long run.

In dieser Arbeit wurde die Systematik und Evolution der Viviparidae (Mollusca, Gastropoda, Caenogastropoda) mit einem Fokus auf den asiatischen Gattungen untersucht. Es wurde die erste umfassende gattungsübergreifende Phylogenie der Gruppe mit Vertretern von mehr als 70% der bekannten Viviparidengattungen durch die Analyse eines molekularen Datensatzes aus mitochondrialen wie auch nukleären Sequenzen rekonstruiert. Die Einteilung in die aufgrund von anatomischen Merkmalen beschriebenen Unterfamilien konnte durch die genetischen Untersuchungen bestätigt werden. Neben der molekularen Systematik stand auch die Aufklärung der historischen Biogeographie der Viviparidae im Fokus. Mithilfe von Fossilbelegen und der Anwendung einer molekularen Uhr wurde die Diversifikation dieser Familie in Raum und Zeit untersucht. Abschätzungen über das Alter der Abspaltungen der wichtigsten Abstammungslinien innerhalb der Viviparidae mittels der molekularen Uhr lassen sowohl Vikarianz- als auch Dispersal-Ereignisse am Zustandekommen heutiger Verbreitungsmuster erkennen. Die bisherige systematische Gliederung der Viviparidae ist ausschließlich durch einen conchologischen Ansatz geprägt. Bei der Untersuchung zur Evolution der Schale, unter Berücksichtigung der molekularen Ergebnisse, zeigt sich jedoch, dass eine klare Ordnung innerhalb der Vivipariden, bezogen auf die Entstehung von Farbbändern oder Skulpturierungen auf der Schalenoberfläche, nicht zu erkennen ist. Scheinbar komplexe Schalenmerkmale entstanden mehrfach unabhängig in unterschiedlichen Linien. Es konnte hier aber auch gezeigt werden, dass die Untersuchung von anatomischen Merkmalen im Vergleich zur Schale wesentlich besser geeignet ist, natürliche Verwandtschaftsbeziehungen zu erkennen. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse schaffen die Grundlage für eine in Zukunft nötige Revision der Familie Viviparidae auf Gattungsebene. / This thesis focusses on the systematics and evolution of Viviparidae (Mollusca, Gastropoda, Caenogastropoda), a large and putatively ancient group of ovoviviparous freshwater gastropods with an almost worldwide distribution. With more than 200 described species with highly disparate shells, Asia and Australia have the highest viviparid diversity. Three genetic markers where used to calculate the first molecular phylogeny comprising more than 70% of all extant viviparid genera which provides new insights into the systematics and biogeography of this diverse group of freshwater snails. The traditional division into three subfamilies (Lioplacinae Gill, 1863, Viviparinae Gray, 1847 and Bellamyinae Rohrbach, 1937), based on anatomical data, is supported by the molecular phylogeny. The taxonomy of the Asian taxa is still largely based on shell morphology and rather inconsistent, though, making it difficult to gain deeper insights into their evolution and biogeography at present. The molecular phylogeny presented here indicates that the current shell morphology-based viviparid taxonomy does not reflect the phylogenetic relationships of species and clades. In addition to the focus on molecular systematics, a major part of this thesis is devoted to elucidating the historical biogeography of viviparids. A molecular clock analysis based on a calibration scheme using fossils of varying age and taxonomic affinity was used to yield divergence time estimates for the major viviparid lineages. Ancestral areas were inferred by parsimony and likelihood analyses. Viviparid distribution patterns have been shaped by both dispersal and vicariance events. The study of anatomical features turned out to be considerably better approach for establishing phylogenetic relationships of viviparids, manifested in good support of genera established by molecular data. The results obtained in this work provide the basis for a much needed revision of the Viviparidae at the generic level.

In der vorliegenden Arbeit wurde der spezifische Einfluss verschiedener kernkodierter phagentypischer RNA Polymerasen auf die organelläre Genexpression in Physcomitrella und die mitochondrial Genexpression in Arabidopsis untersucht. Während das Fehlen von AtRpoTm in Arabidopsis und PpRpoTmp1 in P. patens lethal ist, wurden Insertionsmutanten für PpRpoTmp2 und AtRpoTmp einer detailierten Untersuchung unterzogen. Sowohl PprpoTmp2, als auch AtrpoTmp Pflanzen zeigten Abweichungen im Phänotyp charakteristisch für mitochondriale Dysfunktion. Identifizierte organelläre Promotoren in P. patens wurden zum Nachweis der Transkriptionsaktivität von PpRpoTmp1 und PpRpoTmp2 in vitro herangezogen. Beide Proteine besitzen die inhärente Fähigkeit zur Promotorerkennung ohne zusätzliche Kofaktoren. Die hier vorgestellten Studien unterstreichen die essentielle Bedeutung von AtRpoTm und PpRpoTmp1 für die Transkription mitochondrialer bzw organellärer Gene in Arabidopsis und P. patens. Im Gegensatz dazu können die Funktionen von AtRpoTmp und PpRpoTmp2 partiell durch andere organelläre RNAPs ersetzt werden. Phänotypische Abweichungen belegen jedoch, das AtRpoTmp und PpRpoTmp2 für die normale Entwicklung von Arabidosis bzw. P. patens essentiell sind. Veränderte Transkriptmengen in AtrpoTmp Pflanzen korrelierten mit genspezifischen Änderungen in der mitochondrialen Transkription. AtRpoTmp muss daher als essentiel für die normale Expression eines spezifischen Sets mitochondrialer Gene angesehen werden. Jedoch konnten für diese mitochondrialer Gene keine AtRpoTmp spezifischen Promotormotive mit reduzierter Aktivität identifiziert werden. Initiationsraten an allen Promotoren stromaufwärts von mitochondrialen Genen mit geringeren Transkriptmengen sind jedoch reduziert. Es erscheint daher wahrscheinlich, daß für einen Teil der mitochondrialen Gene genspezifische Elemente existieren, welche die Transkription durch AtRpoTmp dirigieren. / This study aimed to elucidate how the different transcriptional activities are facilitated in mitochondria of Arabidopsis thaliana and in both organelles of Physcomitrella patens. Insertional mutants for PprpoTmp2 and AtrpoTmp were analysed in detail. As for Arabidopsis RpoTm, knock-out of Physcomitrella RpoTmp1 was found to be lethal. Null mutant plants PprpoTmp2 and AtrpoTmp show surprisingly similar but clearly convergent phenotypical aberrations reminiscent of phenotypes reported for other mitochondrial mutants. Evidence is provided that PpRpoTmp1 and PpRpoTmp2 are functional RNA polymerases, which both posses the inherent ability to recognize organellar promoters in a minimal in vitro transcription system without the aid of additional cofactors. The data suggest that coding for two RpoT proteins one representing an enzyme with a high portion of non-specific transcriptional activity, as seen for AtRpoTmp and PpRpoTmp1 and one that can act as a single-polypeptide enzyme and recognize numerous mitochondrial promoters in vitro as AtRpoTm and PpRpoTmp2 echo convergent inventions but reflect complementing roles of these RNA polymerases in plant mitochondrial transcription. Phenotypical aberrations of rpoTmp2 plants suggest RpoTmp2 is important for normal growth and development. Altered transcript levels in AtrpoTmp were found to result from gene-specific transcriptional changes, establishing that AtRpoTmp functions in distinct transcriptional processes within mitochondria. Decreased transcription of a specific set of mitochondrial genes in AtrpoTmp was not associated with changes in the utilisation of specific promoters. Therefore AtRpoTmp function is not promoter-specific but gene-specific. This indicates that additional gene-specific elements direct the transcription of a subset of mitochondrial genes by RpoTmp.

Makrophagen sind professionelle phagozytische Zellen, welche körpereigene gealterte oder toten Zellen und in den Körper eingedrungene Krankheitserreger aufnehmen. Die phagozytierten Partikel werden von lysosomalen Hydrolasen abgebaut und daraus hervorgehende Antigene an Zellen des spezifischen Immunsystems präsentiert. Aufgabe der lysosomalen Phospholipase A1 (PLA1) ist der Abbau von Phospholipiden. Sie spielt damit nicht nur eine elementare Rolle bei dem Abbau von Phospholipidmembranen nach Phago- und Autophagozytose, sondern kann auch an der Generation von Lipidantigenen beteiligt sein. Die vorliegende Arbeit bietet zum ersten Mal Hinweise auf die Sequenz der lysosomalen PLA1. Mittels proteinbiochemischer Reinigung und nachfolgender massenspektrometrischer Sequenzanalyse wurden zwei Proteinkandidaten identifiziert, welche der lysosomalen PLA1-Aktivität zugrunde liegen können. Des Weiteren werden ausführliche Untersuchungen zu den Katalyseeigenschaften des Enzyms an Liposomen präsentiert. Die Lipidzusammensetzung der Membran beeinflusst maßgeblich die Aktivität der lysosomalen PLA1. So haben in die Membran integrierte anionische Phospholipide eine stark enzymaktivierende Wirkung. Eine Erhöhung der Ionenstärke oder des pH-Wertes vermindern die Bindungsfähigkeit der lysosomalen PLA1 an die Membran und damit deren Aktivität. Dies lässt vermuten, dass elektrostatische Wechselwirkungen eine Rolle bei der Membranbindung spielen. Das Enzym besitzt pIs / Macrophages are professional phagocytes which engulf and degrade senescent and dead cells as well as pathogens. Phagocytosed particles are subsequently degraded by lysosomal enzymes. The lysosomal phospholipase A1 (PLA1) degrades phospholipids, the major components of biological membranes and, hence, plays a mandatory role in decomposition of phagocytosed and autophagocytosed membranes. Furthermore the enzyme might play a role in the processing of lipid antigens for immune presentation. Nevertheless, the gene encoding this important enzyme activity is as yet unknown. Here, we used proteinbiochemical methods to isolate the lysosomal PLA1 activity from RAW B cells and identified resulting sequences by tandem mass spectrometry. This analysis revealed for the first time two putative protein candidates responsible for lysosomal PLA1 activity. Using native enzyme fractions and liposome-embedded substrate, we show that PLA1 activity depends on the presence of anionic phospholipids, low pH and low ionic strength. Lysosomal PLA1 only attaches to membranes with anionic but not zwitterionic charges. High ionic strength impairs binding demonstrating that electrostatic attraction is responsible for membrane partitioning. Upon binding the enzyme remains on membranes for numerous catalytic cycles. The enzyme’s pIs at

Hantaviren sind einzelsträngige RNA-Viren, die zur Familie der Bunyaviridae gehören. In den letzten Jahren haben sie immer mehr Aufmerksamkeit als “emerging viruses” auf sich gezogen, welche zunehmend Relevanz als humanpathogene Erreger gewinnen. Sie verursachen, abhängig vom Hantavirustyp, zwei verschiedene Krankheitsbilder: das hämorrhagische Fieber mit renalem Syndrom (HFRS) und das kardiopulmonale Syndrom (HCPS). Beide Syndrome sind mit Veränderungen in der vaskulären Permeabilität, akutem Abfall der Blutplättchen (Thrombozytopenie) und Koagulationsdefekten verbunden. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch immer kaum verstanden. Hantaviren infizieren zwar Endothelzellen, bisher aber konnte kein zytopathischer Effekt nachgewiesen werden. Diese Doktorarbeit untersucht in vitro, ob und auf welche Weise Hantaviren mit Zellen des hämostatischen Systems interagieren. Zu diesen gehören insbesondere Megakaryozyten, die Thrombozyten generieren und die Thrombozyten selbst. Wir zeigen, dass das pathogene Hantaan Virus (HTNV), im Gegensatz zu dem weniger pathogenen Tula Virus (TULV) und Prospect Hill Virus (PHV), megakaryozytäre Zellen infiziert. Interessanterweise erhöht sich nach Induktion der Differenzierung in den infizierten megakaryozytären Zellen die Virusrepliaktion drastisch. Das Überleben der Zellen und der Verlauf der Differenzierung wird dadurch jedoch nicht beeinflusst. Ähnlich, wie bereits früher für Endothelzellen gezeigt, haben demnach pathogene Hantaviren keinen direkten zytopathischen Effekt auf Megakaryozyten. Weiterhin verdeutlicht die vorliegende Doktorarbeit, dass HTNV mit humanen Thrombozyten interagiert. Dies resultiert in einer Herunterregulation von essentiellen Oberflächenmarkern, die wichtig für die Aggregation und das Signalling sind. / Hantaviruses are single stranded (ss) RNA viruses belonging to the family Bunyaviridae. Over the past years they attracted more and more attention as “emerging viruses”, increasingly gaining relevance as human pathogens. Depending on the hantavirus type they cause haemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) or hantavirus cardiopulmonary syndrome (HCPS). Both syndromes are associated with changes in vascular permeability, acute thrombocytopenia, and defects in platelet function. The underlying mechanisms are still poorly understood. Although hantaviruses infect endothelial cells, no viral cytopathic effect after infection was observed. This thesis investigates in vitro whether and how hantaviruses target cells of the haemostatic system. In particular megakaryocytes (MKs), which generate platelets, and platelets themselves. We show that pathogenic Hantaan virus (HTNV), in contrast to less pathogenic Tula virus (TULV) and Prospect Hill virus (PHV), infects megakaryocytic cells. Intriguingly, after induction of differentiation megakaryocytic cells switch from low-level to high-level HTNV production without reduction in cell survival or alteration in differentiation. Thus, there is no direct viral pathogenic effect on megakaryocytic cells as previously observed for endothelial cells. Furthermore, this study demonstrates that HTNV interacts with human platelets, resulting in downregulation of essential adhesion markers, which are important for platelet aggregation and signalling.

Im Zuge der frühen embryonalen Herzentwicklung entstehen ausgehend von einem einfachen Herzschlauch zwei deutlich voneinander getrennte Herzkammern. Die Kardiomyozyten des Atriums und Ventrikels weisen spezifische Eigenschaften auf, die sich morphologisch wie auch funktionell auf das Herz auswirken. Veränderungen in der Gewebsarchitektur werden hauptsächlich durch Zellinterkalation und kollektive Zellmigration erreicht. Viele Studien zeigen, dass der Wnt/PCP-Signalweg eine essentielle Rolle in der Regulation dieser Bewegungen einnimmt. Die Daten dieser Studie belegen, dass die nicht-kanonischen Liganden Wnt11 und Wnt5b sowie die Kernkomponenten des PCP Signalweges Fzd7, Vangl2, Dvl2 und Pk1 an der Steuerung der Reorganisation der Kardiomyozyten während der Kammerbildung beteiligt sind, was Einfluss auf die Architektur des frühen Myokardiums nimmt. Effektoren des PCP Signalweges umfassen das Zytoskelett sowie Adhäsions- und Migrationsprozesse. In dieser Studie wird gezeigt, dass die Komponenten dieses Signalweges im Myokardium hauptsächlich Prozesse der Actomyosin Modulation regulieren und damit unter anderem die Morphologie der Kardiomyozyten beeinflussen. Zusätzlich ist die frühe Kardiogenese durch eine Relokalisierung der phosphorylierten Form der Myosin Regulatory Light Chain (MRLC) vom Kern zur Membran gekennzeichnet. Hier wird gezeigt, dass die Phosphorylierung von MRLC sowie die Relokalisation von den Kernkomponenten des PCP Signalweges kontrolliert werden sowie dass es im Verlauf der frühen Herzentwicklung u.a. durch die Relokalisierung von pMRLC zu Änderungen in der Gewebespannung kommt, welche sich auf die nukleäre Spannung auswirken und damit Veränderungen in der Genregulation hervorrufen. Diese Veränderungen werden hauptsächlich durch Effekte auf die Lokalisation und Aktivität des Serum Response Factors (SRF) vermittelt, welche in diesem Kontext durch die PCP Kernkomponente Pk1 reguliert sind. / Formation of a complex multiple-chambered heart from the simple linear heart tube does not only require orchestrated morphogenesis of the myocardium, but also cardiac muscle differentiation and changes in intercellular electrical coupling. To date, the processes that lead to the formation of a functional syncytium are incompletely understood. One of the major pathways controlling multiple aspects of organogenesis and tissue morphogenesis is the planar cell polarity (PCP) pathway. Changes in tissue architecture are controlled by cell intercalation and collective cell migration. It is widely accepted that Wnt/PCP signaling plays a crucial role in guiding these cellular processes. This study provides evidence that morphogenesis of the heart is controlled by the non-canonical ligands Wnt11 and Wnt5b and the PCP core components Fzd7, Vangl2, Dvl2, and Pk1 through regulation of cell rearrangements during embryonic cardiac remodeling. Downstream effectors of the PCP pathway target adhesion processes, cytoskeleton, and migration. Here, it is revealed that PCP signaling in the heart affects cardiomyocyte morphology and actomyosin organization. Specifically, changes in the subcellular localization of the phosphorylated non-muscle myosin II regulatory light chain (pMRLC) at LHT stage are targeted by the PCP pathway core components. Furthermore, actomyosin relocalization concurs with changes in nuclear tension and SRF signal transduction within the myocardium. This study unravels a novel function of the PCP core component Pk1 in regulation of SRF translocation and target gene expression that is critical to cardiac maturation. Taken together, this study provides evidence that the PCP pathway is a major regulator of cardiac remodeling and organ maturation by modulating mechanosensitive SRF signal transduction involved in muscle differentiation.

In den meisten Organismen tickt eine zirkadiane Uhr mit einer Periode von ungefähr 24 Stunden. Sie ermöglicht ihnen die Zeitmessung ohne äußere Signale. Viele physiologische und zelluläre Prozesse unterliegen zirkadianer Regulation. Die molekulare Uhr besteht aus gekoppelten intrazellulären Rückkopplungen: Die Produkte der Uhrgene regulieren ihre eigene Bildung direkt oder indirekt und erzeugen so molekulare Oszillationen. In dieser Arbeit werden bestehende und neue mathematische Modelle des zirkadianen Oszillators verwendet, um die Bedeutung struktureller Merkmale - insbesondere der Rückkopplungen - für grundlegende zirkadiane Eigenschaften zu untersuchen. In einem Modell (Goodwin-Modell), mit einer negativen Rückkopplung erleichtert sättigende Kinetik in einem Abbauterm, nicht aber in einem Produktionsterm, Oszillationen. Ein neues Modell mit zusätzlicher positiver Rückkopplung erzeugt korrekte Phasen zwischen den Komponenten. Es reproduziert die Phänotypen von zirkadianen Mutanten. Das Modell synchronisiert mit dem Licht/Dunkel-Rhythmus. Die positive Rückkopplung beeinflußt die Robustheit der Oszillationen gegenüber Parametervariationen nur gering. Dies erklärt den rhythmischen Phänotyp von Rev-erb alpha-/- Mäusen, die die positive Rückkopplung nicht besitzen. Die überraschende Wiederherstellung von zirkadianen Oszillationen in der Per2Brdm1/Cry2-/- Doppelmutante kann mit dem Modell erklärt werden. Die Wiederherstellung zirkadianer Oszillationen in der arhythmischen Per2Brdm1 Mutante durch zusätzliche Mutation von Rev-erb alpha-/- wird vorausgesagt. Durch das Einfügen von Rev-erb alpha in das Modell entsteht eine weitere Rückkopplung. Mit diesem neuen Modell koennen Phänotypen von Mutanten reproduziert werden. Zuletzt werden Modelle verschiedener molekularer Oszillatoren und allgemeine Modelle, die aus einer positiven oder negativen Rückkopplung unterschiedlicher Kettenlänge bestehen, bezüglich ihrer Robustheit bei Parametervariationen verglichen. Die strukturelle Anordnung und speziell die Art der Rückkopplung ist wichtig für die Robustheit der Modelle. Die weitere Untersuchung zirkadianer Eigenschaften mit diesen und anderen Modellen wird zum Verständnis der zugrundeliegenden Prinzipien des zirkadianen Oszillators beitragen. / In many organisms the circadian clock ticks with a period of approximately 24 hours, enabling the organisms to keep track of time without any environmental time cues. Many physiological and cellular processes underlie circadian regulation. The molecular clock is a network of intracellular feedback loops: The clock gene products directly or indirectly regulate their own transcription, which results in molecular oscillations. In this thesis, existing and new mathematical models of the circadian oscillator are used to investigate the meaning of structural features - in particular of the feedback loops - for fundamental circadian characteristics. In a simple model (Goodwin model) with one negative feedback loop, saturating kinetics in a degradation term, but not in a production term, support oscillations. A new model containing an additional positive feedback loop shows circadian oscillations with the correct phases between the clock components. The phenotype of several clock mutants can be reproduced. The model synchronizes with the light/dark cycle. Assuming restricted light-input (gating), its phase can be fixed to either light onset or light offset with varying day lengths. In this model, the positive feedback has only a minor influence on the robustness of the circadian oscillations towards parameter variations. This explains the rhythmic phenotype of Rev-erb alpha-/- mutant mice that lack a positive feedback. The model can also explain the unexpected regeneration of circadian oscillations in Per2Brdm1/ Cry2-/- double mutant mice. The regeneration of circadian oscillations in the arrhythmic Per2Brdm1 by additional mutation of Rev-erb alpha is predicted. By including Rev-erb alpha explicitly into the model, another negative feedback loop is added: This model reproduces the phenotypes of several clock mutants. Finally, models describing different molecular oscillators and general models with positive or negative feedback loops of varying chain length are compared with respect to their robustness towards parameter variation. The structural design and in particular the kind of feedback underlying the oscillator seems important for the robustness of the model. Further analysis of circadian features with these and other models will give insight into underlying principles of the circadian oscillator.

Angiopoietin-2 (Ang-2) wirkt gefäßdestabilisierend und ist Voraussetzung für das Aussprossen von Gefäßen am Anfang der angiogenen Kaskade. Die Expression des Antagonisten der endothelialen Rezeptor-Tyrosin-Kinase Tie-2 ist streng gewebsspezifisch reguliert. Trotz des Zusammenhangs von Ang-2 und pathologischer Angiogenese sind die molekularen Mechanismen der ang-2 Regulation noch unverstanden. Mittels Microarray wurden die genomweiten Expressionsänderungen in endothelialen Zellen nach Behandlung mit dem demethylierenden 5-Aza-2’-deoxycytidine (5-Aza-dC) untersucht. Unter den induzierten Genen wurde ang-2 mit dem Fokus auf angiogeneserelevante Gene identifiziert. Obwohl die Endothelzellen unter Kontrollbedingungen ang-2 exprimieren, wurde die Expression durch Demethylierung weiter gesteigert. Es wurden jedoch keine potentiellen CpG-Inseln in unmittelbarer Nähe des Transkriptionsstarts identifiziert. Diese Daten lassen auf einen methylierungsunabhängigen Effekt von 5-Aza-dC auf die ang-2 Expression schließen. Zur molekularen Untersuchung der ang-2 Expression wurden 3kb der 5´-flankierenden Sequenz des humanen ang-2 Gens kloniert und der Transkriptionsstartpunkt (TS) bestimmt. Durch funktionelle 5´-Deletionsanalyse und zielgerichtete Mutagenese wurden regulatorische Promotorelemente identifiziert. Die Promotorregion -105 bis +51 relativ zum TS war ausreichend für die Vermittlung der basalen ang-2 Expression. Mittels Bindungsstudien wurden die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3 als Proteine, die primär an den ang-2 Minimalpromotor binden, identifiziert. Die Basen -78 bis -74 relativ zum TS sind eine essentielle Sp-Bindestelle für die Regulation der ang-2 Expression. Durch Mutation von potentiellen Bindungsstellen für Proteine der ETS-Familie wurde die ang-2 Promotoraktivität signifikant reduziert. Jedoch konnte die Spezifität von ETS-Proteinen in Bindungsstudien nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben neue Einblicke in die ang-2 Regulation offenbart und zeigen, dass die Sp1/Sp3-abhängige Aktivierung des proximalen Promotorbereichs (-105/-56) entscheidend für die transkriptionelle ang-2 Regulation in Endothelzellen ist. / Angiopoitein-2 (Ang-2) acts destabilizing on blood vessels and is mandatory for the onset of the angiogenic cascade. The expression of the antagonistic ligand of the endothelial cell tyrosine kinase receptor Tie-2 is tightly regulated. Despite the accumulating evidence confirming the involvement of Ang-2 in pathologic angiogenesis, the molecular mechanisms controlling ang-2 expression are still unclear. Using microarray analysis, the global changes of gene expression were investigated after treatment of endothelial cells with the demethylating agent 5-aza-2’-deoxycytidine (5-aza-dC). Focusing on angiogenesis related genes, ang-2 was identified among the upregulated ones. Although endothelial cells expressed ang-2 under control conditions already the expression was further increased by drug-induced demethylation. A screen for CpG-islands revealed no putative islands surrounding the transcription initiation site. These data indicate a methylation-independent effect of 5-aza-dC on the ang-2 expression. To elucidate underlying molecular mechanisms of ang-2 expression, 3kb of the human ang-2 gene were cloned and the transcription start site (TS) determined. Regulatory promoter elements were identified by functional 5’-deletion analysis and site-directed mutagenesis. The promoter region -105 to +51 relative to TS was recognized as sufficient and necessary for the ang-2 gene transcription. Electrophoretic Mobility Shift Assays revealed Sp1 and Sp3 as dominant nuclear proteins binding to the ang-2 promoter. The region spanning -78/-74 was identified as essential Sp1/3 site regulating ang-2 expression. The mutation of potential ETS-binding sites resulted in a significant decrease of ang-2 promoter activity. However, the binding of ETS-proteins could not be confirmed by means of EMSA. The results of this thesis revealed new insights of ang-2 regulation and strongly suggest that Sp1/Sp3-dependent activation of an upstream enhancer at -105 to -56 is crucial for the regulation of ang-2 expression in endothelial cells.

Die von Tumorzellen exzessiv exprimierte Laktat-Dehydrogenase 5 (LDH-A) ist das Schlüssel-Enzym für den katalytischen Stoffwechsel um Pyruvat in Laktat unter Gewinnung von Energie umzuwandeln. Bei LDH handelt es sich um einen wichtigen prognostischen Marker für die Einstufung der Aggressivität und die Behandlung von Tumoren. Ziel dieser Arbeit war es, das Wissen um die Funktion des Genproduktes von LDH-A (LDH-V) in Bezug auf die Proliferation von Tumorzellen, die Expression Angiogenese-Gene, maligne Konversion von Tumoren und die Metastasierung zu vertiefen. Zusätzlich sollte die Rolle von LDH auf die Genexpression HIF-regulierter Proteine, die das Überleben von Tumorzellen und vor allem der Glykolyse fördern, untersucht werden. Hierfür wurden LDH-A knockdown-Klone von dem murinen B16F10 Melanom und Lewis Lung Karzinom sowie dem humanem HT29 Kolonkarzinom generiert und in vitro und in vivo in den drei verschiedenen Tumormodellen untersucht. Der knockdown von LDH-A führte in vitro zu einer Hemmung der Proliferation in Lewis Lung und B16F10, während bei HT29 Tumorzellen kein solcher Effekt beobachtet werden konnte. Interessanterweise ließen sich nicht bei allen drei Zelllinien die durch limitierte LDH Aktivität ausgelösten Effekte auf die in vitro Proliferation auf das Tumorwachstum in vivo übertragen: Das Wachstum der Lewis Lung als auch der HT29 Tumoren in vivo war durch die Reduktion von LDH-A drastisch vermindert, während die Größe der B16F10 Tumoren davon nicht beeinflusst war. Es konnte gezeigt werden, dass B16F10 Tumoren unter LDH Suppression verstärkt VEGF exprimieren. Dadurch waren diese Zellen in vivo in der Lage, durch verstärkte Vaskularisierung des Tumors der durch LDH-A knockdown ausgelösten Hemmung des Tumorwachstums zu entkommen. Bei Lewis Lung Tumorzellen hingegen, führte die Unterdrückung von LDH-V zu einer beeinträchtigten Glukoseaufnahme unter normoxischen sowie hypoxischen Bedingungen. Die reduzierte Aufnahme von Glukose hatte in vivo, in einer vielschichtigen komplexen Struktur, deutlich größere Auswirkungen als auf einer eindimensionalen Zellkulturschale. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern neue Erkenntnisse zur Rolle von LDH-V während der Tumorprogression und können als Grundlage für zukünftige, neue Therapiestrategien bei Krebspatienten dienen. / LDH is an important prognostic marker in cancer staging and therapy. High serum LDH activity is associated with poor patient prognosis in different tumor types. LDH-A has been shown to play a major role in tumor malignancy, but the molecular mechanism behind this role is only starting to be understood. The objective of this work was to broaden our knowledge about the role of LDH-A gene product (LDH-V) in tumor cell proliferation, angiogenesis-related gene expression, tumor malignancy and metastasis. Herein, LDH-A shRNA knockdown clones of murine B16F10 melanoma, Lewis Lung carcinoma and human HT29 colon carcinoma were generated to uncover the molecular mechanisms between diminished ability of metabolizing pyruvate to lactate and tumor cell growth in vitro and in vivo. In this study, a significant correlation between tumor weight and serum LDH in in vivo tumor models was found, which additionally correlated with the in vitro LDH secretion. In vitro, suppression of LDH-A led to anti-proliferative effects in Lewis Lung and B16F10 tumor cells, while having no effect on HT29 cells. Interestingly, the consequence of limiting LDH activity in vitro did not show a direct correlation to the in vivo anti-tumor effects in LDH-deficient tumors: B16F10 tumor growth was unaffected by silencing LDH-A, while Lewis Lung and HT29 demonstrated a drastic reduction in tumor growth in vivo. B16F10 tumors were found to have increased VEGF expression upon LDH knockdown, and therefore were able to compensate the tumor growth inhibition-driven by LDH deficiency through increased tumor vascularization in vivo. In contrast, LDH-V suppressed Lewis Lung cells demonstrated an impeded glucose uptake ability under normoxic and hypoxic conditions. Subsequently, a genome-wide gene expression analysis and functional assays of LDH-A deficient and control HT29 clones revealed potential new oncogenic features of LDH-A in tumor migration and invasion as well as a feedback loop to HIF1alpha. In summary, the collective data presented in this thesis provide new insights of LDH-V in tumor progression and therapeutic strategies for the treatment of cancer.

Das Proteasom ist ein multikatalytischer, ATP-abhängiger Enzymkomplex, der kurzlebige und regulatorische Proteine in der Zelle abbaut. Im Rahmen der Proteinqualitätskontrolle werden durch das Proteasom auch fehlerhaft synthetisierte bzw. falsch gefaltete oder chemisch geschädigte Proteine degradiert. Zellen hämatopoetischen Ursprungs exprimieren sogenannte Immunoproteasomen, die durch drei alternative katalytische Untereinheiten (LMP2, MECL-1 und LMP7) charakterisiert sind. Unter dem Einfluss von Interferonen kommt es auch in nicht-hämatopoetischen Zellen zur de novo Assemblierung von IP. Sie weisen im Vergleich zu Standardproteasomen einen erhöhten Substratumsatz sowie veränderte Schnittpräferenzen auf. Dadurch können Standard- und Immunoproteasomen verschiedene MHC Klasse I-restringierte antigene Peptide generieren. Die vorliegende Arbeit untersucht die Relevanz der LMP2- bzw. der LMP7- Untereinheit im Rahmen der Coxsackievirus B3 Myokarditis. LMP7-/- Mäuse zeigen eine suffiziente CD8+ T Zell Antwort, die zur vollständigen Viruselimination nach der akuten Entzündungsphase beiträgt. Die reguläre Expression pro-inflammatorischer Zytokine und antiviraler Signalwege sowie CVB3-spezifischer IgG-Antikörper spricht gegen eine spezielle Funktion von IP bei der Induktion einer effektiven Immunantwort in diesem Modell. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass der verminderte Einbau aller IP-Untereinheiten in LMP7-defizienten Mäusen mit einer schweren Inflammation und Myokardschädigung einhergeht. Der verringerte Substratumsatz führt zur Akkumulation von polyubiquitinylierten, oxidativ geschädigten Proteinen sowie zur verstärkten Apoptose IP-defizienter Kardiomyozyten und inflammatorischer Zellen. / The standard proteasome is the major ATP-dependent multi-catalytic protein complex that is important for the proteolytic processing of short-lived and regulatory proteins. It also degrades exogenous or improperly synthesized, misfolded, and damaged proteins. Cells of hematopoietic origin predominantly express an alternative variant - the immunoproteasome, which is characterized by three specific catalytically active subunits (LMP2, MECL-1 and LMP7). In non-immune cells, these immunosubunits are also induced and incorporated into newly assembling IPs upon exposure to interferons. As compared to standard proteasomes, IPs display altered cleavage site preferences, resulting in the generation of a different spectrum of antigenic peptides for MHC class I presentation. The present thesis investigates the impact of LMP2- and LMP7 within the context of viral heart disease, making use of the well-established murine model of coxsackievirus B3 infection. LMP7-deficient mice demonstrate a potent CD8+ T cell capacity to control CVB3 infection, resulting in viral clearance after the acute stage of disease. The expression of pro-inflammatory cytokines, innate antiviral mediators, and CVB3-specific IgG antibodies argue against a specific role of IPs in the induction of an effective immune response against CVB3 infection. However, the impaired incorporation of all three immunosubunits in LMP7-deficient hearts coincides with severe inflammation and myocardial tissue damage. Exposure to IFN-γ gives rise to prolonged accumulation of oxidant-damaged, poly-ubiquitylated proteins in IP-deficient cardiomyocytes and inflammatory cells. Along with the restricted degradation of toxic protein aggregates, inflammatory cells and the adjacent myocardium are prone to increased apoptotic cell death.