Fructose-2, 6-bisphosphate (fru-2, 6P2), synthesized by 6-phosphofructo-2-kinase (PFK2), regulates glucose metabolism via modulating phosphofructokinase-1 (PFK1) and fructose-1, 6-bisphosphatase (FBPase1) reciprocally in mammalian tissues. How this control system develops in brain is poorly understood. This article presents the postnatal comparative profiles of fru-2, 6P2 and PFK2 & fru-2, 6P2 dependent regulation of PFK1 and FBPase1 in mice brain. Fru-2, 6P2 and PFK2 activity both attained their adult levels in concordance from day1 to 1wk age. Western blot analysis of mice liver and brain & rat liver PFK2 using anti rat liver PFK2/FBPase2 confirmed that both, mice liver and brain isoforms cross- react efficiently with this antibody. In addition, DEAE-eluted brain fractions from different postnatal ages revealed that 1day mice brain expresses a liver type enzyme (∼55 kDa) that is replaced by an adult brain type protein (∼110 kDa) from 1wk onward ages. As compared to 1day mice, significantly decreased Km values of PFK2 at 1wk-10wk ages also suggest the existence of a kinetically different isoform of this enzyme from 1wk onward ages. In vitro effects of fru-2, 6P2 on partially enriched brain PFK1 and FBPase1 suggest that fru-2, 6P2 dependent respective stimulatory and inhibitory responses of both these enzymes increase progressively from day1 to 3wk age. This is well corroborated with the postnatal age-dependent linear increase in PFK1 and decrease in FBPase1 activities in mice brain. The results suggest that fru-2, 6P2 associated regulatory components develop in concordance in mice brain during early postnatal life.

Das S100A4-Protein ist für die Manifestierung eines metastatischen Phänotyps bei vielen Tumorarten von enormer Bedeutung. Die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und der Interaktionspartner von S100A4 stellt daher einen vielsprechenden Forschungsansatz dar, um neue Erkenntnisse über das Verhalten von Tumorzellen während des Metastasierungsprozesses zu erhalten. Darauf aufbauend können neue Ansatzpunkte für die Therapie metastasierender Krebserkrankungen gewonnen werden. In dieser Hinsicht ist das bisher einer Behandlung kaum zugängliche maligne Melanom als besonders aggressiver und frühzeitig metastasierender Tumor ein ideales Modell zur Aufklärung der zellulären und molekularen Prozesse, über die S100A4 seine Metastasen-fördernden Wirkungen ausübt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die biochemische und radiopharmakologische Charakterisierung der S100A4-RAGE-Interaktion sowie die Untersuchung der Beteiligung von S100A4 an Prozessen der Metastasierungskaskade in vitro und in vivo. Dies erforderte die Herstellung von rekombinantem S100A4-Protein und die Generierung von stabil mit S100A4-transfizierten Melanomzellen, die damit eine heraufregulierte S100A4-Proteinbiosynthese aufweisen. Die Gewinnung von rekombinantem S100A4 in biologisch funktioneller Form unter Verwendung eines prokaryotischen Expressionssystems erfolgte mit einem Reinheitsgrad von ca. 92%. Das rekombinante S100A4-Protein wurde mit dem Aktivester N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoat radioaktiv markiert und charakterisiert. Es wurde die Interaktion zwischen S100A4 bzw. 18F-markiertem S100A4 und der löslichen RAGE-Isoform sRAGE mit einer moderaten Bindungsaffinität im µM-Bereich nachgewiesen. Des Weiteren erfolgte erstmals die Analyse der radiopharmakologischen Eigenschaften von 18F-S100A4 mittels Untersuchungen zur zellulären Assoziation sowie zur metabolischen Stabilität, Bioverteilung und zu In-vivo-Interaktionen mittels Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie in der Ratte. Die In-vitro-Experimente wurden an Endothelzellen (HAEC) und an stabil mit RAGE-transfizierten A375-, A375-mock bzw. nicht transfizierten A375-Melanomzellen durchgeführt. Die A375-hRAGE-Zellen zeigten eine deutlich heraufregulierte RAGE-Proteinbiosynthese während die Endothelzellen eine vergleichsweise geringe intrazelluläre RAGE-Proteinkonzentration aufwiesen. Bei den Melanomzellen kann aufgrund der höheren Assoziation von 18F-S100A4 an A375-hRAGE-Zellen auf eine selektive Bindung von 18F S100A4 an RAGE-Rezeptoren auf der Zelloberfläche geschlossen werden. Die Assoziation von 18F S100A4 an Endothelzellen war bei 37°C in Gegenwart von nicht markiertem rekombinantem S100A4 signifikant vermindert, dementsprechend findet eine spezifische Interaktion von 18F-S100A4 mit Zelloberflächenrezeptoren der Endothelzellen statt. Dieses Ergebnis und die insgesamt höhere Bindung von 18F S100A4 an Endothelzellen im Vergleich zur Assoziation an Melanomzellen lassen neben RAGE noch andere Rezeptoren wie z. B. internalisierende Scavenger-Rezeptoren vermuten. Die In-vivo-Stabilitätsuntersuchungen verdeutlichen einen proteolytischen Abbau von 18F S100A4, allerdings belegen das Vorhandensein von 67% intaktem 18F-S100A4-Protein nach einer Stunde, die Stabilität von 18F-S100A4 in vivo. Die Bioverteilungs- bzw. PET-Untersuchungen zeigen eine schnelle, innerhalb weniger Minuten stattfindende hohe Akkumulation in den Nieren und verdeutlichen somit die renale Ausscheidung von 18F S100A4. Die maßgeblichen Anreicherungen in Milz, Leber, Blut, Lunge und Nebennieren lassen Interaktionen mit Oberflächenrezeptoren dieser Gewebe erkennen. Die temporäre Retention von 18F-S100A4 in der Lunge, dem Hauptsyntheseorgan von RAGE, und die verminderte 18F-S100A4-Akkumulation in Gegenwart des spezifischen RAGE-Liganden glykLDL ist ein Hinweis dafür, dass S100A4 in vivo in der Lunge an RAGE bindet. Die Aktivitätsanreicherungen in Milz, Leber und Nebenniere deuten aufgrund der geringeren RAGE-Synthese in diesen Organen auf die Interaktion von 18F-S100A4 mit anderen Zelloberflächenrezeptoren z. B. aus der Familie der Scavenger-Rezeptoren hin. Die Beteiligung von S100A4 an Metastasierungsprozessen des malignen Melanoms wurde an stabil mit S100A4-transfizierten A375-Melanomzellen, die eine Heraufregulierung der humanen bzw. murinen S100A4-Proteinbiosynthese im Vergleich zu A375-mock- (Vektor-Kontrolle) und nicht-transfizierten A375-Zellen zeigen, untersucht. Die A375-hS100A4-Zellen sezernierten zudem eine signifikant höhere S100A4-Proteinkonzentration in das umgebende Zellkulturmedium im Vergleich zu den Kontrollen. In dieser Hinsicht konnte bei den A375-hS100A4-Zellen, vermutlich aufgrund der höheren extrazellulären S100A4-Konzentration, eine gesteigerte Proliferations-, Motilitäts-, Migrations- und Invasionsrate gegenüber den A375-mock- und A375-Zellen nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang stehen ebenso die gesteigerte RAGE-Proteinbiosynthese und die signifikant höhere Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB bei A375-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Kulturmedium der A375-hS100A4-Zellen. Demnach wirkt vermutlich das extrazelluläre S100A4-Protein als autokriner bzw. parakriner Regulator von RAGE und NF κB. Die subkutane Injektion der A375- und stabil transfizierten A375-Melanomzellen in Nacktmäuse führte zur Entwicklung subkutaner Tumore an der Injektionsstelle. Bereits zwei Wochen nach der Injektion etablierten die A375-hS100A4-Zellen die signifikant größeren Tumore im Vergleich zu den A375-mS100A4-, A375-mock und A375-Zellen. Nach Injektion der Zellen in die Schwanzvene der Nacktmäuse konnte keine Entwicklung von Metastasen im Tierkörper festgestellt werden. IN DER VORLIEGENDEN ARBEIT WURDE NACHGEWIESEN: • RAGE ist ein Rezeptor für das S100A4-Protein. Allerdings gibt es eindeutige Hinweise für weitere S100A4-Zielproteine an der Zelloberfläche. • Die bedeutende Rolle von extrazellulärem S100A4 bei wichtigen zellulären Metastasierungsprozessen sowie bei der Aktivierung von Signalproteinen wie NF-κB und RAGE beim malignen Melanom. Die weitere Aufklärung der S100A4-spezifischen Signalkaskaden und Rezeptoren bei metastasierenden Tumorerkrankungen sowie die Charakterisierung von S100A4 als klinischen Parameter bei Patienten mit malignem Melanom stellen hoch interessante Aspekte in der Krebsforschung dar.

Das S100A4-Protein ist für die Manifestierung eines metastatischen Phänotyps bei vielen Tumorarten von enormer Bedeutung. Die Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen und der Interaktionspartner von S100A4 stellt daher einen vielsprechenden Forschungsansatz dar, um neue Erkenntnisse über das Verhalten von Tumorzellen während des Metastasierungsprozesses zu erhalten. Darauf aufbauend können neue Ansatzpunkte für die Therapie metastasierender Krebserkrankungen gewonnen werden. In dieser Hinsicht ist das bisher einer Behandlung kaum zugängliche maligne Melanom als besonders aggressiver und frühzeitig metastasierender Tumor ein ideales Modell zur Aufklärung der zellulären und molekularen Prozesse, über die S100A4 seine Metastasen-fördernden Wirkungen ausübt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die biochemische und radiopharmakologische Charakterisierung der S100A4-RAGE-Interaktion sowie die Untersuchung der Beteiligung von S100A4 an Prozessen der Metastasierungskaskade in vitro und in vivo. Dies erforderte die Herstellung von rekombinantem S100A4-Protein und die Generierung von stabil mit S100A4-transfizierten Melanomzellen, die damit eine heraufregulierte S100A4-Proteinbiosynthese aufweisen. Die Gewinnung von rekombinantem S100A4 in biologisch funktioneller Form unter Verwendung eines prokaryotischen Expressionssystems erfolgte mit einem Reinheitsgrad von ca. 92%. Das rekombinante S100A4-Protein wurde mit dem Aktivester N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoat radioaktiv markiert und charakterisiert. Es wurde die Interaktion zwischen S100A4 bzw. 18F-markiertem S100A4 und der löslichen RAGE-Isoform sRAGE mit einer moderaten Bindungsaffinität im µM-Bereich nachgewiesen. Des Weiteren erfolgte erstmals die Analyse der radiopharmakologischen Eigenschaften von 18F-S100A4 mittels Untersuchungen zur zellulären Assoziation sowie zur metabolischen Stabilität, Bioverteilung und zu In-vivo-Interaktionen mittels Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie in der Ratte. Die In-vitro-Experimente wurden an Endothelzellen (HAEC) und an stabil mit RAGE-transfizierten A375-, A375-mock bzw. nicht transfizierten A375-Melanomzellen durchgeführt. Die A375-hRAGE-Zellen zeigten eine deutlich heraufregulierte RAGE-Proteinbiosynthese während die Endothelzellen eine vergleichsweise geringe intrazelluläre RAGE-Proteinkonzentration aufwiesen. Bei den Melanomzellen kann aufgrund der höheren Assoziation von 18F-S100A4 an A375-hRAGE-Zellen auf eine selektive Bindung von 18F S100A4 an RAGE-Rezeptoren auf der Zelloberfläche geschlossen werden. Die Assoziation von 18F S100A4 an Endothelzellen war bei 37°C in Gegenwart von nicht markiertem rekombinantem S100A4 signifikant vermindert, dementsprechend findet eine spezifische Interaktion von 18F-S100A4 mit Zelloberflächenrezeptoren der Endothelzellen statt. Dieses Ergebnis und die insgesamt höhere Bindung von 18F S100A4 an Endothelzellen im Vergleich zur Assoziation an Melanomzellen lassen neben RAGE noch andere Rezeptoren wie z. B. internalisierende Scavenger-Rezeptoren vermuten. Die In-vivo-Stabilitätsuntersuchungen verdeutlichen einen proteolytischen Abbau von 18F S100A4, allerdings belegen das Vorhandensein von 67% intaktem 18F-S100A4-Protein nach einer Stunde, die Stabilität von 18F-S100A4 in vivo. Die Bioverteilungs- bzw. PET-Untersuchungen zeigen eine schnelle, innerhalb weniger Minuten stattfindende hohe Akkumulation in den Nieren und verdeutlichen somit die renale Ausscheidung von 18F S100A4. Die maßgeblichen Anreicherungen in Milz, Leber, Blut, Lunge und Nebennieren lassen Interaktionen mit Oberflächenrezeptoren dieser Gewebe erkennen. Die temporäre Retention von 18F-S100A4 in der Lunge, dem Hauptsyntheseorgan von RAGE, und die verminderte 18F-S100A4-Akkumulation in Gegenwart des spezifischen RAGE-Liganden glykLDL ist ein Hinweis dafür, dass S100A4 in vivo in der Lunge an RAGE bindet. Die Aktivitätsanreicherungen in Milz, Leber und Nebenniere deuten aufgrund der geringeren RAGE-Synthese in diesen Organen auf die Interaktion von 18F-S100A4 mit anderen Zelloberflächenrezeptoren z. B. aus der Familie der Scavenger-Rezeptoren hin. Die Beteiligung von S100A4 an Metastasierungsprozessen des malignen Melanoms wurde an stabil mit S100A4-transfizierten A375-Melanomzellen, die eine Heraufregulierung der humanen bzw. murinen S100A4-Proteinbiosynthese im Vergleich zu A375-mock- (Vektor-Kontrolle) und nicht-transfizierten A375-Zellen zeigen, untersucht. Die A375-hS100A4-Zellen sezernierten zudem eine signifikant höhere S100A4-Proteinkonzentration in das umgebende Zellkulturmedium im Vergleich zu den Kontrollen. In dieser Hinsicht konnte bei den A375-hS100A4-Zellen, vermutlich aufgrund der höheren extrazellulären S100A4-Konzentration, eine gesteigerte Proliferations-, Motilitäts-, Migrations- und Invasionsrate gegenüber den A375-mock- und A375-Zellen nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang stehen ebenso die gesteigerte RAGE-Proteinbiosynthese und die signifikant höhere Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB bei A375-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit Kulturmedium der A375-hS100A4-Zellen. Demnach wirkt vermutlich das extrazelluläre S100A4-Protein als autokriner bzw. parakriner Regulator von RAGE und NF κB. Die subkutane Injektion der A375- und stabil transfizierten A375-Melanomzellen in Nacktmäuse führte zur Entwicklung subkutaner Tumore an der Injektionsstelle. Bereits zwei Wochen nach der Injektion etablierten die A375-hS100A4-Zellen die signifikant größeren Tumore im Vergleich zu den A375-mS100A4-, A375-mock und A375-Zellen. Nach Injektion der Zellen in die Schwanzvene der Nacktmäuse konnte keine Entwicklung von Metastasen im Tierkörper festgestellt werden. IN DER VORLIEGENDEN ARBEIT WURDE NACHGEWIESEN: • RAGE ist ein Rezeptor für das S100A4-Protein. Allerdings gibt es eindeutige Hinweise für weitere S100A4-Zielproteine an der Zelloberfläche. • Die bedeutende Rolle von extrazellulärem S100A4 bei wichtigen zellulären Metastasierungsprozessen sowie bei der Aktivierung von Signalproteinen wie NF-κB und RAGE beim malignen Melanom. Die weitere Aufklärung der S100A4-spezifischen Signalkaskaden und Rezeptoren bei metastasierenden Tumorerkrankungen sowie die Charakterisierung von S100A4 als klinischen Parameter bei Patienten mit malignem Melanom stellen hoch interessante Aspekte in der Krebsforschung dar.

Zentrales Thema dieser Dissertation ist die Untersuchung anorganisch/organischer Hybridsysteme (HIOS) mit besonderem Fokus auf den speziellen Prozessen an der Grenzfläche beider Materialklassen. Organische Moleküle, in Verbindung mit anorganischen Halbleitern haben ein großes Potenzial für Anwendungen in zukünftigen optoelektronischen Hybridbauteilen, indem sie Vorteile zweier unterschiedlicher Welten kombinieren. Entscheidend für die Herstellung von hybriden Strukturen ist das Verständnis der Wechselwirkungen an der Grenzfläche zwischen organischem und anorganischem Material. In dieser Arbeit werden diese Wechselwirkungen analysiert, um eine Wachstumskontrolle an der Grenzfläche zwischen konjugierten organischen Molekül und anorganischem Halbleiter zu ermöglichen. Hierfür werden unterschiedliche Ansätze verfolgt: Im ersten Teil der Arbeit wird die Wechselwirkung des Modellsystems Sexiphenyl (6P) an der Grenzfläche zu ZnO untersucht, sowie das Wachstum des Moleküls mittels verschiedener Methoden kontrolliert. Das daraus gewonnene Wissen kann im zweiten Teil dazu verwendet werden einen hybriden ZnO/6P/ZnO-Stapel zu realisieren, bei dem die organische Schicht ohne Beeinträchtigung der Kristallstruktur, mit definierten Grenzflächen bis hin zur atomaren/molekularen Ebene, überwachsen werden kann. Der letzte Teil der Arbeit befasst sich mit der optischen Echtzeit-Beobachtung während des organischen Wachstums verschiedener Moleküle. Dadurch ist es möglich Veränderungen von Struktureigenschaften und Wechselwirkungen zwischen Molekülen und dem Substrat zerstörungsfrei zu bestimmen, während diese aufgewachsen werden. Hierdurch können schlussendlich mögliche Mechanismen aufgezeigt werden, um elektronische und optische Wechselwirkung an der Grenzfläche zwischen organischem Molekül und anorganischen Halbleitern zu analysieren, sowie Wachstumsprozesse weiter zu verstehen und kontrollieren. / The central subject of this thesis are hybrid inorganic/organic systems (HIOS) with a focus on the specific processes at the interface between the two material classes. Organic molecules used together with inorganic semiconductors, have a great potential for future optoelectronic applications in hybrid components, by combining the advantages of two dissimilar worlds. Decisive for the production of hybrid structures is the understanding of the interactions at the interface between organic and inorganic material. In this thesis, the interactions are analyzed to enable growth control at the interface between conjugated organic molecules and inorganic semiconductors. In the first part of the thesis, the interaction of the model system sexiphenyl (6P) at the interface with ZnO, as well as approaches to control the growth of the molecule are being investigated. The knowledge gained here is used in the second part to realize a hybrid ZnO/6P/ ZnO stack, in which the organic layer can be overgrown without affecting the crystal structure, exhibiting defined interfaces down to the atomic/molecular level. The last part of the thesis deals with real time optical observation during organic growth of different molecules. By this changes in structural properties and interactions between molecules and the substrate can be non-destructively determined as they are growing. Ultimately, a comprehensive insight into the optical and electronic interactions at the interface between organic molecules and inorganic semiconductors can be gained and possible control mechanisms are shown.

Die Interaktion von S100-Proteinen mit dem Rezeptor für advanced glycation endproducts (RAGE) wird als hoch relevant bei der Entstehung, Manifestation und Progression verschiedener entzündlicher Erkrankungen sowie bei der Tumorigenese gewertet. Das tiefergehende Verständnis der Interaktion von S100-Proteinen mit RAGE in vivo stellt eine wissenschaftliche Herausforderung dar und ist ein Ansatz für therapeutische Interventionen. Darüber hinaus stellen Untersuchungen zum Metabolismus von extrazellulär zirkulierenden S100-Proteinen in vivo einen vielversprechenden Forschungsansatz zur Analyse von S100-Protein-assoziierten Erkrankungen dar. Die einzigartigen Eigenschaften der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) als nicht-invasives bildgebendes Verfahren erlauben die Darstellung und quantitative Erfassung biochemischer Prozesse mit der Möglichkeit zelluläre und molekulare Reaktionswege aufzuzeigen sowie in vivo-Mechanismen von Krankheiten im Kontext eines physiologischen Umfeldes darzulegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Fluor-18-markierte S100-Proteine (18F-S100) herzustellen, diese biochemisch, radiochemisch und radiopharmakologisch zu charakterisieren und deren Metabolismus und Interaktion mit RAGE in vivo mittels Kleintier-PET am Tiermodell zu untersuchen. Es wurden die mit RAGE interagierenden S100-Proteine S100A1, S100A12 und S100B in biologisch funktioneller Form hergestellt. Dazu wurden die entsprechenden S100-Gene in den prokaryotischen Expressionsvektor pGEX-6P-1 kloniert. Mit diesen Konstrukten wurden E. coli-Zellen transformiert, aus denen nachfolgend die S100-Proteine isoliert und gereinigt werden konnten. Es konnte eine Reinigung unter nativen, milden Bedingungen etabliert werden, die es ermöglichte, S100A1, S100A12 und S100B in biologisch aktiver Form und in hohen Reinheitsgraden (> 95%) für die nachfolgenden Experimente bereitzustellen. Diese S100-Proteine wurden über den 18F-tragenden Aktivester N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoesäure ([18F]SFB) radioaktiv markiert und charakterisiert. Dabei konnte sichergestellt werden, dass die 18F-S100-Proteine in vitro und in vivo stabil sind. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die radioaktive Markierung keine Beeinträchtigung auf die biologische Funktionalität der S100-Proteine hat. Dies wurde anhand von sRAGE-Bindungsuntersuchungen sowie Zell-Interaktionsuntersuchungen an konfluenten Endothelzellen (HAEC) und an zu Makrophagen differenzierten THP-1-Zellen (THP-1-Makrophagen) verifiziert. Für die Untersuchung der RAGE-Bindung war die Produktion des löslichen sRAGE bzw. die Generation von flRAGE-berexprimierenden Zellen erforderlich. Beide Konstrukte wurden in geeigneten Zellsystemen exprimiert und das sRAGE-Protein wurde in biologisch aktiver Form synthetisiert und gereinigt (Reinheitsgrad > 97%). Die 18F-S100-Bindung an THP-1-Makrophagen und HAEC wurde in Gegenwart von glykierten LDL (glykLDL) sowie sRAGE signifikant inhibiert, was auf eine RAGE-Interaktion hinweist. Weiterhin konnten durch den Einsatz von Scavenger-Rezeptor-Liganden, wie z. B. Maleinanhydrid-modifiziertes BSA (malBSA) bzw. von Lektinen inhibierende Effekte erzielt werden. Dies ist ein Indiz für die 18F-S100-Interaktion mit Scavenger-Rezeptoren und Glykokonjugaten an der Zelloberfläche. Durch die Untersuchungen mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie an THP-1-Makrophagen wurde eine Zellaufnahme des Fluoreszein-markierten S100A12 festgestellt. Weiterhin konnten Kolokalisationen mit Lektinen detektiert werden. Das metabolische Schicksal extrazellulär zirkulierender 18F-S100-Proteine in vivo wurde mit Hilfe dynamischer PET-Untersuchungen bzw. anhand von Bioverteilungs-Untersuchungen in männlichen Wistar-Ratten analysiert. Die Hauptakkumulation der Radioaktivität wurde in der Leber und in den Nieren detektiert. In diesen Organen findet der Metabolismus bzw. die glomeruläre Filtration der 18F-S100-Proteine statt. In den Untersuchungen zur Genexpression mittels Echtzeit-PCR sowie im immunchemischen Proteinnachweis am Western Blot wurde eine hohe Expression und Proteinbiosynthese des RAGE in der Lunge ermittelt. Die Lunge eignet sich daher als „Referenz“-Organ für eine funktionelle in vivo-Charakterisierung von RAGE mit 18FS100-Proteinen. Bei den durchgeführten PET-Untersuchungen konnte eine temporäre 18F-S100-Interaktion mit dem Lungengewebe festgestellt werden. Die Retention des 18FS100A12 in der Lunge wurde in Gegenwart von sRAGE inhibiert. Dies ist ein Hinweis dafür, dass 18F-S100-Proteine auch in vivo an RAGE binden können. Die Radioaktivitäts-Akkumulation in den Organen Leber und Milz, die eine Vielzahl von sessilen Makrophagen aufweisen, wurde durch die Applikation von malBSA inhibiert. Dies ist ein Indiz dafür, dass 18F-S100-Proteine in vivo mit Scavenger-Rezeptoren interagieren können. Die vorliegende Arbeit liefert deutliche Hinweise darauf, dass RAGE nicht der alleinige Rezeptor für 18F-S100-Proteine ist. Der Einsatz von 18F-S100-Proteinen als experimentelles Werkzeug in dynamischen PET-Untersuchungen birgt das Potential einer Charakterisierung von S100-Protein-assoziierten, pathophysiologischen Prozessen. / Members of the S100 family of EF-hand calcium binding proteins play important regulatory roles not only within cells but also exert effects in a cytokine-like manner on definite target cells once released into extracellular space or circulating blood. Accordingly, increased levels of S100 proteins in the circulating blood have been associated with a number of disease states, e.g., diabetes, cancer, and various inflammatory disorders. As the best known target protein of extracellular S100 proteins, the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is of significant importance. However, the role of extracellular S100 proteins during etiology, progression, and manifestation of inflammatory disorders still is poorly understood. One reason for this is the shortage of sensitive methods for direct assessment of the metabolic fate of circulating S100 proteins and, on the other hand, measurement of functional expression of extracellular targets of S100 proteins, e.g., RAGE in vivo. In this line, small animal PET provides a valuable tool for noninvasive imaging of physiological processes and interactions like plasma or vascular retention, tissue-specific receptor binding, accumulation or elimination in vivo. To address this question, human S100 proteins were cloned in the bacterial expression vector pGEX-6P-1, expressed in E. coli BL21, and purified by affinity chromatography and anion exchange chromatography. Purified S100A1, S100B and S100A12 proteins were then radiolabeled with the positron emitter fluorine-18 (18F) by N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB). Radiolabeling of S100 proteins resulted in radiochemical yields of 3-10% (corrected for decay) and effective specific radioactivities of 1 GBq/µmol, respectively. For investigations about RAGE binding soluble RAGE (sRAGE) was expressed and purified using pSecTag2B. A radioligand binding assay confirmed specific binding of 18F-S100A12, 18F-S100A1, and 18F-S100B to immobilized sRAGE, also showing an order of affinity with S100A12 > S100A1 > S100B. These results indicate that radioactive labelling of S100 proteins did not affect their overall affinity to RAGE. Cellular association studies in human THP-1 macrophages and human aortic endothelial cells (HAEC) showed specific binding of all 18F-S100 proteins to the non-internalizing RAGE as confirmed by inhibitory effects exerted either by other RAGE ligands, e.g., glycated LDL, or by soluble RAGE. Of interest, 18F-S100 proteins were also shown to interact with other putative binding sites, e.g. scavenger receptors as well as proteoglycans. In this line, uptake of 18F-S100 proteins in THP-1 and HAEC could be inhibited by various scavenger receptor ligands, in particular by maleylated BSA as well as by lectines (e.g. ConA and SBA). Confocal laser scanning microscopy analysis showed a major part of the fluoresceinated S100A12 bound to the surface of THP-1 macrophages. Beyond this, uptake of S100A12 could be determined indicating an interaction of S100A12 with both non-internalizing, e.g., RAGE, and internalizing receptors, e.g. scavenger receptors. By evaluation of the relative contribution of 18F-S100A12 association to RAGE-overexpressed CHO cells (using pIres2-AcGFP1), 18F-S100A12 showed a significantly higher association to CHO-RAGE cells compared with CHO-mock cells. Based on these findings and due to their crucial role in inflammatory disorders the metabolic fate of S100 proteins was further investigated in dynamic small animal Positron emission tomography (PET) studies as well as in biodistribution studies in Wistar rats in vivo. For interpretation of in vivo investigations in rats, expression of RAGE was analyzed by quantitative real time RT-PCR as well as western blotting in various organs. Lung tissue expressed the highest level of RAGE protein compared to the other tissues. PET studies in rats revealed a comparatively long mean residence time of circulating 18F-S100 proteins. A major contributor to this phenomenon seems to be a sustained temporary interaction with tissues overexpressing RAGE, e.g., the lung. On the other hand, renal clearance of 18F-S100 via glomerular filtration is a major elimination pathway. However, scavenger receptor-mediated pathways in the liver, the spleen and, to a minor extent, in the kidneys, also seem to contribute to the overall clearance. The presence of sRAGE revealed a decreased retention of 18F-S100A12 in the lung, indicating in vivo binding to RAGE. In vivo blocking studies using maleylated BSA demonstrated a strong inhibition of putative binding sites in rat tissues enriched in cells expressing scavenger receptors like liver and spleen. In conclusion, 18F-labeling of S100 proteins and the use of small animal PET provide a valuable tool to discriminate the kinetics and the metabolic fate of S100 proteins in vivo. Furthermore, the results strongly suggest an involvement of other putative receptors beside RAGE in distribution, tissue association and elimination of circulating proinflammatory S100 proteins. Moreover, the approach provides novel probes for imaging of functional expression of RAGE and scavenger receptors in peripheral inflammatory compartments.

Die Interaktion von S100-Proteinen mit dem Rezeptor für advanced glycation endproducts (RAGE) wird als hoch relevant bei der Entstehung, Manifestation und Progression verschiedener entzündlicher Erkrankungen sowie bei der Tumorigenese gewertet. Das tiefergehende Verständnis der Interaktion von S100-Proteinen mit RAGE in vivo stellt eine wissenschaftliche Herausforderung dar und ist ein Ansatz für therapeutische Interventionen. Darüber hinaus stellen Untersuchungen zum Metabolismus von extrazellulär zirkulierenden S100-Proteinen in vivo einen vielversprechenden Forschungsansatz zur Analyse von S100-Protein-assoziierten Erkrankungen dar. Die einzigartigen Eigenschaften der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) als nicht-invasives bildgebendes Verfahren erlauben die Darstellung und quantitative Erfassung biochemischer Prozesse mit der Möglichkeit zelluläre und molekulare Reaktionswege aufzuzeigen sowie in vivo-Mechanismen von Krankheiten im Kontext eines physiologischen Umfeldes darzulegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Fluor-18-markierte S100-Proteine (18F-S100) herzustellen, diese biochemisch, radiochemisch und radiopharmakologisch zu charakterisieren und deren Metabolismus und Interaktion mit RAGE in vivo mittels Kleintier-PET am Tiermodell zu untersuchen. Es wurden die mit RAGE interagierenden S100-Proteine S100A1, S100A12 und S100B in biologisch funktioneller Form hergestellt. Dazu wurden die entsprechenden S100-Gene in den prokaryotischen Expressionsvektor pGEX-6P-1 kloniert. Mit diesen Konstrukten wurden E. coli-Zellen transformiert, aus denen nachfolgend die S100-Proteine isoliert und gereinigt werden konnten. Es konnte eine Reinigung unter nativen, milden Bedingungen etabliert werden, die es ermöglichte, S100A1, S100A12 und S100B in biologisch aktiver Form und in hohen Reinheitsgraden (> 95%) für die nachfolgenden Experimente bereitzustellen. Diese S100-Proteine wurden über den 18F-tragenden Aktivester N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoesäure ([18F]SFB) radioaktiv markiert und charakterisiert. Dabei konnte sichergestellt werden, dass die 18F-S100-Proteine in vitro und in vivo stabil sind. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die radioaktive Markierung keine Beeinträchtigung auf die biologische Funktionalität der S100-Proteine hat. Dies wurde anhand von sRAGE-Bindungsuntersuchungen sowie Zell-Interaktionsuntersuchungen an konfluenten Endothelzellen (HAEC) und an zu Makrophagen differenzierten THP-1-Zellen (THP-1-Makrophagen) verifiziert. Für die Untersuchung der RAGE-Bindung war die Produktion des löslichen sRAGE bzw. die Generation von flRAGE-berexprimierenden Zellen erforderlich. Beide Konstrukte wurden in geeigneten Zellsystemen exprimiert und das sRAGE-Protein wurde in biologisch aktiver Form synthetisiert und gereinigt (Reinheitsgrad > 97%). Die 18F-S100-Bindung an THP-1-Makrophagen und HAEC wurde in Gegenwart von glykierten LDL (glykLDL) sowie sRAGE signifikant inhibiert, was auf eine RAGE-Interaktion hinweist. Weiterhin konnten durch den Einsatz von Scavenger-Rezeptor-Liganden, wie z. B. Maleinanhydrid-modifiziertes BSA (malBSA) bzw. von Lektinen inhibierende Effekte erzielt werden. Dies ist ein Indiz für die 18F-S100-Interaktion mit Scavenger-Rezeptoren und Glykokonjugaten an der Zelloberfläche. Durch die Untersuchungen mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie an THP-1-Makrophagen wurde eine Zellaufnahme des Fluoreszein-markierten S100A12 festgestellt. Weiterhin konnten Kolokalisationen mit Lektinen detektiert werden. Das metabolische Schicksal extrazellulär zirkulierender 18F-S100-Proteine in vivo wurde mit Hilfe dynamischer PET-Untersuchungen bzw. anhand von Bioverteilungs-Untersuchungen in männlichen Wistar-Ratten analysiert. Die Hauptakkumulation der Radioaktivität wurde in der Leber und in den Nieren detektiert. In diesen Organen findet der Metabolismus bzw. die glomeruläre Filtration der 18F-S100-Proteine statt. In den Untersuchungen zur Genexpression mittels Echtzeit-PCR sowie im immunchemischen Proteinnachweis am Western Blot wurde eine hohe Expression und Proteinbiosynthese des RAGE in der Lunge ermittelt. Die Lunge eignet sich daher als „Referenz“-Organ für eine funktionelle in vivo-Charakterisierung von RAGE mit 18FS100-Proteinen. Bei den durchgeführten PET-Untersuchungen konnte eine temporäre 18F-S100-Interaktion mit dem Lungengewebe festgestellt werden. Die Retention des 18FS100A12 in der Lunge wurde in Gegenwart von sRAGE inhibiert. Dies ist ein Hinweis dafür, dass 18F-S100-Proteine auch in vivo an RAGE binden können. Die Radioaktivitäts-Akkumulation in den Organen Leber und Milz, die eine Vielzahl von sessilen Makrophagen aufweisen, wurde durch die Applikation von malBSA inhibiert. Dies ist ein Indiz dafür, dass 18F-S100-Proteine in vivo mit Scavenger-Rezeptoren interagieren können. Die vorliegende Arbeit liefert deutliche Hinweise darauf, dass RAGE nicht der alleinige Rezeptor für 18F-S100-Proteine ist. Der Einsatz von 18F-S100-Proteinen als experimentelles Werkzeug in dynamischen PET-Untersuchungen birgt das Potential einer Charakterisierung von S100-Protein-assoziierten, pathophysiologischen Prozessen. / Members of the S100 family of EF-hand calcium binding proteins play important regulatory roles not only within cells but also exert effects in a cytokine-like manner on definite target cells once released into extracellular space or circulating blood. Accordingly, increased levels of S100 proteins in the circulating blood have been associated with a number of disease states, e.g., diabetes, cancer, and various inflammatory disorders. As the best known target protein of extracellular S100 proteins, the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE) is of significant importance. However, the role of extracellular S100 proteins during etiology, progression, and manifestation of inflammatory disorders still is poorly understood. One reason for this is the shortage of sensitive methods for direct assessment of the metabolic fate of circulating S100 proteins and, on the other hand, measurement of functional expression of extracellular targets of S100 proteins, e.g., RAGE in vivo. In this line, small animal PET provides a valuable tool for noninvasive imaging of physiological processes and interactions like plasma or vascular retention, tissue-specific receptor binding, accumulation or elimination in vivo. To address this question, human S100 proteins were cloned in the bacterial expression vector pGEX-6P-1, expressed in E. coli BL21, and purified by affinity chromatography and anion exchange chromatography. Purified S100A1, S100B and S100A12 proteins were then radiolabeled with the positron emitter fluorine-18 (18F) by N-succinimidyl-4-[18F]fluorobenzoate ([18F]SFB). Radiolabeling of S100 proteins resulted in radiochemical yields of 3-10% (corrected for decay) and effective specific radioactivities of 1 GBq/µmol, respectively. For investigations about RAGE binding soluble RAGE (sRAGE) was expressed and purified using pSecTag2B. A radioligand binding assay confirmed specific binding of 18F-S100A12, 18F-S100A1, and 18F-S100B to immobilized sRAGE, also showing an order of affinity with S100A12 > S100A1 > S100B. These results indicate that radioactive labelling of S100 proteins did not affect their overall affinity to RAGE. Cellular association studies in human THP-1 macrophages and human aortic endothelial cells (HAEC) showed specific binding of all 18F-S100 proteins to the non-internalizing RAGE as confirmed by inhibitory effects exerted either by other RAGE ligands, e.g., glycated LDL, or by soluble RAGE. Of interest, 18F-S100 proteins were also shown to interact with other putative binding sites, e.g. scavenger receptors as well as proteoglycans. In this line, uptake of 18F-S100 proteins in THP-1 and HAEC could be inhibited by various scavenger receptor ligands, in particular by maleylated BSA as well as by lectines (e.g. ConA and SBA). Confocal laser scanning microscopy analysis showed a major part of the fluoresceinated S100A12 bound to the surface of THP-1 macrophages. Beyond this, uptake of S100A12 could be determined indicating an interaction of S100A12 with both non-internalizing, e.g., RAGE, and internalizing receptors, e.g. scavenger receptors. By evaluation of the relative contribution of 18F-S100A12 association to RAGE-overexpressed CHO cells (using pIres2-AcGFP1), 18F-S100A12 showed a significantly higher association to CHO-RAGE cells compared with CHO-mock cells. Based on these findings and due to their crucial role in inflammatory disorders the metabolic fate of S100 proteins was further investigated in dynamic small animal Positron emission tomography (PET) studies as well as in biodistribution studies in Wistar rats in vivo. For interpretation of in vivo investigations in rats, expression of RAGE was analyzed by quantitative real time RT-PCR as well as western blotting in various organs. Lung tissue expressed the highest level of RAGE protein compared to the other tissues. PET studies in rats revealed a comparatively long mean residence time of circulating 18F-S100 proteins. A major contributor to this phenomenon seems to be a sustained temporary interaction with tissues overexpressing RAGE, e.g., the lung. On the other hand, renal clearance of 18F-S100 via glomerular filtration is a major elimination pathway. However, scavenger receptor-mediated pathways in the liver, the spleen and, to a minor extent, in the kidneys, also seem to contribute to the overall clearance. The presence of sRAGE revealed a decreased retention of 18F-S100A12 in the lung, indicating in vivo binding to RAGE. In vivo blocking studies using maleylated BSA demonstrated a strong inhibition of putative binding sites in rat tissues enriched in cells expressing scavenger receptors like liver and spleen. In conclusion, 18F-labeling of S100 proteins and the use of small animal PET provide a valuable tool to discriminate the kinetics and the metabolic fate of S100 proteins in vivo. Furthermore, the results strongly suggest an involvement of other putative receptors beside RAGE in distribution, tissue association and elimination of circulating proinflammatory S100 proteins. Moreover, the approach provides novel probes for imaging of functional expression of RAGE and scavenger receptors in peripheral inflammatory compartments.