Lors d’une infection, les polynucléaires neutrophiles phagocytent l’agent pathogène et le détruisent grâce à la production de formes réactives de l’oxygène (FRO) par la NADPH oxydase. Cette enzyme est constituée de sous-unités membranaires (Nox2, p22phox) et cytosoliques (p67phox, p47phox,p40phox, Rac) qui s’assemblent soit à la membrane plasmique, lors de l’activation des cellules par un stimulus soluble comme le fMLF, soit à la membrane du phagosome, lors de la phagocytose de particules. La régulation de la NADPH oxydase implique divers facteurs comme la signalisation calcique et les lipides, notamment les phospholipides anioniques. En effet, il a été montré que l’activation et la translocation de la petite protéine G Rac peuvent être dépendantes du calcium. D’autre part les sous unités Rac et p47phox peuvent interagir avec les phospholipides anioniques tels que la phosphatidylsérine,grâce à des interactions stéréosélectives et/ou électrostatiques.L’objectif de ce travail est donc d’évaluer le rôle du calcium et de la phosphatidylsérine dans le recrutement de p47phox et/ou Rac lors de l’assemblage de NADPH oxydase. Pour suivre la dynamique des deux protéines, nous avons exprimé ces sous-unités marquées avec des protéines fluorescentes dans des lignées phagocytaires mimant les neutrophiles (HL-60 et PLB-985). Nous avons ainsi pu suivre, par vidéomicroscopie, le déplacement des sous-unités marquées lors d’une stimulation par fMLF ou PMA etdurant la phagocytose de particules opsonisées. Après stimulation par fMLF, Rac1 transloque du cytosol à la membrane plasmique, alors que le mutant constitutivement actif de Rac1 est constamment localisé àla membrane plasmique, indépendamment de la stimulation par fMLF. De plus après stimulation parPMA, le mutant constitutivement actif de Rac2 transloque à la membrane plasmique, suggérant que sa translocation pourrait être possible en absence d’un influx de calcium extracellulaire. Lors de la phagocytose, en masquant la phosphatidylsérine avec le domaine C2 discoïdine de la lactadhérine qui lie spécifiquement ce phospholipide, nous avons pu montrer que la phosphatidylsérine régule la production initiale des FRO en favorisant le recrutement de p47phox et de Rac2 au phagosome. De plus, ces deux sous-unités se détachent du phagosome alors que la production intraphagosomale de FRO continue,suggérant que leur départ n’est pas un signal de terminaison pour l’activité oxydase. Plus précisément,p47phox et Rac2 sont recrutées de manière transitoire, pendant seulement 1 à 3 minutes après la fermeture du phagosome. Ceci est en accord avec le modèle qui propose que p47phox servirait principalement à transporter p67phox au phagosome, et que les deux sous-unités p47phox et Rac2 faciliteraient le positionnement de p67phox dans le complexe membranaire. / During phagocytosis, neutrophils internalize pathogens in a phagosome and kill them through the production of reactive oxygen species (ROS) by the NADPH oxidase enzyme. The cytosolic NADPHoxidase subunits (p67phox p47phox, p40phox, Rac2) and the membranous subunits (Nox2, p22phox) assemble either at the plasma membrane after stimulation with soluble agonist, or at the phagosomal membrane during particle phagocytosis. The regulation of this enzyme involves several actors like calciumsignalling and anionic phospholipids. Actually Rac activation and translocation was found to be calciumdependent and, on the other hand, p47phox and Rac can interact with anionic phospholipids such asphosphatidylserine through stereoselective and/or electrostatic interactions.Therefore we wanted to investigate the role of calcium and phosphatidylserine in p47phox and Rac membrane recruitment. To study this dynamic, we expressed the subunits tagged with a fluorescent protein in neutrophil-like cells (HL-60 and PLB-985), and followed them by videomicroscopy duringfMLF or PMA stimulation or during phagocytosis of opsonised particles. After fMLF stimulation, Rac1translocated from the cytosol to the plasma membrane whereas constitutively active form of Rac1 was permanently located at the plasma membrane, independently of fMLF stimulation. In addition, afterPMA treatment, constitutively active form of Rac2 translocated to the plasma membrane, suggesting that its translocation could occur without extracellular calcium entry. By using the specific phosphatidylserine binding discoïdine C2 domain of lactadherin, we could mask this phospholipid and found that phosphatidylserine is involved in NADPH oxidase activity by participating in the phagosomal recruitment of p47phox and Rac2. In addition we show that these two subunits detached from the phagosome while ROS production continued for a longer period, suggesting that their dissociation from the complex is not a termination signal for oxidase activity. More precisely, p47phox and Rac2 were briefly recruited to the phagosomal membrane, for 1 to 3 minutes after the phagosome closure. These results support the model in which p47phox serves as a carrier for p67phox and both p47phox and Rac2 are adapters that correctly position p67phox in the complex.

Le récepteur MerTK est impliqué dans la phagocytose des segments externes des photorécepteurs (SEP) par l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), fonction cruciale pour la survie des photorécepteurs et la vision. Dans la rétine, ces deux tissus sont en contact permanent et la phagocytose ne survient qu'une fois par jour, cette fonction nécessite donc d'être contrôlée précisément. Le pic de phagocytose est lié à l'activation intracellulaire de MerTK via l'intégrine αvβ5. Ce projet a eu pour but d'étudier les mécanismes extracellulaires régulant la fonction de MerTK au cours de cette phagocytose.Nous avons montré que MerTK est clivé à la surface des cellules d'EPR in vivo avant et après le pic de phagocytose. Ceci permettrait d'éviter une phagocytose trop prononcée des SEP.Nous avons démontré le rôle opposé des ligands de MerTK, spécifique à l'EPR. Gas6 semble inhibiteur, il stimule le clivage de MerTK et inhibe la phagocytose in vitro, et son expression in vivo est faible au moment du pic de phagocytose. Au contraire, Protéine S, dont l'expression augmente in vivo au moment du pic, inhibe le clivage de MerTK et stimule la phagocytose in vitro, et pourrait ainsi potentialiser cette fonction.Parmi les protéases étudiées, l'inhibition d'ADAM17 in vitro engendre une diminution du clivage de MerTK corrélée à une augmentation de sa biodisponibilité à la surface cellulaire et de son activité. Cependant, cet effet n'étant pas total, l'implication d'une autre protéase n'est pas exclue.Ainsi, mes travaux de Doctorat permettent de mieux comprendre la régulation complexe de l'activité de MerTK dans la phagocytose rétinienne, essentielle pour le rythme circadien de cette fonction. / The MerTK receptor is involved in the daily phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS) by the retinal pigment epithelium (RPE), an indispensable process for photoreceptors survival and vision. In the retina, the contact between POS and RPE is permanent, and POS phagocytosis occurs once a day, requiring a precise control of this function. The phagocytic peak is initiated by activation of MerTK via the αvβ5 integrin receptor. This project aimed at studying extracellular mechanisms that control MerTK function during POS phagocytosis. We have shown that MerTK can be cleaved from the RPE cell surface in vivo before and just after the phagocytic peak. This process might avoid an excess of POS phagocytosis. We have also shown the opposite role of MerTK ligands, specific to RPE cells. Gas6 appears to act as an inhibitor as it stimulates MerTK cleavage and inhibits POS phagocytosis in vitro. Moreover, in vivo, Gas6 expression is weak at peak phagocytosis time. In contrast, Protein S, which in vivo expression increases at the time of the phagocytic peak, inhibits MerTK cleavage and stimulates POS phagocytosis in vitro, and thus might potentiate phagocytosis. Among the protease candidates we studied, in vitro inhibition of ADAM17 results in decreased MerTK cleavage associated with the increase of full-length receptors available at cell surface and of MerTK activation. However, as cleavage still occurs in these conditions, we cannot exclude the implication of another protease. Taken together, my PhD data allows us to better understand the complex regulation of MerTK activity during retinal phagocytosis, which is essential for the circadian rhythm of this function.

Le système immunitaire inné génère des réponses inflammatoires contre les pathogènes ou les cellules dangereuses mais est aussi impliqué dans l'élimination tolérogène des cellules apoptotiques. La reconnaissance des cibles est médiée par un grand nombre de protéines membranaires et solubles. Parmi celles-ci, on trouve les protéines de reconnaissance du complément : C1q, MBL (« mannose-binding lectin) et ficolines. Bien que les propriétés structurales de reconnaissances de la MBL aient été extensivement étudiées, celles des ficolines et du C1q restent à établir. Ceci était l'objectif de la première partie du projet présenté ici. Nous avons analysé par cristallographie aux rayons X la structure des domaines de reconnaissance de ces protéines en présence ou en absence de plusieurs ligands connus. Nous avons montré que les ficolines H et M possédaient un seul site de fixation, conservé au sein des domaines de type fibrinogène. Ce site conservé ne semble pas actif dans la ficoline L, mais de nouveaux sites ont été mis en évidence, créant une surface de reconnaissance étendue favorable à la fixation de larges polymères. Nous avons également trouvé un nouveau site de fixation de la phosphosérine sur C1q. Des propriétés particulières de la ficoline M ont été mises en évidence : la fixation de Neu5Ac, un marqueur du soi, et un changement conformationnel dépendent du pH. Comme l'étude des propriétés de reconnaissance de quelques récepteurs isolés ne lève pas le voile sur le comportement particulier des phagocytes en présence de débris cellulaires, nous avons commencé un nouveau projet afin de comprendre les voies de signalisations activées dans le phagocyte en réponse aux cellules apoptotiques. De nombreuses données suggèrent que le complexe GEF : DOCK/ELMO est commun à de nombreuses voies de signalisation mais aussi un point de régulation. Mon travail dans ce second projet était d'initier la mise en place d'outils cellulaires afin d'étudier le comportement de ce complexe dans différentes lignées cellulaires modèles. J'ai développé un test quantitatif de phagocytose ainsi que des outils pour détecter et sur-exprimer ELMO1. Nous avons également observé la re-localisation de cette protéine dans les coupes phagocytiques.

Le macrophage joue un rôle clé dans l'athérogenèse, intervenant notamment, dans la captation de cholestérol à l'origine de la formation des stries lipidiques. Sa capacité à éliminer le cholestérol en excès est donc critique pour l'évolution de la pathologie. Il intervient aussi dans la captation des cellules apoptotiques présentes au sein de la lésion, processus déterminant en termes d'inflammation et de stabilité de la plaque. Mes travaux ont consisté à évaluer le rôle du transporteur ATP-Binding-Cassette G1 (ABCG1), dans ces mécanismes clés de l'athérogenèse. Ainsi, nous avons donc montré qu'ABCG1 est à la fois impliqué dans les processus d'efflux au sein des cellules spumeuses chargées en cholestérol libre mais aussi qu'il participe au mécanisme de phagocytose des corps apoptotiques. Ainsi, grâce à ces travaux ABCG1 pourrait être envisagé comme une nouvelle cible thérapeutique de l'athérosclérose.

La mort cellulaire par apoptose est un processus biologique fondamental, nécessitant des interactions fines avec le système immunitaire pour une reconnaissance et une élimination efficace des cellules mortes. C'est ainsi que C1q, une molécule du complément, essentielle dans le système immunitaire inné, a été mise en évidence comme fortement impliquée dans le mécanisme de reconnaissance et d'élimination des cellules apoptotiques, notamment via sa région globulaire (C1qGR). Récemment, la translocation de la calréticuline (CRT) au niveau externe de la membrane plasmique des cellules cancéreuses a été identifiée comme un signal " eat-me " pouvant être immunogène. Initialement, l'interaction entre la CRT et C1q a été caractérisée à la surface des phagocytes et la CRT a été considérée comme un récepteur pour les queues collagènes de C1q (C1qCLF). L'ensemble de ces observations est en faveur d'un double rôle de la CRT, à la surface des phagocytes et des cellules apoptotiques. Dans un premier temps, l'élaboration d'une stratégie de FRET a permis de détecter une interaction directe entre la CRT et C1qGR à la surface de la cellule HeLa en apoptose précoce. Dans un second temps, la mise en place de tests de phagocytose a permis de montrer que la calréticuline exposée à la surface des cellules apoptotiques peut moduler la phagocytose : des effets opposés ont été observés selon le modèle cellulaire utilisé (HeLa traitées par des ARNi ou MEF CRT-/-) et dans certaines conditions, une modulation combinée de la calréticuline et de C1q a été observée sur la réponse inflammatoire (production de cytokines).

Les protéines eucaryotes Elmo (Engulfment and Cell Motility) forment une famille de régulateurs conservés qui jouent un rôle central dans les processus biologiques reposant sur le remodelage du cytosquelette d'actine comme la phagocytose et la migration cellulaire et régulé par les GTPases de la famille Rho. Les protéines Elmo régulent la fonction des protéines Dock (Downstream of Crk), qui sont des Facteurs d'Echange de Guanine (GEF) atypiques pour les GTPases Rac1 et Cdc42. Le mécanisme de régulation connu à ce jour, repose sur l'interaction entre les 200 résidus C-terminaux d'Elmo et les 180 premiers résidus N-terminaux de Dock. Cependant, le rôle précis des différents domaines et motifs identifiés dans ces régions n'est pas encore défini. En effet, les données fonctionnelles, biochimiques et structurales rapportées à ce jour semblent contradictoires quant à la contribution de l'extrémité C-terminale d'Elmo qui comprend un motif polyproline et le domaine SH3 N-terminal de Dock. Nous avons donc étudié la contribution de l'extrémité C-terminale de Elmo1 à l'interaction entre Elmo1 et le domaine SH3 de Dock1 en utilisant notamment la résonance plasmonique de surface. Nos données démontrent la capacité du domaine SH3 de Dock1 à interagir avec Elmo1, indépendamment de l'extrémité C-terminale contenant le motif polyproline. Toutefois, la présence de cette région conduit à une augmentation significative du temps de demi-vie du complexe Elmo1/Dock1. En parallèle, des expériences de diffusion des rayons X aux petits angles nous ont permis de déterminer des enveloppes tridimensionnelles de la protéine Elmo1. Ces données nous permettent ainsi de proposer un premier modèle à basse résolution dans lequel nous localisons les parties N et C-terminales de Elmo1. De façon surprenante cette étude semble indiquer un changement de conformation de la région N-terminale de Elmo1 ainsi qu'une interaction possible de cette même région avec le domaine SH3 de Dock1. / The eukaryotic Elmo proteins (EnguLfment and cell MOtility) form a conserved regulatory family that plays a central role in a number of processes that depend on actin cytoskeleton remodeling, such as phagocytosis and cell migration. Elmo proteins regulate the function of Dock proteins (Downstream of CrK), a new family of atypical guanine exchange factors (GEF) for Rac1 and Cdc42 GTPases. The regulation of this mechanism is based on the interaction between the 200 C-terminal residues of Elmo and the 180 N-terminal residues of Dock. However, the precise role of the different domains and motifs identified in these regions is still not well defined. Indeed, functional, structural and biochemical data reported to date seem contradictory with respect to the contribution of the C-terminal end of Elmo, which includes a polyproline motif, and the N-terminal SH3 domain of Dock. We have therefore investigated the contribution of the C-terminal region of Elmo1 to the interaction between Elmo1 and the SH3 domain of Dock1 using surface plasmon resonance. Our data demonstrate the ability of the SH3 domain of Dock1 to interact with Elmo1 independently of the C-terminal polyproline containing region. However, the presence of this region induces a significant increase in the half-life of the Elmo1/Dock1 complex. In parallel, small angle X-ray experiments were recorded. These data allowed us to propose the first low-resolution model of Elmo1 in which we can locate N and C-terminal regions. Surprisingly, this study suggests a conformational change of the N-terminal region of Elmo1 and a possible interaction of this same region with the SH3 domain of Dock1

La phagocytose par les macrophages est un processus biologique essentiel au système immunitaire et joue un rôle clé dans le maintien de l’homéostasie cellulaire. Les cibles à éliminer varient en terme de tailles, des bactéries (µm) aux cellules cancéreuses ou senescentes (10 – 20 µm). La plupart des études quantitatives sur la phagocytose reposent sur l'utilisation de microparticules de polymère rigides en tant que cibles modèles pour la compréhension des paramètres qui régissent ce processus. Cependant, ces particules ne rendent pas compte de la mobilité latérale des ligands à leur surface malgré la pertinence de ce paramètre dans le contexte immunologique. Cette étude a pour but de synthétiser un matériau biomimétique qui constitue un nouveau système modèle pour l’étude de la phagocytose. Il s’agit de gouttes d’émulsions monodisperses fonctionnalisées avec des IgGs libres de diffuser sur toute la surface. Dans le cadre de cette thèse, nous avons obtenu différentes densités contrôlées de fonctionnalisation, caractérisées de façon quantitative. Ainsi, il nous a été possible de déterminer une densité minimale d’IgGs nécessaire à induire une internalisation efficace des gouttes. Pour des densités supérieures d’IgGs, ces gouttes sont efficacement et spécifiquement internalisées par phagocytose induite par les récepteurs FcR in vitro. Nous avons plus précisément cherché à approfondir la compréhension de certains aspects mécaniques. Nous montrons que, contrairement à des billes de polymères solides, l’internalisation des gouttes est efficace même pour de faibles densités d’IgGs. La phagocytose s’accompagne, pendant la phase d’adhésion à la surface du macrophage, d’une mobilité latérale des ligands en zone de contact. Il apparaît donc que la mobilité latérale des protéines à l'interface d'une cible améliore considérablement sa phagocytose par les macrophages. Ainsi, ces gouttes permettrons d’aborder de nouvelles questions biologiques pour approfondir certaines mécanismes moléculaires et/ou mécaniques. / Phagocytosis by macrophages represents a fundamental process essential for both immunity and tissue homeostasis. The size of targets to be eliminated ranges from small particles as bacteria to large objects as cancerous or senescent cells. Most of our current quantitative knowledge on phagocytosis is based on the use of solid polymer microparticles as model targets that are well adapted to the study of phagocytosis mechanisms that do not involve any lateral mobility of the ligands, despite the relevance of this parameter in the immunological context. The aim of this study is to synthesize a biomimetic material that constitutes a new model system for the study of phagocytosis. We designed monodisperse, lateraly mobile IgG-coated emulsion droplets, with different controlled densities of IgGs, that are efficiently and specifically internalized by macrophages through in-vitro FcγR-mediated phagocytosis. The excellent control of the opsonization density allowed us to measure the minimal IgGs density required to induce an efficient internalization. We also attempted to deepen the understanding of certain mechanical aspects. We show that, contrary to solid polymeric beads, droplet uptake is high even for low IgG densities and is accompagnied by the clustering of the opsonins in the zone of contact with the macrophage during the adhesion step. Beyond the sole interest in the design of the material, our results suggest that lateral mobility of proteins at the interface of a target greatly enhances the phagocytic uptake. Thus, emulsion droplets constitute a new interesting target to investigate different biological issues and understand molecular and/or mechanical mechansims.

La mort cellulaire par apoptose est un processus biologique fondamental, nécessitant des interactions fines avec le système immunitaire pour une reconnaissance et une élimination efficace des cellules mortes. C'est ainsi que C1q, une molécule du complément, essentielle dans le système immunitaire inné, a été mise en évidence comme fortement impliquée dans le mécanisme de reconnaissance et d'élimination des cellules apoptotiques, notamment via sa région globulaire (C1qGR). Récemment, la translocation de la calréticuline (CRT) au niveau externe de la membrane plasmique des cellules cancéreuses a été identifiée comme un signal « eat-me » pouvant être immunogène. Initialement, l'interaction entre la CRT et C1q a été caractérisée à la surface des phagocytes et la CRT a été considérée comme un récepteur pour les queues collagènes de C1q (C1qCLF). L'ensemble de ces observations est en faveur d'un double rôle de la CRT, à la surface des phagocytes et des cellules apoptotiques. Dans un premier temps, l'élaboration d'une stratégie de FRET a permis de détecter une interaction directe entre la CRT et C1qGR à la surface de la cellule HeLa en apoptose précoce. Dans un second temps, la mise en place de tests de phagocytose a permis de montrer que la calréticuline exposée à la surface des cellules apoptotiques peut moduler la phagocytose : des effets opposés ont été observés selon le modèle cellulaire utilisé (HeLa traitées par des ARNi ou MEF CRT-/-) et dans certaines conditions, une modulation combinée de la calréticuline et de C1q a été observée sur la réponse inflammatoire (production de cytokines). / Cell death by apoptosis is a fundamental biological process, requiring fine interactions with the immune system for the effective recognition and removal of the apoptotic cells. C1q, a complement molecule, essential in the innate immune system, has been shown to be strongly involved in the mechanism of recognition and elimination of apoptotic cells, mainly through its globular region (C1qGR). Recently, the translocation of calreticulin (CRT) at the surface of cancer cells has been identified as an eat-me signal, which can be immunogenic. Initially, the interaction between CRT and C1q was characterized on phagocytes surface and CRT was described as a receptor for the collagenous tails of C1q (C1qCLF). All these observations support a dual role of CRT at the surface of phagocytes and their targets. At first, using a FRET strategy we achieve to detect a direct interaction between CRT and C1qGR at the surface of early apoptotic HeLa cells. Second, the establishment of phagocytosis assays showed that calreticulin exposed at the surface of apoptotic cells could modulate phagocytosis: opposite effects were observed depending on the cellular model used (RNAi treated HeLa or MEF CRT-/-) and under certain conditions, a combined modulation of calreticulin and C1q was observed on the inflammatory response (cytokine production).

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’extension des activités humaines est responsable du rejet de molécules et de perturbations climatiques pouvant affecter la physiologie des organismes aquatiques. La moule zébrée possède des caractéristiques biologiques faisant d’elle une espèce intéressante en surveillance environnementale. Chez cet organisme, les hémocytes constituent une cible privilégiée pour la mise en place d’une approche multi-biomarqueurs. En effet, ces cellules à fonctionnalités multiples sont impliquées dans les grandes fonctions physiologiques de l’espèce et la régulation de l’homéostasie des individus. L’objectif de ce travail est de développer les outils analytiques permettant d’étudier les réponses hémocytaires de la moule zébrée. Les expérimentations menées ont permis de caractériser la structure des populations hémocytaires ainsi que leurs fonctionnalités propres en lien avec le processus de phagocytose. L’utilisation de ces biomarqueurs dans divers contextes indique une forte adaptabilité de l’espèce aux conditions environnementales. Les résultats montrent l’intérêt d’analyser les activités hémocytaires à l’échelle des sous populations comparativement à l’approche globale ne tenant pas compte de la diversité cellulaire. Il a été observé que certains facteurs comme le statut reproducteur ou l’espèce échantillonnée (D. polymorpha vs D. bugensis) constituent des facteurs de confusion importants. Il ressort également un positionnement fort du test de phagocytose en tant que marqueur de sensibilité aux contaminants. Ce travail constitue un ensemble de données voué à être utilisé dans des contextes multiples aussi bien en écotoxicologie qu’en écophysiologie. / Extension of human activities is responsible of molecule releases and climate changes that may affect physiology of aquatic organisms. The zebra mussel has biological traits making it an interesting species for environmental monitoring. In this organism, hemocyte cells constitute an interesting target to develop a multi-biomarker approach. These cells possess multiple functionalities and are involved in all major physiological functions of the species and in homeostasis regulation. The objective of this work was to develop analytical tools to study hemocyte responses of zebra mussels. Experiments allowed characterizing structure of hemocyte populations and their functionalities linked with phagocytosis process. Use of these biomarkers in various contexts indicated an important adaptation capacity of the species to environmental conditions. Results highlighted interest to analyze hemocyte activities at sub-population scale comparatively to global approach that does not consider hemocyte diversity. It was demonstrated that factor such as reproductive status or sampled species (D. polymorpha vs D. bugensis) constitute important confounding factors. Studies also demonstrated a strong positioning of phagocytosis assay as a sensitive marker to contaminants. This work constitutes a data set destined to be used in multiple contexts such as ecotoxicology or ecophysiology.