Polifosfato inorgânico (PPi) é um polímero linear formado por diversas moléculas de ortofosfato (Pi) unidas por ligações fosfoanidridas de alta energia. Bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa acumulam grandes quantidades de PPi. Moléculas de Pi são captadas do meio através de dois sistemas de transporte. O principal deles é o sistema Pst, que possui alta afinidade por seu substrato. Pst é codificado por um operon de mesmo nome, formado por cinco genes. Os quatro primeiro genes codificam para as proteínas envolvidas no transporte de Pi, sendo que o último gene do operon, phoU, codifica para uma proteína cuja exata função é desconhecida. Com o objetivo de elucidar o papel deste gene e avaliar a sua relação com o acúmulo de PPi, foi construída uma mutação phoU na cepa PA14 de P. aeruginosa. O mutante não só apresentou uma maior capacidade de acumular PPi mas também se mostrou mais sensível a estresses ambientais e a antibióticos. Os resultados obtidos indicam que o gene phoU possui uma função regulatória sobre o acúmulo de PPi. O mutante phoU também apresentou níveis mais altos da molécula de alarme guanosina tetrafosfato (ppGpp). Foi proposto um modelo que explica a relação entre o gene phoU, o acúmulo de polifosfato e ppGpp. O mutante phoU foi também cultivado em cultura contínua em um quimiostato limitado em Pi por 13 dias. Diversos ensaios fenotípicos foram realizados com bactérias isoladas do quimiostato. Estes apresentaram algumas características fisiológicas distintas da cepa ancestral. / Inorganic polyphosphate (PPi) is a linear polymer composed of several molecules of orthophosphate (Pi) linked by energy-rich phosphoanhydride bonds. Bacteria of the species Pseudomonas aeruginosa accumulate large amounts of PPi. Pi molecules are captured via two trasport systems. The main one is the Pst system, which has high affinity for its substrate. Pst is encoded by an operon of the same name, consisting of five gene. The first four genes encode proteins involved in the transport of Pi and the last gene of the operon, phoU, encodes a protein whose exact function is unknown. To elucidate the role of phoU and its relation to PPi accumulation, a phoU mutant was constructed in strain PA14 of P. aeruginosa. The mutant accumulated high levels of PPi but was more sensitive to environmental stresses and antibiotics. The results indicate that phoU plays a regulatory role in the accumulation of PPi. The phoU mutant also displays high levels of the alarmone guanosine tetraphosphate (ppGpp). A model that explains the relation between phoU, ppGpp and polyphosphate accumulation is proposed. The phoU mutant was grown under steady-state conditions in a chemostat limited Pi for 13 days. Phenotypic assays performed with the bacteria isolated from the chemostat showed they acquired some distinct physiological characteristics.

Apesar dos diversos estudos sobre a presença de cianobactérias e a correlação entre fatores ambientais que influenciam ou desencadeiam florações, é ainda incipiente a informação sobre o controle fisiológico e bioquímico da produção de metabólitos secundários, cianotoxinas e compostos orgânicos voláteis (COVs) nestes organismos. Os COVs mais comumente encontrados em cianobactérias são a geosmina e o 2- metil-isoborneol, compostos que resistem ao tratamento convencional da água, causam mau cheiro e alteram seu gosto, além de bioacumular em peixes e moluscos. Estudos sobre possíveis sistemas de competição (alelopatia) entre linhagens de cianobactérias, ou entre elas e outros organismos, podem contribuir para elucidação do papel da produção de COVs por cianobactérias. Dessa forma, os objetivos deste projeto foram (i) prospectar a produção de COVs e seus efeitos na auto-regulação fisiológica em cianobactérias mantidas em laboratório; e (ii) desenvolver um método analítico, por microextração em fase sólida (SPME) e cromatografia em fase gasosa com detecção por espectrometria de massas (GC-MS), para a determinação destes compostos. Foram realizados ensaios para avaliar os perfis de produção dos COVs em duas linhagens de M. aeruginosa em diferentes fases de crescimento, sob diferentes intensidades luminosas (50, 150 e 250 ?µmol.fótons.m-2.s-1) e também ao longo do ritmo circadiano, avaliando a influência dos períodos claro e escuro. Para avaliar efeitos alelopáticos, exsudatos de uma linhagem de M. aeruginosa produtora de microcistinas foram testados em culturas de outra linhagem de M. aeruginosa não produtora de toxinas por meio de técnicas tradicionais de cultivo com monitoramento do crescimento. Na análise da produção de COVs, por GC-MS, observou-se que se destacam, majoritariamente, os compostos α-ciclocitral, &#946-ciclocitral e β-ionona, sendo o β-ciclocitral o mais abundante, em todas as condições testadas, para as ambas as linhagens estudadas. A linhagem não toxigênica, no entanto, apresentou produção mais elevada de todos os compostos identificados. Dentre as intensidades luminosas testadas, a intensidade de 250 µmol.fótons.m-2s-1 foi a que apresentou a maior taxa de crescimento para a linhagem LTPNA 08 e relação negativa entre o aumento da irradiância e a produção de β-ciclocitral. Foram identificadas, também, variações na produção dos compostos α-ciclocitral, β-ciclocitral e β-ionona nas linhagens ao longo do ritmo circadiano, sendo as maiores concentrações encontradas no período escuro. Observou-se morte celular e redução na produção de COVs 24 horas após adição de exsudatos pertencentes à linhagem de M. aeruginosa toxigênica em cultivos da linhagem não-toxigênica. Sendo assim, pode-se inferir que a produção dos COVs pode sofrer alterações qualitativas e quantitativas dependendo do estímulo ambiental presente, tanto por interações bióticas (com outros organismos e ritmo circadiano), quanto por fatores abióticos (intensidade luminosa). / There are several studies on the presence of cyanobacteria and the correlation between environmental factors that may influence or trigger blooms. However, information concerning the physiological and biochemical control of the production of secondary metabolites, toxins and volatile organic compounds (VOC) by cyanobacteria is poorly understood. Geosmin and 2-methyl-isoborneolare are commonly found VOC in cyanobacteria, they resist to conventional water treatment and can cause bad smell and taste in the final water. In addition, VOC can bioaccumulate in fish and shellfish. Studies on possible competition systems (allelopathy) either among strains of cyanobacteria or among them and other organisms such as green microalgae, may help to elucidate the role of VOC production by cyanobacteria. Thus, the main objectives of this study are: (i) prospect the production of VOCs and their effects on physiological self-regulation in cyanocrobacteria kept in the laboratory; and (ii) to develop an analytical method, by solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography with mass spectrometry detection (GC-MS), for the determination of these compounds. The assays were carried out to evaluate the production profiles of VOCs in two strains of M. aeruginosa at different growth stages under different light intensities (50, 150 and 250 µmol.fótons.m-2.s-1) and also along of the circadian rhythm, evaluating the influence of light and dark periods. To assess allelopathic effects, exudates from a microcystin-producing strain of M. aeruginosa were tested on cultures of another non-toxin producing M. aeruginosa strain by traditional growth monitoring culture techniques. In the analysis of VOC production by GC-MS, it was observed that α-cyclocyclal, β-cyclocyclal and β-ionone compounds were the most prominent, with β-cyclocitral being the most abundant in all conditions tested, for both strains studied. The non-toxigenic lineage, however, showed higher production of all the identified compounds. Among the light intensities tested, the intensity of 250 µmol.fótons.m-2s-1 was the one with the highest growth rate and positive relation between the irradiance increase and the β-cyclocitral production. Variations in the production of the α-cyclocyclal, β-cyclocyclal and β-ionone compounds were also identified in the lines along the circadian rhythm, being the highest concentrations found in the dark period. Cell death and reduction in VOC production were observed 24 hours after addition of exudates belonging to the toxigenic M. aeruginosa lineage in cultures of the non-toxigenic lineage. Thus, it can be inferred that the production of VOCs can undergo qualitative and quantitative changes depending on the environmental stimulus present, both by biotic interactions (with other organisms and circadian rhythm) and by abiotic factors (luminous intensity).

Au cours de ma thèse je me suis intéressée aux relations hôte-pathogène entre Drosophila melanogaster et Pseudomonas aeruginosa PA14. RhlR, un facteur de transcription bactérien permet à la bactérie d’échapper à la phagocytose. Mon projet de thèse consistait à identifier comment RhlR exerce cette fonction. Mes résultats suggèrent que RhlR exercerait également une fonction indépendante du quorum sensing. Un crible de mutants PA14 nous a permis d’isoler trois gènes importants pour la virulence de la bactérie et possiblement reliés à RhlR: xcpR, vfR et sltB1. L’utilisation de mutants de drosophile tep4, m’a permis de montrer que le rôle d’échappement à la phagocytose se ferait au niveau de la détection de la bactérie. Par ailleurs, mes résultats suggèrent aussi l’intervention d’un composé volatil qui permettrait de synchroniser la virulence de la bactérie. Dans une dernière partie, j’ai étudié les effets d’une co-infection entre un virus entérique et PA14. / During my PhD, I studied the host-pathogen interactions between Drosophila melanogaster and Pseudomonas aeruginosa PA14. We previously identified RhlR as a bacterial transcription factor that allows the bacteria to circumvent phagocytosis. My main PhD project was to study and identify how RhlR exerts this function. My first results suggested that RhlR plays also a role independently its the quorum sensing. A screen of PA14 mutants allowed me to identify three genes involved in PA14 virulence and possibility in RhlR function: xcpR, vfR and sltB1. By using tep4 fly mutants, I have shown that RhlR’s role against phagocytosis is most likely required at the level of PA14 detection. Beside this, my results indicated that possibly a volatile compound is involved to synchronize PA14 virulence. In the last part, I studied the effects of a co-infection between an enteric virus and PA14.

Objetivo: Diversas estratégias de erradicação da Pseudomonas aeruginosa (Pa) em pacientes com fibrose cística (FC) têm sido propostas, mas poucas realizaram o tratamento em fases e incluíram crianças na primeira colonização por Pa na vida. O objetivo desse estudo é descrever a efetividade do protocolo de erradicação em fases, em crianças brasileiras com FC no primeiro aparecimento de Pa. Métodos: Estudo de vida real, retrospectivo, que avaliou os prontuários dos pacientes pediátricos submetidos ao protocolo de erradicação em um período de 8,5 anos. O protocolo de 3 fases era guiado pela cultura de via aérea, e utilizou colistimetato nebulizado e ciprofloxacino oral. Foram avaliadas as taxas de sucesso após cada fase e a acumulada. Resultados: 47 episódios de colonização por Pa foram elegíveis à erradicação. A fase 1 do protocolo foi aplicada em 29 pacientes (mediana 2,7 anos, 59% masculino, 65% com no mínimo um alelo F508del), a fase 2 em 12 e a fase 3 em 6 pacientes. A taxa de sucesso foi de 58,6% (IC 95%: 40,7 a 74,5), 50,0% (IC 95%: 25,4 a 74,6) e 66,7% (IC 95%:30,0 a 90,3), após as fases 1, 2 e 3 respectivamente. A taxa de sucesso acumulado foi de 93,1% (IC: 78,0 a 98,1). Apenas 2 pacientes tiveram falha do tratamento de erradicação. Conclusão: O primeiro aparecimento da Pa ocorreu em crianças de baixa idade. O protocolo de erradicação em fases foi efetivo com alta taxa de sucesso / Background: Although several Pseudomonas aeruginosa (Pa) eradication strategies have been proposed for Cystic Fibrosis (CF) patients, only a few have used a stepwise treatment and enrolled children in their first-onset Pa colonization. The purpose of this study is to describe the effectiveness of a multistep eradication protocol in CF Brazilian children in their first-onset Pa. Methods: This was a real life retrospective study that evaluated medical records of pediatric patients who underwent the eradication protocol in a timeframe of 8.5 years. The 3-step protocol was guided by airway culture, using inhaled colistimethate and oral ciprofloxacin. The success rate after each step, and also the cumulative success rate were evaluated. Results: During the study period, 47 Pa colonization episodes were eligible to eradication. All the 29 patients underwent protocol\'s step 1 (median 2.7 years old, 59% male, 65% with at least one F508del allele), twelve patients step 2, and six patients step 3. Success rate was 58.6% (CI 95%: 40.7 to 74.5), 50.0% (CI 95%: 25.4 to 74.6) and 66.7% (CI 95%:30.0 to 90.3), after step 1, 2 and 3 respectively. Cumulative success rate was 93.1% (CI: 78.0 to 98.1). Failure of the eradication protocol occurred in only 2 patients. Conclusion: First-onset Pa colonization occurred in very young children. The stepwise eradication protocol was effective with a high success rate

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MARCIANO DE SOUSA NOBREGA.pdf: 616658 bytes, checksum: 0673ba9db2600506e22ee2169eef0af7 (MD5) Previous issue date: 2012-05-14 / The increase in bacterial resistance occurs in all regions of the world, especially in critically ill patients hospitalized in intensive care units (ICUs) and that make use of several antimicrobials. Bacterial resistance complicates therapy prolongs the ICU stay and increased morbidity and mortality. Among the microorganisms that cause infections in ICUs, we highlight P. aeruginosa and A. baumannii, gram-negative high incidence of nosocomial infections and have shown a tendency to increased antimicrobial resistance. OBJECTIVE: To evaluate microbial and bacterial resistance in adult intensive care agents P. aeruginosa and A. baumannii. MATERIALS AND METHODS: Retrospective study from January 2007 to December 2010 on the sensitivity and P. aeruginosa and A. baumannii in adult ICU patients (medical and surgical) of HC / UFG, with a diagnosis of hospital infection. We analyzed the evolution of resistance, antimicrobial consumption, mortality, topography of infections and length of stay in the units. 121 cases have been cataloged. RESULTS: The mean age of patients was 51.2 ± 17.9 years, male 45.45% and 55.55% female, mean ICU stay was 26.99 days, compared with 6.22 days of the general population unit. The mortality rate was 37.19% compared to a rate of 27.17% of the population. The primary site of infection was the respiratory tract with 41.3% followed by infection of the bloodstream with 27.27%. The initial average of bacterial resistance related of P. aeruginosa was close to 50% and A. baumannii was greater than 80%, with no significant modifications to the P. aeruginosa in this period. There was a significant increase in resistance to A. baumannii to amikacin. Consumption of antimicrobial agents showed an increase of antimicrobials amikacin, imipenem and piperacillin-tazobactam in cases of infection by P. aeruginosa infections and imipenem in A. baumannii. No correlation was found between bacterial resistance and antimicrobial consumption. CONCLUSION: Mortality and length of stay were higher in the study group. The bloodstream and respiratory tract were the main sites of infection by A. baumannii and P. aeruginosa multiresistant. The susceptibility profile revealed that P. aeruginosa and A. baumannii are highly resistant to antimicrobials. There were no significant changes in the evolution of antimicrobial resistance to the antibiotics tested, except for amikacin used in infections caused by A. baumannii. The consumption of antimicrobials showed increased consumption of amikacin, imipenem and piperacillin-tazobactam in patients infected with P. aeruginosa and to A. baumannii increased consumption was only to imipenem. The relationship between consumption of antimicrobials and increased bacterial resistance was not identified. / O aumento da resistência bacteriana ocorre em todas as regiões do mundo, principalmente em pacientes graves, internados em unidades de terapia intensiva (UTIs) e que fazem uso de vários antimicrobianos. A resistência bacteriana dificulta a terapia, prolonga a permanência nas UTIs e aumenta a morbimortalidade. Dentre os microrganismos causadores de infecções em UTIs, destacam-se P. aeruginosa e A. baumannii, gram-negativos de alta incidência em infecções hospitalares e que vêm apresentando aumento da resistência aos antimicrobianos. OBJETIVO: Avaliar os aspectos microbiológicos e a resistência bacteriana em UTIs dos agentes P. aeruginosa e A. baumannii. MATERIAL E MÉTODOS: Estudo retrospectivo, de janeiro de 2007 a dezembro de 2010, sobre o perfil de sensibilidade e P. aeruginosa e de A. baumannii em pacientes de UTIs adulto (clínica e cirúrgica) do HC/UFG, com diagnóstico de infecção hospitalar. Analisou-se a evolução da resistência, consumo de antimicrobianos, mortalidade, topografia das infecções e tempo de permanência nas unidades. Foram catalogados 121 casos. RESULTADOS: A média de idade dos pacientes foi 51,2±17,9 anos, sendo 45,45% do sexo masculino e 55,55% do sexo feminino; a média de permanência na UTI foi de 27 dias, comparado com 6,22 dias da população geral da unidade. A taxa de mortalidade foi de 37,19% ante uma taxa de 27,17% da população geral. O principal local de infecção foi a via respiratória com 41,3% seguido pela infecção de corrente sanguínea com 27,27%. A taxa média inicial de resistência bacteriana da P. aeruginosa foi próxima de 50% e A. baumannii foi superior a 80%, não se observando modificações para a P. aeruginosa nesse período. Houve um aumento significativo na resistência para o A. baumannii para amicacina. O consumo de antimicrobianos apresentou aumento dos antimicrobianos amicacina, imipenem e piperacilina-tazobactam nos casos de infecção por P. aeruginosa e imipenem nas infecções por A. baumannii. Não foi encontrada correlação entre a resistência bacteriana e o consumo de antimicrobianos. CONCLUSÃO: A mortalidade e o tempo de permanência foram maiores no grupo em estudo. A corrente sanguínea e o trato respiratório foram os principais sítios de infecção por A. baumannii e P. aeruginosa multirresistentes. O perfil de susceptibilidade revelou que P. aeruginosa e A. baumannii são altamente resistentes aos antimicrobianos testados. Não houve mudanças significativas na evolução da resistência aos antimicrobianos para os antibióticos testados, exceto para a amicacina usada nas infecções por A. baumannii. O consumo de antimicrobianos aumentou para amicacina, imipenem e piperacilina-tazobactam, nos pacientes com infecção por P. aeruginosa e, para A. baumannii o aumento do consumo foi apenas para o imipenem. A relação entre o consumo de antimicrobianos e o aumento da resistência bacteriana não foi identificada.

Pseudomonas aeruginosa é uma proteobactéria do grupo gama muito versátil, capaz de colonizar ambientes variados e infectar hospedeiros filogeneticamente distintos, incluindo humanos imunocomprometidos. Os fatores sigma de função extracitoplasmática (ECF) são membros de sistemas de sinalização de superfície celular (CSS), abundantes em P. aeruginosa. Vinte genes codificando fatores sigma ECF estão presentes nos genomas sequenciados de P. aeruginosa, a maioria fazendo parte de sistemas TonB relacionados à captação de ferro. Neste trabalho, seis fatores sigma pobremente caracterizados foram superexpressos na linhagem PA14 a partir de um promotor induzível por arabinose para investigar seu papel na expressão dos sistemas de dois componentes PvrSR e RcsCB, que atuam na regulação da fímbria CupD, além de sua influência no crescimento de culturas de P. aeruginosa. Não foi observado efeito positivo de nenhum dos fatores sigma testados na expressão dos sistemas de dois componentes e a superexpressão de cinco deles tampouco levou a qualquer alteração no crescimento, porém a produção de piocianina foi alterada na superexpressão de PA14_55550 e a superexpressão de PA14_26600 e PA14_46810 levou a um discreto aumento no início da formação de biofilme em PA14. Por outro lado, culturas superexpressando σx (ALB04) apresentaram um perfil alterado de lipopolissacarídeo e uma curva de crescimento bifásica, alcançando precocemente uma fase estacionária seguida de uma recuperação do crescimento até uma segunda fase estacionária. Durante a primeira fase estacionária, a maior parte das células aumenta de tamanho e morre, mas as células remanescentes retornam à morfologia selvagem e seguem para a segunda fase de crescimento exponencial. Isso não acontece devido a mutações compensatórias, uma vez que células coletadas de pontos tardios da curva e diluídas em meio novo repetem este comportamento. Apesar de trabalhos com a linhagem PAO1 associarem σx à transcrição de oprF, que codifica a principal porina não específica de Pseudomonas, nas condições dos nossos ensaios em PA14 a expressão dessa porina não foi induzida pela superexpressão de σx. Assim, os efeitos observados nessa superexpressão também não podem ser atribuídos a OprF. A transcrição de oprF em PA14 mostrou-se majoritariamente dependente da região promotora a que se atribui a ligação de σ70, ao contrário dos relatos na literatura da dependência da região de ligação a σx. Análises proteômicas foram realizadas para investigar os elementos envolvidos nesses efeitos de superexpressão de σx, o que revelou a indução de diversas enzimas envolvidas na via de biossíntese de ácidos graxos. As células superexpressando σx apresentam uma maior proporção de ácidos hexadecanoico (C16) e hexadecenoico (C16:1) e dados de anisotropia mostram uma maior fluidez da(s) membrana(s). Este trabalho é o primeiro relato de um fator sigma ECF envolvido em biossíntese de lipídeos em P. aeruginosa. / Pseudomonas aeruginosa is a very versatile gammaproteobacteria, able to colonize different environments and to infect phylogenetically distinct hosts, including immunocompromised humans. The extracytoplasmic function sigma factors (ECFs) are members of cell signaling systems (CSS), abundant in P. aeruginosa. Twenty genes coding for ECF sigma factors are present in the sequenced genomes of P. aeruginosa, most of them being part of TonB systems related to iron uptake. In this work, six poorly characterized sigma factors were overexpressed in strain PA14 from an arabinose inducible promoter to investigate their role in the expression of the two-component systems PvrSR and RcsCB, which regulates CupD fimbria, and their influence in P. aeruginosa cultures growth. None of the tested sigma factors led to two-component systems upregulation and overexpression of five of them caused no change in the growth profile, but pyocyanin production was altered in PA14_55550 overexpression and PA14_26600 and PA14_46810 overexpression led to a slight increase in biofilm initiation in PA14. By the other side, cultures overexpressing σx (ALB04) presented an altered lipopolysaccharide profile and a biphasic growth curve, reaching an early stationary phase followed by a growth resuming untill a second stationary phase. During the early stationary phase, most cells swells and dies, but the remaining cells return to wild type morphology and proceed to the second exponential phase of growth. This is not due to compensatory mutations, since cells collected from late points of the curve and diluted in fresh medium repeat this behavior. Although studies with strain PAO1 associate σx with transcription of oprF, encoding the major nonspecific porin of Pseudomonas, under our experiments conditions with PA14, this porin expression is not induced by σx overexpression. Thus, the effects observed in this overexpression cannot be attributed to OprF. Transcription of oprF in PA14 proved to be mainly controlled by the σ70-dependent promoter region instead of the σx-dependent promoter region reported in the literature. Proteomic analyses were performed to investigate the elements involved in these effects of σx overexpression, which revealed the induction of several enzymes involved in fatty acids biosynthesis. Cells overexpressing σx exhibit a greater proportion of hexadecanoic (C16) and hexadecenoic (C16: 1) acids and anisotropy data show higher fluidity of the membrane (s). This work is the first report of an ECF sigma factor involved in lipid biosynthesis in P. aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa é um patógeno humano que tem preocupado a comunidade científica pelo aumento da resistência antimicrobiana. Os efeitos provocados pelos antimicrobianos podem levar à ativação de respostas mutagênicas que regulam polimerases de baixa fidelidade, atuando na Síntese Translesão de DNA (TLS). Neste trabalho, avaliamos a resposta de P. aeruginosa frente à Ceftazidima e Ciprofloxacina. Foi observado que Ceftazidima não induz a resposta SOS e mutagênese, diferentemente de Ciprofloxacina. Demonstramos que as três polimerases de TLS estão envolvidas na mutagênese induzida por Ciprofloxacina e peróxido de hidrogênio. Também, observamos que a perda de qualquer uma das polimerases alterou significativamente o espectro de mutações espontâneas e induzidas por Ciprofloxacina e que possuem funções redundantes neste processo mutagênico. Assim, demonstramos que as polimerases de TLS são importantes para a mutagênese induzida por Ciprofloxacina em P. aeruginosa, e podem estar implicadas na mutagênese adaptativa e, consequentemente, na resistência bacteriana. / Pseudomonas aeruginosa is a human pathogen that has worried the scientific community by increasing antimicrobial resistance. The effects caused by the antimicrobial agents may lead to the activation of mutagenic responses that regulate low fidelity polymerases, acting in DNA Transmission Synthesis (TLS). In this work, we evaluated the response of P. aeruginosa to Ceftazidime and Ciprofloxacin. It has been observed that Ceftazidime does not induce the SOS response nor mutagenesis, unlike Ciprofloxacin. We show that the three TLS polymerases are involved in the mutagenesis induced by Ciprofloxacin and hydrogen peroxide. Also, we observed that the loss of any of the polymerases significantly altered the spectrum of spontaneous mutations induced by Ciprofloxacin and that have redundant functions in this mutagenic process. Thus, we have shown that TLS polymerases are important for Ciprofloxacin-induced mutagenesis in P. aeruginosa, and may be implicated in adaptive mutagenesis and consequently bacterial resistance.

La pathogénicité de P. aeruginosa (P. a) repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SST3). Ce complexe multiprotéique est constitué d'une aiguille se terminant par un translocon composé des protéines PopB et PopD. En s'insérant dans les membranes plasmiques, le translocon permet le passage des exotoxines dans le cytoplasme de la cellule cible. L'induction de la synthèse et de la sécrétion des exotoxines est dépendante d'un contact entre P. a et la cellule cible. Dans ce travail, nous avons examiné l'influence de facteurs cellulaires sur l'efficacité de translocation des toxines. L'utilisation d'un système rapporteur fluorescent CCF2/β-lactamase a permis de visualiser l'injection de toxine. En parallèle, l'association des protéines du translocon avec la membrane de la cellule hôte a été évaluée par immunodétection de PopB/D après fractionnement des membranes sur gradient de sucrose. Les cellules promyelocytaires HL-60 et promonocytaires U937 sont résistantes à l'injection de toxine, bien que PopB et PopD soient associées à la membrane. Après différenciation en neutrophiles, or monocytes/macrophages, ces cellules deviennent sensibles à l'injection sans que l'on détecte de variation notable de la quantité de protéines du translocon insérées dans la membrane. Le traitement des cellules HL-60 sensibles avec un agent déplétant le cholestérol, entraine une diminution de l'injection de toxine. De plus, la protéine PopB est retrouvée dans la fraction membranaire, obtenue par purification sur gradient de sucrose, contenant le marqueur des radeaux lipidiques flotilline. Par une approche pharmacologique, nous apportons la preuve que, en plus de la composition de la membrane, des voies de signalisation intracellulaires impliquées dans la polymérisation de l'actine sont essentielles pour la formation d'un pore fonctionnel. / The pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa (P.a) implies multiple virulence factors among which the type III secretion system (T3SS). This multiprotein complex is composed of a needle through which four exotoxins are exported. The protein PopB and PopD form an oligomeric structure (translocon) at the end of the needle that inserts into the host cell membrane and translocates the exotoxins into the cytoplasm. Synthesis and toxin secretion is induced on contact with eukaryotic cell. In this work, we examined the influence of host cell elements on exotoxin translocation efficiency. The delivery of T3SS toxins was investigated using a CCF2/β-lactamase fluorescent reporter system In parallel, the association of translocon proteins with host plasma membranes was evaluated by immunodetection of PopB/D following sucrose gradient fractionation of membranes. Promyelocytic HL-60 cells and promonocytic U937 cells were found to be resistant to toxin injection even though PopB/D associated with host cell plasma membranes. Differentiation of these cells to neutrophil- or macrophage-like cells resulted in an injection-sensitive phenotype without any significant change in the level of membrane-inserted translocon proteins. Treatment of sensitive HL-60 cells with a cholesterol-depleting agent, resulted in a diminished injection of toxin. Moreover, the PopB translocator was found in the membrane fraction obtained from sucrose-gradient purifications and containing lipid-raft marker flotillin. Through a pharmacological approach, we brought evidence that, in addition to membrane composition, some general signalling pathways involved in actin polymerization may be critical for the formation of a functional pore.

Apesar dos diversos estudos sobre a presença de cianobactérias e a correlação entre fatores ambientais que influenciam ou desencadeiam florações, é ainda incipiente a informação sobre o controle fisiológico e bioquímico da produção de metabólitos secundários, cianotoxinas e compostos orgânicos voláteis (COVs) nestes organismos. Os COVs mais comumente encontrados em cianobactérias são a geosmina e o 2- metil-isoborneol, compostos que resistem ao tratamento convencional da água, causam mau cheiro e alteram seu gosto, além de bioacumular em peixes e moluscos. Estudos sobre possíveis sistemas de competição (alelopatia) entre linhagens de cianobactérias, ou entre elas e outros organismos, podem contribuir para elucidação do papel da produção de COVs por cianobactérias. Dessa forma, os objetivos deste projeto foram (i) prospectar a produção de COVs e seus efeitos na auto-regulação fisiológica em cianobactérias mantidas em laboratório; e (ii) desenvolver um método analítico, por microextração em fase sólida (SPME) e cromatografia em fase gasosa com detecção por espectrometria de massas (GC-MS), para a determinação destes compostos. Foram realizados ensaios para avaliar os perfis de produção dos COVs em duas linhagens de M. aeruginosa em diferentes fases de crescimento, sob diferentes intensidades luminosas (50, 150 e 250 ?µmol.fótons.m-2.s-1) e também ao longo do ritmo circadiano, avaliando a influência dos períodos claro e escuro. Para avaliar efeitos alelopáticos, exsudatos de uma linhagem de M. aeruginosa produtora de microcistinas foram testados em culturas de outra linhagem de M. aeruginosa não produtora de toxinas por meio de técnicas tradicionais de cultivo com monitoramento do crescimento. Na análise da produção de COVs, por GC-MS, observou-se que se destacam, majoritariamente, os compostos α-ciclocitral, &#946-ciclocitral e β-ionona, sendo o β-ciclocitral o mais abundante, em todas as condições testadas, para as ambas as linhagens estudadas. A linhagem não toxigênica, no entanto, apresentou produção mais elevada de todos os compostos identificados. Dentre as intensidades luminosas testadas, a intensidade de 250 µmol.fótons.m-2s-1 foi a que apresentou a maior taxa de crescimento para a linhagem LTPNA 08 e relação negativa entre o aumento da irradiância e a produção de β-ciclocitral. Foram identificadas, também, variações na produção dos compostos α-ciclocitral, β-ciclocitral e β-ionona nas linhagens ao longo do ritmo circadiano, sendo as maiores concentrações encontradas no período escuro. Observou-se morte celular e redução na produção de COVs 24 horas após adição de exsudatos pertencentes à linhagem de M. aeruginosa toxigênica em cultivos da linhagem não-toxigênica. Sendo assim, pode-se inferir que a produção dos COVs pode sofrer alterações qualitativas e quantitativas dependendo do estímulo ambiental presente, tanto por interações bióticas (com outros organismos e ritmo circadiano), quanto por fatores abióticos (intensidade luminosa). / There are several studies on the presence of cyanobacteria and the correlation between environmental factors that may influence or trigger blooms. However, information concerning the physiological and biochemical control of the production of secondary metabolites, toxins and volatile organic compounds (VOC) by cyanobacteria is poorly understood. Geosmin and 2-methyl-isoborneolare are commonly found VOC in cyanobacteria, they resist to conventional water treatment and can cause bad smell and taste in the final water. In addition, VOC can bioaccumulate in fish and shellfish. Studies on possible competition systems (allelopathy) either among strains of cyanobacteria or among them and other organisms such as green microalgae, may help to elucidate the role of VOC production by cyanobacteria. Thus, the main objectives of this study are: (i) prospect the production of VOCs and their effects on physiological self-regulation in cyanocrobacteria kept in the laboratory; and (ii) to develop an analytical method, by solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography with mass spectrometry detection (GC-MS), for the determination of these compounds. The assays were carried out to evaluate the production profiles of VOCs in two strains of M. aeruginosa at different growth stages under different light intensities (50, 150 and 250 µmol.fótons.m-2.s-1) and also along of the circadian rhythm, evaluating the influence of light and dark periods. To assess allelopathic effects, exudates from a microcystin-producing strain of M. aeruginosa were tested on cultures of another non-toxin producing M. aeruginosa strain by traditional growth monitoring culture techniques. In the analysis of VOC production by GC-MS, it was observed that α-cyclocyclal, β-cyclocyclal and β-ionone compounds were the most prominent, with β-cyclocitral being the most abundant in all conditions tested, for both strains studied. The non-toxigenic lineage, however, showed higher production of all the identified compounds. Among the light intensities tested, the intensity of 250 µmol.fótons.m-2s-1 was the one with the highest growth rate and positive relation between the irradiance increase and the β-cyclocitral production. Variations in the production of the α-cyclocyclal, β-cyclocyclal and β-ionone compounds were also identified in the lines along the circadian rhythm, being the highest concentrations found in the dark period. Cell death and reduction in VOC production were observed 24 hours after addition of exudates belonging to the toxigenic M. aeruginosa lineage in cultures of the non-toxigenic lineage. Thus, it can be inferred that the production of VOCs can undergo qualitative and quantitative changes depending on the environmental stimulus present, both by biotic interactions (with other organisms and circadian rhythm) and by abiotic factors (luminous intensity).

A contaminação de corpos d\'água por fármacos é um tema de extrema relevância, tendo em vista problemas como a escassez de água, florações de cianobactérias tóxicas e lançamentos clandestinos de efluentes domésticos. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo determinar a presença de cafeína (CAF), fluoxetina (FLX), levotiroxina (LVX) e bezafibrato (BZF) em mananciais do estado de São Paulo, bem como avaliar a toxicidade desses compostos à cianobactéria Microcystis aeruginosa LTPNA 08. Um método por LC-MS/MS foi desenvolvido e validado, de acordo com a RDC nº 166 da ANVISA, para a detecção de CAF, FLX, LVX e BZF em amostras ambientais. As represas Guarapiranga e Billings, bem como os rios Taiçupeba, Sorocaba, Baixo Cotia, Grande e Paraíba foram monitorados de abril a setembro de 2017. A toxicidade dos fármacos foi avaliada por meio do monitoramento do crescimento, produção de microcistinas e viabilidade celular da cianobactéria M. aeruginosa LTPNA 08. CAF foi detectada em todas as amostras analisadas, com concentrações que variaram de 6,6 ng.L-1 a 16,47 µg.L-1. No Rio Cotia foram verificadas as maiores concentrações de CAF, FLX e BZF (16,47 µg.L-1; 3,5 ng.L-1 e 322 ng.L-1, respectivamente). A LVX, cujos produtos de biotransformação não foram monitorados, não foi detectada em nenhuma amostra analisada. A concentração de 50 µg.L-1 de FLX inibiu o crescimento da cianobactéria em 82,3% (CE50: 31,4 µg.L-1). Em relação à produção de microcistinas totais, os fármacos inibiram a liberação da fração extracelular para a maior concentração testada ao longo do tempo de monitoramento, embora não tenham demonstrado efeito sobre a viabilidade celular. Sendo assim, considerando-se que fármacos estão presentes nos mananciais monitorados no estado de São Paulo e que a FLX pode causar efeito sobre a M. aeruginosa, os efeitos decorrentes da exposição a concentrações ambientais contínuas e cumulativas de fármacos em corpos d\'água devem ser estudados. Além disso, uma vez que a ocorrência destas substâncias e outros contaminantes antropogênicos no ambiente aquático natural é uma questão emergente devido aos efeitos adversos potenciais que estes compostos representam para a vida aquática e os seres humanos, os tipos e níveis destes compostos, que têm um impacto maior na qualidade da água, deve ser constantemente monitorada. Práticas de gestão que investem em saneamento e na redução da descarga de efluentes não tratados, e um plano de proteção de recursos hídricos com o objetivo de garantir a segurança da água seriam medidas essenciais para reduzir o aporte de contaminantes nos corpos d\'água do estado de São Paulo. / Contamination of water bodies by drugs is a subject of extreme relevance considering related problems such as water scarcity, harmful cyanobacterial blooms and discharge of untreated domestic effluents. Therefore, the aim of this work was to determine the presence of caffeine (CAF), fluoxetine (FLX), levothyroxine (LVX) and bezafibrate (BZF) in springs in the State of São Paulo, and to evaluate the toxicity of these compounds in cyanobacteria Microcystis aeruginosa LTPNA 08. A LC-MS/MS method was developed and validated according to RDC nº 166 of ANVISA to assess the concentration of CAF, FLX, LVX and BZF in environmental samples. Guarapiranga and Billings reservoirs, as well as the Taiçupeba, Sorocaba, Baixo Cotia, Grande and Paraíba rivers were monitored from April to September 2017.The drugs toxicity in M. aeruginosa LTPNA 08 was assessed by monitoring their effects on cyanobacterial growth, microcystins production and cell viabilityby flow cytometry. CAF was detected in all analyzed samples at concentrations ranging from 6.6 ng to 16.47 µg.L-1.Among studied sites, Cotia river showed the highest concentrations of CAF, FLX and BZF (16.47 µg.L-1, 3.5 ng.L-1 and 322 ng.L-1, respectively). LVX, which biotransformation products were not monitored, was not detected in any of the analyzed samples. Regarding the drugs toxicity, 50 µg.L-1 of FLX inhibited the cyanobacterial grow thin 82.3% (EC50 of 31.4 µg.L-1). Although no effect on cell viability was seen by flow cytometry, the highest concentrations of all compounds tested were able to inhibit the release of microcystins. Therefore, considering that some of the drugs monitored showed to be present in water sources in São Paulo State and that FLX affects cyanobacteria M. aeruginosa growth, the effects of continuous and cumulative exposure at environmental drug concentrations of in water bodies should be evaluated. Also, since the occurrence of these substances and other anthropogenic contaminants in the natural aquatic environment is an emerging issue due to the potential adverse effects these compounds pose to aquatic life and humans, thet ypes and levels of these compounds, which have a greater impact on water quality, should be constantly monitored. Management practices investing in sanitation and in reducing discharge of untreated effluents, as well as a plan for water resources protection with the goal of ensuring water security would be essential measures in reducing drugs loading into water bodies situated in São Paulo State.