Thesis (M. Phil.)--University of Hong Kong, 2002. / Includes bibliographical references (leaves 57-64).

Submitted by VANESSA SANTOS MOURA null (vanessa_smoura@hotmail.com) on 2017-08-29T04:50:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Vanessa_Santos_Moura.pdf: 2606729 bytes, checksum: 3c16d37b47ce11933b2d1f88e4aa9b1f (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-08-29T18:18:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 moura_vs_me_jabo.pdf: 2606729 bytes, checksum: 3c16d37b47ce11933b2d1f88e4aa9b1f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-29T18:18:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 moura_vs_me_jabo.pdf: 2606729 bytes, checksum: 3c16d37b47ce11933b2d1f88e4aa9b1f (MD5) Previous issue date: 2017-07-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O bolor verde e a podridão azeda destacam-se entre as doenças de pós-colheita em frutos cítricos, causados por Penicillium digitatum e Geotrichum citri-aurantii, diminuindo a qualidade e a quantidade dos frutos e, consequentemente, resultando em significativas perdas econômicas. Uma alternativa para controle destes fungos é através da toxinas killer produzidas por algumas espécies de levedura, capazes de matar fungos filamentosos. Saccharomyces cerevisiae produz toxinas killer proteicas que são letais para células sensíveis de levedura. Estas toxinas foram agrupadas em quatro tipos, K1, K2, K28 e Klus, codificado por elementos extra cromossomais associados a partículas virais na forma de dsRNA. Este trabalho tem como objetivo caracterizar a toxina killer de S. cerevisiae ACB-K1 e testar sua atividade antagônica em patógenos pós-colheita de citros. O isolado ACB-K1 apresentou atividade killer, sobre levedura sensível (S. cerevisae NCYC 1006) além do fitopatógeno P. digitatum, não apresentando porém inibição contra o patógeno G. citri-aurantii. A toxina apresentou máxima atividade em pH 4,1 a 22 °C, tanto para a levedura sensível quanto para o fitopatógeno P. digitatum. A toxina apresentou estabilidade em diferentes pH de 4,1 a 6,0, após a incubação de 24h a 22 °C sobre o fungo. O isolado ACB-K1 apresentou dsRNA, sendo detectadas duas formas (LA e M-dsRNA), sugerindo que a base genética para a produção da toxina é extra cromossomal, dado confirmado pela cura do fenótipo killer a 40 °C. As frações obtidas por cromatografia de exclusão molecular em gel de Sephadex G75 demonstraram características de biocontrole contra o fitopatógeno P. digitatum. / Green mold and sour rot are among post-harvest diseases in citrus fruits, caused by Penicillium digitatum and Geotrichum citri-aurantii, reducing a quality and quantity of fruits and, consequently, resulting in significant economic losses. An alternative for the control of fungi is using killer toxins produced by some species of yeasts, capable of killing filamentous fungi. Saccharomyces cerevisiae produces protein killer toxins that are lethal to yeast sensitive cells. These toxins were grouped into four types, K1, K2, K28 and Klus, encoded by extrachromosomal elements associated with viral particles in the form of dsRNA. This work aims to characterize a killer toxin of S. cerevisiae ACB-K1 and to test its antagonistic activity in post-harvest citrus pathogens. The isolate ACB-K1 showed activity killer on sensitive yeast (S. cerevisae NCYC 1006) besides the phytopathogenic P. digitatum, but did not present inhibition against the pathogen G. citri-aurantii. The killer toxin showed maximum activity at pH 4.1 at 22 ° C for both a sensitive yeast and the phytopathogenic P. digitatum. The toxin presented stability at pH range from 4.1 to 6.0, after a 24h incubation at 22 ° C on the fungus. The ACB-K1 isolate showed dsRNA and two forms were detected (LA and M-dsRNA), suggesting that a genetic basis for a toxin production is extrachromosomal, confirmed by curing the killer phenotype at 40 ° C. The fractions obtained by exclusion chromatography Sephadex G75 gel, demonstrated biocontrol characteristics against the phytopathogen P. digitatum.

published_or_final_version / Ecology and Biodiversity / Master / Master of Philosophy

Occidiofungin is an antifungal compound that targets the conserved cytoskeletal protein, actin. Despite >90% amino acid conservation between fungal actin proteins, sensitivity to occidiofungin has been shown to vary with C. albicans, F. oxysporum, and P. digitatum exhibiting a resistant profile relative to S. cerevisiae. To determine whether differences in the amino acid sequences of actin contribute to differences in occidiofungin susceptibility, we expressed the actin gene from these fungal organisms in the ACT1 S. cerevisiae shuffle strain. Functionality of actin gene products was determined by measuring growth kinetics, actin protein levels, nuclear position, and actin cable formation. Results demonstrated functional complementation for all actin orthologs. Analysis of occidiofungin susceptibility found that fungal actin ortholog expression resulted in a similar sensitivity profile as the wildtype S. cerevisiae. These findings suggest that amino acid differences in actin are not directly responsible for the resistance to occidiofungin identified for these fungal organisms.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:39:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5369129 bytes, checksum: 9b335fdfaa7871edcc12363d6834d034 (MD5) Previous issue date: 2010-02-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The green mold, caused by Penicillium digitatum, is a major disease in the postharvest of citrus fruit. In this work the effects of alternatives to agrochemicals in the control of green mold in 'Ponkan' tangerines and 'Valencia' oranges were tested. Physiologically mature fruits were superficially wounded in the equatorial region with a tube of 9 mm in diameter filled with needles and inoculated with a conidial suspension of P. digitatum at a concentration of 1x106 conidia/mL. After air drying, they were sprayed to full wetting with distilled water (control), distilled water + 8 mL/L Tween 20, imazalil (200 mL EC/100 Magnate ® 500 L of water), thiabendazole (103 mL Tecto ® SC/100 L of water), methyl thiophanate (70 g Cercobin® 700 WP/100 L of water), chitosan 10 mL/L of water or essential oils of garlic 10 mL/L of water, clove 5 mL/L water, neem 10 mL/L of water, long pepper 5 mL/L of water and citric biomass 10 mL/L of water. To the essential oils and chitosan were added 8 mL/L Tween 20. Then the fruits were packed in groups of three in polystyrene trays and kept at 21 ± 1 º C and 85-90% RH for 8 ('Ponkan' tangerine) or 7 days ('Valencia' orange). The fruits were analyzed for incidence and severity of illness, incubation period and latent period of the fungus, loss of fresh weight and CO2 production. In the case of 'Ponkan' tangerine, citric biomass was able to reduce the incidence of 76.3% compared to the control, in the third day, and also reduce the severity in 44%, in the fourth day. For the incubation period, except for fruits treated with garlic oil, there is formation of distinct groups of averages between the control and those treated with alternative products, indicating capacity to delay the onset of symptoms. Citric biomass stood out, showing similar results to the fungicide methyl thiophanate, delaying the incubation period in a day in relation to the water. The same was observed for the latent period, in which the fruits treated with alternative products, except garlic oil, stood in a group other than the control. Although the fruits of all treatments overcome the control, imazalil was able to better maintain the turgidity of the fruit, showing the lower values of loss of fresh weight on the eighth day of evaluation (5.2%). The mass loss and CO2 production correlated positively with the incidence and severity, in other words, the largest mass losses and higher respiratory rates result from high values of incidence and severity. In the case of 'Valencia' orange, citric biomass and chitosan reduced the incidence and severity during the entire experimental period. On the seventh day after inoculation, the incidence was reduced by 73.7% and 67.4% by citric biomass and chitosan, respectively, in comparison to control water, while the severity was reduced by 59.6% and 62%, respectively. On the other hand, neem oil, long pepper oil and garlic oil were ineffective in controlling the pathogen. Imazalil and methyl thiophanate totally controlled the disease during the evaluation period. The loss of fresh weight was increasing over time, however, fruits of all treatments had acceptable values for the marketing, located in the range 3 until 5%. As for CO2 production, fungicides maintained the respiratory rate low, followed in ascending order by chitosan and subsequently by other products. Thus, the citric biomass has good potential for control of green mold on 'Ponkan', while citric biomass and chitosan are capable of controlling the disease in 'Valencia' orange. / O bolor verde, causado pelo fungo Penicillium digitatum, é uma das principais doenças na pós-colheita dos frutos cítricos. Neste trabalho foram testados os efeitos de produtos alternativos aos agroquímicos no controle do bolor verde em tangerinas Poncã e em laranjas Valência . Frutos fisiologicamente maduros foram feridos superficialmente na região equatorial com um tubo de 9 mm de diâmetro preenchido por agulhas e inoculados com uma suspensão de conídios de P. digitatum na concentração de 1x106 conídios/mL. Após a secagem ao ar, foram pulverizados até o molhamento completo com água destilada (testemunha), água destilada + 8 mL/L de tween 20, imazalil (200 mL de Magnate® 500 EC/100 L de água), thiabendazole (103 mL de Tecto® SC/100 L de água), tiofanato metílico (70 g de Cercobin® 700 WP/100 L de água), quitosana 10 mL/L de água ou óleos essenciais de alho 10 mL/L de água, cravo-da-índia 5 mL/L de água, nim 10 mL/L de água, pimenta longa 5 mL/L de água e biomassa cítrica 10 mL/L de água. Os óleos essenciais e a quitosana foram acrescidos de 8 mL/L de tween 20. Em seguida, os frutos foram acondicionados em grupos de três em bandejas de poliestireno expandido e mantidos em câmara a 21±1 ºC e 85-90% UR por 8 (tangerina Poncã ) ou 7 dias (laranja Valência ). Os frutos foram analisados quanto à incidência e severidade da doença, período de incubação e período latente do fungo, perda de massa da matéria fresca e produção de CO2. No caso da tangerina Poncã , a biomassa cítrica foi capaz de reduzir a incidência em 76,3%, em comparação à testemunha, no terceiro dia, e reduzir também a severidade em 44%, no quarto dia. Para o período de incubação, com exceção dos frutos tratados com óleo de alho, observa-se formação de grupos de médias distintos entre a testemunha e aqueles tratados com produtos alternativos, indicando capacidade de atrasar o surgimento de sintomas da doença. A biomassa cítrica destacou-se, apresentando resultado semelhante ao fungicida tiofanato metílico, atrasando o período de incubação em um dia em relação à água. O mesmo foi observado para o período latente, em que os frutos tratados com produtos alternativos, exceto óleo de alho, situaram-se em um grupo distinto da testemunha. Embora os frutos de todos os tratamentos superassem a testemunha, o imazalil foi capaz de melhor preservar a turgidez dos frutos, apresentando os menores valores de perda de massa da matéria fresca no oitavo dia de avaliação (5,2%). A perda de massa e a produção de CO2 se correlacionaram positivamente com a incidência e severidade, ou seja, as maiores perdas de massa e maiores taxas respiratórias decorrem de altos valores de incidência e severidade. No caso da laranja Valência , biomassa cítrica e quitosana reduziram a incidência e severidade durante todo o período experimental. No sétimo dia após a inoculação, a incidência foi reduzida em 73,7% e 67,4% pela biomassa cítrica e quitosana, respectivamente, em comparação com a testemunha água, enquanto a severidade foi reduzida em 59,6% e 62%, respectivamente. Por outro lado, óleo de nim, óleo de pimenta longa e óleo de alho foram ineficazes em controlar o patógeno. Imazalil e tiofanato metílico controlaram totalmente a doença durante o período de avaliação. A perda de massa da matéria fresca foi crescente ao longo do tempo, porém, os frutos de todos os tratamentos apresentaram valores aceitáveis para a comercialização, situados na faixa de 3 a 5%. Quanto à produção de CO2, os fungicidas mantiveram a taxa respiratória dos frutos baixa, seguidos em ordem crescente pela quitosana e, posteriormente, pelos demais produtos. Dessa maneira, conclui-se que a biomassa cítrica tem bom potencial para controle do bolor verde em tangerina Poncã , enquanto biomassa cítrica e quitosana são capazes de controlar a doença em laranja Valência .

Thesis (MScAgric)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: Please refer to full text for abstract / AFRIKAANSE OPSOMMING: Sien volteks vir opsomming

Inputs from terrestrial habitats to aquatic habitats are important for structuring aquatic communities. Terrestrial producer diversity in the tropics may decline due to anthropogenic causes. I investigated how tree diversity affects aquatic communities. We used leaves from three timber-producing species (Dalbergia retusa, Pachira quinata, and Tectona grandis) to test the effects of leaf litter species composition and richness on invertebrate aquatic communities in Gamboa, Panama. We quantified macroinvertbrate species richness and abundances, leaf litter mass loss, and dissolved carbon to nitrogen ratios (C:N) after 4 weeks. We found that litter types differed in breakdown and C:N. Tectona grandis had lower dissolved C:N than both native species and supported the fewest number of invertebrates. C:N ratios declined with increasing litter diversity; however breakdown was not affected by litter richness. Mosquito abundance increased with litter species richness. Results of this study highlight the importance of diverse detritus in structuring aquatic treehole communities.

Submitted by Luriany Pompeo Ferraz (luriany@hotmail.com) on 2018-05-10T13:54:38Z No. of bitstreams: 1 Tese Luriany Pompeo Ferraz.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-05-10T18:09:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ferraz_lp_dr_jabo.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-10T18:09:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ferraz_lp_dr_jabo.pdf: 2121530 bytes, checksum: dbc5ecaf4e4d278a002ba09e3ed9af57 (MD5) Previous issue date: 2018-04-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fenômeno killler é característico de leveduras que produzem e excretam proteínas ou glicoproteínas que são inibidoras de células microbianas sensíveis. A estabilidade e atividade das toxinas killer são altamente sensíveis a fatores como pH, temperatura de incubação das leveduras, composição e propriedades físico-químicas do meio e concentração de células sensíveis. Sporobolomyces koalae é uma nova espécie de levedura com potencial para produção de toxina killer. No intuito de se conhecer mais sobre as funções desse microrganismo no ecossistema, esse trabalho teve por objetivos: (i) detectar a atividade killer do precipitado proteico de S. koalae, (ii) caracterizar bioquimicamente e funcionalmente o precipitado proteico S. koalae, (iii) purificar parcialmente a toxina killer produzida por S. koalae e, finalmente, (iv) verificar sua ação antagônica sobre Geotrichum citri-aurantii e Penicillium digitatum, patógenos que ocorrem na póscolheita de citros. Pelos resultados obtidos neste trabalho, foi possível detectar a presença de atividade killer no precipitado proteico da levedura S. koalae contra células sensíveis da levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006. O precipitado proteico da levedura apresenta várias proteínas com diferentes tamanhos moleculares e, parte dessas proteínas é positiva para atividade de β1,3-glucanase, quitinase e protease, podendo ser uma dessas enzimas ou, o sinergismo entre elas, o responsável pelo fator killer da levedura. A funcionalidade de suas proteínas para atividade killer aumenta em pH 4.9 e em uma faixa de temperatura de 22 °C a 27 °C e, o melhor agente precipitante das proteínas da levedura foi o etanol 80%. A purificação parcial das proteínas, que constituem o precipitado proteico de S. koalae, mostrou a existência de aproximadamente quatro bandas proteicas em uma das frações de purificação, Fração 1, com tamanhos aproximados que variaram de 8 a 65 kDa. A atividade killer, presente no precipitado proteico da levedura S. koalae, não apresenta ação antagônica sobre Geotrichum citri-aurantii e Penicillium digitatum. / The killer phenomenon is characterized by yeasts that produce and excrete proteins or glycoproteins that are inhibitors of sensitive microbial cells. The stability and activity of killer toxins are highly sensitive to the factors such as pH, the temperature of incubation of yeasts, composition and physical-chemical properties of the medium and concentration of sensitive cells. Sporobolomyces koalae is a new species of yeast with potential for killer toxin production. In order to know more about the functions of this microorganism in the ecosystem, this work had as objectives: (i) to detect the killer activity of the S. koalae protein precipitate, (ii) to characterize biochemically and functionally the S. koalae protein precipitate, (iii) to partially purify the killer toxin produced by S. koalae, and, finally, (iv) to verify its antagonistic action on Geotrichum citri-aurantii and Penicillium digitatum, pathogens that occur in the postharvest of citrus. By the results obtained in this work, it was possible to detect the presence of killer activity in the protein precipitate of S. koalae against sensitive cells of Saccharomyces cerevisiae NCYC 1006. The protein precipitate from yeast has several proteins with different molecular sizes and some of these proteins are positive for β1,3-glucanase, chitinase and protease activity. It may be one of these enzymes or synergism between them, the responsible for the killer factor. The functionality of their proteins for killer activity increases at pH 4.9 and a temperature range of 22 oC to 27 oC and the best precipitant of protein from yeast was ethanol (80%). Partial purification of the proteins showed the existence of approximately 4 protein bands in one of the purification fractions, Fraction 1, with approximate sizes ranging from 8 to 65 kDa. The killer activity, present in the protein precipitate of yeast S. koalae, did not present antagonistic action on G. citri-aurantii and P. digitatum. / FAPESP: 14/25067-3

Tesis por compendio / [ES] Los péptidos antimicrobianos (AMP) son una alternativa prometedora para el desarrollo de nuevos antifúngicos que puedan sustituir a los fungicidas usados en agricultura. Sin embargo, el alto coste de la síntesis química y la dificultad para su producción a gran escala han limitado su aplicación. Las proteínas antifúngicas (AFP) son AMP naturales, pequeñas, catiónicas, secretadas y ricas en cisteína con gran potencial para el control de hongos fitopatógenos. Las AFPs se encuentran en hongos filamentosos, son estables y pueden producirse en grandes cantidades. Sin embargo, el papel biológico en su hongo productor no se conoce en profundidad. En esta tesis, se estudió la diversidad de AFPs en genomas de hongos ascomicetos y se propuso una nueva clasificación en tres clases (A, B y C). Penicillium digitatum es el principal patógeno postcosecha de cítricos y codifica solo una AFP en su genoma de clase B (AfpB), mientras que Penicillium expansum, el principal patógeno postcosecha de manzana, codifica una AFP de cada clase (AfpA, AfpB y AfpC). En este trabajo describimos la producción biotecnológica y la caracterización de estas cuatro AFPs. Se ha caracterizado el papel biológico del gen afpB en P. digitatum mediante estudios de expresión génica y generación de mutantes nulos y de expresión constitutiva. Los resultados indicaron que afpB es prescindible para la biología y el ciclo vital del hongo, aunque la expresión del gen afpB bajo el promotor constitutivo gpdA de Aspergillus nidulans es perjudicial para su crecimiento y virulencia. Sorprendentemente, ni la cepa parental ni las cepas constitutivas produjeron cantidades detectables de AfpB a pesar de la alta expresión del gen codificante. El modelado molecular y el diseño racional permitieron predecir la estructura terciaria de AfpB y diseñar péptidos sintéticos para mapear motivos antifúngicos en su secuencia primaria. Confirmamos que los bucles catiónicos L2 y L3 mostraron actividad antifúngica moderada y que pueden actuar sinergísticamente. Con el objetivo de producir AfpB mediante biotecnología, usamos un casete de expresión de AFPs basado en las regiones promotora y terminadora del gen paf de Penicillium chrysogenum, hongo que produce naturalmente grandes cantidades de su propia proteína PAF. Este casete funcionó en P. digitatum y permitió la producción homóloga de AfpB. Los datos también mostraron que las secuencias del péptido señal (SP) y el pro-péptido de la SP-Pro-AfpB no determinan la producción de proteína. También demostramos la estabilidad térmica y la resistencia a la proteólisis de AfpB, y aportamos datos que sugieren que la estructura terciaria no es necesaria para la actividad antifúngica. Similar a lo descrito en P. digitatum, ninguna de las tres AFPs se detectó en los sobrenadantes de cultivo en medio rico de P. expansum. Sin embargo, AfpA se produjo en grandes cantidades en cultivos de medio mínimo de P. expansum. Para completar el repertorio de AFPs, produjimos las tres AFPs de P. expansum (AfpA, AfpB y AfpC) en P. chrysogenum con el casete paf. Las tres proteínas de P. expansum se produjeron, purificaron y caracterizaron con éxito. Ninguna de las AFPs producidas en este trabajo fue citotóxica frente a eritrocitos de mamíferos. AfpA de P. expansum seguida de AfpB de P. digitatum fueron las AFPs más activas contra hongos filamentosos, incluyendo patógenos de plantas y humanos, productores de micotoxinas y sus propios hongos productores, una característica previamente no descrita en las AFPs. Además, la AfpA de P. expansum y la AfpB de P. digitatum protegieron frente a la infección causada por el hongo Botrytis cinerea en plantas de tomate, y AfpA de P. expansum protegió frente a P. digitatum en frutos de naranja. Estos resultados confirman nuestra hipótesis de que las AFPs son buenas candidatas para el desarrollo de nuevos antifúngicos en protección vegetal y conservación postcosecha, pero ta / [CA] Els pèptids antimicrobians (AMP) són una alternativa prometedora per al desenvolupament de nous antifúngics que puguen substituir als fungicides utilitzats en agricultura. No obstant això, l'alt cost de la síntesi química i la dificultat per a la producció biotecnològica a gran escala han limitat la seua aplicació. Les proteïnes antifúngiques (AFP) són AMPs naturals, xicotetes, catiòniques, secretades i riques en cisteína que oferixen un gran potencial per al control de fongs fitopatogens. Les AFPs estan presents de en fongs filamentosos, són molt estables i poden produir-se en grans quantitats. No obstant això, el paper biològic d'estes AFPs en el seu fong productor encara no està clar. En esta tesi es va estudiar la diversitat d'AFPs en genomes de fongs ascomicets i es va proposar una nova classificació en tres clases (A, B i C). Penicillium digitatum, el principal patogen postcollita de cítrics, codifica només una AFP en el seu genoma de classe B (AfpB). Penicillium expansum, el principal patogen postcollita de poma, codifica una AFP de cada classe (AfpA, AfpB i AfpC). En este treball presentem la producció biotecnològica i la caracterització d'estes quatre AFPs. Hem caracteritzat el paper biològic del gen afpB en P. digitatum mitjançant estudis d'expressió gènica i la generació de mutants nuls i d'expressió constitutiva. Els resultats van indicar que afpB és prescindible per a la biologia i el cicle de vida d'este fong, encara que l'expressió del gen afpB davall el promotor constitutiu gpdA d'Aspergillus nidulans és perjudicial per al seu creixement i virulència sobre fruits cítrics. Sorprenentment, ni el cep parental ni els ceps constitutius van produir quantitats detectables d'AfpB malgrat l'alta expressió del gen afpB. El modelatge molecular i el disseny racional van permetre predir l'estructura terciària d'AfpB i dissenyar pèptids sintètics per a identificar motius antifúngics dins de la seqüència primària. Confirmarem que les estructures catiòniques L2 i L3 mostren activitat antifúngica i que poden actuar de forma sinèrgica. Amb l'objectiu de la producció biotecnològica d'AfpB, utilitzarem un casset d'expressió d'AFPs basat en les regions promotora i terminadora del gen paf de Penicillium chrysogenum, el qual produïx naturalment grans quantitats de la seua pròpia proteïna PAF. Este casset va funcionar en P. digitatum i va permetre la producció homòloga d'AfpB. Les dades també van mostrar que les seqüències del pèptid señal (SP) i el propèptid de la SP-Pro-AfpB no determinaren la producció de proteïna. També demostrarem l'extrema estabilitat tèrmica i la resistència proteolítica d'AfpB, i proporcionem dades que suggerixen que l'estructura terciària no és necessària per a l'activitat antifúngica. Semblant a P. digitatum, cap de les tres AFPs es van detectar en els sobrenadants de medi de cultiu ric de P. expansum. Al contrari, AfpA es va produir en grans quantitats en cultius de P. expansum en medi mínim. Per a completar el repertori d'AFPs, vam produir les tres AFPs de P. expansum (AfpA, AfpB i AfpC) en P. chrysogenum mitjançant l'ús del casset paf. Així, les tres proteïnes de P. expansum es van produir, purificar i caracteritzar amb èxit. Cap de les AFPs produïdes en este treball va ser citotóxica front eritròcits de mamífer. AfpA de P. expansum seguida d'AfpB de P. digitatum van ser les AFPs més actives contra fongs filamentosos, incloent patògens de plantes i humans, productors de micotoxines i els seus propis productors, una característica prèviament no descrita per a les AFPs. A més, AfpA de P. expansum i AfpB de P. digitatum van protegir front la infecció causada pel fong Botrytis cinerea en plantes de tomaca, i l'AfpA de P. expansum va protegir front P. digitatum en fruits de taronja. Estos resultats confirmen la nostra hipòtesi anterior de que les AFPs són bones candidates per al desenvolupament d'antifúngics en protecció / [EN] Antimicrobial peptides (AMPs) are promising antifungal alternatives to the fungicides used in agriculture. However, the high cost of chemical synthesis and the difficulties of large-scale production have limited their application. Antifungal proteins (AFPs) are a group of natural, small, cationic, secreted, cysteine-rich AMPs that offer a great potential to develop new biomolecules for the control of phytopathogenic fungi. AFPs are naturally present in filamentous fungi, are very stable, and can be produced in large amounts. However, the biological role of these AFPs in their producer fungus is still unclear. In this thesis, we first studied the diversity of AFPs in ascomycetous genomes and proposed a new classification in three different classes (A, B and C). Penicillium digitatum is the main citrus postharvest pathogen and encodes only one AFP from class B in its genome (AfpB), while Penicillium expansum is the main pome postharvest pathogen and encodes one AFP from each class (AfpA, AfpB and AfpC). In this work, we report the identification, efficient biotechnological production and characterization of these four AFPs. We characterized the biological role of the afpB gene in P. digitatum by the study of its gene expression pattern and the generation of null and constitutive expression mutants. Results indicated that afpB is dispensable for the biology and life cycle of this fungus, although expression of the afpB gene under the constitutive Aspergillus nidulans gpdA promoter is detrimental to growth and virulence to citrus. Surprisingly, neither the wild type nor the constitutive strains produced detectable amounts of AfpB in spite of the high afpB gene expression. Molecular modeling and rational design allowed us to predict the AfpB tertiary structure and design synthetic peptides to map antifungal motifs within the AfpB primary sequence. We confirmed that the cationic exposed loops L2 and L3 showed moderate antifungal activity and that they can act synergistically. With the objective of the biotechnological production of AfpB, we used an AFP expression cassette based on the promoter and terminator regions of the well-studied paf gene from Penicillium chrysogenum, which naturally produces high amounts of its own protein PAF. This paf cassette worked efficiently in P. digitatum and allowed the homologous production of AfpB. Data also showed that the signal peptide (SP) and pro-peptide sequences of the translated SP-Pro-AfpB do not determine protein production. We also demonstrated the thermal stability and resistance to proteolytic cleavage of the P. digitatum AfpB, and provided data that suggest that tertiary structure is not required for antifungal activity. Similar to P. digitatum, none of the three AFPs were detected in supernatants of cultures of P. expansum in rich medium. By contrast, AfpA was produced with very high yields in P. expansum cultures in minimal medium. To complete the repertoire of AFPs from P. expansum we produced the three AFPs from P. expansum (AfpA, AfpB and AfpC) in P. chrysogenum with the use of the paf cassette. With this combined approach, the three P. expansum proteins were successfully produced, purified and characterized. None of the four AFPs produced in this work were cytotoxic against mammal erythrocytes. The P. expansum AfpA followed by the P. digitatum AfpB were the most active AFPs against filamentous fungi, including plant and human pathogens, mycotoxin-producer fungi, and their own producers, a feature that had not been previously described for AFPs. Moreover, AfpA from P. expansum and AfpB from P. digitatum protected against fungal infection caused by Botrytis cinerea in tomato plants, and additionally the P. expansum AfpA protected against P. digitatum in orange fruits. These results confirm our previous hypothesis that AFPs are good candidates for the development of antifungals in plant protection and postharvest conservation, but also in clinic or food preservation. / Garrigues Cubells, SM. (2018). Producción y utilización Biotecnológica de nuevas proteínas antifúngicas de hongos filamentosos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/113162 / Compendio

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