Selbstreproduktion ist eines der Kennzeichen aller lebenden Organismen. Der Zellzyklus dient der Selbstreproduktion in einzelligen Organismen. In mehrzelligen Organismen ist der Zellzyklus darüber hinaus für andere lebenswichtige Prozesse, einschließlich Immunreaktionen, unerlässlich. In dieser Arbeit wird eine Methode entwickelt mit der die Dauer der Zellzyklus Phasen bestimmt werden kann. Kenntnis über die Zellzyklusphasendauer ermöglicht vorherzusagen, wie schnell eine Population von proliferierenden Zellen wachsen wird, oder wie viele neue Zellen pro Stunde in einem Gewebe geboren werden. Im Kapitel 1 dieser Arbeit wird ein Zellzyklusmodell aufgestellt und mit experimentellen Bromdesoxyuridin Daten verglichen. Die Analyse zeigt, dass das Modell gut die experimentelle Kinetik beschreibt, hebt jedoch auch hervor dass einige der Parameter nicht identifiziert werden können. Dieses Problem wird in Kapitel 2 bearbeitet, wo zwei Ansätze erforscht werden, um den Informationsgehalt der Experimente zu erhöhen. In einem ersten Ansatz wird die Theorie der Versuchsplanung angewendet, um optimale Versuchspläne zu bestimmen. In einem zweiten Ansatz wird das übliche Bromdesoxyuridin Protokoll durch ein zweites Nukleosid erweitert. Beide Methoden verbessern in silico erheblich die Genauigkeit und Präzision der Abschätzungen. Im dritten Kapitel wird die Methodik in der Analyse der Keimzentrumsreaktion angewendet. Ein erheblicher Zufluss von Zellen in die dunkle Zone von Keimzentren wird vorhergesagt, und die Ansicht einer extrem schellen Zellteilung im Keimzentrum erscheint in dem Modell als ein Artefakt der Zellmigration. / Self-reproduction is one of the distinguishing marks of living organisms. The cell cycle is the underlying process by which self-reproduction is accomplished in single-celled organisms. In multi-cellular organisms, the cell cycle is in addition indispensable for other vital processes, including immune reactions. In this thesis a method is developed that allows to estimate the time it takes for a dividing cells to complete the CC phases. Knowledge of the CC phase durations allows to predict, for example, how fast a population of proliferating cells will grow in size, or how many new cells are born per hour in a given tissue. In Chapter 1 of this thesis, a cell cycle model with delays and variability in the completion times of each phase is developed. Analytical solutions are derived to describe a common experimental technique used for cell cycle analysis, namely pulse labeling with bromodeoxyuridine (BrdU). Comparison with data shows that the model reproduces closely measured cell cycle kinetics, however also reveals that some of the parameter values cannot be identified. This problem is addressed in Chapter 2. In a first approach, the framework of D-optimal experimental designs is employed, in order to choose optimal sampling schemes. In a second approach, the prevailing protocol with a single nucleoside is modified by adding a second nucleoside analog pulse. Both methods are tested and the results suggest that experimental design can significantly improve parameter estimation. In Chapter 3, the model is applied to the germinal center reaction. A substantial influx of cells into the dark zone of germinal centers is predicted. Moreover the wide-held view of rapid proliferation in germinal centers, appears, under this model, as an artifact of cell migration.

Zusammenfassung in PDF Zielstellung: Der biologische Botenstoff N ist von signifikanter Bedeutung für die Funktionsfähigkeit des Herz-Kreislauf-Systems. Pathologische Bedingungen sind oft auf eine veränderte Verfügbarkeit von N zurückzuführen. Das Verständnis der Regulierung der N-Bildung durch Endothelzellen (EC) und die nachfolgende N-Chemie im gesunden und kranken Organismus ist deshalb essentiell, jedoch längst nicht vollständig. Das Ziel dieser Dissertation war aus diesem Grund Untersuchungen zum Schutz von N vor der Wechselwirkung mit S (durch SOD-mimetische Nitroxide), sowie zum Effekt des Membranpotentials (Em) und des Zellwachstums (Proliferation) auf die Aktivität der endothelialen N Synthase (eNOS) an Kulturen von Atrium-Endothelzellen des Rindes (BAtEC). Methoden: Zum empfindlichen und spezifischen Nachweis von N wurde die ozon-vermittelte N-Chemolumineszenz (N-CL) evaluiert, modifiziert und an verschiedene in vitro Systeme angepaßt. Die N-CL wurde auf Grundlage des durch SOD hemmbaren Abbaus von N durch S als ein neuartiger Ansatz zur Bestimmung physiologisch niedriger Konzentrationen an S vorgeschlagen. Ergebnisse: Die Nitroxide -hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl und 3-ethoxycar-bonyl-proxyl erhöhten die N-Konzentration durch ihre SOD-mimetische Wirkung in Modellsystemen von 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) und Kulturen von BAtEC. Mittels ESR-Spin-Trap Untersuchungen an Lösungen von SIN-1 wurde die Bildung von H-Addukten durch Dismutierung von S bestätigt, Peroxynitrit wurde als Quelle ausgeschlossen. Modulierung des Em (durch Veränderung der extrazellulären K + -Konzentration) beeinflußte die endotheliale N-Freisetzung; Hyperpolarisierung erhöhte, Depolarisierung verminderte die N Produktion. Inhibierung der elektrogenen Na + -K + ATPase induzierte synchrone Oszillationen der endothelialen N-Freisetzung. Die systematische Untersuchung zu EC-Wachstum/Proliferation zeigte keine Änderung der N-Produktion (in Gegenwart von SOD). Jedoch war die Menge von verfügbarem N (in der Abwesenheit von SOD) niedrig in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Die Expression der eNOS erhöhte sich mit der Kultivierungsdauer und erreichte ein Maximum bei Konfluenz. Die relative eNOS-Aktivität (N, 2-, und L-citrulline-Produktion pro eNOS-Protein) war am größten in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC. Schlußfolgerungen: Die Wechselwirkung mit S ist kritisch für die Halbwertszeit von N. Aus der durch diese Studie gezeigten Erhöhung von N in biologischen und chemischen Modellsystemen kann geschlußfolgert werden, daß Nitroxide unter Bedingungen einer S-bedingten Verminderung von verfügbarem N pharmakologische Wirksamkeit besitzen könn-ten. Untersuchungen ergaben den Nachweis zur Em-abhängigen Modulierung der endothelialen N-Freisetzung. Dies liefert eine Erklärung für die Em-bedingten Veränderungen des Gefäßto-nus, nachgewiesen während physiologischer Zellstimulierung, aber auch unter pathologischen Bedingungen. Untersuchungen zu EC-Wachstum/Proliferation lieferten den Beweis für die Ver-minderung von verfügbarem N in präkonfluenten, stark proliferierenden BAtEC durch endogen gebildetes S. Die Expremierung von eNOS war proliferationsabhängig. Die spezifische eNOS-Aktivität war in proliferierenden BAtEC erhöht (wahrscheinlich durch post-translationale Verän-derungen) und in ruhenden BAtEC erniedrigt (wahrscheinlich durch Substrat- oder Kofaktormangel). / abstract in pdf Objective: The biological messenger n is of significant importance for the functionality of the cardiovascular system. Pathological conditions are often attributed to an altered availability of n. The understanding of the regulation of n formation by endothelial cells (EC) and the concomitant chemistry of n in health and disease is therefore essential but far from being complete. The objective of this dissertation was therefore to study in culture systems of bovine atrial endothelial cells (BAtEC) the protection of n from the interaction with S by SOD-mimetic nitroxides, and the effect of the membrane potential (Em) and cell growth/proliferation on the activity of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Methods: For the sensitive and specific detection of n, the ozone-mediated n chemiluminescence (n-CL) was evaluated, modified and adapted to various in vitro systems. Due to the SOD-inhibitable degradation of n by S , the n-CL was proposed as a novel approach to quantify the physiological low levels of S . Results: The nitroxides 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl, 3-carboxy-proxyl, and 3-ethoxycarbonyl-proxyl increased the n concentration by their SOD-mimetic action in a model system of 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) and cultures of BAtEC. EPR spin trapping in SIN-1 solution revealed the formation of H adducts due to dismutation of S and not via decomposition of peroxynitrite. Changes in Em (by alteration of the extracellular K + concentration) affected the endothelial n release; membrane hyperpolarization increased, membrane depolarization decreased the n production. Inhibition of the electrogenic Na + -K + ATPase induced synchronous oscillations in endothelial n liberation. The systematic investigations on EC growth/proliferation showed no change in total n production (in the presence of SOD). However, the bioavailable n (in the absence of SOD) was low in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Expression of eNOS increased with culture duration with a maximum at confluence. Relative eNOS activity (n, 2, and L-citrulline production per eNOS protein) was highest in preconfluent, highly proliferating BAtEC. Conclusions: The interaction of S is critical for the half-life of n. With the increase of n in biological and chemical model systems shown by this study, nitroxides might exert pharmacological potential under conditions of S -mediated diminution of bioavailable n. Experimental evidence was shown for the Em-dependent modulation of endothelial n formation. It supports an explanation for the Em-mediated changes of vascular tone, as demonstrated for physiological cell stimulation but also under pathological conditions. Investigations on the EC growth/proliferation provided evidence that BAtEC-derived S decreases bioavailable n in preconfluent, highly proliferating BAtEC, whereas expression of eNOS is proliferation-dependent. The specific eNOS activity is upregulated in proliferating BAtEC (probably via post-translational modifications) and down-regulated in quiescent BAtEC (probably via substrate or cofactor limitations).

Phagozyten entfernen apoptotische Zellen während der Entwicklung und beseitigen Pathogene im Immunsystem. Die zugrundeliegenden molekularen und zellulären Mechanismen, insbesondere die Unterschiede zwischen Makrophagen und nicht-professionellen Phagozyten wie Gliazellen, sind weitestgehend unklar. Wir haben neuartige Zellkultur-basierte Assays entwickelt, um 86 Kandidatengene zu testen, die wir aus der Literatur sowie unserem Expressions-Profiling in embryonalen Gliazellen von Drosophila melanogaster zusammengestellt haben. Die Genfunktion wurde durch RNAi herabgesenkt und die Phagozytoseeffizienz wurde mittels FACS untersucht; um die funktionelle Spezifität der Gene zu messen, haben wir nicht nur apoptotische Zellen, sondern auch Bakterien und Beads als „Essen“ angeboten. Mit Hilfe von Null-Mutanten und transgenem RNAi wurden die Ergebnis in vivo validiert. Um die Phagozytose apoptotischer Zellen testen, haben wir untersucht, wie Makrophagen und Gliazellen tote Zellen während der Embryonalentwicklung entfernen, während zur Untersuchung der bakteriellen Phagozytoze adulte Fliegen mit Bakterien infiziert wurden. Unser Screen liefert einen Querschnitt durch die verschiedenen Schritte der Phagozytose. In Bezug auf die Erkennung apoptotischer Zellen finden wir sowohl bekannte als auch neue Akteure für Makrophagen und Gliazellen. Außerdem zeigen wir, dass Vesikeltransport für die Phagozytose apoptotischer Zellen erforderlich ist. Überraschenderweise werden Rezeptoren zur Bakterienerkennung auch für apoptotische Zellen benötigt. Umgekehrt sind Apoptose- Rezeptoren auch für bakterielle Phagozytose notwendig, wodurch eine grundlegende Kreuz-Spezifität zutage tritt. Unsere Arbeit liefert die erste systematische und vergleichende Analyse der verschiedenen Phagozytosearten. Durch die Identifizierung vieler neuer Faktoren legt diese Arbeit den Grundstein für ein mechanistisches Verständnis der Phagozytose von apoptotischen Zellen und Bakterien durch Makrophagen und Gliazellen. / Phagocytes remove apoptotic cells during development and eliminate pathogens in the immune system. The underlying molecular and cellular mechanisms, particularly the differences between macrophages and non-professional phagocytes like glia, are not well understood. We used novel cell-based assays to screen phagocytic function of candidate genes assembled from literature and our genome-wide transcription profiling of Drosophila melanogaster embryonic glia. Gene function was knocked-down by RNAi and phagocytic efficiency assessed by flow cytometry; to explore functional specificity, we offered not only bacteria, but also apoptotic cells and beads as ''food''. To validate results in vivo, we analysed glial clearance of apoptotic neurons in embryonic development and immune clearance of bacteria in adult flies using both genetic mutants and transgenic RNAi. Our screen provides a cross section of the different steps of phagocytosis from recognition to engulfment and phagosomal degradation. For the recognition of apoptotic cells, we confirm the involvement of known factors, such as the chaperone Calreticulin and PS-binding Annexin, and identify new players, such as NIMA for macrophage and Megalin for glial corpse clearance. We find components associated with vesicular trafficking including the v-SNARE Synaptobrevin and the cytochrome Cyp4g15 to be required for corpse clearance. Unexpectedly, receptors known for bacterial recognition, such as PGRP-LC and TEP2, are also strongly required for apoptotic clearance. Conversely, receptors previously implicated in apoptotic cell recognition are also required in bacterial clearance (SIMU, Draper), revealing cross-specificity of the system. Our work represents the first systematic and comparative assessment of the molecular repertoire of different types of phagocytosis, and, with the identification of many new players, lays the groundwork for a mechanistic dissection of bacterial and corpse clearance by glia and macrophages.

Das Ziel dieser Studie war, die Anzahl der Mastomys-Arten und ihrer geographischen Verbreitung in Namibia und Teilen von Botswana und Angola zu bestimmen. Der methodische Ansatz umfasst Schädel-Morphometrie, Karyotypisierung und Cytochrom-b-Gen-Sequenzierung. Traditionellen Morphometrie-Studie lieferten keine klaren morphologischen, wohingegen die geometrische Morphometrie-Analyse erfolgreicher war. Hier zeigten die Ergebnisse bei drei Spezies deutliche dorsale und ventrale Unterschiede in der Schädelform. Die Resultate der zytogenetischen und molekularen Methoden ergaben drei Formen von Mastomys mit unterschiedlichen Karyotypen und mtDNA. Diese wurden M. coucha (2n = 36, aFN = 60/60), M. natalensis (2n = 32, aFN = 57/58) und M. shortridgei (2n = 36, aFN = 51/52) zugeordnet. Die mtDNA Divergenz zwischen der Art M. coucha und M. shortridgei war relativ gering (1.3%), außerdem legte die „Moleküluhr“ (molecular clock) nahe, dass M. shortridgei ein aktueller Ableger von M. coucha (0.71 Mya) ist. Man nimmt an, dass der Paläo-Makgadikgadi See, im heutigen Botswana einen Großteil des östlichen Kalahari-Beckens bedeckte. Es könnte sein, dass Ausläufer früherer Populationen von M. shortridgei in Kontakt mit dem Paläo-Makgadikgadi See kammen und während des End-Pleistozäns bis zum frühen Holozän durch das Schrumpfen des Sees isoliert wurden. Im Laufe der Zeit haben sich die frühen Populationen von M. shortridgei an die lokalen sumpfigen Umweltbedingungen angepasst. M. coucha und M. natalensis haben eine klar begrenzte geografischen Verteilung in Namibia, dies scheint durch Niederschlag beeinflusst zu sein: M. coucha tritt vor allem in den niederschlagsarmen Gebieten von Zentral-Namibia auf, M. natalensis dagegen in den niederschlagsreichen Gebieten im nördlich-zentralen und nordöstlichen Namibia und erstreckt sich bis nach Angola und in das nördliche Botswana hinein. Die M. shortridgei-Proben wurden nur in den Okavango-Sümpfen gefunden. / Study aims to summarise the patterns of morphological, cytogenetic and genetic variation of genus Mastomys across the south-west arid region of southern Africa. The methodological approach included skull morphometrics, karyotyping and cytochrome-b gene sequencing. Traditional morphometrics study did not yield clear morphological differences between the three species. Geometric morphometrics analysis was more successful with clear differences, in the shape of the skulls based on landmarks from both the dorsal and ventral views. Results obtained with cytogenetical and molecular methods revealed three forms of Mastomys with different karyotypes and mtDNA clades. These were assigned to M. coucha (2n = 36, aFN = 60/60), M. natalensis (2n = 32, aFN = 57/58) and M. shortridgei (2n = 36, aFN = 51/52). The mtDNA divergence between the species M. coucha and M. shortridgei was relatively low (1.3%), additionally the molecular clock estimated M. shortridgei to be a recent off-shoot of M. coucha (0.71 Mya). It is estimated that the lake Palaeo-Makgadikgadi, in present day Botswana, covered much of the eastern Kalahari basin. It could be that the peripheral ancestral population of M. shortridgei came in contact with the lake Palaeo-Makgadikgadi and was isolated with the shrinking lake Palaeo-Makgadikgadi during the End-Pleistocene to Early Holocene. Over time ancestral populations of M. shortridgei became adapted to the local swampy environmental conditions. M. coucha and M. natalensis have distinct geographical distribution influenced by precipitation. M. coucha mainly occurs in the low rainfall areas of central Namibia, whereas M. natalensis occurs in higher rainfall areas of north-central and north-eastern Namibia, extending into Angola and northern Botswana. The M. shortridgei specimens were only trapped along the Okavango River swamps in northern Botswana and south-eastern Angola.

Mikrogliazellen stellen die professionellen Phagozyten des zentralen Nervensystems dar und sind maßgeblich bei der Entfernung apoptotischer Neurone aus dem Gewebe beteiligt. Die Erkennungsmechanismen, die zu einer Erkennung und Phagozytose apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen führen, sind bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines Kokulturmodells die Erkennungsmechanismen zwischen primären Mikrogliazellen und apoptotischen Kleinhirnneuronen untersucht. Der apoptotische Zelltod, charakterisiert durch Schrumpfung und Fragmentation der Neuron, durch Kondensation des Chromatins, durch Fragmentation der DNA und durch Präsentation von Phosphatidylserin auf der extrazellulären Seite der Plasmamembran, wurde in den Kleinhirnneuronen durch eine Behandlung mit 100 µM S-Nitrosocystein induziert. Es konnte gezeigt werden, daß apoptotische Neurone keine löslichen Substanzen sekretierten, die chemotaktisch auf Mikrogliazellen wirken. Dies zeigt, daß die Erkennung apoptotischer Neurone über Zell-Zell-Kontakte erfolgt. Zur Untersuchung der beteiligten Erkennungsmechanismen wurden Mikrogliazellen zwei Stunden nach der Induktion des apoptotischen Zelltods zu den Neuronen gegeben und für sechs Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von Liganden kultiviert, die mögliche Rezeptoren zur Erkennung von apoptotischen Neuronen inhibieren. Die Bindung/Phagozytose der apoptotischen Kleinhirnneurone durch Mikrogliazellen wurde mit einer kombinierten DAPI/Propidiumjodid (für apoptotische/nekrotische Zellen) und einer Lektin Färbung (für Mikrogliazellen) durch Auszählung bestimmt. Die Aufnahme apoptotischer Neurone durch Mikrogliazellen wurde durch Galaktose und N-Acetylglukosamin reduziert, was auf eine Erkennung apoptotischer Zellen durch Lektine hindeutet. Weiterhin weist der inhibitorische Effekt von RGDS-Peptiden auf die Bindung/Phagozytose von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen auf eine Erkennung durch ein Vitronektinrezeptor hin. Da Mikrogliazellen spezifisch Lipidvesikel, die mit Phosphatidylserin angereichert waren, binden und O-Phospho-L-Serin die Aufnahme von apoptotischen Neuronen durch Mikrogliazellen deutlich inhibierte, erfolgte die Erkennung apoptotischer Neurone hauptsächlich durch einen Phosphatidylserin Rezeptor. Die Expression des PS-Rezeptors auf Mikrogliazellen ist unabhängig vom Aktivierungszustand der Mikrogliazellen in vitro. Die Bindung von PS ist mit einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration in der Mikrogliazelle verbunden und führt nicht zu einer sekretorischen Aktivierung der Mikrogliazelle. Da Astrozyten ebenfalls einen PS-Rezeptor exprimieren, könnten sie als semiprofessionelle Phagozyten ebenfalls eine Bedeutung bei der Aufnahme apoptotischer Neurone einnehmen. Diese Ergebnisse zeigen, daß apoptotische Neurone ein komplexes Oberflächenmuster exprimieren, welches durch unterschiedliche Rezeptorsysteme der Mikrogliazelle erkannt werden kann. Die Erkennung von PS auf apoptotischen Neuronen durch Mikroglia scheint bei diesen untersuchten Rezeptorsystemen die wichtigste Rolle zu spielen. / Microglia are the professional phagocytes of the central nervous system and play a crucial role in removal of apoptotic neurons out offrom the tissue. The recognition mechanisms leading to the recognition and phagocytosis of these apoptotic neurons by microglia are not yet characterized. Here IIn the present work established a co-culture model was established to examine the receptor systems involved in the recognition of apoptotic cerebellar neurons by primary microglia. Treatment with 100 µM S-nitrosocysteine induced apoptosis of cerebellar neurons as indicated by condensation and fragmentation of the neurons, condensation of the chromatin, fragmentation of the DNA and phosphatidylserine exposure to the exoplasmic leaflet of the plasma membrane. It was shown that apoptotic neurons do not release soluble signals that serve to attract microglia. Consequently, contact-dependent interaction between the microglial cell and the apoptotic neuron is required for recognition. For the examination of the receptor systems involved in recognition, microglial cells were added to neurons 2 h after induction of apoptosis induction and co-cultured for 6 h in the presence of ligands that inhibit recognition by binding to their respective receptors. Binding/phagocytosis was determined after combined DAPI/propidium iodide (for apoptotic/necrotic neurons) and lectin staining (for microglia). Uptake of neurons was reduced by galactose or N-acetylglucosamine, suggesting that recognition involves lectins. Furthermore, the inhibition of microglial binding/uptake of apoptotic neurons by RGDS peptide suggesteds a rolethe involvement of a microglial vitronectin receptor. The selective Binding of phosphatidylserine-enriched lipid vesicles on microglial cells and the strong interference of O-phospho-L-serine with the uptake of apoptotic neurons was indicative of an important role for the phosphatidylserine receptor (PS-receptor)As microglia selectively bind lipid vesicles enriches in phosphatidylserine and O-phospho-L-serine interfered in a strong way with the uptake of apoptotic neurons, the recognition of apoptotic neurons is manly dependent on a phosphatidylserine receptor. The expression of the PS-receptor is independent of the activation state of the microglial cell in vitro. The bindigbinding of PS induces an elevation of the intracellular calcium concentration in the microglia but doesid not induce an activationsectretion of (Liste der getesteten Zytokine einsetzen) of the microglial cell in an secretory way. Because of the expression of a PS-receptor, Astrocytes could also play a role in the uptake of apoptotic neurons as semiprofessional phagocytes. In summaryCollectively, these results suggest that apoptotic neurons generate a complex surface signal recognized by different receptor systems on microglia. The recognition of PS on the surface of apoptotic neurons by microglial cells seems to play a major role in the recognition of these apoptotic neuronscells..

Die Blutgefäßentwicklung ist ein mehrstufiger Prozess, der durch verschiedenste Signalwege und Zellmechanismen bestimmt wird. Murale Zellen sind mit dem Endothel assoziiert und wichtig für die Stabilisierung von Blutgefäßen. Ein essentieller Faktor für die Blutgefäßentwicklung ist die Bestimmung der Zellmigrationsrichtung durch verschiedene Faktoren. Einige dieser Faktoren wurden ursprünglich für die neurale Entwicklung beschrieben. Die Proteinfamilie der Neuron Navigators (NAV) sind neue Akteure, die die Migration von Zellen während des Neuronenwachstums beeinflussen. Ein möglicher Einfluss auf die Blutgefäßentwicklung ist bisher unbekannt. Wir nehmen an, dass das Protein NAV1 in Zellmigrationsprozessen während der Angiogenese eine Rolle spielt und verwendeten zur Aufklärung der Funktion von NAV1 Modelle in der Maus und im Zebrafisch. Das Blutgefäßnetzwerk in der Retina von neonatalen NAV1-/--Mäusen, als auch in einem aortic ring assay zeigte Defekte der Gefäßremodellierung durch eine verringerte Anzahl an Verzweigungspunkten der Blutgefäße auf. Es konnte erstmals eine Expression von NAV1 in muralen Zellen gezeigt werden. Die NAV1-defizienten Mäuse zeigten eine verringerte Anzahl von muralen Zellen auf Blutgefäßen auf. Dieser Defekt ging mit einer verstärkten Regression von Blutgefäßen einher, welche für die geringere Verzweigung dieser verantwortlich sein kann. In vitro Experimente mit primären muralen Zellen deuten auf einen zellautonomen Einfluss von NAV1 auf die Bewegung von Zellen in Abhängigkeit von Netrin-1 und der extrazelluären Matrixkomponente Kollagen I hin. Nav1-depletierte Zebrafische wiesen eine verringerte Komplexität von bestimmten zerebralen Blutgefäßen auf. Dies deutet darauf hin, dass der Einfluss von Nav1 auf die Blutgefäßausbildung konserviert ist. Wir konnten NAV1 als einen neuen zelleigenen Faktor der Motilität von muralen Zellen identifizieren, der in Folge als positiver Modulator zur Regulation der Gefäßstrukturierung beiträgt. / Vessel development is a multistep process orchestrated by different cellular and signaling mechanisms. Mural cells are associated with the endothelium and thought to be important for vessel stabilization. Cell guidance is an essential factor during vascular development, accomplished by different attractive and repulsive factors. Some of these were originally described in neural development. The Neuron Navigator (NAV) protein family is a novel player in regulating cell migration events during neuron growth, but their potential impact in vessel development is unknown. We hypothesized that the family member NAV1 plays a role in cell migration events during angiogenesis and examined the function of NAV1 in vascular development using loss-of-function models in mouse and zebrafish. Analysis of the vessel network phenotype in neonatal retina and an aortic ring assay of NAV1-/--mice revealed defective vessel remodeling in the absence of NAV1, indicated by reduced branch point numbers of vessels. Characterization of cellular expression domains point to a prominent, so far unknown, NAV1 expression in mural cells and NAV1-knockout mice exhibited reduced mural cell numbers on vessels. Decreased mural cell recruitment accompanies with increased vessel regression in the retina that may be attributable for the vascular phenotype. In vitro data of primary mural cells indicate a cell-autonomous influence of NAV1 on cell locomotion in response to Netrin-1 and/or the extracellular matrix component Collagen I. Analysis of Nav1 depleted zebrafish embryos revealed less complex vessel networks of specific cerebral vessels, the central arteries, suggesting that the impact of Nav1 on vessel development is conserved in vertebrates.

Experimentelle Modelle und aktuelle Studien legen nahe, dass epileptische Anfälle mit Störungen des adrenergen Systems im Gehirns einhergehen. Noradrenalin, welches an beta-adrenerge Rezeptoren bindet, ist für hippokampale Plastizität sowie für das hippokampale Lernen und Gedächtnis von großer Bedeutung. Die vorliegende Arbeit untersucht epilepsieinduzierte Veränderungen der noradrenergen Steuerung von hippokampalen Ausgangssignalen. Gezielt werden die funktionellen Konsequenzen synaptischer Plastizität, hervorgerufen durch beta-adrenerge Rezeptoraktivierung an CA1-Subiculum Synapsen, für die neuronale Signaltransduktion zwischen Hippocampus und parahippokampal Regionen in einem Tiermodell für Epilepsie untersucht. Wir kombinieren elektrophysiologische Methoden (Single-Cell- und Multi-Elektroden-Array Ableitungen) um zu zeigen, dass die Aktivierung von beta-adrenergen Rezeptoren eine zellspezifische Form der Langzeit-Potenzierung in subiculären Pyramidenzellen induziert und eine Verstärkung der Konnektivität zwischen Subiculum und Presubiculum, beziehungsweise Subiculum und entorhinalen Cortex nach sich zieht. Bei Tieren, die mit dem Parasympathomimetikum Pilocarpin behandelten wurden, ist die beta-adrenerge Modulation zwischen dem Hippocampus und verschiedenen parahippokampal Zielstrukturen beeinträchtigt. Die gestörte polysynaptische Transmission zwischen CA1, dem Subiculum und parahippokampalen Zielstrukturen resultiert in einer Abnahme der Langzeit-Potenzierung im Presubiculum, wohingegen die Transmission zum medialen EC intakt bleibt. Diese Beeinträchtigung der beta-Adrenorezeptor abhängigen Modulation der Informationsübertragung vom Hippocampus zu seine Zielstrukturen können zu hippocampalen Defiziten, wie Gedächtnis- und Stimmungsstörungen beitragen, die häufig bei Patienten mit Temporallappen-Epilepsie beobachtet werden. / Experimental models and previous studies suggest that seizures are accompanied by disturbances in the beta-adrenergic (beta-AR) system of the brain. Norepinephrine acting via beta-ARs plays a major role in hippocampal plasticity and hippocampus-dependent learning and memory. To elucidate seizure-associated alterations in the norepinephrine-dependent encoding of hippocampal output, the present study investigates the functional consequences of the beta-AR mediated synaptic plasticity at CA1-subiculum synapses for the transduction of hippocampal output to the parahippocampal region in an animal model of epilepsy. Using combined electrophysiological (single-cell and multi-electrode array recordings) approaches, we show that activation of beta-AR induces a cell-specific form of long-term potentiation in subicular pyramidal cells that may allow a strengthening of target-specific connectivity to the presubiculum and entorhinal cortex (EC). In pilocarpine-treated animals, the beta-AR-mediated modulation of functional connectivity between the hippocampus and distinct parahippocampal target str uctures is disturbed. The attenuated long-term potentiation is associated with a disturbed polysynaptic transmission from the CA1, via the subiculum to the presubiculum, but with a preserved transmission to the medial EC. The impairment in the beta-AR-dependent modulation of information transfer from the hippocampus to its target structures may contribute to hippocampus-dependent deficits like memory impairments and mood disorders which are often observed in patients with temporal lobe epilepsy.

Leishmaniosen gehören zu den tropischen Krankheiten und bedrohen geschätzte 350 Millionen Menschen in 88 Ländern weltweit. Die schwerste Form, viszerale Leishmaniose, betrifft die ärmsten Bevölkerungsschichten und ist die Ursache für circa 50 000 Todesfälle pro Jahr. Es wird angenommen, dass die Entwicklung eines Impfstoffs möglich ist, aber trotz aller Bemühungen, steht derzeit noch kein Impfstoff zur Verfügung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Impfstoff gegen viszerale Leishmaniose entwickelt und in vivo auf pre-klinischer Ebene getestet. Des Weiteren wurden rekombinante Membranvesikel konstruiert, um ein Boostreagenz zu erhalten. Die Herstellung sowohl des rekombinanten Salmonellenimpfstoffs als auch der Membranvesikel sollte, trotz des geringen Handelspreis, ökonomisch praktikabel sein, was besonders wichtig ist für Menschen in den betroffenen Entwicklungsländern. Der erste Schritt war die Auswahl neuartiger Antigenkandidaten aus einem Proteomics Datensatz, in dem beide Leishmania Lebensformen verglichen wurden. Der Schwerpunkt wurde auf abundante, hypothetische Proteine gelegt, die sowohl in Pro- als auch Amastigoten identifiziert wurden, in Leishmanienarten hochkonserviert sind aber gleichzeitig keine Sequenzhomologien zu humanen und murinen Proteinen besitzen. Diese Antigene wurden in unterschiedlicher Menge auf der Oberfläche und im Cytoplasma von S. typhimurium SL3261 und auch auf Membranvesikeln exprimiert. Impfstämme wurden selektiert in Hinsicht auf ihre bakterielle Fitness und Antigenexpression. Es konnte gezeigt werden, dass LinJ08.1140-, LinJ23.0410-exprimierende Impfstämme oder eine Mischung dieser in der Lage waren besonders anfällige BALB/c Mäuse vor L. major und wichtiger L. donovani Infektion zu schützen. Analyse der humoralen Immunantwort deutet darauf hin, dass der Impfschutz das Ergbnis einer TH1 Antwort war. Erste Schritte zur Aufklärung struktureller und funktioneller Eigenschaften von LinJ08.1140 wurden unternommen. Es wird allgemein angenommen, dass antigenspezifische CD4+ und CD8+ T-Zellen am Schutz beteiligt sind. Daher wurde für LinJ08.1140 potentielle MHC-I Epitope mit Hilfe von bioinformatischen Programmen vorhergesagt. Zusätzlich deuten Fluoreszenz-färbungen mit antigenspezifischen Antikörpern in L. major Promastigoten darauf hin, dass LinJ08.1140 eine Rolle bei der Zellteilung spielt. / Leishmaniasis is a neglected tropical disease and currently an estimated 350 million people in 88 countries around the world are at risk. Its most severe form, visceral leishmaniasis, affects the poorest people in a population and causes an estimated 50 000 deaths every year. Vaccination is thought to be feasible but despite all efforts, no vaccine is yet available. Vaccines will mainly be targeted for people in developing countries such as India, thus focus has to be placed on affordability. In this thesis a vaccine against visceral leishmaniasis was designed and evaluated in vivo at pre-clinical level. Furthermore, recombinant outer membrane vesicles were developed in an attempt to create a booster reagent. Both, the recombinant salmonella vaccine and the preparation of outer membrane vesicles should be commercially viable, and can still be sold at low prices, which is crucial for people in developing countries. First, novel antigen candidates were selected using proteomics data comparing leishmania life stages. Abundant and hypothetic proteins, which have been identified in both parasite life stages and have high sequence homology throughout Leishmania species while lacking homologues in human and mouse, were selected. These antigens were differentially expressed on the surface or in the cytosol of S. typhimurium SL3261 and in the form of outer membrane vesicles. A two step procedure was developed to select optimised vaccine strains based on bacterial fitness and antigen expression. Selected salmonella strains expressing LinJ08.1140, LinJ23.0410 or an admixture of these strains are shown to protect susceptible BALB/c mice by reducing visceralisation of L. major and more importantly L. donovani infections. Analysis of vaccine specific antibody responses suggests that protection resulted from induction of a TH1 response. First steps were undertaken towards resolving functional and structural properties of the most protective antigen LinJ08.1140. Putative MHC-I epitopes of antigen LinJ08.1140 were predicted using bioinformatics since antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells are believed to be required. In addition, immunofluorescent staining of LinJ08.1140 in L. major promastigotes suggested a functional role for this antigen in parasite cell division, since especially dividing cells emmited a strong fluorescence signal.

Selenoproteine enthalten die 21. Aminosäure Selenocystein (Sec), das über einen speziellen Mechanismus in Proteine eingebaut wird. Dieser beinhaltet eine Rekodierung des „Stopp“-Codons UGA in ein Sec-Codon unter Anleitung und Interaktion mehrerer Sec-spezifischer Faktoren, von denen einige sowie deren Funktionen bisher noch unbekannt sind. Darunter das SECp43, das als Kofaktor in der Selenoproteinbiosynthese vermutet wird. Aufgrund früherer Befunde wurde die Rolle von SECp43 in der Selenoproteinbiosynthese in vivo am Mausmodell untersucht und die Interaktion von SECp43 mit der tRNASec in vitro erneut getestet. Es wurden zwei Secp43-Mausmutanten generiert, wobei eine mit konstitutiv deletierten Exons 3 und 4, inklusive des ersten RNA recognition motif, keine Effekte zeigte. Die zweite Mutante hingegen, mit einer konstitutiven Deletion der Exons 7 und 8, welche die Tyrosin-reiche Region eliminierte, war embryonal letal. Eine dementsprechende leberspezifische Secp43-Inaktivierung wurde durchgeführt, um dort die Selenoproteinexpression zu analysieren. Die generierten Alb-Cre; Secp43fl/fl-Mäuse wiesen jedoch keine veränderte Expression auf. Weiterhin zeigten die Interaktionsstudien eine Bindung von SECp43 mit der tRNASec in vitro, die aber noch verifiziert werden muss. Die deletierten Domänen von SECp43 scheinen nicht essentiell für die Selenoproteinexpression in Hepatozyten zu sein. Darum wurde über eine konditionale Secp43-Inaktivierung in Neuronen überprüft, ob SECp43 in anderen Zellen essentiell ist. Bis auf einen leichten Bewegungsphänotyp wurde keine Veränderung der Selenoproteinexpression im Gehirn der Mutanten gefunden. Ein weiterer unbekannter Faktor ist die 2´O- Methyltransferase der tRNASec-Isoform mcm5Um. Die Präsenz der Isoform scheint mit der Expression stressbezogener Selenoproteine zu korrelieren. Anlässlich früherer Ergebnisse galt die RNMTL1 als ein Kandidat, deren Einfluss sowie der von Deletionsmutanten auf die Selenoproteinenexpression in HepG2-Zellen, insbesondere der Dejodase 1, getestet wurde, jedoch ohne einen Effekt zu zeigen und die früheren Ergebnisse zu reproduzieren. Auch konnte keine eindeutige Bindung von RNMTL1 mit der tRNASec in vitro im Interaktionstest nachgewiesen werden. Zudem wurde ein RNMTL1-Transport in die Mitochondrien angenommen, der vor allem über Importassays von unserer Kooperationsgruppe bestätigt wurde. Kurz nach Abschluss dieser Versuche wurde die RNMTL1 als die 2´O-Methyltransferase der Ribose von G1370 des 16S-rRNA-Kerns der humanen großen mitochondrialen Ribosomenuntereinheit identifiziert, wodurch unter Einbeziehung der Ergebnisse dieser Arbeit die RNMTL1 als Kandidat der 2´O- Methyltransferase der mcm5Um verworfen werden kann. / Selenoproteins contain the 21st amino acid selenocysteine (Sec). Sec is incorporated into proteins by a specific mechanism requiring the recoding of UGA stop codons into a SEC codon under guidance and interaction of several Sec-specific factors. Many of these are still unidentified and their functions unknown. SECp43 represents one of them which is hypothesized to serve as a co-factor in selenoprotein biosynthesis. Due to former results the role of SECp43 within the selenoprotein biosynthesis was analyzed in vivo in a mouse model and in addition the interaction between SECp43 and the tRNASec was tested again in vitro. Two Secp43 mouse mutants were generated whereupon one with constitutive deletion of exons 3 and 4, including the first RNA recognition motif, wasn’t showing any effect. In contrast the second mutant with a constitutive deletion of exons 7 and 8, including the tyrosine-rich region, was embryonal lethal. A corresponding liver specific inactivation of Secp43 was carried out to analyze the local selenoprotein expression. However, the generated Alb-Cre; Secp43fl/fl-mice didn’t exhibit any changes in the selenoprotein expression. Furthermore, the binding studies demonstrated an interaction of SECp43 with tRNASec in vitro, but which has to be verified specifically. The eliminated domains of SECp43 appear not to be essential for selenoprotein biosynthesis in hepatocytes. Thus, it was tested whether SECp43 is essential in other cells via a conditional inactivation of Secp43 in neurons. Other than a slight mobility phenotype there was no altered selenoprotein expression in the brain of mutant mice observed. The 2´O-methyltransferase of the tRNASec isoform mcm5Um stands for another unidentified factor. Due to prior investigation, RNMTL1 served as a potential candidate. The presence of this isoform is supposed to correlate with expression of stress-related selenoproteins. Thereby, the influence of RNMTL1 and whose corresponding deletion mutants on selenoprotein expression in HepG2 cells, particularly deiodinase 1, was tested. But no effect was shown and former findings couldn’t be reproduced. Additionally, no distinct interaction of RNMTL1 with the tRNASec through binding tests in vitro could be detected. Moreover, a transport of RNMTL1 into mitochondria was assumed, which was confirmed primarily via import assays by our cooperation partner. Briefly after finishing these experiments, the RNMTL1 was identified as the responsible 2´O-methyltransferase of the ribose at position G1370 of the 16S rRNA core from the large human mitochondrial ribosome subunit. Thus, in addition to our results, lead to the conclusion that RNMTL1 is not the responsible 2´O-methyltransferase of mcm5Um.

Der Südozean ist die Schlüsselregion zur Kenntnis der neogenen Klimaentwicklung. In diesem Zusammenhang ist die Untersuchung von planktonischen Gemeinschaften in Hinblick auf die Umweltentwicklung von großer Bedeutung. In antarktischen neogenen Sedimenten sind Radiolarien reichlich, in großer Diversität und einheitlich gut erhalten. Sie sind nicht nur perfekte Testobjekte für paläobiologischen Studien, sondern auch eine wichtige Quelle für eine verbesserte Biostratigraphie – bisher behinderte nämlich das Fehlen einer verlässlichen Geochronologie detaillierte Studien. Es wurde ein Datensatz aller Taxa von mehreren Standorten des Südozeans gesammelt: für alle der 98 Proben je ca. 7000 Radiolarien. Die Fauna enthält ca. 500 Arten (inclusive 120 neuer Taxa). Die Untersuchung der Makroevolutionsgeschichte dieser Fauna zeigt, dass eine wesentliche ökologische Umwälzung, ohne Aussterbeereignis, bezogen auf den Verlauf der Artengleichheit und den Anstieg der Gattung Antarctissa, bei ca. 8 Ma erfolgte. Dann, 3 My später, folgte ein wesentlicher Diversitätsverlust. Obwohl das ökologische Ereignis eventuell mit einer Änderung der Primärproduzenten assoziiert sein kann, ist der auslösende Faktor des Diversitätsabfalls unbekannt. Außerdem zeigt der Vergleich zwischen der Diversitätsgeschichte dieser Fauna und einer Paläodiversitätsrekonstruktion südozeanischer Faunen, beruhend auf der Neptune Datenbank, daß der generelle Verläufe mit den Probenteilungsmethodologien nachgezeichnet wird, jedoch diese Methodologien aufgrund grober Verzerrungen nicht geeignet für Detailstudien sind. Schließlich wurde eine biostratigraphische Analyse für die komplette Fauna vom Obermiozän bis Pliozän durchgeführt. Obwohl diese Analyse noch vorlaüfig ist, zeigt sich eine Angleichung des aktuellen Altersmodells um mehr als 1 My. Diese Studie zeigt auch 94 neue, sichere Ereignisse, die für die stratigraphische Einordnung der Antarktischen Sedimente genutzt werden können. / The Southern Ocean is the key to understand the Neogene climate evolution. Unfortunately the lack of a robust geochronological framework has hindered precise studies. Equally of interest is understanding how planktonic communities changed in relation with the evolution of these environments. Radiolarians are abundant in Antarctic Neogene sediments, diversified and consistently well-preserved. They should constitute not only an ideal testing ground for paleobiological studies but also a major resource for improved biostratigraphy. In this study, a quantitative, taxonomically-complete dataset have been collected in various sites of the Southern Ocean, using 98 samples and ca. 7000 specimens per sample. Ca. 500 species were uncovered in this fauna, including 120 new to science. The study of the macroevolutionary history of this fauna reveals that a significant, extinctionless ecological turnover, linked to a decrease in the evenness of the species'' abundances and the rise of genus Antarctissa to dominance, occured at ca. 8 Ma, followed 3 My later by a significant diversity loss. Although the ecological event can be tentatively associated with a regional change in the composition of primary producers, the triggering event of the diversity loss is yet to be found. The whole-fauna diversity history was compared to paleodiversity reconstructions computed using subsampling methodologies from the occurrences gathered in the Neptune database. The comparison shows that the main trends are retrieved by the subsampling procedures but also that substantial distortions make them poorly suited for detailed studies. Finally a biostratigraphical analysis was conducted on this whole-fauna dataset for the late Miocene - Pliocene sequence. Although this analysis is still very much preliminary, it shows a coherent readjustement of the current age models by more than 1 My. This study also shows that 94 events seem reliable enough to be used to correlate Southern Ocean sites together.