La flore intestinale, composée de l’ensemble des microorganismes retrouvés dans le tractus digestif, joue un rôle essentiel dans le développement et l’homéostasie du système immunitaire. Son altération est associée à de multiples maladies inflammatoires ayant des répercussions non seulement à l’intestin, mais bien dans l’ensemble de l’organisme. Les causes de cette dérégulation restent toutefois méconnues. Parmi les multiples facteurs susceptibles de moduler sa composition, on retrouve plusieurs enzymes bactéricides produites à l’intestin. L’une de ces protéines, la phospholipase A2-IIA sécrétée (sPLA2-IIA), est fortement surexprimée en condition inflammatoire. Nous avons émis l’hypothèse que la surexpression de la sPLA2-IIA à l’intestin au cours de maladies inflammatoires pourrait altérer la composition de la flore intestinale, contribuant ainsi à la physiopathologie de ces maladies. L’utilisation de souris surexprimant la sPLA2-IIA humaine (sPLA2-IIATGN) nous a permis d’observer l’apparition spontanée d’un désordre immunitaire encore jamais caractérisé dans ce modèle. En nous intéressant à l’impact de cette enzyme sur la flore intestinale, nous avons pu identifier plusieurs altérations dans le microbiome de ces souris. Nos résultats suggèrent également que l’environnement, et plus spécifiquement le microbiote intestinal, joue un important rôle dans le développement de ce désordre immunitaire. Nos résultats suggèrent que la modulation de l’inflammation systémique par la sPLA2-IIA est dépendante de la flore intestinale. / The mammalian digestive tract harbors trillions of microorganisms that collectively form the intestinal microbiota. This flora has been shown to play a prominent role in the development and homeostasis of the immune system. As such, its alteration was associated with a wide array of inflammatory diseases with intestinal and systemic afflictions. However, the cause of this unbalance remains poorly understood. While the intestinal flora may be regulated by a large number of environmental factors, multiple endogenous intestinal enzymes have been shown or proposed to play an important part in the shaping of its composition. One of those enzymes, the secreted phospholipase A2-IIA (sPLA2-IIA), possesses great bactericidal properties and is overexpressed during multiple inflammatory disorders. We hypothesized that the overexpression of sPLA2-IIA in the intestine during inflammatory processes could alter the composition of the intestinal microbiota, thereby contributing to the pathophysiology of those diseases. To verify this hypothesis, we used transgenic mice overexpressing the human sPLA2- IIA (sPLA2-IIATGN) and observed a yet uncharacterized spontaneous immune disorder in this model. We aimed to evaluate the impact of sPLA2-IIA on the intestinal flora in this model. We identified multiple alterations in the microbiome of sPLA2-IIATGN mice. Our results also suggest that the environment, and more specifically the intestinal microbiota, play a prominent role in the development of this immune disorder. Our results suggest that the modulation of systemic inflammation by sPLA2-IIA is dependent upon the intestinal flora.

Les médiateurs lipidiques de l'inflammation comprennent plusieurs familles de molécules biologiquement actives, incluant le leucotriène B₄ (LTB₄) et le facteur activant les plaquettes (PAF). Ces médiateurs s'avèrent être particulièrement importants dans la pathogenèse de maladies inflammatoires comme l'arthrite. Effectivement, ils participent directement au recrutement et à l'activation des neutrophiles au site inflammatoire. La biosynthèse du LTB₄ et du PAF implique la phospholipase A₂ de groupe IVA (cPLA₂α); en effet, cette enzyme libère les substrats nécessaires à la biosynthèse de ces médiateurs à partir des phospholipides membranaires. Les mécanismes de régulation de la cPLA₂α sont encore aujourd'hui peu compris. Cette présente étude visait à mieux comprendre et à élucider de nouveaux mécanismes de régulation de la cPLA₂α, première enzyme impliquée dans la biosynthèse du LTB₄ et du PAF dans les neutrophiles humains. Les résultats démontrent que, dans les neutrophiles humains, l'activité de la cPLA₂α est inhibée par son produit, l'acide arachidonique (AA) et que l'AA induit la translocation de l'enzyme aux membranes. Nos résultats suggèrent également une interaction directe du produit (AA) avec l'enzyme et que cette interaction se fait probablement au site catalytique. Les résultats de cette étude ont permis de révéler un nouveau mécanisme de régulation de la cPLA₂α jamais identifié, la régulation négative de la cPLA₂α par l'AA. Le site d'interaction de l'AA sur l'enzyme lors de cette régulation reste à être confirmé.

Les précurseurs des lymphocytes T appelés thymocytes se développent dans le thymus, un organe lymphoïde primaire, via différents processus de sélections aboutissant à l’élimination par apoptose de ceux qui sont inutiles ou dangereux (autoréactifs). Le développement des thymocytes nécessite de nombreuses molécules comme les cytokines et les chimiokines. Bien que le rôle des médiateurs lipidiques dans l’immunité soit bien décrit, leur rôle dans la maturation des thymocytes l’est peu. Nous avons étudié le rôle de la phospholipase A2 cytosolique du groupe IVA (cPLA2α), une enzyme clé pour la biosynthèse des médiateurs lipidiques, dans le développement des thymocytes. En utilisant des approches génétiques (délétion de la cPLA2α) et pharmacologiques (utilisation d’un inhibiteur de la cPLA2α, la pyrrophénone) nous montrons que la maturation des thymocytes se déroule indépendamment de la cPLA2α suggérant que la plupart des produits dérivés de l’acide arachidonique ne sont pas nécessaires au développement des thymocytes. Au cours des processus de sélections dans le thymus, environ 98% des thymocytes sont éliminés par apoptose. Des études ont montré que le lysophosphatidylcholine, obtenu suite au clivage d’un phospholipide membranaire par une phospholipase A2, permet une élimination efficace des cellules apoptotiques. Nous avons étudié le rôle des phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) IIA, V et X dans l’élimination des thymocytes apoptotiques. Ces enzymes sont exprimées dans le thymus mais leur fonction est pour le moment inconnue. Nous montrons in vitro que toutes les sPLA2 testées, excepté la IIA humaine, éliminent les thymocytes apoptotiques et que ceci est dépendant de leur activité enzymatique. De nombreuses études ont émis l’hypothèse que les sPLA2 peuvent affecter la détection et la quantification des microparticules (MPs) formées suite à l’activation cellulaire ou l’apoptose. Nous observons que les sPLA2 V et X humaines éliminent partiellement les MPs de thymocytes apoptotiques humains (il y a une grande quantité de thymocytes apoptotiques dans le thymus) mais pas celles de d’autres origines cellulaires. Nous montrons également que certaines sPLA2 affectent la détection et la quantification des MPs selon l’espèce étudiée, l’origine cellulaire des MPs et le moyen de détection employé. Finalement l’impact de ces enzymes est dépendant de leur activité enzymatique. / T cell precursors called thymocytes develop in the thymus, a primary lymphoid organ, by different selection processes that eliminate by apoptosis useless or dangerous (auto reactive) thymocytes. Numerous molecules such as cytokines and chemokines are needed for thymocyte development. While the roles of eicosanoids in immunity are described their role in thymocyte maturation remains uncertain. We have studied the role of the cytosolic phospholipase A2 of group IVA (cPLA2α), a key enzyme in lipid mediator biosynthesis, in thymocyte development. Using genetic (deletion of cPLA2α) and pharmacological approaches (using an inhibitor, pyrrophenone) we demonstrate that thymocyte maturation occurs independently of cPLA2α suggesting that most arachidonic acid metabolites are dispensable in thymocyte development. During selection processes occurring in the thymus, around 98% of thymocytes are eliminated by apoptosis. Studies demonstrated that the lysophosphatidylcholine, produced by phospholipase A2 hydrolysis of membrane phospholipids, induces an efficient elimination of apoptotic cells. We investigated the role of secreted phospholipase A2 (sPLA2) IIA, V and X in the clearance of apoptotic thymocytes. These enzymes are expressed in the thymus but their functions in this organ are currently unknown. In vitro, we demonstrated that all sPLA2 tested, except the human IIA, eliminate apoptotic thymocytes and that their enzymatic activity is required. Several studies have hypothesized that the sPLA2 could affect the detection and quantification of microparticles (MPs) produced during cell activation or apoptosis. We demonstrated that human sPLA2 V and X eliminate partially apoptotic thymocyte (there are many apoptotic thymocytes in thymus) MPs but not the MPs of other cellular origins. We also observed that certain sPLA2 enzymes impair the quantification of microparticles, depending on the species studied, the cellular source of microparticles and the means of detection employed. Finally, the sPLA2 impact on MPs is dependent on their enzymatic activity.

Title: Improvement of Writing as One of the Language Skills in Teaching German to Adults Summary: The thesis deals with errors in the position of verb in writing assignments of adult distance-studies students of College of Information Management and Business Administration in Prague. Errors are counted in writing assignments of students who reach level A2 according to the Common European Framework of Reference for Languages. Errors are considered with respect to training exercises. The results show that training exercises decreased the number of errors positively in case of sentences with indirect word order and in compound and complex sentences. Key words: errors in writing, level A2, syntax, teaching German to adults

Os venenos de serpentes são misturas complexas com composição variada, possuindo constituintes orgânicos e inorgânicos. Dentre os compostos orgânicos, destacam-se as proteínas, tóxicas e/ou com altas atividades enzimáticas. Desta forma, os venenos desenvolvem importante papel na captura de presas e auxílio à digestão. Venenos de serpentes da família Viperidae apresentam ampla e variada gama de ações biológicas, como proteólise, coagulação, hemorragia, neurotoxicidade e miotoxidade. Populações de serpentes habitantes endemicamente em ilhas são bons modelos para estudos de evolução, especialmente quando comparadas a espécies de mesmo gênero que habitam o continente. Espécies ancestrais de serpentes do gênero Bothrops sofreram isolamento geográfico cerca de 9 mil anos atrás, quando no Período Pleistoceno porções de terra na região Sudeste do Brasil foram isoladas do continente, levando a formação de ilhas costeiras, devido a elevação do nível do mar. Tal isolamento deu origem a novas espécies insulares pertencentes ao gênero Bothrops. Estudos relacionados aos venenos destas espécies, suas especificidades e diferenças com relação a serpentes continentais são escassos. O Arquipélago de Alcatrazes localiza-se no litoral de São Paulo, distando aproximadamente 35 Km da costa. Não há relatos da existência de mamíferos na ilha, com exceção de morcegos. Serpentes adultas da espécie Bothrops alcatraz, endêmica da Ilha de Alcatrazes, apresentam características encontradas em serpentes juvenis do grupo das jararacas, como a dieta baseada exclusivamente em animais ectotérmicos e a composição diferenciada do veneno. O presente trabalho tem como objetivo caracterizar as principais ações do veneno da serpente B. alcatraz, espécie endêmica e ilhoa, isolando cromatograficamente suas frações. Resultados indicam no veneno de B. alcatraz apresenta as atividades coagulante sobre plasma humano, fosfolipásica, miotóxica e edematogênica mais ativas quando comparadas com as ações do veneno de B. jararaca do continente. As ações proteolítica, hemorrágica e toxicidade para camundongos são mais potentes no veneno de B. jararaca. A presença de ação neurotóxica específica para artrópodes no veneno de B. alcatraz sugere a ação de uma fosfolipase A2, a qual foi isolada cromatograficamente. As propriedades e composição do veneno de B. alcatraz indicam uma provável evolução de toxinas adaptadas a seu tipo de presa/alimento. / Snakes venoms are complex mixtures with varied composition constituted by organic and inorganic molecules. The main organic components are proteins, which can be toxic and show high enzymatic activities, thus playing important role in prey capture and digestion in snakes. Viperidae snakes family show wide range of biological actions, as proteolytic, coagulant, hemorrhagic, neurotoxic and myotoxic activities. Snake populations inhabiting endemically islands are useful models for evolution studies, specially when compared to their congeneric continental species. Bothrops species ancestors from Southeastern Brazil underwent geographic isolation about 9 thousand years ago, during the Pleistocene Period, when land portions were separated from the continent by the sea. The isolation originated new (island endemic) Bothrops species. Studies related to those snake venoms, its specialties and differences among continental species of the genera Bothrops are scarce. The Alcatrazes Archipelago is located in São Paulo coast, 35 kilometer far from the continent. There are no register of mammals in those islands, except for bats. Bothrops alcatraz is endemic from the Alcatrazes Island. Adults show some similarities to young specimens from the continental jararaca group. They feed exclusively on ectothermic animals and their venom shows a different composition. The aim of this study was to analyze the endemic island snake, B. alcatraz, venom, isolating by chromatography the venom fractions. Results indicated that B. alcatraz venom presents coagulant, phospholipase, myotoxic and edema forming activities higher than continental B. jararaca venom. The proteolytic, haemorrhagic and mice toxicity are higher on B. jararaca venom. The specific neurotoxic action in arthropods of B. alcatraz venom suggests a phospholipase A2 action, which was isolated bt cromatography. The properties and composition of B. alcatraz venom indicates a possible evolution of toxins adapted to the prey kinds.

As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.

As fosfolipases A2 (PLA2s, ou fosfatidil-acil hidrolases EC 3.1.1.4) catalisam especificamente a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídio. São encontradas em plantas, mamíferos e em veneno de animais vertebrados e invertebrados e estão envolvidas em uma ampla variedade de processos fisiológicos. A fosfolipase A2 secretada humana do grupo IIA (hsPLA2 gIIA) é uma proteína de fase aguda da resposta imunológica, pois sua expressão é induzida por endotoxinas e citocinas via processos autócrinos e/ou parácrinos durante processos inflamatórios de relevância clínica. A hsPLA2 gIIA mostra efeito bactericida contra infecção por Staphylococcus aureus, e tem marcada preferência por fosfolipídios aniônicos tais como fosfatidilglicerol (PG) encontrados em membranas bacterianas. Uma grande variedade de inibidores de PLA2 do grupo IIA foi descrita na literatura, incluindo substâncias polianiônicas que atuam contra os efeitos inflamatórios destas enzimas. Suramina é um derivado de naftiluréia polissulfonado que recentemente mostrou ligação com os resíduos catiônicos no sítio de reconhecimento interfacial de Bothropstoxina-I (BthTX-I), uma PLA2-Lys49 isolada do veneno de Bothrops jararacussu, inibindo a atividade miotóxica da proteína. Devido ao tipo de interação diferenciada da suramina com BthTX-I em relação aos inibidores competitivos de PLA2, nós avaliamos a especificidade de ligação da suramina na hsPLA2 gIIA como um modelo para estudar este novo tipo de inibidor de PLA2s. O efeito da suramina nas atividades biológicas e de membranas artificiais da hsPLA2 gIIA foi avaliado. A suramina aboliu tanto a atividade hidrolítica da hsPLA2 gIIA quanto a atividade de danificação de membranas artificiais Ca2+ independente. Embora a suramina não tenha inibido a atividade bactericida da hsPLA2 gIIA contra a linhagem Micrococcus luteus, a ativação de macrófagos foi abolida pela mesma de maneira dependente de hidrólise. Além disso, técnicas de simulação de dinâmica molecular, calorimetria de titulação isotérmica e mutagênese sítio dirigida foram utilizadas para mapear os sítios de ligação da suramina na proteína. A interação da suramina com a hsPLA2 gIIA resultou de interações eletrostáticas entre grupos sulfonados com cadeias laterais de aminoácidos da região do sítio ativo e dos resíduos em torno das posições 15 e 116 localizados, respectivamente, na N- e Cterminal. Portanto, estes resultados permitem sugerir que a suramina pode atuar como inibidor de sPLA2s / Suramin is a polysulphonated napthylurea used as an antiprotozoal drug that presents inhibitory activity against a broad range of enzymes. We have evaluated the effect of suramin against the artificial and biological activities of the secreted human group IIA phospholipase A2 (hsPLA2 gIIA), a protein involved in inflammatory processes. To map the suramin binding sites on the hsPLA2 gIIA, proteins with mutations in the active site region and in the protein surface that makes contact with the phospholipids membrane were expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. The activation of macrophage cell line RAW 264.7 by hsPLA2 gIIA was monitored by nitric oxide release, and bactericidal activity of the protein against Micrococcus luteus was evaluated by colony counting and by flow cytometry. The hydrolytic activity of the hsPLA2 gIIA against lipossomes composed of a mixture of dioleoylphosphatidylcholine/dioleoylphosphatidylglycerol (DOPC/DOPG) was inhibited by a concentration of 100 nM suramin. The activation of macrophages by hsPLA2 gIIA was abolished at protein/suramin molar ratios where the hydrolytic activity of the enzyme was inhibited. In contrast, both the bactericidal activity of hsPLA2 gIIA against Micrococcus luteus and permeabilization of the bacterial inner membrane were unaffected by suramin concentrations up to 50 M. The affinity of interaction of the suramin with hsPLA2 gIIA was evaluated by suramine fluorescence and the mutants K15A, K38A, R54A and K123A presented a reduced affinity. The binding of the suramin/hsPLA2 gIIA complex was investigated by molecular dynamics simulations, which indicated two conformations of the bound inhibitor, which involve cationic amino-acid side chains in the active-site region and residues around positions 15 and 116 located in the N- and C-termini respectively in the substrate recognition surface. These results were correlated with isothermal titration calorimetry data, which demonstrated 2.7 suramin-binding sites on the hsPLA2 gIIA. These results suggested that suramin represents a novel class of phospholipase A2 inhibitor

A bothropstoxina I (BthTX-I) é uma miotoxina isolada do veneno da serpente brasileira Bothrops jararacussu, a qual é um membro da família das fosfolipases A2, mas não apresentam atividade catalítica devido á substituição D49K. A proteína for fornecida pelo Prof. Dr. J. R. Giglio e Profa. Dra. A. C. O. Cintra do Departamento de Bioquímica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto e usada em experimentos de cristalização, os quais foram realizados usando a técnica de difusão de vapor \"hanging drop\" a 18°C. A BthTX-I cristalizou em tampão HEPES 0.1 M, pH variando entre 7.0 e 7.6. O agente precipitante foi o (NH4)SO4 em concentrações que variaram de 57% a 62% de saturação. A coleta de dados foi inicialmente feita utilizando o difratômetro automático R-AXIS IIC da Rigaku Co. do Laboratório de Cristalografia de proteínas do IFSC-USP. Subseqüentemente foi realizado uma segunda coleta de dados no SERC Daresbury Laboratory na Inglaterra, usando radiação síncrotron. A BthTX-I cristalizou no grupo espacial P3121 com os seguintes parâmetros de rede: a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. O processamento de dados foi realizado com o programa MOSFLM, conduzindo a um Rmerge=6.3% e completeza de 99.6% a uma resolução de 2.1 ANGSTROM. A estrutura foi resolvida por Substituição Molecular, utilizando o programa AMoRe, onde foi utilizada como modelo inicial a estrutura da miotoxina da serpente Agkistrodon piscivorus piscivorus e refinada usando o programa XPLOR que conduziu a um fator Rfinal= 18.7% e Rfree=27.4%. A unidade assimétrica contém dois monômeros, os quais podem ser escolhidos de forma a apresentar interações similares aquelas descritas para a miotoxina II da Bothrops asper. A superfície de interface é entretanto, surpreendentemente pequena quando comparada com outras estruturas diméricas e a complementaridade é menor do que o valor esperado. Um modelo teórico para a ligação do fosfolipídeo na BthTX-I sugere que nenhuma interação direta entre a ligação ester sn-2 e a K49 deve ser esperada de forma a explicar a falta de atividade catalítica. Foi visto também, que é possível se reproduzir um dendrograma baseado na seqüência de aminoácidos, pelo uso de estruturas tridimensionais para os membros da família das PLA2 / Bothropstoxin- I (BthTX-I) is a myotoxin isolated from the Brazilian snake Bothrops jararacussu which is a member of the phospholipase A2 but presents no catalytic activity due to a D49K substitution. Protein was provided from the Departamento de Medecina de Ribeirão Preto by Prof. Dr. J. R. Giglio and Profa. Dra. A. C. O. Cintra and used in crystallization experiments which were performed using the vapor diffusion technique in hanging drops at 18°C. The BthTX-I crystallized in 0.1 M HEPES, pH ranging from 7.0 to 7.6. The precipitant was (NH4)SO4 in concentrations ranging from 57% to 62%. The data collection was initially performed using the automatic difractometer R-AXIS IIC from the Rigaku Co. at the Laboratório de Cristalografia of IFSC-USP. Subsequently a second data set was collected at SERC Daresbury Laboratory in England using synchrotron radiation. BthTX-I crystallizes in space group P3121 with a=b=57.58 ANGSTROM, c= 131.27 ANGSTROM, ALPHA=BETA=90° e GAMA=120°. Processing of the data was performed with the MOSFLM program yielding an Rmerge= 6.3% and completeness of 99.6% at 2.1 ANGSTROM. resolution. The structure was solved by Molecular Replacement using the package AMoRe with the Agkistrodon piscivorus piscivorus enzyme as search model and refined using the refinement program X-PLOR to a Rfinal= 18.7% and Rfree=27.4%. The asymmetric unit contains two BthTX-I monomers, which can be chosen such that they present similar interactions to those described for the homologous myotoxin II from Bothrops asper. The interface is, however, surprisingly small when compared to other dimeric structures and is less complementary than expected. A theorical model for phospholipid building to BthTX-I suggests that no direct interactions between the sn-2 ester bond and K49 would be expected, thus explaining the lack of catalytic activity. It is shown that it is possible to reproduce a dendrogram based on amino acid sequences and by the use of three dimensional structures for members of the PLA2 family

A pancreatite aguda (PA), condição inflamatória do pâncreas caracterizada por dor abdominal e concentrações elevadas de enzimas pancreáticas e outras (ex.: amilase, fosfolipase A2, FLA2), representa a principal causa de hospitalização das doenças gastrointestinais. Entretanto, a patogênese da PA continua pouco compreendida e os tratamentos escassos. Nesse sentido, os objetivos deste estudo foram: i) avaliar comparativamente os efeitos inflamatórios e algogênicos das FLA2s secretória do veneno da serpente Crotalus durissus terrificus (Cdt) e de mamífero (bovino) e, ii) determinar mecanismos envolvidos (neurogênicos e dependentes do sulfeto de hidrogênio (H2S), um recentemente descrito mediador endógeno). A PA foi induzida pela injeção da FLA2 (300 mg/kg) crotálica ou bovina no ducto biliopancreático de ratos anestesiados e pré-tratados com salina, antagonistas dos receptores NK1/NK2 (SR140333/SR48968, e.v., - 15 min) Na2S (doador de H2S, i.p., - 30 min) ou propargilglicina (PGly, inibidor da enzima CSE envolvida na síntese endógena de H2S, i.p., - 30 min). Após 4 horas, a FLA2 crotálica ou bovina promoveu edema pancreático, infiltração de neutrófilos, amilasemia sérica e hiperalgesia abdominal. A FLA2 crotálica também aumentou a geração de H2S pancreática, as concentrações séricas de GT-γ e AST e promoveu leucopenia. O SR140333, mas não o SR48968, inibiu a hiperalgesia induzida por ambas as FLA2s, mas não afetou a PA ou índices enzimáticos. Tratamento com a PGly reduziu a PA induzida por ambas as FLA2, mas inibiu somente a hiperalgesia evocada pela FLA2 bovina. O doador espontâneo de H2S (Na2S) reduziu a PA e hiperalgesia induzidas pela PLA2 crotálica, mas não a amilasemia. Conclui-se que ambas as FLA2s representam ferramentas farmacológicas importantes na indução da PA, pois conseguem mimetizar sinais clássicos da PA em humanos. Em termos mecanisticos, conclui-se que enquanto a ativação do receptor NK1 consiste num mecanismo comum de regulação da resposta sensitiva abdominal (hiperalgésica) frente as duas FLA2s, o papel (protetor ou deletério) do H2S neste modelo ainda não está estabelecido. / Acute pancreatitis (AP), an inflammatory condition of the pancreas characterized by severe abdominal pain and increased levels of pancreatic enzymes and others in the blood (e.g. amilase, phospholipase A2, PLA2), is the leading cause of gastrointestinal hospitalization worldwide. Nevertheless, the pathogenesis of AP still not fully understood and treatments are scant. This study aimed: i) to evaluate comparatively the inflammatory and algesic effects of PLA2 obtained from the venom of Crotalus durissus terrificus (PLA2 Cdt) snake or mammalian (bovine) and, ii) to establish involved mechanisms focusing on neurogenic aspects and the recent gasomediator (hydrogen sulfide, H2S). AP was induced by the injection of bovine PLA2 or sPLA2 from Cdt venom (300 μg/kg) into the common bile duct of anaesthetized rats pretreated with the NK1 or Nk2 receptor antagonists (SR140333/SR48968, i.v., - 15 min), with the H2S donor (Na2S, i.p., - 30 min) or the inhibitor of CSE, an enzyme involved in the endogenous H2S synthesis (Propargylglycin, PGly i.p., - 30 min). After 4 hours, both mammalian and crotalic PLA2s caused pancreatic oedema, local neutrophil infiltration, serum hyperamylasemia and abdominal hyperalgesia. Increased pancreatic production of H2S, serum levels of γ-GT and AST and leukopenia were also observed in Cdt-induced AP. SR140333, but not SR48968, blocked the abdominal hyperalgesia induced by both PLAs but failed to significantly affect the inflammatory response and increased enzymes concentrations in this model. PGly attenuated both mammalian and crotalic PLA2s-induced AP, but inhibited only the abdominal hyperalgesia evoked by bovine PLA,sub>2. Spontaneous H2S donor (Na2S) reduced crotalic PLA2-induced AP and associated abdominal hyperalgesia but failed to affect hyperamylasemia. In conclusion, both mammalian and crotalic PLA2 act as an important pharmacological tool since they can mimic signs and symptoms of human AP. Whereas NK1 receptor (neurogenic mechanism) mediates abdominal hyperalgesia is likely to be the common mechanism involved in AP evoked by both PLA2s, this study still raising questions regarding the role (protective or deleterious) of H2S in the pathophysiology of AP and related pain process.

Os venenos de serpentes contêm concentrações elevadas de fosfolipases A2 secretadas (sFLA2), que apresentam homologia com as FLA2s de mamíferos, cujos níveis estão aumentados em doenças inflamatórias. Neste estudo, investigou-se a ativação e a expressão de fatores envolvidos na formação de corpúsculos lipídicos (CLs) em células fagociticas e o papel desses fatores na resposta imune inata, induzida pela MT-III, uma sFLA2s de veneno. A MT-III induziu aumento dos níveis de triacilglicerol, colesterol e lisofosfolipideos e a ativação e expressão dos fatores PPAR-g, PPAR-d/b, SREBP2 e do CD36. Sob estimulo da MT-III, o receptor PPAR-b/d, as enzimas DGAT, ACAT e FAS foram relevantes para a formação de CLs e para a expressão da PLIN2. O CD36 participa da expressão da COX-2, sem modificar a liberação de PGE2. O TLR2 e a MyD88 foram essenciais para a formação de CLs e síntese da IL-1b e IL-10. Ainda, o TLR2 foi relevante para a liberação de PGE2, PGD2 e LTB4, enquanto MyD88 foi fundamental somente para a liberação de PGE2 e expressão da PLIN2, induzidas pela MT-III. / Snake venoms contain high concentrations of secreted phospholipase A2 (sPLA2) with homology to mammalian PLA2s, whose levels are elevated in inflammatory diseases. In this study, we investigated activation and expression of factors involved in lipid droplets formation (LDs) and participation that factors in the innate immune response induced by MT-III, sPLA2s from snake venom, in phagocytic cells. MT-III induced increase of triacylglycerol, cholesterol and lysophospholipids levels and activation and expression of factors PPAR-g, PPAR-d/b, SREBP2 and CD36. PPAR-b/d receptor, DGAT, ACAT and FAS enzymes were relevant to LDs formation and critical to PLIN2 expression induced by MT-III. CD36 participates in COX-2 expression without modifying PGE2 release stimulated by MT-III. TLR2 and MyD88 were essential to LDs formation and IL-1b and IL-10 synthesis stimulated by MT-III. Moreover, TLR2 was relevant to PGE2, PGD2 and LTB4 biosynthesis, while MyD88 is essential only for PGE2 release and PLIN2 expression induced by MT-III.