Lisdexanfetamina (LDX) é um pró-fármaco estimulante de longa duração indicado para o tratamento dos sintomas do transtorno do déficit de atenção e hiperatividade e do transtorno da compulsão alimentar periódica. A hidrólise da ligação amida da LDX ocorre in vivo liberando a molécula terapeuticamente ativa d-anfetamina (d-ANF) e o aminoácido l-lisina. Visto que a LDX se biotransforma à d-ANF – um potente estimulante do sistema nervoso central com destaque tanto na clínica quanto na toxicologia – existe potencial para uso inadequado, abuso e desvio para fins não terapêuticos. Nos laboratórios de toxicologia, amostras biológicas com resultados positivos para anfetamina (ANF) são um desafio, uma vez que alguns testes toxicológicos podem detectar ANF devido à utilização de alguns medicamentos, dificultando a sua interpretação. Assim, são necessários métodos bioanalíticos eficientes aliados ao conhecimento farmacocinético, que permite a verificação da possibilidade de detecção, a estimativa da janela de detecção e as concentrações que podem ser alcançadas em diferentes matrizes biológicas. Dessa forma, neste trabalho, foram desenvolvidos métodos bioanalíticos para quantificação simultânea da LDX e de seu produto de biotransformação, a ANF, nas matrizes biológicas fluido oral, plasma e urina utilizando a cromatografia líquida acoplada a detector de massas sequencial (CL-EM/EM). A preparação de amostra é simples, utilizando a precipitação de proteínas para o plasma, com pouca quantidade de solvente orgânico, a diluição para o fluido oral e a filtração para urina, ambas com nenhuma quantidade de solvente orgânico. As curvas de calibração utilizando o padrão interno ANF deuterada apresentaram linearidade entre 1 e 128 ng/mL para o fluido oral e o plasma e entre 4 e 256 ng/mL para a urina. A menor concentração das curvas de calibração é igual ao limite inferior de quantificação. Precisão e exatidão intra e interdia ficaram dentro dos limites de ± 15% para os controles e ± 20% para o limite de quantificação. Os métodos foram seletivos e sem efeito residual, porém apresentaram um leve efeito matriz, frequentemente encontrado em métodos de CL-EM/EM. O método foi aplicado para análise das amostras do estudo farmacocinético da LDX e ANF nas matrizes biológicas fluido oral, plasma e urina após administração oral de LDX. Seis voluntários do sexo masculino coletaram amostras de fluido oral e plasma em tempos pré-determinados durante 72 horas e amostras de urina em intervalos pré-determinados durante 120 horas. Os dados foram avaliados de maneira não-compartimental e compartimental. Considerando a análise não-compartimental, a concentração máxima média da d-ANF foi quase seis vezes inferior no plasma em relação ao fluido oral e ocorreu em 3,8 e 4 horas, respectivamente, após a administração oral. A LDX atingiu a concentração máxima no plasma e no fluido oral em 1,2 e 1,8 horas após a administração oral, respectivamente, com um valor médio de pico de concentração quase duas vezes mais elevado no plasma em comparação com o fluido oral. A eliminação da d-ANF a partir do plasma e a partir do fluido oral foi semelhante, porém para LDX a eliminação a partir do fluido oral foi mais lenta, mesmo com concentrações mais baixas do que no plasma. A detecção da d-ANF ocorreu até 48-72 horas no plasma e fluido oral e até 120 horas em urina. Já para a LDX, a detecção ocorreu até 3, 5 e 12 horas no plasma, fluido oral e urina, respectivamente. LDX intacta e d-ANF foram detectadas nas três matrizes avaliadas. Na análise compartimental, o melhor ajuste de modelo foi observado para 1 compartimento para ambos os analitos tanto no plasma quanto no fluido oral. Houve uma correlação entre as concentrações do fluido oral e do plasma para d-ANF e entre as proporções de LDX intacta/d-ANF pelo tempo no plasma e no fluido oral. O método analítico desenvolvido pode ser aplicado em diferentes áreas do conhecimento a fim de certificar os resultados de uma análise de triagem positiva para ANF. Porém, para interpretação das situações tanto de triagem quanto de confirmação é necessário aliar o conhecimento farmacocinético gerado no trabalho, que demonstra se há a possibilidade de detecção na matriz analisada e por quanto tempo após a administração da LDX. Isto auxilia na diferenciação do uso de outros medicamentos derivados da ANF e do uso ilegal, para que as devidas providências legais e de manejos clínicos de tratamento e controle de dependência sejam tomadas quando necessário. / Lisdexamfetamine (LDX) is a long-acting prodrug stimulant indicated for the treatment of attention-deficit/hyperactivity disorder and binge-eating disorder symptoms. In vivo hydrolysis of lisdexamfetamine amide bond releases the therapeutically active d-amphetamine (d-AMPH) and the amino acid l-lysine. Since LDX biotransformation gives rise to d-AMPH - a potent stimulant of the central nervous system that stands out in clinical and toxicology - there is potential for misuse, abuse and diversion for non-therapeutic purposes. In laboratories of toxicology, biological samples with positive results for amphetamine (AMPH) are a challenge, since some toxicological tests can detect AMPH due to the use of some medications hindering the interpretation. Therefore, we need efficient bioanalytical methods combined with the pharmacokinetic knowledge, which allows to verify the possibility of detection, to assess the detection window and the concentrations that can be reached in different biological matrices. Hence, bioanalytical methods were developed for simultaneous quantification of LDX and its main biotransformation product AMPH in the biological matrices oral fluid, plasma and urine by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS). The sample preparation is simple, using protein precipitation for plasma, with a small amount of organic solvent, dilution for oral fluid and filtration to urine, both with no amount of organic solvent. Calibration curves using deuterated AMPH internal standard showed linearity between 1 and 128 ng/mL for oral fluid and plasma, and between 4 and 256 ng/mL for urine. The lowest concentration of the calibration curve is the lower limit of quantification. Intra and interday precision and accuracy were within the limits of ± 15% for controls and ± 20% for the limit of quantification. The methods were selective and no carry-over was observed, however with some matrix effect, often found in LC-MS/MS methods. The method was applied to analyze samples from LDX and AMPH pharmacokinetics study in the biological matrices oral fluid, plasma and urine following oral administration of LDX. Six male volunteers collected oral fluid and plasma samples at predetermined times during 72 hours and urine samples at pre-determined intervals during 120 hours. Data were evaluated through non-compartmental and compartmental analysis. Considering the noncompartmental analysis, the mean maximum concentration of d-AMPH was almost 6-fold lower in plasma than in oral fluid and occurred at 3.8 and 4 hours, respectively, after LDX administration. LDX maximum concentration was reached at 1.2 and 1.8 hours after LDX oral administration for oral fluid and plasma, respectively, with a mean peak concentration almost 2-fold higher in plasma when compared with oral fluid. Elimination of d-AMPH from oral fluid and from plasma were similar, albeit for LDX elimination from oral fluid was slower even with lower concentrations than plasma. Detection occurred until 48 to 72 hours in plasma and oral fluid and until 120 hours in urine for d-AMPH. Whereas for LDX, detection could be done for up to 3, 5 and 12 hours in plasma, oral fluid and urine, respectively. Intact LDX and d-AMPH were detected in the three evaluated matrices. In compartmental analysis, the best model fit was observed for 1-compartment model for both analytes in plasma and in oral fluid. There was a correlation between oral fluid and plasma d-AMPH concentrations and between intact LDX/d-AMPH ratios along time in plasma as well as in oral fluid. The bioanalytical methods developed can be applied in different fields of knowledge in order to ensure the results of a positive screening analysis for AMPH. Nevertheless, for interpretation of situations in both screening and confirmation tests is necessary to combine the pharmacokinetic knowledge produced in this study, which shows if there is the possibility of detection in the analyzed matrix and for how long after the administration of LDX. This results aid in the differentiation from other AMPH derived drugs use and from illegal use, so that appropriate legal action and clinical management strategies for treatments and control of dependence be taken when necessary.

O Brasil destaca-se no cenário mundial em relação ao consumo de estimulantes anfetamínicos (ATS), e estudos nacionais têm evidenciado grande prevalência na utilização destas substâncias por motoristas profissionais. O fluido oral apresenta uma série de vantagens sobre as matrizes tradicionais para a monitorização do consumo de ATS no trânsito, e vem sendo empregada em diversos países. Este trabalho objetivou avaliar a especificidade de imunoensaios comerciais na detecção preliminar dos ATS comercializados no Brasil em amostras de fluído oral e desenvolver e validar um método para a confirmação e quantificação de anfetamina (AMP), metanfetamina (MET), anfepramona (DIE), fenproporex (FEN) e metilfenidato (MPH) no fluído oral por microextração em fase sólida (SPME) e cromatografia a gás com detector de massas (CG/EM). A especificidade analítica dos imunoensaios foi avaliada por meio do estudo das informações técnicas de diversos produtos e da realização de ensaios experimentais com três testes. O método confirmatório por SPME-CG/EM foi desenvolvido a partir da técnica de imersão (DI-SPME), sob agitação magnética, à temperatura ambiente, utilizando fibras revestida por polidimetilsiloxano (30 μm), propilcloroformato como agente derivatizante e adição de Na2CO3 e de Na2SO4 para aumentar o pH e a força iônica do meio, respectivamente. Os testes imunológicos atualmente disponíveis para a triagem de ATS em fluido oral são importados e não detectam, mesmo em altas concentrações, os principais ATS consumidos no Brasil: FEN, DIE e MPH. O método por SPME-CG/EM foi linear para os ATS estudados no intervalo de 2-256 ng.mL-1, exceto para o FEN cujo intervalo foi de 4-256 ng.mL-1. Os limites de detecção foram 0,5 ng.mL-1 (MET), 1 ng.mL-1 (MPH) e 2 ng.mL-1 (DIE, AMP, FEN). A exatidão do método situou-se entre 98,2 – 111,9% e a precisão não excedeu 15% de desvio padrão relativo. O método foi aplicado com sucesso na estimação do perfil farmacocinético do FEN e da AMP no fluído oral de seis indivíduos do sexo masculino, após a administração de dose única de especialidade farmacêutica nacional contendo 25 mg de cloridrato de FEN. / The Brazil stands out on the world as a major consumer of amphetamine-type stimulants (ATS), and several national studies have shown high prevalence in the consumption of these substances by professional drivers. Oral fluid has many advantages over the conventional biological fluids for monitoring ATS use on roads, and has been employed with this purpose in several countries. The aim of this study is to assess the specificity/cross-reactivity of commercial oral fluid immunoassays in detecting the prescription ATS marketed in Brazil and to develop and validate a method for confirmation and quantification of amphetamine (AMP), methamphetamine (MET), amfepramone (DIE), fenproporex (FEN) and methylphenidate (MPH) in oral fluid by solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Analytical specificity of immunoassays was evaluated through the study of the technical information of commercial products and through experimental testing of three kits. The confirmatory SPME-GC-MS method employed SPME immersion technique (DI-SPME), under magnetic stirring, at room temperature, using polydimethylsiloxane (30 μm) fibers, in-matrix propylchloroformate derivatization, Na2CO3 and Na2SO4 to increase both pH and ionic strength. Immunological tests currently available for ATS screening in oral fluid are imported and do not detect, even at high concentrations, the main ATS consumed in Brazil: FEN, MPH and DIE. The SPME-GC-MS method was linear for the studied ATS over the range of 2-256 ng.mL-1, except for FEN where the linear range was 4-256 ng.mL-1. The detection limits were 0.5 ng.mL-1 (MET), 1 ng.mL-1 (MPH) and 2 ng.mL-1 (DIE, AMP, FEN). Accuracy was within 98.2 – 111.9% of the target concentrations and precision did not exceed 15% of relative standard deviation. The method was successfully applied to estimate the pharmacokinetic profile of FEN and AMP in oral fluid of six male subjects after administration of a single dose of 25 mg FEN hydrochloride.

Lisdexanfetamina (LDX) é um pró-fármaco estimulante de longa duração indicado para o tratamento dos sintomas do transtorno do déficit de atenção e hiperatividade e do transtorno da compulsão alimentar periódica. A hidrólise da ligação amida da LDX ocorre in vivo liberando a molécula terapeuticamente ativa d-anfetamina (d-ANF) e o aminoácido l-lisina. Visto que a LDX se biotransforma à d-ANF – um potente estimulante do sistema nervoso central com destaque tanto na clínica quanto na toxicologia – existe potencial para uso inadequado, abuso e desvio para fins não terapêuticos. Nos laboratórios de toxicologia, amostras biológicas com resultados positivos para anfetamina (ANF) são um desafio, uma vez que alguns testes toxicológicos podem detectar ANF devido à utilização de alguns medicamentos, dificultando a sua interpretação. Assim, são necessários métodos bioanalíticos eficientes aliados ao conhecimento farmacocinético, que permite a verificação da possibilidade de detecção, a estimativa da janela de detecção e as concentrações que podem ser alcançadas em diferentes matrizes biológicas. Dessa forma, neste trabalho, foram desenvolvidos métodos bioanalíticos para quantificação simultânea da LDX e de seu produto de biotransformação, a ANF, nas matrizes biológicas fluido oral, plasma e urina utilizando a cromatografia líquida acoplada a detector de massas sequencial (CL-EM/EM). A preparação de amostra é simples, utilizando a precipitação de proteínas para o plasma, com pouca quantidade de solvente orgânico, a diluição para o fluido oral e a filtração para urina, ambas com nenhuma quantidade de solvente orgânico. As curvas de calibração utilizando o padrão interno ANF deuterada apresentaram linearidade entre 1 e 128 ng/mL para o fluido oral e o plasma e entre 4 e 256 ng/mL para a urina. A menor concentração das curvas de calibração é igual ao limite inferior de quantificação. Precisão e exatidão intra e interdia ficaram dentro dos limites de ± 15% para os controles e ± 20% para o limite de quantificação. Os métodos foram seletivos e sem efeito residual, porém apresentaram um leve efeito matriz, frequentemente encontrado em métodos de CL-EM/EM. O método foi aplicado para análise das amostras do estudo farmacocinético da LDX e ANF nas matrizes biológicas fluido oral, plasma e urina após administração oral de LDX. Seis voluntários do sexo masculino coletaram amostras de fluido oral e plasma em tempos pré-determinados durante 72 horas e amostras de urina em intervalos pré-determinados durante 120 horas. Os dados foram avaliados de maneira não-compartimental e compartimental. Considerando a análise não-compartimental, a concentração máxima média da d-ANF foi quase seis vezes inferior no plasma em relação ao fluido oral e ocorreu em 3,8 e 4 horas, respectivamente, após a administração oral. A LDX atingiu a concentração máxima no plasma e no fluido oral em 1,2 e 1,8 horas após a administração oral, respectivamente, com um valor médio de pico de concentração quase duas vezes mais elevado no plasma em comparação com o fluido oral. A eliminação da d-ANF a partir do plasma e a partir do fluido oral foi semelhante, porém para LDX a eliminação a partir do fluido oral foi mais lenta, mesmo com concentrações mais baixas do que no plasma. A detecção da d-ANF ocorreu até 48-72 horas no plasma e fluido oral e até 120 horas em urina. Já para a LDX, a detecção ocorreu até 3, 5 e 12 horas no plasma, fluido oral e urina, respectivamente. LDX intacta e d-ANF foram detectadas nas três matrizes avaliadas. Na análise compartimental, o melhor ajuste de modelo foi observado para 1 compartimento para ambos os analitos tanto no plasma quanto no fluido oral. Houve uma correlação entre as concentrações do fluido oral e do plasma para d-ANF e entre as proporções de LDX intacta/d-ANF pelo tempo no plasma e no fluido oral. O método analítico desenvolvido pode ser aplicado em diferentes áreas do conhecimento a fim de certificar os resultados de uma análise de triagem positiva para ANF. Porém, para interpretação das situações tanto de triagem quanto de confirmação é necessário aliar o conhecimento farmacocinético gerado no trabalho, que demonstra se há a possibilidade de detecção na matriz analisada e por quanto tempo após a administração da LDX. Isto auxilia na diferenciação do uso de outros medicamentos derivados da ANF e do uso ilegal, para que as devidas providências legais e de manejos clínicos de tratamento e controle de dependência sejam tomadas quando necessário. / Lisdexamfetamine (LDX) is a long-acting prodrug stimulant indicated for the treatment of attention-deficit/hyperactivity disorder and binge-eating disorder symptoms. In vivo hydrolysis of lisdexamfetamine amide bond releases the therapeutically active d-amphetamine (d-AMPH) and the amino acid l-lysine. Since LDX biotransformation gives rise to d-AMPH - a potent stimulant of the central nervous system that stands out in clinical and toxicology - there is potential for misuse, abuse and diversion for non-therapeutic purposes. In laboratories of toxicology, biological samples with positive results for amphetamine (AMPH) are a challenge, since some toxicological tests can detect AMPH due to the use of some medications hindering the interpretation. Therefore, we need efficient bioanalytical methods combined with the pharmacokinetic knowledge, which allows to verify the possibility of detection, to assess the detection window and the concentrations that can be reached in different biological matrices. Hence, bioanalytical methods were developed for simultaneous quantification of LDX and its main biotransformation product AMPH in the biological matrices oral fluid, plasma and urine by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS). The sample preparation is simple, using protein precipitation for plasma, with a small amount of organic solvent, dilution for oral fluid and filtration to urine, both with no amount of organic solvent. Calibration curves using deuterated AMPH internal standard showed linearity between 1 and 128 ng/mL for oral fluid and plasma, and between 4 and 256 ng/mL for urine. The lowest concentration of the calibration curve is the lower limit of quantification. Intra and interday precision and accuracy were within the limits of ± 15% for controls and ± 20% for the limit of quantification. The methods were selective and no carry-over was observed, however with some matrix effect, often found in LC-MS/MS methods. The method was applied to analyze samples from LDX and AMPH pharmacokinetics study in the biological matrices oral fluid, plasma and urine following oral administration of LDX. Six male volunteers collected oral fluid and plasma samples at predetermined times during 72 hours and urine samples at pre-determined intervals during 120 hours. Data were evaluated through non-compartmental and compartmental analysis. Considering the noncompartmental analysis, the mean maximum concentration of d-AMPH was almost 6-fold lower in plasma than in oral fluid and occurred at 3.8 and 4 hours, respectively, after LDX administration. LDX maximum concentration was reached at 1.2 and 1.8 hours after LDX oral administration for oral fluid and plasma, respectively, with a mean peak concentration almost 2-fold higher in plasma when compared with oral fluid. Elimination of d-AMPH from oral fluid and from plasma were similar, albeit for LDX elimination from oral fluid was slower even with lower concentrations than plasma. Detection occurred until 48 to 72 hours in plasma and oral fluid and until 120 hours in urine for d-AMPH. Whereas for LDX, detection could be done for up to 3, 5 and 12 hours in plasma, oral fluid and urine, respectively. Intact LDX and d-AMPH were detected in the three evaluated matrices. In compartmental analysis, the best model fit was observed for 1-compartment model for both analytes in plasma and in oral fluid. There was a correlation between oral fluid and plasma d-AMPH concentrations and between intact LDX/d-AMPH ratios along time in plasma as well as in oral fluid. The bioanalytical methods developed can be applied in different fields of knowledge in order to ensure the results of a positive screening analysis for AMPH. Nevertheless, for interpretation of situations in both screening and confirmation tests is necessary to combine the pharmacokinetic knowledge produced in this study, which shows if there is the possibility of detection in the analyzed matrix and for how long after the administration of LDX. This results aid in the differentiation from other AMPH derived drugs use and from illegal use, so that appropriate legal action and clinical management strategies for treatments and control of dependence be taken when necessary.

abstract: Intermittent social defeat stress produces vulnerability to drugs of abuse, a phenomena known as cross-sensitization, which is proceeded by a corresponding upregulation of ventral tegmental area (VTA) mu-opioid receptors (MORs). Since VTA MORs are implicated in the expression of psychostimulant sensitization, they may also mediate social stress-induced vulnerability to drugs of abuse. Social stress and drugs of abuse increase mesolimbic brain-derived neurotrophic factor (BDNF) signaling with its receptor, tropomyosin-related kinase B (TrkB). These studies examined whether VTA MOR signaling is important for the behavioral and cellular consequences of social stress. First, the function of VTA MORs in the behavioral consequences of intermittent social defeat stress was investigated. Lentivirus-mediated knockdown of VTA MORs prevented social stress-induced cross-sensitization, as well as stress-induced social avoidance and weight gain deficits. Next it was examined whether VTA MOR expression is critical for stress-induced alterations in the mesocorticolimbic circuit. At the time cross-sensitization was known to occur, lentivirus-mediated knockdown of VTA MORs prevented stress-induced increases in VTA BDNF and its receptor, TrkB in the nucleus accumbens (NAc), and attenuated NAc expression of delta FosB. There was no effect of either stress or virus on BDNF expression in the prefrontal cortex. Since social stress-induced upregulation of VTA MORs is necessary for consequences of social stress, next activity dependent changes in AKT, a downstream target of MOR stimulation associated with sensitization to psychostimulant drugs, were investigated. Using fluorescent immunohistochemical double labeling for the active form of AKT (pAKT) and markers of either GABA or dopamine neurons in the VTA, it was determined that social stress significantly increased the expression of pAKT in GABA, but not dopamine neurons, and that this effect was dependent on VTA MOR expression. Moreover, intra-VTA inhibition of pAKT during stress prevented stress-induced weight gain deficits, while acute inhibition of VTA pAKT blocked the expression of cross-sensitization in subjects that had previously exhibited sensitized locomotor activity. Together these results suggest that social stress upregulates MORs on VTA GABA neurons, resulting in AKT phosphorylation, and that increased VTA MOR-pAKT signaling may represent a novel therapeutic target for the intervention of substance abuse disorders. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Neuroscience 2015

Selenium is an element that can modulate the dopaminergic neurotransmission. Studies show that diphenyl diselenide, an organic compound of selenium, has antioxidant activity improves depressive-like behavior and reduce the activity of the enzyme monoamine oxidase (MAO). However, there are few studies concerning about possible alterations of diphenyl diselenide in dopaminergic system. Thus, the purpose of the present study was to evaluate the effects of acute and sub-chronic treatment of diphenyl diselenide on amphetamine-induced behavioral and biochemical alterations in mice. In the acute treatment, the mice were treated with diphenyl diselenide (5 and 10 mg/kg, s.c.) or vehicle (10% Tween 80, s.c.) 30 min before administration of amphetamine (1.25 mg/kg, i.p.). After 25 min, locomotor activity was assessed with an open field and, also, the time of stereotypy and immobility was assessed in a glass cage. Sub-chronic treatment was conducted with seven administrations of diphenyl diselenide (5 and 10 mg/kg, s.c.), or its vehicle being one administration per day. On the eighth day, amphetamine (1.25 mg/kg, i.p.) was administered and the behavioral tests were conducted after 25 min. In both treatments ex vivo tests were performed: isoform activity MAO-A and MAO-B, and measurement of total protein and non-protein thiol levels, oxidation of diclorofluorescein. Amphetamine increased the number of crossing and rearing in the open field test and diphenyl diselenide prevented only the increase in the number of crossings when acutely administered to mice. Furthermore, amphetamine increased the time of immobility and stereotypy in mice. Diphenyl diselenide did not prevent these effects. By contrary, at 10 mg/kg, sub-chronic administration of diphenyl diselenide increased per se the time of immobility and stereotypy. It was also found a positive correlation between immobility and stereotypy in acute and sub-chronic treatment with diphenyl diselenide. It was also detected a decrease in brain MAO-B activity caused by sub-chronic treatment with diphenyl diselenide either alone or in combination of amphetamine. Any change was detected in oxidative stress parameters. In conclusion, sub-chronic administration of diphenyl diselenide can promote a behavioral sensitization that seems to be, at least in part, dependent of MAO-B inhibition. / O selênio é um elemento químico capaz importante para o funcionamento celular, envolvido também na modulação do sistema dopaminérgico. Estudos mostram que o disseleneto de difenila, um composto orgânico de selênio, possui atividade antioxidante, melhora o comportamento tipo-depressivo relacionado à inibição da atividade da enzima monoamino oxidase (MAO). No entanto, existem poucos estudos acerca dos efeitos do disseleneto de difenila sobre o sistema dopaminérgico. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do tratamento agudo e sub-crônico do disseleneto de difenila sobre as alterações bioquímicas e comportamentais induzidas por anfetamina em camundongos. No tratamento agudo, os camundongos foram tratados com disseleneto de difenila (5 e 10 mg/kg, s.c.) ou veículo (10% de tween 80, s.c.) 30 minutos antes da administração de anfetamina (1,25 mg/kg, i.p.). Após 25 minutos, foram avaliados a atividade locomotora através do teste de campo aberto, além do tempo de estereotipia e imobilidade, avaliado em caixa espelhada. O tratamento subcrônico foi realizado com sete administrações de disseleneto de difenila ou veículo (5 e 10 mg/kg, s.c.) sendo uma administração por dia. No oitavo dia foi administrada a anfetamina (1,25 mg/kg, i.p.) e realizados os testes comportamentais 25 minutos após. Em ambos os tratamentos os testes ex-vivo realizados foram: atividade das isoformas MAO-A e MAO-B, níveis de tióis totais e não-protéico, oxidação da diclorofluoresceína. O tratamento com anfetamina aumentou o número de cruzamentos e de levantadas no teste do campo aberto e o disseleneto de difenila preveniu somente o número de cruzamentos quando administrado agudamente aos camundongos. Além disso, o tratamento com anfetamina aumentou o tempo de imobilidade e estereotipia em camundongos. O disseleneto de difenila não preveniu estes efeitos. Pelo contrário, na dose de 10 mg/kg, a administração subcrônica de disseleneto de difenila aumentou per se o tempo de imobilidade e de estereotipia. Uma correlação positiva entre o tempo de estereotipia e de imobilidade foi também encontrada tanto para o tratamento agudo como subcrônico com disseleneto de difenila. Também foi detectada uma diminuição na atividade cerebral da MAO-B causada pelo tratamento subcrônico com disseleneto de difenila tanto per se quanto em combinação com a anfetamina. Não foram encontradas alterações em parâmetros de estresse oxidativo. Em conclusão, o tratamento subcrônico com disseleneto de difenila pode promover uma sensibilização comportamental que parece ser, pelo menos em parte, dependente da inibição da MAO-B.

O Brasil destaca-se no cenário mundial em relação ao consumo de estimulantes anfetamínicos (ATS), e estudos nacionais têm evidenciado grande prevalência na utilização destas substâncias por motoristas profissionais. O fluido oral apresenta uma série de vantagens sobre as matrizes tradicionais para a monitorização do consumo de ATS no trânsito, e vem sendo empregada em diversos países. Este trabalho objetivou avaliar a especificidade de imunoensaios comerciais na detecção preliminar dos ATS comercializados no Brasil em amostras de fluído oral e desenvolver e validar um método para a confirmação e quantificação de anfetamina (AMP), metanfetamina (MET), anfepramona (DIE), fenproporex (FEN) e metilfenidato (MPH) no fluído oral por microextração em fase sólida (SPME) e cromatografia a gás com detector de massas (CG/EM). A especificidade analítica dos imunoensaios foi avaliada por meio do estudo das informações técnicas de diversos produtos e da realização de ensaios experimentais com três testes. O método confirmatório por SPME-CG/EM foi desenvolvido a partir da técnica de imersão (DI-SPME), sob agitação magnética, à temperatura ambiente, utilizando fibras revestida por polidimetilsiloxano (30 μm), propilcloroformato como agente derivatizante e adição de Na2CO3 e de Na2SO4 para aumentar o pH e a força iônica do meio, respectivamente. Os testes imunológicos atualmente disponíveis para a triagem de ATS em fluido oral são importados e não detectam, mesmo em altas concentrações, os principais ATS consumidos no Brasil: FEN, DIE e MPH. O método por SPME-CG/EM foi linear para os ATS estudados no intervalo de 2-256 ng.mL-1, exceto para o FEN cujo intervalo foi de 4-256 ng.mL-1. Os limites de detecção foram 0,5 ng.mL-1 (MET), 1 ng.mL-1 (MPH) e 2 ng.mL-1 (DIE, AMP, FEN). A exatidão do método situou-se entre 98,2 – 111,9% e a precisão não excedeu 15% de desvio padrão relativo. O método foi aplicado com sucesso na estimação do perfil farmacocinético do FEN e da AMP no fluído oral de seis indivíduos do sexo masculino, após a administração de dose única de especialidade farmacêutica nacional contendo 25 mg de cloridrato de FEN. / The Brazil stands out on the world as a major consumer of amphetamine-type stimulants (ATS), and several national studies have shown high prevalence in the consumption of these substances by professional drivers. Oral fluid has many advantages over the conventional biological fluids for monitoring ATS use on roads, and has been employed with this purpose in several countries. The aim of this study is to assess the specificity/cross-reactivity of commercial oral fluid immunoassays in detecting the prescription ATS marketed in Brazil and to develop and validate a method for confirmation and quantification of amphetamine (AMP), methamphetamine (MET), amfepramone (DIE), fenproporex (FEN) and methylphenidate (MPH) in oral fluid by solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Analytical specificity of immunoassays was evaluated through the study of the technical information of commercial products and through experimental testing of three kits. The confirmatory SPME-GC-MS method employed SPME immersion technique (DI-SPME), under magnetic stirring, at room temperature, using polydimethylsiloxane (30 μm) fibers, in-matrix propylchloroformate derivatization, Na2CO3 and Na2SO4 to increase both pH and ionic strength. Immunological tests currently available for ATS screening in oral fluid are imported and do not detect, even at high concentrations, the main ATS consumed in Brazil: FEN, MPH and DIE. The SPME-GC-MS method was linear for the studied ATS over the range of 2-256 ng.mL-1, except for FEN where the linear range was 4-256 ng.mL-1. The detection limits were 0.5 ng.mL-1 (MET), 1 ng.mL-1 (MPH) and 2 ng.mL-1 (DIE, AMP, FEN). Accuracy was within 98.2 – 111.9% of the target concentrations and precision did not exceed 15% of relative standard deviation. The method was successfully applied to estimate the pharmacokinetic profile of FEN and AMP in oral fluid of six male subjects after administration of a single dose of 25 mg FEN hydrochloride.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Hoodia gordonii à uma planta da famÃlia das apocinÃceas. OriginÃria do sudeste da Ãfrica, onde tem sido historicamente usada para suprimir o apetite durante longas jornadas de caÃa, sendo utilizada em diversos paÃses com o objetivo de emagrecer. No Brasil foi retirada do mercado devido à falta de estudos que comprovem sua eficÃcia e seguranÃa para o uso. O objetivo deste trabalho foi avaliar as alteraÃÃes comportamentais, neuroquÃmicas e glicolipÃdicas em ratos tratados com Hoodia gordonii. Para a realizaÃÃo deste estudo H. gordonii foi administrada por via oral nas doses de 25 e 50 mg/Kg durante oito dias consecutivos em ratos Wistar machos (160-200g), D-anfetamina 2 mg/Kg foi administrada intraperitonealmente de forma aguda e usada como padrÃo positivo. Os testes aconteceram 60 minutos apÃs o ultimo dia de tratamento com a Hoodia e 30 minutos apÃs o tratamento com D-anfetamina. Foram avaliados a variaÃÃo de peso dos animais durante o tratamento, bem como o consumo de Ãgua e comida. Para os testes comportamentais foram feitos os testes de labirinto em cruz elevado, campo aberto e placa perfurada. Para os estudos neuroquÃmicos foi feito HPLC com detecÃÃo eletroquÃmica. Para os testes glicolipÃdicos foi feita dosagem de Glicose, HDL, LDL, TG, colesterol total, ALT e AST. Os resultados mostraram que H. gordonii à capaz de reduzir o ganho de massa corpÃrea, bem como reduzir o consumo de comida e Ãgua. Os resultados dos testes comportamentais mostraram que ela à capaz de reduzir os parÃmetros observados no teste do labirinto em cruz e placa perfurada sem mostrar alteraÃÃo significante no campo aberto. Os resultados dos experimentos neuroquÃmicos evidenciaram um aumento do conteÃdo de noradrenalina e dopamina em corpo estriado de ratos, detectados eletroquimicamente pelo HPLC. Nos testes bioquÃmicos foi visto que ela tem a capacidade de reduzir os nÃveis de glicose, bem como a concentraÃÃo de triglicerÃdeos e colesterol total em soro de ratos, sem mostrar alteraÃÃo significante da ALT e AST. Foi possÃvel concluir que H. gordonii à capaz de reduzir a ingestÃo de alimentos e que este efeito pode estar de alguma forma ligado à neurotransmissÃo noradrenÃrgica e dopaminÃrgica, possuindo tambÃm atividade ansiogÃnica evidenciada pelos estudos comportamentais. / Hoodia gordonii is a plant of the family apocinaceae. Originally from southeastern Africa, where it has historically been used to suppress appetite during long hunting trips, being used in several countries in order to lose weight. In Brazil was withdrawn from the market due to lack of studies proving its efficacy and safety for use. The aim of this study was to evaluate the behavioral changes and neurochemical glicolipÃdicas in rats treated with Hoodia gordonii. For this study H. gordonii was administered orally at doses of 25 and 50 mg/kg for eight consecutive days in male Wistar rats (160-200g), D-amphetamine 2 mg/kg was intraperitoneally administered acutely and used as a positive standard. The tests took place 60 minutes after the last day of treatment with the Hoodia and 30 minutes after treatment with D-amphetamine. We evaluated the weight change of the animals during treatment, as well as the consumption of water and food. For behavioral tests were performed tests elevated plus-maze, open field and hole board. For neurochemical studies was done HPLC with electrochemical detection. For testing was done glycolipid glucose, HDL, LDL and TG, total cholesterol, ALT and AST. The results showed that H. gordonii is capable of reducing body mass gain and reduce the consumption of food and water. The results of behavioral tests showed that it is able to reduce the parameters observed in the plus-maze test and hole board showing no significant change in the open field. The results of experiments showed an increase in the neurochemical content of noradrenaline and dopamine in the striatum of rats electrochemically detected by HPLC. In biochemical tests it was seen that it has the ability to lower blood glucose levels as well as the concentration of triglycerides and total cholesterol in serum from mice, showing no significant change in ALT and AST. It was concluded that H. gordonii is able to reduce food intake, and this effect may be somehow linked to the dopaminergic and noradrenergic neurotransmission, having also anxiogenic activity evidenced by behavioral studies.

O Brasil destaca-se no cenário mundial em relação ao consumo de estimulantes anfetamínicos (ATS), e estudos nacionais têm evidenciado grande prevalência na utilização destas substâncias por motoristas profissionais. O fluido oral apresenta uma série de vantagens sobre as matrizes tradicionais para a monitorização do consumo de ATS no trânsito, e vem sendo empregada em diversos países. Este trabalho objetivou avaliar a especificidade de imunoensaios comerciais na detecção preliminar dos ATS comercializados no Brasil em amostras de fluído oral e desenvolver e validar um método para a confirmação e quantificação de anfetamina (AMP), metanfetamina (MET), anfepramona (DIE), fenproporex (FEN) e metilfenidato (MPH) no fluído oral por microextração em fase sólida (SPME) e cromatografia a gás com detector de massas (CG/EM). A especificidade analítica dos imunoensaios foi avaliada por meio do estudo das informações técnicas de diversos produtos e da realização de ensaios experimentais com três testes. O método confirmatório por SPME-CG/EM foi desenvolvido a partir da técnica de imersão (DI-SPME), sob agitação magnética, à temperatura ambiente, utilizando fibras revestida por polidimetilsiloxano (30 μm), propilcloroformato como agente derivatizante e adição de Na2CO3 e de Na2SO4 para aumentar o pH e a força iônica do meio, respectivamente. Os testes imunológicos atualmente disponíveis para a triagem de ATS em fluido oral são importados e não detectam, mesmo em altas concentrações, os principais ATS consumidos no Brasil: FEN, DIE e MPH. O método por SPME-CG/EM foi linear para os ATS estudados no intervalo de 2-256 ng.mL-1, exceto para o FEN cujo intervalo foi de 4-256 ng.mL-1. Os limites de detecção foram 0,5 ng.mL-1 (MET), 1 ng.mL-1 (MPH) e 2 ng.mL-1 (DIE, AMP, FEN). A exatidão do método situou-se entre 98,2 – 111,9% e a precisão não excedeu 15% de desvio padrão relativo. O método foi aplicado com sucesso na estimação do perfil farmacocinético do FEN e da AMP no fluído oral de seis indivíduos do sexo masculino, após a administração de dose única de especialidade farmacêutica nacional contendo 25 mg de cloridrato de FEN. / The Brazil stands out on the world as a major consumer of amphetamine-type stimulants (ATS), and several national studies have shown high prevalence in the consumption of these substances by professional drivers. Oral fluid has many advantages over the conventional biological fluids for monitoring ATS use on roads, and has been employed with this purpose in several countries. The aim of this study is to assess the specificity/cross-reactivity of commercial oral fluid immunoassays in detecting the prescription ATS marketed in Brazil and to develop and validate a method for confirmation and quantification of amphetamine (AMP), methamphetamine (MET), amfepramone (DIE), fenproporex (FEN) and methylphenidate (MPH) in oral fluid by solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Analytical specificity of immunoassays was evaluated through the study of the technical information of commercial products and through experimental testing of three kits. The confirmatory SPME-GC-MS method employed SPME immersion technique (DI-SPME), under magnetic stirring, at room temperature, using polydimethylsiloxane (30 μm) fibers, in-matrix propylchloroformate derivatization, Na2CO3 and Na2SO4 to increase both pH and ionic strength. Immunological tests currently available for ATS screening in oral fluid are imported and do not detect, even at high concentrations, the main ATS consumed in Brazil: FEN, MPH and DIE. The SPME-GC-MS method was linear for the studied ATS over the range of 2-256 ng.mL-1, except for FEN where the linear range was 4-256 ng.mL-1. The detection limits were 0.5 ng.mL-1 (MET), 1 ng.mL-1 (MPH) and 2 ng.mL-1 (DIE, AMP, FEN). Accuracy was within 98.2 – 111.9% of the target concentrations and precision did not exceed 15% of relative standard deviation. The method was successfully applied to estimate the pharmacokinetic profile of FEN and AMP in oral fluid of six male subjects after administration of a single dose of 25 mg FEN hydrochloride.

No mundo os acidentes de trânsito são responsáveis pela morte de aproximadamente 1,2 milhão de pessoas por ano. No Brasil, em 2014, foram mais de 44 mil óbitos no trânsito. O uso de substâncias psicoativas na direção é considerado um importante fator contribuinte para a ocorrência destes acidentes. Além do álcool, as drogas ilícitas mais utilizadas em nosso país são a anfetamina, a cocaína e a cannabis. As anfetaminas e a cocaína são utilizadas por motoristas de caminhão, que consomem para se manterem acordados por muitas horas e estão propensos a dormir ao volante. Portanto, há necessidade de conhecer o problema para que as autoridades competentes possam implementar políticas públicas relacionadas ao uso de drogas por motoristas e assim, minimizar os acidentes de trânsito no Brasil. Objetivo: Avaliar a prevalência do uso de substâncias psicoativas (anfetaminas, cocaína e cannabis) entre motoristas de caminhão que trafegavam em rodovias do Estado de São Paulo, através de análises toxicológicas em urina e correlacionar com dados sociodemográficos e ocupacionais. Métodos: Trata-se de estudo observacional do tipo transversal e a coleta dos dados foi realizada entre os anos de 2008 e 2012. Participaram do estudo 1.316 motoristas que, após assinarem o termo de consentimento livre e esclarecido e responderem a um questionário sobre dados sociodemográficos e ocupacionais, forneceram uma amostra de urina. Essas amostras foram analisadas por imunoensaio e por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas. Resultados: Das amostras coletadas, 7,8% (n=103) apresentaram resultados positivos para uma ou mais drogas pesquisadas e/ou seus metabólitos, dos quais 3,4% foram resultados positivos para anfetamina, 2,8% para cocaína e 1,1% para cannabis. O 0,5% restante correspondeu aos casos com mais de uma droga. Com exceção do ano de 2008, as três drogas pesquisadas foram encontradas em todos os anos da pesquisa. Os resultados das análises toxicológicas se distribuíram de formas distintas de acordo com algumas variáveis: a idade, o tempo de profissão e o estado civil estiveram associados com o uso de drogas, enquanto o vínculo empregatício, a etnia e a escolaridade não apresentaram associação. Em relação à viagem, estiveram associados ao consumo de drogas a distância e o tempo de descanso noturno. O descanso diurno, o tempo total e o viajado, as horas de direção sem descanso, o número de ocupantes e o tipo de carga não apresentaram correlações significativas com o uso de drogas. Também não houve associação estatisticamente significante entre o consumo de drogas e doenças como hipertensão arterial, diabetes mellitus e estresse, nem com a prática de atividades físicas. Por outro lado, essa associação foi encontrada com o consumo de álcool, referido pelos caminhoneiros. Conclusão: os resultados indicam o uso de substâncias psicoativas por caminhoneiros e que este uso está associado com a idade, o tempo de profissão e o estado civil, assim como com a distância percorrida e o tempo de descanso noturno / Traffic accidents are responsible for approximately 1.2 million deaths per year worldwide. In Brazil, there were more than 44,000 traffic-related deaths in 2014. The use of psychoactive substances while driving is considered a major contributing factor to the occurrence of these accidents. In addition to alcohol, the most used illicit drugs in our country are amphetamines, cocaine and cannabis. Amphetamines and cocaine are commonly used by truck drivers to stay awake for several hours because they are likely to sleep while driving. Therefore, it is necessary to understand better this problem in order to help authorities implement public policies related to drug use by drivers and thus minimize traffic accidents in Brazil. Objective: To evaluate the prevalence of psychoactive substance (amphetamines, cocaine and cannabis) use among truck drivers in the highways of the State of Sao Paulo by toxicological analysis in urine and to correlate it with sociodemographic and occupational data. Methods: This is an observational cross-sectional study in which data collection was carried out between 2008 and 2012. This study included 1,316 drivers who provided a urine sample after signing a consent form and answering to a questionnaire with sociodemographic and occupational data. The urine samples were analyzed by immunoassay and gas chromatography-mass spectrometry. Results: Of the total samples collected, 7.8% (n = 103) were positive for one or more tested drugs and/or its metabolites, with 3.4% positive for amphetamine, 2.8% for cocaine and 1.1% for cannabis. The remaining 0.5% corresponded to cases with more than one drug. The three drugs were found during most of the study period, except in 2008. Toxicological findings were distributed differently according to some variables: age, employment period and marital status were associated with drug use, while the employment type, ethnicity and education were not. Travel length and night rest period were also associated with drug use. Daytime rest period, travel length period, driving time without rest, number of occupants and freight content did not correlate significantly with drug use. In addition, there was no statistically significant association between consumption of drugs and diseases (such as hypertension, diabetes and stress) or physical activity. However, the association between alcohol use (reported by truck drivers) and drug use was found. Conclusion: The results indicate that the use of psychoactive substances by truck drivers is common and this use is associated with age, employment period and marital status, as well as distance traveled and night rest period

This thesis will address the mechanisms underlying amphetamine addiction, as well as the psychosis that may develop with amphetamine use.