Os venenos do gênero Bothrops induzem efeitos locais caracterizados por hemorragia, necrose, edema e dor intensa. Apesar da importância clínica do fenômeno de dor, os estudos sobre os mecanismos envolvidos na gênese deste fenômeno são ainda escassos. Além disso, não existem dados sobre a capacidade do antiveneno em neutralizar este fenômeno. Neste trabalho foi investigada, a capacidade dos venenos de Bothrops jararaca, Bothrops asper e da miotoxina III (Fosfolipase A2, variante Asp 49), uma toxina isolada do veneno de Bothrops asper, em induzir hiperalgesia em ratos, a mediação química deste fenômeno e a capacidade dos antivenenos em neutralizar esta ação dos venenos. A possível correlação entre a hiperalgesia e a resposta edematogênica causada pelos venenos ou miotoxina foi também avaliada. O limiar de dor foi determinado antes e em diferentes tempos após a administração dos venenos ou toxina, empregando o teste de pressão de pata de rato. Para o estudo da resposta edematogênica, o aumento do volume das patas posteriores foi determinado por pletismografia. Os venenos e a toxina, administrados por via intraplantar, nas doses de 5µg (VBj), 15µg (VBa) ou 10µg (MIII), induziram hiperalgesia e edema, com respostas máxima na 1a (VBj, MIII) ou 2a (VBa) hora, não sendo mais detectadas na 24a hora. Para o estudo da neutralização, foram utilizados o antiveneno botrópico produzido no Instituto Butantan e o antiveneno polivalente produzido no Instituto Clodomiro Picado da Costa Rica, administrados por via endovenosa, 15 min. ou imediatamente antes ou 15 min. após a injeção dos venenos. O AVIB, quando injetado 15 min. antes do VBj, foi capaz de reverter a hiperalgesia induzida pelo veneno. Em relação ao edema, esta inibição foi observada quando o antiveneno foi administrado 15 min. ou imediatamente antes do VBj. Por outro lado, o AVCP não interferiu com a dor e o edema acarretados pelo VBa. Quando o VBj e o VBa foram incubados, in vitro, por 30 min., a 370C com os AV correspondentes, a hiperalgesia e o edema foram abolidos. Estes resultados indicam que a incapacidade do AVCP, quando administrado in vivo, de bloquear a hiperalgesia e o edema induzidos pelo VBa, não é consequência da ausência de anticorpos específicos no antiveneno, uma vez que estes efeitos foram inibidos quando o veneno foi pré-incubado com o antiveneno. Para avaliação da mediação química da hiperalgesia e do edema, os animais foram submetidos a tratamentos com inibidores de síntese, antagonistas de receptores, anticorpos ou drogas depletoras destes mediadores. Os resultados mostraram que o Hoe-140, dexametasona e NDGA inibem a hiperalgesia induzida pelo VBa, enquanto que apenas a prometazina interferiu com o edema causado pelo veneno. A hiperalgesia induzida pela MIII foi revertida pelo tratamento com prometazina, metisergida, Hoe-140, dexametasona e por NDGA, enquanto que o edema foi inibido apenas por prometazina e dexametasona. Estes dados sugerem que: a) a MIII é um importante componente do veneno para a geração de hiperalgesia, b) a bradicinina e os derivados da lipoxigenase são mediadores da dor acarretada pelo VBa e pela MIII, c) histamina e serotonina participam também da hiperalgesia induzida pela miotoxina e d) a histamina é mediador do edema induzido pelo VBa e pela MIII. Com relação à hiperalgesia induzida pelo VBj, somente o tratamento com Hoe-140 diminuiu este fenômeno, indicando a participação da bradicinina. Por outro lado, este tratamento não foi capaz de interferir com o edema induzido por este veneno. Cabe ressaltar que TEIXEIRA et al. (1994) demonstraram a participação de eicosanóides e PAF na hiperalgesia induzida pelo VBj. Os dados em conjunto sugerem ainda, dissociação entre os fenômenos de dor e edema acarretados por ambos os venenos e pela miotoxina. / Bothrops venoms cause pronounced local tissue-damage characterized by hemorrhage, myonecrosis, edema and pain. Venom-induced pain has been poorly investigated, despite its clinical relevance. Furthermore, the ability of antivenom to neutralize hyperalgesia induced by these venoms is not known. In the present study the hyperalgesia and edema induced by Bothrops jararaca (BjV) and Bothrops asper (BaV) venom and by myotoxin III-MIII (Asp49- phospholipase A2), a toxin isolated from BaV, were investigated. The chemical mediators involved in these phenomena and the ability of the antivenom to neutralize the hyperalgesia and edema induced by these venoms were also investigated. Pain threshold was assessed before and at several intervals after venom injection, using the rat paw pressure test. Edema of paw was measured phethysmographically at the same periods of time. The intraplantar injection of BjV (5µg/paw), BaV (15µg/paw) or MIII (10µg/paw) caused hyperalgesia and edema, whose peak were observed at the 1st (BjV, MIII) or 2nd (BaV) hours after venom/toxin administration, decreasing thereafter. For neutralization studies, the antivenoms produced either at Instituto Butantan from Brazil (AVIB) or Instituto Clodomiro Picado from Costa Rica (AVCP) were administered intravenously 15 min prior to, or immediately before, or 15 min after venoms injection. When the antivenom from Instituto Butantan was injected 15 min. before BjV, the hyperalgesia and edema were abolished. Furthermore, partial inhibition of edema was also observed when the antivenom was injected together with BjV. On the other hand, hyperalgesia and edema induced by BaV were not modified by AVCP. Incubation of BjV and BaV, for 30 min. at 37oC, with the antivenoms in vitro, abolished the hyperalgesia and edema. The inability of the in vivo treatment with antivenom in abolishing hyperalgesia and edema induced by BaV seems not to be related to the lack of neutralizing antibodies in antivenom, because neutralization was achieved in pre-incubation experiments. In order to investigate the chemical mediation of hyperalgesia and edema induced by the venoms or toxin, animals were treated with several drugs. Pretreatment with Hoe-140, dexamethasone and NDGA blocked the hyperalgesia induced by BaV, whereas only promethazine reduced the edema induced by this venom. The MIII-induced hyperalgesia was blocked by promethazine, methysergide, Hoe-140, dexamethasone and NDGA, whereas the edema was reduced only by promethazine and dexamethasone. These results suggest that: a) MIII may contribute to the BaV-induced hyperalgesia, b) bradykinin and leukotrienes mediate the BaV- and MIII-induced pain and MIII; c) histamine and serotonin also participate in the myotoxin-induced hyperalgesia and d) the edema induced by BaV and MIII is mediated by histamine. Pre-treatment of the animals with Hoe-140 abolished BjV-induced hyperalgesia, suggesting that bradykinin may mediate the venom-induced hyperalgesia. However, this treatment did not modify the BjV-induced edema. It is important to stress that previous studies have shown that BjV-induced hyperalgesia is mediated, at least partially, by eicosanoids and PAF (TEIXEIRA et al.,1994). The data presented herein also suggest that distinct mechanisms may be involved in the development of hyperalgesia and edema induced by both venoms and myotoxin III.

O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus e seus componentes desencadeiam importantes efeitos biológicos que envolvem direta e/ou indiretamente, componentes do sistema circulatório. Contudo, não há estudos específicos na literatura sobre os efeitos do veneno crotálico ou de suas toxinas, em células endoteliais. As células endoteliais constituem a camada de revestimento interna dos vasos sanguíneos, denominada endotélio. Este tecido é metabolicamente ativo, com função protetora do sistema cardiovascular e desempenha papel central na regulação da função circulatória, através do controle da coagulação, permeabilidade e do tônus vascular. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt), do seu componente majoritário, a crotoxina (CTX) e de suas subunidades, fosfolipase A2 (CB) e crotapotina (CA), sobre células endoteliais, em cultura, quanto à: i) viabilidade e proliferação celular; ii) integridade das monocamadas; iii) produção de óxido nítrico, de prostaciclina e mecanismos envolvidos neste efeito. Os resultados obtidos demonstram que o veneno de Crotalus durissus terrificus afetou a viabilidade e a integridade de células endoteliais em cultura, de modo tempo-dependente e apenas na maior concentração, sugerindo sua baixa toxicidade sobre as células endoteliais. A subunidade CB, mas não a CTX nem a crotapotina, reproduziu os efeitos causados pelo VCdt. Em concentrações não citotóxicas, tanto o veneno quanto as toxinas não alteraram a proliferação celular nem a produção basal de óxido nítrico pelas células endoteliais. Por outro lado, o veneno e a subunidade CB, mas não a CTX nem a CA causaram aumento significativo da produção de prostaciclina, via COX-1 e COX-2, sendo que a expressão protéica da isoforma COX-2 foi induzida por estes agentes. Além disso, foi demonstrado que a fosfolipase citosólica é relevante para o aumento da produção de prostaciclina, induzido pela CB. Adicionalmente, foi demonstrado que a atividade catalítica da subunidade CB é essencial para os efeitos descritos. Isto reforça a sugestão de que a subunidade fosfolipásica, isoladamente, possa contribuir para os efeitos do veneno total no endotélio. Nesse sentido, se houver alguma fração desta enzima na sua forma livre, no veneno total, sugere-se que ela contribua, de modo significativo, para os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus no endotélio. / Crotalus durissus terrificus snake venom (CdtV) and their components induces systemic effects, which interfere with blood vessel system. Endothelial cells (EC) are central elements for haemostasis, regulating blood vessel-wall permeability, blood fluidity and adhesion properties of circulating leukocytes. However, there is no available data on the effects of this venom and its components on endothelial cells. In this study, the effects of CdtV, crotoxin (CTX) which is formed by two distinct subunits named crotapotin (CA) and phospholipase A2 (CB), on endothelial cells in vitro were investigated, analyzing EC viability and proliferation, EC monolayers integrity, release of both nitric oxide and prostacyclin (PGI2). CdtV, at the highest concentration, time-dependently decreased the viability of EC and the integrity of cell monolayers. The CB subunit, but not CTX nor CA, reproduced the effects caused by crude venom. In contrast, neither EC proliferation nor release of oxide nitric were affected by non-cytotoxic concentrations of CdtV or isolated toxins. However, at the same experimental condition, both CdtV and CB increased the prostacyclin release by endothelium through activation of COX-1 and -2 enzyme systems. Moreover, these toxins upregulated protein expression of COX-2 isoform, but did not alter constitutive expression of COX-1. On the other hand, neither CTX nor CA affected basal production of PGI2. Inhibition of cytosolic PLA2 (cPLA2) by AACOCF3 significantly reduced PGI2 increments caused by both CdtV and CB implying that cPLA2 cooperates for the synthesis of PGI2 induced by them. Inhibition of the catalytic activity of CB abrogated its ability to induce the release of PGI2, thus suggesting the importance of the phospholipase A2 enzyme activity for this effect. These findings provide evidence that CdtV and CB can directly activate EC and up-regulate cyclooxygenase pathways for production of prostacyclin, an important mediator of vasodilation and inflammation. Moreover, CB through its catalytic activity may significantly contribute for the stimulatory effect of CdtV in EC. Therefore, these findings indicate novel regulatory mechanisms for both CdtV and venom secretory PLA2 in endothelial cells.

A caracterização proteômica de venenos de serpentes contribui significativamente para o avanço das Ciências na área Biomédica. Várias destas moléculas, utilizadas como instrumentos de investigação de mecanismos celulares e moleculares, estão envolvidas em diversos processos fisiopatológicos e de intoxicação. No entanto, os venenos de serpentes ainda requerem caracterização funcional e/ou biológica adicionais. As fosfolipases A2s (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos, e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de intoxicação ocasionados por estas proteínas. Este trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica, enzimática, funcional e estrutural da primeira PLA2 Asp49 ácida, denominada Bpir-I-PLA2, isolada do veneno da serpente Bothrops pirajai, espécie endêmica da região Sul do Estado da Bahia e atualmente, integrante da Lista Nacional das Espécies da Fauna Brasileira Ameaçadas de Extinção. O isolamento da Bpir-I-PLA2 foi realizada através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de troca iônica, seguida de HPLC de fase reversa. Quanto submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida para proteínas ácidas, Bpir-I-PLA2 apresentou alto grau de homogeneidade. A massa molecular relativa, determinada através de eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, foi de aproximadamente 28.000 para a forma de dímero e 14.500 para o monômero. A focalização isoelétrica demonstrou uma única banda para a fosfolipase A2, revelando pI aproximado de 4,9. A região N-terminal de Bpir-I-PLA2, seqüenciada através do método de degradação de Edman, apresentou elevada homologia entre outras PLA2s de venenos de serpentes. A composição de amioácidos da proteína corroborou com sua característica ácida, apresentando um elevado conteúdo de aminoácidos carregados negativamente. A enzima apresentou elevada atividade fosfolipásica e induziu edema moderado in vivo. Além disso, Bpir-I-PLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária e a coagulação do plasma, e também induzir efeito hipotensor in vivo e citotóxico sobre células tumorais, bactérias, fungos e leishmanias. O tratamento da enzima com o reagente brometo de p-bromofenacila neutralizou as atividades enzimática, inibitória sobre a agregação plaquetária, anticoagulante, hipotensora e antitumoral. A moderada atividade edematogênica foi parcialmente inibida. O cDNA contendo 366 bp (BPIR-A) que codifica a proteína Bpir-I-PLA2 foi clonado e a proteína recombinante, expressa. Bpir-I-PLA2 recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, estrutura secundária, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa Bpir-I-PLA2, sugerindo que a recPLA2 foi eficientemente expressa e purificada. Devido à baixa toxicidade demonstrada, a Bpir-I-PLA2 pode tornar-se uma ferramenta importante nos estudos das desordens da coagulação, como também um potencial modelo para a elaboração de novos fármacos para uso na clínica-médica. / The proteomic characterization of snake venoms significantly contributes to science advance in the biomedical area. Several venom toxins are used as instruments for the investigation of cellular and molecular mechanisms, and are involved in a number of physiopathological and intoxication processes. Nevertheless, snake venoms still require further functional and/or biological characterization. Phospholipases A2 (PLA2s) are enzymes that induce several pharmacological effects and usually correspond to the major percentage of snake venom protein contents. Being so, the isolation and characterization of PLA2s could generate important information for the better understanding of the pharmacological and toxic effects caused by these proteins. This work describes the isolation and biochemical, enzymatic and functional characterization of the first acidic Asp49 PLA2 (named Bpir-I-PLA2) from the venom of Bothrops pirajai snake, an endemic species from the south region of state of Bahia and that nowadays is part of the national list of Brazilian fauna species threatened of extinction. The isolation of Bpir-I-PLA2 was carried out by two chromatographic steps, an ion-exchange chromatography followed by reverse phase HPLC. When submitted to polyacrylamide gel electrophoresis for acidic proteins, Bpir-I-PLA2 showed high homogeneity level. The relative molecular mass, determined by polyacrylamide gel electrophoresis with denaturating agent, was of approximately 28,000 for the dimmer and 14,500 for the monomer. With high phospholipase activity and pharmacological effects, characteristic of acidic isoforms, Bpir-I-PLA2 did not present myotoxic activity and showed to be little edematogenic. However, the enzyme acts inhibiting platelet aggregation, delaying plasma clotting time and inducing hypotension, antitumoral effects, antibacteria, antifungal and parasiticide actions. The treatment of the enzyme with the reagent p-bromofenacil brometo neutralized the enzymatic activities, inhibition of aggregation platelet, anticoagulant, hypotensive and antitumoral. The moderate activity edematogenic was inhibited partially. The cDNA (BPIR-A) that codes the protein Bpir-I-PLA2 was cloned and the protein recombinant, expressed. Bpir-I-PLA2 recombinant presented the same sequence of amino acids, structures secondary, phospholipase activity and inhibitory effects on platelet of the native protein, suggesting that recPLA2 was efficiently express and isolated. Due to its low toxicity, Bpir-I-PLA2 could become an important tool in the study of the disorders of the clotting as well as a potential model for the elaboration of new drugs for use in the clinic-doctor.

Neste estudo foram avaliados os efeitos da subunidade CB (FLA2 isolada do veneno da serpente C. d. terrificus) em células endoteliais quanto: 1) síntese de PGI2 e mecanismos e 2) mecanismos inibitórios sobre moléculas de adesão. Os resultados mostraram que a liberação de PGI2 induzida pela CB depende de COX-1, PGIS, cFLA2, ERK1/2, mas não de COX-2, NF-kB, p38, JNK, iFLA2, receptor IP, AC ou PKA. Em adição, a CB aumentou os níveis de PGIS, mas não de COX-1 ou COX-2. Ainda, a CB inibiu a expressão de ICAM-1 e VCAM-1, mas não de PECAM-1, induzidas pelo LPS. Em relação aos mecanismos da ação inibitória da CB, foi demonstrado que o PPAR-α e -β/δ, IP, AC, PKA e a PGI2 são relevantes para inibição de ICAM-1, mas não de VCAM-1, induzida pelo LPS. Além disso, a CB inibiu a expressão gênica de ICAM-1, VCAM-1, TNF-α e IL-6, induzida pelo LPS. Este estudo evidenciou importantes vias na ação inibitória da FLA2 crotálica, em um evento fundamental da resposta inflamatória e trouxe a melhor compreensão das atividades biológicas desencadeadas por esta FLA2 em células endoteliais. / In this study the effect of CB, a phospholipase A2 (PLA2) isolated from Crotalus durissus terrificus snake venom, in cultured endothelial cells was investigated, with focus on: i) biosynthesis of prostacyclin (PGI2) and related mechanisms, and ii) inhibitory mechanisms on expression of ICAM-1, VCAM-1 and PECAM-1 adhesion molecules. Results showed that COX-1, PGI2 synthase (PGIS), cPLA2, ERK1/2 and MEK1/2, but not COX-2, NF-kB, p38, JNK, iPLA2, IP receptor, cyclase adenylate nor PKA, are involved CB-induced PGI2 biosynthesis. In addition, CB up-regulated PGIS, but not COX-1 nor COX-2 protein levels. Moreover, CB was able to inhibit LPS-induced ICAM-1 and VCAM-1, but not PECAM-1 protein expression. PPAR-α and -β/δ, IP receptor, cyclase adenylate, PKA and PGI2, but not PPAR-γ, are essential for CB-induced inhibition of ICAM-1. Furthermore, CB inhibited LPS-induced gene expression of ICAM-1, VCAM-1, TNF-α and IL-6. Inhibition of these cytokines by CB may be related to down regulation of both VCAM-1 and ICAM-1 seen in endothelial cells incubated with this venom PLA2.

Uma linhagem celular de CHO, previamente modificada geneticamente pela introdução de cDNA da 2,6 sialiltransferase de rato, gerou, pela primeira vez, um hTSH recombinante com sialilação humanizada (hlsr-hTSH), mais similar ao hormônio nativo, com 61% de ligação de ácido siálico na conformação 2,3 e 39%, na conformação 2,6. O clone mais produtivo, quando submetido à amplificação gênica com 8 M de metotrexato, apresentou um nível de secreção de aproximadamente 2 g de hTSH/106 células/dia, nível este útil para a purificação e caracterização do produto. A massa molecular relativa do heterodímero e das subunidades e do hlsr-hTSH purificado, determinada por espectrometria de massa MALDI-TOF, e a hidrofobicidade relativa, determinada por RP-HPLC, não apresentaram diferenças significativas com relação às preparações de hTSH recombinante derivadas de células CHO sem a modificação devida ao gene da 2,6 sialiltransferase. Entretanto, algumas diferenças foram observadas na composição dos N-glicanos, com mais estruturas tri- e tetra-sialiladas no hlsr-hTSH. O hlsr-hTSH mostrou-se eqüipotente (p>0,05) à preparação comercial de r-hTSH (Thyrogen) e 1,5 vezes mais potente do que a preparação nativa de hTSH (p<0,001), quando analisado por um bioensaio in vivo baseado na capacidade do TSH de estimular a liberação de T4. / A CHO cell line, previously genetically modified by the introduction of rat 2,6-sialyltransferase cDNA, generated for the first time a human-like sialylated recombinant hTSH (hlsr-hTSH) more similar to the native hormone, with 61% of 2,3- and 39% of 2,6-linked sialic acid residues. The best clone, when submitted to gene amplification with up to 8 M methotrexate, presented a secretion level of ~2 g hTSH/106 cells/day, useful for product purification and characterization. The relative molecular masses (Mr) of the heterodimer and of the - and -subunits of purified hlsr-hTSH, determined by MALDI-TOF mass spectrometry, and the relative hydrophobicities, determined by RP-HPLC, were not remarkably different from those presented by two r-hTSH preparations secreted by normal CHO cells. Some differences were observed, though, in N-glycan composition, with more tri- and much more tetra-sialylated structures in hlsr-hTSH. When analyzed via an in vivo bioassay based on hTSH-induced T4 release in mice, hlsr-hTSH was shown to be equipotent (p > 0.05) with the commercial preparation of r-hTSH (Thyrogen), and 1.5-fold more potent than native hTSH (p < 0.001).

Notre travail a démontré l’implication du p-crésyl sulfate (PCS), de la zinc a2glycoprotéine (ZAG) et du triméthylamine-N-oxide (TMAO), représentants des 3 groupes de toxines urémiques décrits par le groupe EUTox, dans la survenue des complications métaboliques de la maladie rénale chronique (MRC). Nous avons démontré que l’augmentation du PCS induisait une insulino-résistance, une perte de masse grasse et une redistribution des lipides chez la souris, en montrant une altération de la voie de signalisation de l’insuline dans le muscle strié squelettique. Nous avons ensuite montré que la protéine ZAG était surexprimée par le tissu adipeux dans la MRC. Du fait de ses effets lipolytiques et anti-lipogeniques, l’élévation des concentrations tissulaires de cette adipokine pourrait être impliquée dans les phénomènes de dyslipidémies et dysfonction adipocytaire observés dans la MRC. Chez l’homme, notre étude a confirmé l’augmentation des concentrations de ZAG dans les stades 5 et 5D de la MRC uniquement, faiblement corrélée au débit de filtration glomérulaire (DFG). L’étude n’a en revanche pas permis de mettre en évidence de corrélation entre les taux circulants de ZAG et les critères de complications métaboliques, notamment la dénutrition. Enfin, en l’absence de données précises sur l’élimination rénale du TMAO et la physiopathologie de son augmentation dans la MRC, nous avons conduit une étude clinique mettant en évidence une forte corrélation entre les taux de TMAO et le DFG mesuré, excluant une contribution tubulaire à son excrétion. Les résultats d’une étude préliminaire chez l’animal suggèrent une possible implication du TMAO dans le développement de la fibrose rénale / Our work demonstrated the role of p-cresyl sulfate (PCS), zinc a2-glycoprotein (ZAG) and trimethylamine-N-oxide (TMAO) that belong to the 3 groups of uremic toxins described by the EUTox group, in the metabolic complications of chronic kidney disease (CKD). We demonstrated that the increase of PCS induced an insulin resistance, a loss of fat mass and a lipid redistribution in mice, showing an alteration of the insulin pathway in skeletal muscle. We showed a surexpression of ZAG by adipose tissue in CKD. Because of ZAG lipolytic and anti-lipogenic effects, the elevation of its tissu levels could be implicated in dyslipidemia and adipose dysfonction in CKD. In humans, our study confirmed the elevation of ZAG concentrations only in CKD stages 5 and 5D, with a poor correlation with the glomerular filtration rate (GFR). The study did not shown correlation between ZAG circulating levels and metabolic complications, as wasting. With the lack of data about renal elimination and physiopathology of TMAO, we conducted a clinical study that reported a strong correlation between TMAO levels and measured GFR, without proof of tubular excretion of TMAO. Results of a preliminary animal study suggests a possible implication of TMAO in the renal fibrosis

Os efeitos da MT-I, uma fosfolipase A2 isolada do veneno de Bothrops asper (VBa), foram avaliados em mastócitos (MC) em cultura, quanto à: i) desgranulação e liberação de prostaglandina E2 (PGE2); ii) papel da atividade catalítica na desgranulação; iii) papel da PLD, PLC, cPLA2, iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, G&alpha;i, G&alpha;q e do cálcio na desgranulação; iv) expressão gênica de citocinas Th1 e Th2, e v) alterações ultraestruturais em MC. Os resultados mostraram que a MT-I, em concentrações não citotóxicas, causou a desgranulação de MC. Este efeito foi parcialmente dependente da atividade catalítica e dependente da cPLA2, PLC, PLD e PI3K, mas não da iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, G&alpha;i e G&alpha;q. O cálcio intra e extracelular (CRAC e LTCC) estão envolvidos neste efeito da MT-I. Ainda, a MT-I induziu a síntese e liberação da PGE2, expressão de genes de citocinas Th1 e Th2, aumento do número de vesículas citoplasmáticas e de endocitose dependente de clatrina. O VBa também causou a desgranulação de MC sugerindo que a MT-I é relevante para este efeito. / The effects of Myotoxin-I (MT-I), a phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops asper venom (BaV) in cultured mast cells (MC) were evaluated focusing: i) degranulation and prostaglandin E2 (PGE2) release; ii) role of PLA2 catalytic activity in degranulation; iii) role of PLD and PLC, cPLA2 and iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, G&alpha;i and G&alpha;q protein and calcium in degranulation; iv) gene expression of Th1 and Th2 cytokines, and v) MC ultrastructural alterations. Results showed that MT-I, at non-cytotoxic concentrations, caused MC degranulation. This effect was partially dependent on its catalytic activity and dependent on cPLA2, PLC, PLD and PI3K, but not iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, G&alpha;i nor G&alpha;q. Both intra and extracellular calcium (CRAC and LTCC) are involved in MT-I-induced degranulation. Furthermore, MT-I induced synthesis and release of PGE2, gene expression of Th1 and Th2 cytokines, increased numbers of cytoplasmic vesicles and clathrin-dependent endocytosis. BaV also caused MC degranulation suggesting that MT-I is relevant for this effect.

Hialuronidases são responsáveis pela hidrólise de hialuronan, o principal componente da matriz intersticial. Estas enzimas são ubíquas nas peçonhas de serpentes, contudo suas concentrações e características podem variar entre as espécies. Embora estudos indiquem a presença de atividade hialuronidásica na peçonha de Crotalus durissus terrificus e a hialuronidase apresente importante papel no envenenamento local e sistêmico, a enzima ainda não havia sido estudada. Os objetivos deste trabalho focaram o isolamento e a caracterização funcional e estrutural da hialuronidase (CdtHya1) presente na peçonha de serpente Crotalus durissus terrificus. CdtHya1 foi purificada por cromatografia de troca iônica seguida de filtração molecular e interação hidrofóbica (recuperação proteica = 0,23%), consistindo no primeiro estudo de isolamento e caracterização de uma hialuronidase crotálica. Os 44 primeiros aminoácidos do seu N-terminal foram determinados por degradação de Edman e mostraram compartilhar um elevado grau de identidade sequencial com outras hialuronidases depositadas em bancos de dados. CdtHya1 é uma glicoproteína e apresentou atividade máxima a 37°C, pH 5,5 e na presença de NaCl 0,2 mol/L. Seu monômero de 64,5 kDa foi estimado por SDS-PAGE sob condições redutoras. A atividade específica da peçonha solúvel foi 145 unidades turbidimétricas reduzidas por miligrama (UTR/mg), contra 5.066 UTR/mg para CdtHya1. A enzima apresentou Kcat de 3.781,0 min-1 sobre hialuronan e em torno de 400 min-1 sobre os sulfatos de condroitina A, B e C, indicando maior atividade sobre hialuronan. Cátions divalentes (Ca2+ e Mg2+) e NaCl 1 mol/L reduzem significativamente a atividade enzimática. A enzima pura (32 UTR/40 ?L) diminuiu o edema provocado pela injeção subplantar de tampão, crotoxina ou fosfolipase A2 (PLA2), aumentando a difusão destes pelos tecidos dos camundongos. CdtHya1 potencializou a ação da crotoxina, como evidenciado pela morte de camundongos até o final do ensaio de edema de pata. A enzima nativa pura foi submetida a ensaios cristalográficos preliminares onde foram obtidos os primeiros cristais, constituindo assim um passo importante para a determinação da primeira estrutura tridimensional de hialuronidase de peçonha de serpente. Este estudo relata o procedimento de purificação da CdtHya1, a primeira hialuronidase isolada de peçonhas crotálicas com alta atividade antiedematogênica. / Hyaluronidases are responsible for hyaluronan hydrolysis, the major component of the interstitial matrix. These enzymes are ubiquitous in snake venoms, however their concentrations and characteristics may vary between species. Although studies indicate the presence of hyaluronidase activity in the Crotalus durissus terrificus venom and hyaluronidase presents important role in local and systemic envenoming, the enzyme has not been studied yet. The objectives of this study focused on the isolation and functional and structural characterization of hyaluronidase (CdtHya1) presents in Crotalus durissus terrificus snake venom. CdtHya1 was purified by ion exchange chromatography followed by molecular filtration and hydrophobic interaction (protein recovery = 0.23%), consisting in the first study on the isolation and characterization of a crotalic hyaluronidase. Its first 44 N-terminal amino acids were determined by Edman degradation and showed to share a high level of sequence identity against other hyaluronidases deposited in data banks. CdtHya1 is a glycoprotein and it showed maximum activity at 37 °C, pH 5.5 and in the presence of 0.2 mol/L NaCl. Its monomer of 64.5 kDa was estimated by SDS-PAGE under reducing conditions. The soluble venom specific activity was 145 turbidity reducing units per milligram (TRU/mg), against 5,066 TRU/mg for CdtHya1. The enzyme showed Kcat of 3,781.0 min-1 on hyaluronan and about 400 min-1 on chondroitin sulphates A, B or C, indicating higher activity on hyaluronan. Divalent cations (Ca2+ and Mg2+) and 1 mol/L NaCl significantly reduce the enzyme activity.The pure enzyme (32 TRU/40 ?L) decreased the edema caused by subplantar injections of buffer, crotoxin or phospholipase A2 (PLA2), increasing their diffusion through mice tissues. CdtHya1 potentiated crotoxin action, as evidenced by mice death by the end of the paw edema assay. The pure native enzyme was subjected to preliminary crystallographic studies where the first crystals were obtained, thus providing an important step in determining the first three-dimensional structure of hyaluronidase snake venom. This study reports the purification procedure of CdtHya1, the first hyaluronidase isolated from crotalic venoms with high antiedematogenic activity.

Fosfolipases A2 (PLA2s) são enzimas abundantes em peçonhas de serpentes do gênero Bothrops, possuindo uma grande variedade de efeitos farmacológicos e/ou tóxicos, como miotóxico, causador de necrose muscular. Em busca de novos fármacos de interesse médico e científico, os inibidores de fosfolipases A2 (PLIs) tornaram-se importantes alvos de pesquisa nos últimos anos. Tendo isto em vista, o presente trabalho teve como objetivo a caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de fosfolipase A2 miotóxica do tipo alfa (?BaltMIP) de B. alternatus em sua forma recombinante. Para os estudos de neutralização funcional foram utilizadas as toxinas da peçonha de Bothrops jararacussu: Lys49 PLA2-símile BthTX-I e a Asp49 PLA2 BthTX-II. O processo de purificação das toxinas de B. jararacussu consistiu em dois passos cromatográficos: exclusão molecular seguida de troca iônica, sendo o grau de pureza avaliado por HPLC. A expressão heteróloga do inibidor recombinante ?-BaltMIP foi induzida em leveduras Pichia pastoris. O inibidor purificado, denominado rBaltMIP, apresentou-se como uma proteína pura com pI de 5,8, massa molecular de ~21 kDa por SDS-PAGE e 19,5 kDa por MALDI/TOF MS e com conteúdo de carboidratos de 10%. Após o sequenciamento dos peptídeos trípticos obtidos, os resultados foram comparados com outros ?PLIs depositados em bancos de dados, observando-se 100% de identidade entre o rBaltMIP e o seu inibidor nativo ?BaltMIP, e de 92 a 96% com os demais inibidores analisados. Para as toxinas BthTX-I e BthTX-II, as concentrações efetivas (CE50) para as atividades miotóxicas medidas através dos níveis plasmáticos de CK foram de 0,1256 ?g/?L e de 0,6183 ?g/?L, respectivamente, e quando incubadas com o rBaltMIP houve neutralização de até 65% da miotoxicidade induzida por estas enzimas. Já nos ensaios de formação de edema de pata, foram obtidas as CE50 de 0,02581 ?g/?L e 0,02810 ?g/?L, respectivamente, com neutralização do edema pelo rBaltMIP de até 40%, mostrando-se um inibidor viável para complementar a soroterapia antiofídica sem, no entanto, ser imunogênico. Reforçando esta hipótese, experimentos de neutralização da miotoxicidade feitos com a miotoxina BthTX-I mostraram que o rBaltMIP foi mais eficiente em inibir os danos musculares que o próprio soro antiofídico quando usado isoladamente. Assim, devido a gravidade dos envenenamentos e a baixa neutralização de seus efeitos locais, como a miotoxicidade, pelo soro antiofídico usado atualmente, o estudo do rBaltMIP como inibidor de PLA2s do grupo II de serpentes torna-se promissor devido às suas possíveis aplicações clínicas, podendo neutralizar com maior rapidez, eficiência e especificidade as ações tóxicas de peçonhas ofídicas. / Phospholipases A2 are abundant enzymes present in Bothrops venoms which have a wide variety of pharmacological and/or toxic effects, such as myotoxicity, related to muscle necrosis. In search for new drugs of medical and scientific interest, the phospholipase A2 inhibitors (PLls) have become important targets in recent years. Considering this, the present study aimed at the biochemical and functional characterization of an alpha type phospholipase A2 inhibitor (?-BaltMIP) from B. alternatus in its recombinant form. For the functional neutralization studies, toxins from Bothrops jararacussu venom were used: Lys49 PLA2-like BthTX-I and Asp49 PLA2 BthTX-II. The process of purification of B. jararacussu toxins consisted of two chromatographic steps: molecular exclusion followed by ion exchange, evaluating their purity by HPLC. The heterologous expression of the recombinant ?BaltMIP inhibitor was induced in Pichia pastoris yeast. The purified inhibitor, called rBaltMIP, presented itself as a pure protein with pI of 5.8, molecular mass of ~21 kDa by SDS-PAGE and 19.5 kDa by MALDI/TOF MS, with 10% carbohydrate content. After tryptic peptides sequencing, the results were compared with other ?PLIs deposited in databases, observing a 100% identity between rBaltMIP and its native inhibitor ?BaltMIP, and from 92 to 96% identity with the other analyzed inhibitors. Toxins BthTX-I and BthTX-II showed effective concentrations (EC50) for myotoxic activities measured via plasma CK levels of 0.1256 ?g/?L and 0.6183 ?g/?L, respectively, and incubation with rBaltMIP indicated neutralization of up to 65% of myotoxicity. In paw edema formation assays, EC50 of 0.02581 ?g/?L and 0.02810 ?g/?L, respectively, were observed, with edema neutralizations of up to 40% by rBaltMIP, showing viability to complement antivenoms without, however, being immunogenic. Reinforcing this hypothesis, myotoxicity neutralization experiments performed with the myotoxin BthTX-I showed that rBaltMIP was more effective in inhibiting muscle damage than the actual antivenom by itself. Thus, considering the severity of envenomations and the low neutralization of their local effects, such as myotoxicity, by the antivenoms currently used, the study of rBaltMIP as a PLA2 inhibitor becomes promising due to its possible clinical applications, neutralizing quickly and with more efficiency and specificity the toxic actions of venoms

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Os venenos de serpentes contem substÃncias biologicamente ativas, primariamente consistindo de proteÃnas (90-95%). Algumas delas apresentam atividade enzimÃtica como as fosfolipases A2 e L-aminoÃcido oxidase. O presente estudo verificou a aÃÃo dos venenos de Bothrops leucurus (BleuVT) e Bothrops marajoensis (BmarVT), e suas fraÃÃes PLA2 (BleuPLA2 e BmarPLA2) e LAAO (BleuLAAO e BmarLAAO) sobre cepas de bactÃria, C. albicans, Leishmania sp e T. cruzi, bem com sua toxicidade sobre macrÃfagos murinos. A susceptibilidade das cepas bacterianas e fÃngica foi analisada atravÃs do mÃtodo de difusÃo em Ãgar, para determinaÃÃo do potencial antimicrobiano; e microdiluiÃÃo em caldo, para determinaÃÃo da CIM e CLM, com modificaÃÃes. A atividade antiparasitÃria foi avaliada atravÃs do tratamento das culturas de parasitos com diferentes concentraÃÃes dos venenos ou de suas fraÃÃes. As formas promastigotas de Leishmania sp. foram cultivadas, durante 72h, em meio NNN/Schneider a 28ÂC; e as formas epimastigotas de T. cruzi foram cultivadas em meio LIT, durante 5 dias, a 28ÂC. Os macrÃfagos foram cultivados em meio RPMI 1640, em presenÃa de diferentes concentraÃÃes dos venenos e fraÃÃes, durante 24h, e submetidos ao ensaio com MTT. Os resultados foram estatisticamente analisados atravÃs do teste t ou ANOVA seguida do teste Bonferroni, quando apropriado, com p<0.05. A BmarLAAO foi capaz de inibir o crescimento bacteriano do Gram-negativo P. aeruginosa, da levedura C. albicans e do Gram-positivo S. aureus; e o BleuTV inibiu o crescimento de S. aureus, sendo a inibiÃÃo dose-dependente. A ordem de susceptibilidade dos microorganismos testados com BmarLAAO foi S. aureus > C. albicans > P. aeruginosa. Por outro lado o BmarTV, BmarPLA2, BleuPLA2 e BleuLAAO nÃo apresentaram nenhum grau de inibiÃÃo sobre as cepas em estudo. O potencial inibitÃrio foi mais significante sobre S. aureus apresentando CIM= 50Âg/mL e CLM=200Âg/mL para BmarLAAO, e CIM=CLM=25Âg/mL para BleuTV. Em concentraÃÃes maiores que 1.56Âg/mL a BmarLAAO foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. chagasi e L.amazonensis, sendo os valores de IC50, apÃs 72h de cultivo, para L. amazonenis, 2.55Âg/mL e 2.86 Âg/mL para L. chagasi. BmarTV e BleuTV tambÃm apresentaram significante inibiÃÃo sobre o crescimento parasitÃrio, sendo os valores de IC50 86.56 Âg/mL para L. amazonensis e 79.02Âg/mL para L. chagasi, quando tratado com BmarTV; e 5.49Âg/mL para L. amazonensis e 1.94Âg/mL para L. chagasi, quando tratado com BleuTV. Os venenos e BmarLAAO mostraram efeito inibitÃrio sobre formas epimastigotas de T. cruzi. Os valores de IC50 para BleuTV, BmarTV e BmarLAAO foram, respectivamente, 1.14Âg/mL, 24.19Âg/mL e 0.89Âg/mL. As fraÃÃes BmarPLA2, BleuPLA2 e BleuLAAO nÃo foram capazes de promover nenhum efeito inibitÃrio sobre os parasitos em estudo. O BmarLAAO , BmarTV e BleuTV apresentaram baixa toxicidade sobre macrÃfagos nas concentraÃÃes estudadas. Em conclusÃo, os veneno de B. leucurus e de B. marajoensis, bem como a L-aminoÃcido oxidase de Bothrops marajoensis mostraram ser capazes de interferir no crescimento de diferentes microorganismos como S.aureus, C. albicans, P. aeruginosa, Leishmania sp. e T. cruzi. / Snakes venoms contain biologically active substances primarily consisting of proteins (90-95%). Some of these present enzymatic activities, such as phospholipases A2 and the L-amino acid oxidases. In this study we verify the action of Bothrops leucurus (BleuTV) and Bothrops marajoensis (BmarTV) venoms, and fractions PLA2 (BleuPLA2 and BmarPLA2) and LAAO (BleuLAAO and BmarLAAO) on strains of bacteria, yeast, Leishmania sp and T. cruzi. The susceptibility of bacterial and yeast strains was analyzed through disc-diffusion assay, for determination of antimicrobial potential; and the microdilution method, for determination of MIC and MLC, with modifications. The antiparasitic activity was evaluated through of the culture treatment of parasites with different concentrations of venoms or their fractions. The forms promastigotes of Leishmania sp. had been cultived, during 72h, in NNN/Schneider media, 28ÂC; and the forms epimastigotes of T. cruzi had been cultived in LIT media, during 5d, 28ÂC. The macrophages were cultured in RPMI 1640 media, during 24h, 37ÂC and 5% of CO2, with different concentrations of venoms or fractions. After, they were analyzed by MTT method. The results was statistically analyzed with t test or ANOVA followed the Bonferroniâs test, when appropriated, with p<0.05. The BmarLAAO was able to inhibit the growth of gram negative P. aeruginosa, of yeast C. albicans and of gram positive S. aureus; and the BleuTV inhibited the growth of S. aureus, being the inhibitions dose-dependent. The order of susceptibility of microorganisms tested against BmarLAAO was S. aureus > C. albicans > P. aeruginosa. On the other hand the BmarTV, BmarPLA2, BleuPLA2 and BleuLAAO had not provided any degree of inhibition on strains in study. The inhibitory effect was more significant on S. aureus presenting CIM= 50Âg/mL and CLM=200Âg/mL for BmarLAAO, and CIM=CLM=25Âg/mL for the BleuTV. In concentrations greater than 1.56Âg/mL BmarLAAO was able to inhibit the growth of promastigotes forms of L. chagasi and L.amazonensis, after 72h of culture. The IC50 values were 2.55Âg/mL for L. amazonenis, and 2.86 Âg/mL for L. chagasi. BmarTV and BleuTV also provided significant inhibition of the parasitic growth, with an IC50 value of 86.56 Âg/mL for L. amazonensis and 79.02 Âg/mL for L. chagasi, when treated with BmarTV; and 5.49Âg/mL for L. amazonensis and 1.94Âg/mL for L. chagasi, when treated with BleuTV. The venoms and BmarLAAO showed inhibitory effect on epimastigotes forms of T. cruzi. The IC50 value for BleuTV, BmarTV and BmarLAAO where, respectively 1.14Âg/mL, 24.19Âg/mL and 0.89Âg/mL.This effects presented behavior dose-dependent. The fractions BmarPLA2, BleuPLA2 and BleuLAAO had not been capable to promote any inhibition on the growth of these parasites. The BmarLAAO, BmarTV and BleuTV presented low toxicity in studied concentrations. In conclusion, the whole venoms as well as the L-amino acid oxidase from Bothrops marajoensis showed to be capable to interfere in the growth of several microorganisms as S.aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Leishmania sp. and T. cruzi.