As fosfolipases A2 (PLA2s, ou fosfatidil-acil hidrolases EC 3.1.1.4) catalisam especificamente a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídio. São encontradas em plantas, mamíferos e em veneno de animais vertebrados e invertebrados e estão envolvidas em uma ampla variedade de processos fisiológicos. A fosfolipase A2 secretada humana do grupo IIA (hsPLA2 gIIA) é uma proteína de fase aguda da resposta imunológica, pois sua expressão é induzida por endotoxinas e citocinas via processos autócrinos e/ou parácrinos durante processos inflamatórios de relevância clínica. A hsPLA2 gIIA mostra efeito bactericida contra infecção por Staphylococcus aureus, e tem marcada preferência por fosfolipídios aniônicos tais como fosfatidilglicerol (PG) encontrados em membranas bacterianas. Uma grande variedade de inibidores de PLA2 do grupo IIA foi descrita na literatura, incluindo substâncias polianiônicas que atuam contra os efeitos inflamatórios destas enzimas. Suramina é um derivado de naftiluréia polissulfonado que recentemente mostrou ligação com os resíduos catiônicos no sítio de reconhecimento interfacial de Bothropstoxina-I (BthTX-I), uma PLA2-Lys49 isolada do veneno de Bothrops jararacussu, inibindo a atividade miotóxica da proteína. Devido ao tipo de interação diferenciada da suramina com BthTX-I em relação aos inibidores competitivos de PLA2, nós avaliamos a especificidade de ligação da suramina na hsPLA2 gIIA como um modelo para estudar este novo tipo de inibidor de PLA2s. O efeito da suramina nas atividades biológicas e de membranas artificiais da hsPLA2 gIIA foi avaliado. A suramina aboliu tanto a atividade hidrolítica da hsPLA2 gIIA quanto a atividade de danificação de membranas artificiais Ca2+ independente. Embora a suramina não tenha inibido a atividade bactericida da hsPLA2 gIIA contra a linhagem Micrococcus luteus, a ativação de macrófagos foi abolida pela mesma de maneira dependente de hidrólise. Além disso, técnicas de simulação de dinâmica molecular, calorimetria de titulação isotérmica e mutagênese sítio dirigida foram utilizadas para mapear os sítios de ligação da suramina na proteína. A interação da suramina com a hsPLA2 gIIA resultou de interações eletrostáticas entre grupos sulfonados com cadeias laterais de aminoácidos da região do sítio ativo e dos resíduos em torno das posições 15 e 116 localizados, respectivamente, na N- e Cterminal. Portanto, estes resultados permitem sugerir que a suramina pode atuar como inibidor de sPLA2s / Suramin is a polysulphonated napthylurea used as an antiprotozoal drug that presents inhibitory activity against a broad range of enzymes. We have evaluated the effect of suramin against the artificial and biological activities of the secreted human group IIA phospholipase A2 (hsPLA2 gIIA), a protein involved in inflammatory processes. To map the suramin binding sites on the hsPLA2 gIIA, proteins with mutations in the active site region and in the protein surface that makes contact with the phospholipids membrane were expressed in E. coli and refolded from inclusion bodies. The activation of macrophage cell line RAW 264.7 by hsPLA2 gIIA was monitored by nitric oxide release, and bactericidal activity of the protein against Micrococcus luteus was evaluated by colony counting and by flow cytometry. The hydrolytic activity of the hsPLA2 gIIA against lipossomes composed of a mixture of dioleoylphosphatidylcholine/dioleoylphosphatidylglycerol (DOPC/DOPG) was inhibited by a concentration of 100 nM suramin. The activation of macrophages by hsPLA2 gIIA was abolished at protein/suramin molar ratios where the hydrolytic activity of the enzyme was inhibited. In contrast, both the bactericidal activity of hsPLA2 gIIA against Micrococcus luteus and permeabilization of the bacterial inner membrane were unaffected by suramin concentrations up to 50 M. The affinity of interaction of the suramin with hsPLA2 gIIA was evaluated by suramine fluorescence and the mutants K15A, K38A, R54A and K123A presented a reduced affinity. The binding of the suramin/hsPLA2 gIIA complex was investigated by molecular dynamics simulations, which indicated two conformations of the bound inhibitor, which involve cationic amino-acid side chains in the active-site region and residues around positions 15 and 116 located in the N- and C-termini respectively in the substrate recognition surface. These results were correlated with isothermal titration calorimetry data, which demonstrated 2.7 suramin-binding sites on the hsPLA2 gIIA. These results suggested that suramin represents a novel class of phospholipase A2 inhibitor

As fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de efeitos tóxicos ocasionados por estas proteínas. Através de dois métodos cromatográficos (troca-iônica em CM-Sepharose e hidrofóbica em Phenyl-Sepharose) foi isolada uma isoforma de fosfolipase A2 ácida presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni, denominada de BmooPLA2. Quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, BmooPLA2 apresentou massa molar relativa de aproximadamente 14.000. A proteína isolada, BmooPLA2, possui uma única cadeia polipeptídica, pI~5,2, é rica em aminoácidos hidrofóbicos, ácidos e possui 14 resíduos de cisteína. Esta isoforma pH-termoestável apresentou alta atividade fosfolipásica. A enzima induziu edema moderado in vivo, na concentração de 25 g. Além disso, a BmooPLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária de modo dose dependente e induzir efeito hipotensor nas concentrações de 15 e 30 g . Foi realizada também a construção da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha da serpente Bothrops moojeni, onde o cDNA que codifica a proteína BmooPLA2 foi clonado e a proteína recombinante expressa em E. coli. Todos os ESTs (Expressed Sequence Tags) foram classificados de acordo com a homologia de sua estrutura primária com sequências conhecidas. As sequencias codificando para toxinas representaram cerca de 30% do total de sequências identificadas. De acordo com o transcriptoma, as toxinas mais expressas pela serpente Bothrops moojeni são as metaloproteases (SVMP), as quais correspondem a aproximadamente 77% das toxinas encontradas. A proteína recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa BmooPLA2, sugerindo que a recBmooPLA2 foi expressa, purificada e reenovelada em sua forma ativa. Como nenhum estudo abordou a participação das PLA2s ácidas de Bothrops nos processos inflamatórios e os mecanismos envolvidos na liberação desses mediadores, particularmente os prostanóides, as toxinas nativa e recombinante foram avaliadas quanto ao seu efeito sobre a resposta inflamatória (ensaios sobre leucócitos in vitro), avaliando a expressão da enzima COX-2 e liberação do prostanóide PGE2, além de outros mediadores como TXB4 e LTB2, após a incubação com macrófagos isolados, in vitro. Com estes resultados foi possível uma melhor compreensão da composição da peçonha desta serpente, bem como um melhor entendimento da participação das PLA2s ácidas envenenamento ofídico, abrindo novas perspectivas para sua aplicação biotecnológica. / The phospholipase A2 (PLA2s) are enzymes that induce various pharmacological effects and usually correspond to a higher percentage of the protein content of snake venoms. Thus, isolation, biochemical, functional and structural characterization of PLA2s may generate important information for a better understanding of the pharmacological effects and toxicity induced by these proteins. Through two chromatographic steps (ion exchange on CMSepharose and hydrophobic in Phenyl-Sepharose) an acidic phospholipase A2 isoform was isolated from the venom of the snake Bothrops moojeni and named BmooPLA2. Its biochemical and partial functional characterization were also performed. When submitted to electrophoresis on polyacrylamide gel with denaturing agent (SDS-PAGE), BmooPLA2 presented relative molar mass of approximately 14,000. The isolated protein, BmooPLA2, has a single polypeptidic chain, pI ~ 5.2, is rich in hydrophobic amino acids and has 14 cysteine residues. This pH-thermostable isoform showed high phospholipasic activity. The enzyme induced moderate edema in vivo, at the concentration of 25 g. In addition, BmooPLA2 was able to inhibit platelet aggregation in a dose dependent manner and showed hypotensive effect at different concentrations (15 and 30 g). It was also carried out the construction of the cDNA library from the venom gland of the snake Bothrops moojeni, where the cDNA encoding the protein BmooPLA2 was cloned and a recombinant protein expressed in E. coli. All ESTs (Expressed Sequence Tags) were classified according to their primary structure homology with known sequences. The sequences coding for toxins accounted for approximately 30% of all identified sequences. According to the transcriptome, the majority of the toxins expressed by the snake Bothrops moojeni are metalloproteases (SVMP), which correspond to approximately 77% of the toxins found. The recombinant protein presented the same amino acid sequence, phospholipase activity and inhibitory effect on platelets, observed for the native BmooPLA2, suggesting that recBmooPLA2 was expressed, purified and refolded in its active form. Since no study has addressed the involvement of acidic PLA2s from Bothrops genus upon inflammatory processes and the mechanisms involved in the release of such mediators, particularly prostanoids, native and recombinant toxins were evaluated for their effects on the inflammatory response (essays on leukocytes in vitro), evaluating the expression of COX-2 and prostanoid release of PGE2, as well as other mediators as TXB4 and LTB2, after incubation with isolated macrophages, in vitro. With these results it was possible to better understand the composition of the venom of this snake, and a better understanding of the role of acidic PLA2s on the snake envenomation, opening new perspectives for its biotechnological application.

As peçonhas de serpente do gênero Bothrops se caracterizam por induzir miotoxicidade, edema, coagulação e hemorragia. Por essa razão, alguns pesquisadores estão buscando por tratamentos alternativos contra os envenenamentos ofídicos com inibidores naturais e artificiais. O presente estudo tem como objetivo estudar as interações entre as PLA2s (Asp49 e Lys49) de veneno de serpente Bothrops jararacussu, denominadas BthTX-I e BthTX-II, respectivamente, e o inibidor vegetal isolado da espécie Cordia verbenacea. C. verbenacea apresenta diversas atividades farmacológicas já demonstradas, sendo utilizada também pela população como antiofídica. O extrato hidroalcoólico das folhas preparado à seco, foi submetido a técnicas cromatográficas como Sephadex LH-20 e CLAE, obtendo-se a purificação do princípio ativo antiofídico da planta, denominado ácido rosmarínico. A peçonha de B. jararacussu foi submetida à cromatografia de filtração em gel Sephadex G-75 e, à cromatografia de troca iônica. O ácido rosmarínico (AR) foi isolado do extrato metanólico de C. verbenacea e apresentou inibição da hemorragia provocada pela peçonha bruta de B. jararacussu. Em comparação, o ácido rosmarínico® também inibiu o efeito hemorrágico causado pela peçonha bruta de B. jararacussu. A atividade edematogênica provocada pelas toxinas BthTX-I e II foi avaliada e testada com os inibidores. Ambos AR e AR® não inibiram significativamente a induçào de edema. Resultados semelhantes foram obtidos com as atividades anticoagulante, e fosfolipásica. O ácido rosmarínico, AR e AR®, demonstrou alto efeito inibitório sobre a citotoxicidade e miotoxicidade induzida pela peçonha bruta e pela toxina BthTX-I. Ambos inibidores apresentou um menor efeito sobre a atividade miotóxica induzida pela toxina BthTX-II. Simulações de docking realizadas com três PLA2s e AR mostraram perfis de interações similares, reforçando as principais interações enzima-inibidor obtidas experimentalmente, relatadas na literatura. Os cálculos de derivação de farmacóforo baseados em diferentes inibidores relatados na literatura, assim como estudos de campos de interação molecular foram realizados, nos quais os resultados indicaram as principais modificações na estrutura do inibidor ácido rosmarínico necessárias para otimização. Nas simulações de screening virtual, novos potenciais inibidores de BthTX-I foram selecionados a partir de base de dados de compostos drug-like, direcionando os próximos passos aos testes biológicos, os quais serão realizados com esta fosfolipase e os novos candidatos a inibidores modelados. / Snake venoms from Bothrops genus are characterized by inducing myotoxicity, edema, thrombosis and hemorrhage. Thus, some researchers are searching for alternative treatments against ophidian poisoning with natural and artificial inhibitors. This work aimed study the interactions between PLA2s (Asp49 e Lys49) from Bothrops jararacussu snake venom, named BthTX-I and BthTX-II, respectively, and the inhibitor isolated from Cordia verbenacea plant. C. verbenacea presents several pharmacological activities already demonstrated, and it is also used by the population by its antiophidic activity. The hydroalcoholic extract prepared from the dried leaves, was submitted to chromatographic techniques as Sephadex LH-20 and HPLC, resulting in the purification of the antiophidian compound active from the plant, named rosmarinic acid. B. jararacussu snake venom was submitted to gel filtration chromatography on Sephadex G-75 and ion exchange chromatography. Rosmarinic acid (RA) was isolated from the C. verbenacea methanolic extract and it presented hemorrhage inhibition caused by crude venom from B. jararacussu. In comparison with this, Rosmaric acid® also inhibited the hemorrhagic effect caused by crude venom from B. jararacussu. Edematogenic activity caused by BthTX-I and II was evaluated and tested with the inhibitors. Both, RA e RA® did not inhibit the edema indution significantly. Similar results were obtained with the anticoagulant and phospholipasic activity. The rosmarinic acid, RA e RA®, presented high inhibitory effect for myotoxicity and cytotoxicity induced by crude venom and the toxin BthTX-I. Both inhibitors presented minor effect on myotoxicity activity induced by BthTX-II toxin. Docking simulations performed with three PLA2 and RA have shown similar interactions profiles, corroborating the main enzyme-inhibitor interactions experimentally obtained, reported in literature. Pharmacophore perception calculations based on different inhibitors reported in literature as well as molecular interaction fields studies were here carried out, whose results indicate the main changes in the structure of the rosmarinic acid inhibitor necessary to optimization. In the virtual screening simulations, novel potential BthTX-I inhibitors were selected from drug-like compounds databases, thus guiding next steps towards biological tests, which will must be performed with this phospholipase and the new inhibitor candidates modeled.

Os venenos de serpentes são misturas complexas com composição variada, possuindo constituintes orgânicos e inorgânicos. Dentre os compostos orgânicos, destacam-se as proteínas, tóxicas e/ou com altas atividades enzimáticas. Desta forma, os venenos desenvolvem importante papel na captura de presas e auxílio à digestão. Venenos de serpentes da família Viperidae apresentam ampla e variada gama de ações biológicas, como proteólise, coagulação, hemorragia, neurotoxicidade e miotoxidade. Populações de serpentes habitantes endemicamente em ilhas são bons modelos para estudos de evolução, especialmente quando comparadas a espécies de mesmo gênero que habitam o continente. Espécies ancestrais de serpentes do gênero Bothrops sofreram isolamento geográfico cerca de 9 mil anos atrás, quando no Período Pleistoceno porções de terra na região Sudeste do Brasil foram isoladas do continente, levando a formação de ilhas costeiras, devido a elevação do nível do mar. Tal isolamento deu origem a novas espécies insulares pertencentes ao gênero Bothrops. Estudos relacionados aos venenos destas espécies, suas especificidades e diferenças com relação a serpentes continentais são escassos. O Arquipélago de Alcatrazes localiza-se no litoral de São Paulo, distando aproximadamente 35 Km da costa. Não há relatos da existência de mamíferos na ilha, com exceção de morcegos. Serpentes adultas da espécie Bothrops alcatraz, endêmica da Ilha de Alcatrazes, apresentam características encontradas em serpentes juvenis do grupo das jararacas, como a dieta baseada exclusivamente em animais ectotérmicos e a composição diferenciada do veneno. O presente trabalho tem como objetivo caracterizar as principais ações do veneno da serpente B. alcatraz, espécie endêmica e ilhoa, isolando cromatograficamente suas frações. Resultados indicam no veneno de B. alcatraz apresenta as atividades coagulante sobre plasma humano, fosfolipásica, miotóxica e edematogênica mais ativas quando comparadas com as ações do veneno de B. jararaca do continente. As ações proteolítica, hemorrágica e toxicidade para camundongos são mais potentes no veneno de B. jararaca. A presença de ação neurotóxica específica para artrópodes no veneno de B. alcatraz sugere a ação de uma fosfolipase A2, a qual foi isolada cromatograficamente. As propriedades e composição do veneno de B. alcatraz indicam uma provável evolução de toxinas adaptadas a seu tipo de presa/alimento. / Snakes venoms are complex mixtures with varied composition constituted by organic and inorganic molecules. The main organic components are proteins, which can be toxic and show high enzymatic activities, thus playing important role in prey capture and digestion in snakes. Viperidae snakes family show wide range of biological actions, as proteolytic, coagulant, hemorrhagic, neurotoxic and myotoxic activities. Snake populations inhabiting endemically islands are useful models for evolution studies, specially when compared to their congeneric continental species. Bothrops species ancestors from Southeastern Brazil underwent geographic isolation about 9 thousand years ago, during the Pleistocene Period, when land portions were separated from the continent by the sea. The isolation originated new (island endemic) Bothrops species. Studies related to those snake venoms, its specialties and differences among continental species of the genera Bothrops are scarce. The Alcatrazes Archipelago is located in São Paulo coast, 35 kilometer far from the continent. There are no register of mammals in those islands, except for bats. Bothrops alcatraz is endemic from the Alcatrazes Island. Adults show some similarities to young specimens from the continental jararaca group. They feed exclusively on ectothermic animals and their venom shows a different composition. The aim of this study was to analyze the endemic island snake, B. alcatraz, venom, isolating by chromatography the venom fractions. Results indicated that B. alcatraz venom presents coagulant, phospholipase, myotoxic and edema forming activities higher than continental B. jararaca venom. The proteolytic, haemorrhagic and mice toxicity are higher on B. jararaca venom. The specific neurotoxic action in arthropods of B. alcatraz venom suggests a phospholipase A2 action, which was isolated bt cromatography. The properties and composition of B. alcatraz venom indicates a possible evolution of toxins adapted to the prey kinds.

Os venenos de serpentes contêm concentrações elevadas de fosfolipases A2 secretadas (sFLA2), que apresentam homologia com as FLA2s de mamíferos, cujos níveis estão aumentados em doenças inflamatórias. Neste estudo, investigou-se a ativação e a expressão de fatores envolvidos na formação de corpúsculos lipídicos (CLs) em células fagociticas e o papel desses fatores na resposta imune inata, induzida pela MT-III, uma sFLA2s de veneno. A MT-III induziu aumento dos níveis de triacilglicerol, colesterol e lisofosfolipideos e a ativação e expressão dos fatores PPAR-g, PPAR-d/b, SREBP2 e do CD36. Sob estimulo da MT-III, o receptor PPAR-b/d, as enzimas DGAT, ACAT e FAS foram relevantes para a formação de CLs e para a expressão da PLIN2. O CD36 participa da expressão da COX-2, sem modificar a liberação de PGE2. O TLR2 e a MyD88 foram essenciais para a formação de CLs e síntese da IL-1b e IL-10. Ainda, o TLR2 foi relevante para a liberação de PGE2, PGD2 e LTB4, enquanto MyD88 foi fundamental somente para a liberação de PGE2 e expressão da PLIN2, induzidas pela MT-III. / Snake venoms contain high concentrations of secreted phospholipase A2 (sPLA2) with homology to mammalian PLA2s, whose levels are elevated in inflammatory diseases. In this study, we investigated activation and expression of factors involved in lipid droplets formation (LDs) and participation that factors in the innate immune response induced by MT-III, sPLA2s from snake venom, in phagocytic cells. MT-III induced increase of triacylglycerol, cholesterol and lysophospholipids levels and activation and expression of factors PPAR-g, PPAR-d/b, SREBP2 and CD36. PPAR-b/d receptor, DGAT, ACAT and FAS enzymes were relevant to LDs formation and critical to PLIN2 expression induced by MT-III. CD36 participates in COX-2 expression without modifying PGE2 release stimulated by MT-III. TLR2 and MyD88 were essential to LDs formation and IL-1b and IL-10 synthesis stimulated by MT-III. Moreover, TLR2 was relevant to PGE2, PGD2 and LTB4 biosynthesis, while MyD88 is essential only for PGE2 release and PLIN2 expression induced by MT-III.

Orientadores: Sergio Marangoni, Luís Alberto Ponce Soto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T20:51:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RomeroVargas_FreyFrancisco_D.pdf: 4482249 bytes, checksum: 951ba98ea20426e2308c178f17a7680d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Uma nova miotoxina fosfolipase A2 (BtTX-II) foi purificada a partir do veneno total de Bothriopsis taeniata através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de exclusão molecular, seguida de HPLC de fase reversa. BtTX-II foi caracterizada bioquimicamente através de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrando uma única banda eletroforética com massa relativa (Mr) de 14000 Da, em condições não reduzidas e reduzidas (DTT 1M). A pureza e massa molecular foram confirmadas por espectrometria de massa (MALDI-Tof MS), a qual determinou uma massa molecular de 13889,98 Da. BtTX-II apresentou atividade catalítica de 12,075 ± 0,138 nmoles/mg/min em presença do substrato cromogênico específico ácido 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoico. Análise de composição de aminoácidos da PLA2 (BtTX-II) corroborou seu caráter básico. A análise dos peptídeos trípticos foi determinada por ESI-QTof-MS/MS espectrometria de massa e as regiões contendo peptídeos internos mostraram semelhança com outras PLA2s miotóxicas botrópicas cataliticamente ativas. BtTX-II, pertencente à classe PLA2 D49, exibiu atividade ótima a pH 8,0 e temperatura de 37 ºC. Na ausência de Ca2+ e na presença de alguns íons divalentes, tais como Mg2+, Mn2+, Zn2+ e Cd2+ (10mM), a atividade fosfolipásica foi significativamente diminuída. Também foi demonstrado o efeito inibitório de crotapotinas crotálicas sobre a atividade PLA2 da BtTX-II. O efeito neurotóxico da BtTX-II foi analisado através de estudos miográficos em preparações neuromusculares "ex vivo", mostrando que BtTX-II induz um leve bloqueio na junção neuromuscular em preparações Biventer cervicis de pintainho. Tais preparações foram utilizadas para o estudo morfológico quantitativo da BtTX-II, o que mostrou uma leve atividade miotóxica "in vitro" com a concentração de 50?g de BtTX-II. O efeito miotóxico também foi avaliado através de ensaios de liberação de creatina kinase plasmática e análise histopatológica do músculo gastrocnêmio de camundongo "in vivo", com estes últimos testes foram observandos maiores mudanças morfológicas quando comparadas aos estudos "in vitro", mostrando estar diretamente relacionada com a liberação de CK. BtTX-II induz miotoxicidade local após injeção intramuscular, mas não produz miotoxicidade sistêmica após injeções intravenosa. O efeito edematogênico foi estudado através do modelo coxim plantar de camundongo e mostrou ser elevado nas primeiras horas após injeções subcutâneas, em todas as concentrações aplicadas (1- 20 ?g). O efeito citotóxico "in vitro" foi caracterizado utilizando uma cultura celular da linhagem de mioblastos/miotubos de músculo esquelético de camundongo. BtTX-II não induz citotoxicidade em mioblastos; mas BtTX-II evidenciou atividade citotóxica em miotubos, em uma concentração padrão de 20 ?g. Nossos resultados sugerem que BtTX-II atua no processo de regeneração muscular em baixas concentrações (10 ?g) durante o período de 28 dias após as injeções intramusculares no gastrocnêmio de camundongo, demonstrando ser apropriado para a análise na regeneração muscular, pois induz necrose e não acarreta lesão do tecido vascular nem nervoso, o que é de suma importância para o processo de regeneração muscular. Isto foi possível pela presença de células satélite envolvidas neste processo junto com o infiltrado inflamatório notório em todos os períodos da regeneração / Abstract: A new miotoxin phospholipase A2 (BtTX-II) was purified from Bothriopsis taeniata crude venom through two steps cromatográficos, involving molecular exclusion chromatography, as first step, and followed by RP-HPLC. BtTX-II, was characterized biochemically through electrophoresis in polyacrylamide gel (SDS-PAGE) showing a single eletrophoretic band, in reduced and not reduced conditions, with relative mass (Mr) of 14000 Da. The purity and molecular mass was confirmed by mass spectrometry mass (Maldi-Tof SM), showed a molecular mass of 13889.98 Da. BtTX-II showed catalytic activity of 12.075 ± 0.138 nmoles/mg/min upon of the specific chromogenic substrate acid 4-nitro-3-(octanoyloxy) benzoic. Analysis of aminoacid composition of PLA2 (BtTX-II) corroborated its basic character. Tryptic peptide analyse were determined for ESI-QTof-MS/MS mass spectrometry and the regions containing internal peptides showed similarity with other miotoxic botropics PLA2s. BtTX-II belonging to the class PLA2 D49 exhibited an optimal activity in pH 8.0 and at 37 ºC. In the absence of Ca2+ and in presence of some divalent íons such Mg2+, Mn2+, Zn2+ and Cd2+ (10mM), the phospholipasic activity was significantly decreased. Also, it was demonstrated the inhibitory effect of crotalics crotapotins upon activity PLA2 of the BtTX-II. The neurotoxic effect of the BtTX-II was analized through myographic studies in neuromuscular preparations "ex vivo", showing that BtTX-II induce a light blockade at the neuromuscular junction on chicken Biventer cervicis preparations. Such preparations were used for quantitatives morphologic studies, were shown a light myotoxic activity "in vitro" at higher concentration. On the other hand, the myotoxic effect was evaluated through release of plasmatic creatine kinase "in vivo" and was carry out histophatologic analyzes mouse gastrocnemius muscle, with these last tests were observed larger morphologic changes when compared to studies "in vitro", showing directly related with the CK liberation. BtTX-II induces local miotoxicity after intramuscular injection, but it did not produce systemic miotoxicity after intravenous injections. The edematogenic effect was studied through the model mouse paw edema and showed to be high in the first hours after subcutaneous injections, in all applied concentrations (1-20 ?g). The cytotoxic effect "in vitro" was characterized using a cell culture of the rodent lineage of myoblasts/myotubes cells. BtTX-II did not induce citotoxicity in skeletal muscle myoblasts; however, BtTX-II showed cytotoxic activity in myotubes, both with a standard concentration of 20 ?g. Our results suggest that BtTX-II act in the process of muscular regeneration in low concentrations (10 ?g) during a period of 28 days after intramuscular injections in the mouse gastrocnemius muscle, This effect was to be appropriate for muscular regeneration analyzes because it induces necroses and it did not carry out lesion of the vascular nor nervous tissue, thus, it is of supreme importance for the process of muscular regeneration. Those results were possible by the presence of satellite cells involved in these processes together with notorious inflammatory infiltrate in every periods of the regeneration / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

L’exocytose est un mécanisme biologique fondamental qui permet la libération du contenu des granules de sécrétion dans le milieu extracellulaire. C’est un processus finement régulé par le calcium qui nécessite entre autre, la réorganisation de la membrane plasmique et la formation de domaines lipidiques. Dans les cellules chromaffines, l’annexine A2, protéine capable de lier les phospholipides et l’actine de manière calcium-dépendante, est responsable de la formation et de la stabilisation de ces plateformes lipidiques. Le résultat majeur de ma thèse concerne l’organisation tridimensionnelle et le rôle de l’actine au niveau des sites d’exocytose. Sachant que la phosphorylation de la tyrosine 23 de l’annexine A2 affecte sa liaison à l’actine et aux membranes, deux acteurs majeurs de l’exocytose, j’ai mis en évidence l’importance fonctionnelle de cette phosphorylation. Une autre conséquence de cette phosphorylation est le passage de l’annexine A2 de la face interne à la face externe de la membrane plasmique. Le mécanisme de sortie et le rôle de l’annexine A2 extracellulaire dans les cellules chromaffines ont également été étudiés. / Exocytosis is a fundamental biological mechanism which allows liberation of the contents of secretory granules into the extracellular medium. This calcium-regulated process requires the formation of lipid domains for the structural and spatial organisation of exocytotic sites. In the chromaffin cell, annexine A2, a calcium-, actin- and lipid-binding protein participates in the formation and stabilization of lipid microdomains. The major advance resulting from my thesis is the elucidation of the three-dimensional organization and the role of actin at the exocytotic site. Phosphorylation of the tyrosine 23 is known to affect the binding of annexin A2 to actin filaments and plasma membrane, two major actors of the exocytotic process and my results highlight the functional importance of this phosphorylation on exocytosis. Furthermore, tyrosine 23 phosphorylation also triggers a translocation of annexin A2 to the external face of the plasma membrane. The role and functional signification of this externalization was also examined.

Les biocapteurs sont des moyens d'analyse en plein essor à la fois rapides, sélectifs et peu coûteux applicables à des domaines extrêmement variés (environnement, santé, agroalimentaire,…). Dans ce type d'outil, un élément sensible de nature biologique (anticorps, enzyme, microorganisme, ADN…) doté d'un pouvoir de reconnaissance pour un analyte ou un groupe d'analytes est associé à un transducteur pouvant être de type électrochimique, optique ou thermique. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au développement de différents biocapteurs, en se basant à l'immobilisation d'enzymes sur des microélectrodes en vue de la détection électrochimique d'analytes d'intérêt dans le domaine environnemental. Nous avons montré les potentialités d'application de deux biocapteurs conductimétrique et impédimétrique à base de lipase Candida Rugosa pour la détection directe et rapide des pesticides organophosphorés. Nous avons cherché à mieux comprendre le fonctionnement des biocapteurs et optimisé le procédé d'immobilisation des enzymes ainsi que différents paramètres de mesure afin de maximiser les performances analytiques des outils développés. Nous avons également élaboré un biocapteur impédimètrique pour une détermination très sensible de la phospholipase A2 en utilisant les nanoparticules d'or afin de renforcer la conductivité électrique. Enfin, nous avons développé un biocapteur de tyrosinase pour la détection du Bisphénol A, en se basant sur la modification électrochimique des électrodes de diamant dopé qui possèdent des propriétés électriques remarquables et uniques, avec l'ajout de nanotube de carbone multi-feuillet, ce qui permet d'améliorer des performances analytiques du biocapteur, en particulier sa limite de détection et sa stabilité. Les biocapteurs à base de lipase et de tyrosinase ont été appliqués avec succès à la quantification des composés organophosphorés et du bisphénol A respectivement dans plusieurs échantillons d'eaux réelles / A biosensor is an analytical device, used for the detection of an analyte, that combines a biological component so-called a receptor (e.g. enzyme, antibody, DNA, microorganism) to a physical transducer (e.g. electrochemical, optical or thermal). In last decade, biosensors are quite promising tools since they are rapid, selective and cost effective, with an increasing interest for their application in various fields (e.g environment, food, health). In this work, we developed different biosensors based on immobilized enzymes onto microelectrodes in view of electrochemical detection. First, we demonstrated the potentialities of conductometric and impedimeteric biosensors based on lipase from Candida Rugosa for direct and rapid detection of organophosphate pesticides. In order to enhance the analytical performances of the developed devices, we tried to optimize enzyme immobilization as well as several operational parameters. We also elaborated an impedimetric biosensor for a sensitive determination of phospholipase A2 activity. Finally, a tyrosinase biosensor was developed for ultra-sensitive detection of Bisphenol A, based on the unique proprieties of boron doped diamond electrodes and taking advantage the use of multi walled carbon naotubes to improve the stability and detection limit of biosensor. We also demonstrated the applicability of both biosensors based on lipase and tyrosinase for the detection of organophosphate pesticides and bisphenol A in river water

L'agressivité des cancers est souvent liée au pouvoir métastatique des cellules tumorales et la dissémination de ces dernières peut survenir suite à un phénomène appelé la transition épithéliomésenchymateuse. Une analyse de l'expression de la Cycline A2 conduite sur des échantillons humains de tumeurs primaires colorectales et de leurs métastases correspondantes révèle que cette protéine est moins abondante dans ces dernières. Le travail décrit dans cette thèse a permis de relier la Cycline A2 au remodelage du cytosquelette d'Actine dans les fibroblastes. Cette régulation requiert la localisation cytoplasmique de la molécule ainsi que son domaine N-terminal qui ne lie pas les CDKs. Nos expériences suggèrent que cette nouvelle activité est la conséquence d'une liaison directe entre la GTPase RhoA et la Cycline A2. La présence de cette dernière augmente l'activation de RhoA par sa GEF in vitro. L'utilisation de cellules épithéliales mammaires normales a permis l'identification d'un autre partenaire, RhoC. Dans ce contexte cellulaire, l'invalidation de la Cycline A2 diminue l'activation de RhoA et, renforce celle de RhoC ce qui conduit à une augmentation de l'invasion cellulaire en matrice de collagène. Ces cellules acquièrent aussi des propriétés mésenchymateuses caractéristiques de l'EMT, et ce phénotype est exacerbé par la présence de RasV12. Ce travail établit donc l'existence de nouvelles fonctions pour la Cycline A2 qui viennent compléter le tableau de régulation de la motilité par les protéines du cycle cellulaire et contribuent à une meilleure compréhension de son rôle dans le cancer. / Cancer aggressiveness is often associated with metastases occurrence and their dissemination can arise following an epithelial to mesenchymal transition (EMT). Cyclin A2 expression is lower in metastases relative to primary colon adenocarcinoma of matched human tumors. This manuscript describes new links between Cyclin A2 and Actin cytoskeleton remodeling in fibroblasts. This regulation requires a cytoplasmic localization of the protein and its N-terminal domain, which is unable to bind CDKs. This new Cyclin A2 activity appears to be mediated by its binding to RhoA. Accordingly, the activity of its GEF is potentiated when Cyclin A2 is present, in vitro. Furthermore, we used a normal mammary epithelial cell line and identified another Cyclin A2 partner, RhoC. Cyclin A2 depletion in this context leads to a reciprocal RhoGTPase activation where RhoA activation is impaired and that of RhoC is increased. Moreover, cell invasiveness is increased in a collagen matrix following Cyclin A2 knockdown in these cells. In addition, the epithelial cells acquire mesenchymal properties, which are exarcerbated by the expression of RasV12 and are characteristic of an EMT. Our work completes the network involving cell cycle proteins in motility. These novel functions of Cyclin A2 will hopefully help to understand the impact of its deregulation in cancer.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-17T20:16:41Z No. of bitstreams: 1 Adriano Silvio dos Santos.pdf: 1418434 bytes, checksum: 4ac5ef78eb225e6693c107993f6ee978 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T20:16:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adriano Silvio dos Santos.pdf: 1418434 bytes, checksum: 4ac5ef78eb225e6693c107993f6ee978 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / Snakes venom of the Bothrops species induces a local inflammatory reaction, characterized by pain, edema, leukocyte migration and can be accompanied by tissue necrosis. The use of antivenom performs the function of neutralizing the greatest possible amount of circulating venom, thus minimizing its systemic effects, but its action does not extend to local manifestations, and thus require the use of another therapeutic option to control this reaction. The low level laser therapy (LLLT) is used as an alternative treatment in cases of muscle injury due to its biological effects, such as analgesics, anitinflamatory and healing. In a previous study of our lab it was found that LBP can enhance the viability of C2C12 muscle cells after the addition of B. jararacussu venom in the medium and that this effect of LBP is related to protection of the cell membrane. In the present study we analyzed the effect of LBP in the cell monolayer integrity, viability of muscle cells, exposed to injury by myotoxins BthTX - I - and BthTX - II isolated from Bothrops jararacussu venom. Cells received BthTX – I (75 μg / mL) and were immediately irradiated with LLLT Aluminum Indium Gallium Phosphate and Aluminium Gallium Arsenide, the wavelengths (λ) 685nm and 830 nm, power density 4 J/cm2, 100mW of power, total energy 1,3 J, application time of 13 and 35 seconds per point and the cells were incubated for 15, 30 and 60 minutes. The results demonstrated that BthTX – I affect cell viability in a dose dependent manner, but did not change cell integrity. The concentration of 75 μg/mL was chosen for the experiments with LBP. LLLT caused an significant increase in cell viability in all the analyzed period of time and in the λ 685 nm and 830 nm against Bothrops I toxin, however in the LBP λ 685 nm against Bothrops toxin II was effective only at 15 min, while the LBP at λ 830 was effective at 15 and 60 min. The LLLT was not able to change the LDH release at all times and wavelength used. Thus, LBP was able to protect C2C12 muscle cells against the miotoxic effect of isolated myotoxins isolated from B. jararacussu venom. Therefore, the results suggest that LLLT can be considered an effective therapeutic tool in patients bitten by snakes. / O veneno das serpentes do gênero Bothrops induz uma reação inflamatória local intensa, caracterizada por dor, formação de edema, migração leucocitária, podendo ser acompanhada por necrose tecidual. A utilização do soro antibotrópico desempenha a função de neutralizar a maior quantidade possível do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistêmicos, porém sua ação não se estende às manifestações locais, sendo assim necessário o uso de outro recurso terapêutico para o controle dessa manifestação. A laserterapia de baixa potência (LBP) é uma alternativa de tratamento em situações de lesão muscular, devido a seus efeitos biológicos, tais como analgésicos, antinflamatórios e cicatrizantes. Em trabalhos anteriores realizados em nosso laboratório, verificou-se que o LBP foi capaz de aumentar a viabilidade de células musculares C2C12, após a adição do veneno de B. jararacussu e que esse efeito do LBP é relacionado a uma proteção da membrana celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do LBP em células musculares C2C12 submetidas à lesão por miotoxinas (BthTX - I e BthTX - II) isoladas do veneno da serpente Bothrops jararacussu quanto a: viabilidade, descolamento celular e liberação da enzima LDH. As células receberam a BthTX – I e BthTX – II na dose 75 μg/mL e foram imediatamente irradiadas com LBP Índio Gálio Alumínio Fósforo e Arseneto de Gálio Alumínio, nos comprimentos de onda (λ) 685 nm vermelho e 830 nm infra-vermelho, de forma pontual, tempo de aplicação de 13 s e 35 s respectivamente e as células foram incubadas por 15, 30 e 60 minutos. Os resultados demonstraram que a BthTX - I e BthTX - II afetou a viabilidade celular de forma dose-dependente, sendo escolhida a dose 75 μg/mL para a realização dos experimentos com o LBP, porém não foi capaz de causar alterações na integridade. O LBP causou aumento significativo na viabilidade celular, em todos os tempos analisados no λ 685 nm e 830 nm frente à BthTX - I, entretanto o LBP no λ 685 nm e λ 830 frente a BthTX - II foi efetivo somente no tempo de 15 e 60. O LBP não foi capaz de diminuir a liberação de LDH em todos os tempos analisados e com os dois λ utilizados. Desta forma, verificou-se que o LBP foi capaz de proteger as células musculares C2C12 contra o efeito miotóxico das miotoxinas isoladas do veneno B. jararacussu e que esta proteção está relacionada ao efeito protetor a nível mitocondrial. Ainda, os resultados obtidos sugerem que o LBP pode ser considerado uma ferramenta terapêutica eficaz em pacientes picados por serpentes.