Cette thèse présente la découverte de nouveaux inhibiteurs de l’amidotranférase ARNt-dépendante (AdT), et résume les connaissances récentes sur la biosynthèse du Gln-ARNtGln et de l’Asn-ARNtAsn par la voie indirecte chez la bactérie Helicobacter pylori. Dans le cytoplasme des eucaryotes, vingt acides aminés sont liés à leur ARNt correspondant par vingt aminoacyl-ARNt synthétases (aaRSs). Ces enzymes sont très spécifiques, et leur fonction est importante pour le décodage correct du code génétique. Cependant, la plupart des bactéries, dont H. pylori, sont dépourvues d’asparaginyl-ARNt synthétase et/ou de glutaminyl-ARNt synthétase. Pour former le Gln-ARNtGln, H. pylori utilise une GluRS noncanonique nommée GluRS2 qui glutamyle spécifiquement l’ARNtGln ; ensuite, une AdT trimérique, la GatCAB corrige le Glu-ARNtGln mésapparié en le transamidant pour former le Gln-ARNtGln, qui lira correctement les codons glutamine pendant la biosynthèse des protéines sur les ribosomes. La formation de l’Asn-ARNtAsn est similaire à celle du Gln-ARNtGln, et utilise la même GatCAB et une AspRS non-discriminatrice. Depuis des années 2000, la GatCAB est considérée comme une cible prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques, puisqu’elle est absente du cytoplasme de l’être humain, et qu’elle est encodée dans le génome de plusieurs bactéries pathogènes. Dans le chapitre 3, nous présentons la découverte par la technique du « phage display » de peptides cycliques riches en tryptophane et en proline, et qui inhibent l’activité de la GatCAB de H. pylori. Les peptides P10 (CMPVWKPDC) et P9 (CSAHNWPNC) inhibent cette enzyme de façon compétitive par rapport au substrat Glu-ARNtGln. Leur constante d’inhibition (Ki) est 126 μM pour P10, et 392 μM pour P9. Des modèles moléculaires ont montré qu’ils lient le site actif de la réaction de transmidation catalysée par la GatCAB, grâce à la formation d’une interaction π-π entre le résidu Trp de ces peptides et le résidu Tyr81 de la sous-unité GatB, comme fait le A76 3’-terminal de l’ARNt. Dans une autre étude concernant des petits composés contenant un groupe sulfone, et qui mimiquent l’intermédiaire de la réaction de transamidation, nous avons identifié des composés qui inhibent la GatCAB de H. pylori de façon compétitive par rapport au substrat Glu-ARNtGln. Cinq fois plus petits que les peptides cycliques mentionnés plus haut, ces composés inhibent l’activité de la GatCAB avec des Ki de 139 μM pour le composé 7, et de 214 μM pour le composé 4. Ces inhibiteurs de GatCAB pourraient être utiles pour des études mécanistiques, et pourraient être des molécules de base pour le développement de nouvelles classes d’antibiotiques contre des infections causées par H. pylori. / This thesis describes the discovery of inhibitors of a tRNA-dependent amidotransferase (AdT) and summarizes the present state of our knowledge about the two-step biosynthesis of Gln-tRNAGln and Asn-tRNAAsn in Helicobacter pylori. In eukaryotic cytoplasm, twenty amino acids (aa) are generally attached to their cognate tRNAs by twenty corresponding aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs). These enzymes have a high specificity, and their function is important to the proper decoding of mRNA. However, in a number of bacteria including H. pylori, GlnRS and/or AsnRS are absent. To synthesize Gln-tRNAGln, H. pylori first uses a noncanonical GluRS2 which is specific for tRNAGln to form Glu-tRNAGln; then the trimeric AdT (GatCAB) transforms Glu-tRNAGln into Gln-tRNAGln which is proper for protein biosynthesis. In a similar manner, the biosynthesis of Asn-tRNAAsn also takes place in H. pylori by using the same GatCAB and a canonical nondiscriminating AspRS. The widespread use of these indirect pathways among prominent human pathogens, and their absence in the mammalian cytoplasm, identify AdT as a promising target for the development of new and highly specific antimicrobial agents. By using phage display, we discovered several cyclic peptides rich in tryptophan and proline that inhibit H. pylori GatCAB. Peptides P10 (CMPVWKPDC) and P9 (CSAHNWPNC) are competitive inhibitors of GatCAB with respect to its substrate Glu-tRNAGln. The inhibition constants (Ki) of P10 and P9 are 126 and 392 μM, respectively. Their docking models revealed that they bind to the transamidation active site of GatB via π-π stacking interactions with Tyr81, as does the 3’-terminal A76 of tRNA. We also discovered two small dipeptide-like sulfone-containing inhibitors of H. pylori GatCAB by mimicking the intermediate of its transamidation reaction. Although they are much smaller than the cyclic peptides mentioned above, they are competitive inhibitors of GatCAB with respect to GlutRNAGln, with Ki values of 139 μM for compound 7 and 214 μM for compound 4. These inhibitors could be useful not only to study the reaction mechanisms of GatCAB, but also could be lead compounds for the development of a new class of antibiotics to treat infections caused by H. pylori.

Une des causes principales de la Maladie d’Alzheimer et des autres Tauopathies est la présence d’enchevêtrements neurofibrillaires (ENF). Les ENF sont des agrégations intracellulaires de la protéine Tau hyperphosphorylée. Plusieurs études ont montré que les ENF sont associés à la pathogénèse des troubles neurodégénératifs et à la neurotoxicité. De plus, il a été démontré qu’une diminution du niveau de la protéine Tau permet de prévenir les déficits cognitifs dans les modèles murins. Basé sur ces études, notre hypothèse de recherche est que réduire le niveau total de Tau dans le cerveau, pourrait diminuer les ENF et retarder la pathologie. Notre objectif est de développer une molécule capable de cibler l’ARNm de Tau plutôt que la protéine Tau hyperphosphorylée. Ainsi, nous avons développé le SOFA-delta ribozyme, capable de cliver l’ARNm de Tau. Notre ribozyme a trois composantes soit le bloqueur, le biosenseur et l’effecteur. Nous avons développé des deltaribozymes capable cibler les exons constitutifs et l’exon 10 (spécifique au Tau4R) de l’ARNm de Tau, ainsi nous pouvons cibler tous les isoformes de Tau. Dans ce projet, nous avons tout d’abord synthétisé le deltaribozyme par clonage moléculaire et nous avons confirmé son effet grâce au clivage in vitro. Dans un second temps, nous avons transfecté le ribozyme dans des cellules neuronales, et nous avons caractérisé son effet sur l’ARNm de Tau par RT-PCR. Enfin, nous avons produit des virus AAV, infecté des cellules neuronales et caractérisé encore une fois l’effet du ribozyme sur l’ARNm de Tau par RT-PCR. Cette approche thérapeutique est basée sur la spécificité et l’efficacité du SOFA-delta-ribozyme, qui identifie et coupe l’ARNm de Tau. Ainsi, dans ce mémoire nous avons identifié le ribozyme 350 et 395 comme candidats potentiellement capable de cliver l’ARNm de Tau. / One of the main causes of Alzheimer’s disease and Tauopathies is the presence of neurofibrillary tangles (NFT). NFT consist in intracellular aggregation of the abnormally hyperphophorylated protein Tau. Several studies have shown that NFT are associated with the pathogenesis of neurodegenerative disorders and neurotoxicity. Moreover, it has been demonstrated that decreasing the level of Tau protein could prevent cognitive deficits in mouse models. Based on these studies, our hypothesis is that reducing the level of total Tau in the brain could decrease NFTs and delay the pathology. Our objective is to design a molecule that will target directly Tau mRNA instead of the hyperphosphorylated protein. We developed a modified delta-ribozyme, the SOFA (Specific On/Off Adaptor) ribozyme, which is able to cleave the Tau mRNA. Our ribozyme is composed of three components: the blocker, the biosensor, and the effector. We have designed delta-ribozymes that target constitutive exons of Tau mRNA as well as the exon 10 specific of Tau 4R. Therefore, we can target all the Tau isoforms. In this project, we first synthesized the delta-ribozyme by molecular cloning and we confirmed its effect by in vitro cleavage. Secondly, by transfecting it in neuronal cells we characterized its effects on Tau mRNA by RT-PCR. Finally, we produced AAV viruses and infected neuronal cells and characterized its effects on Tau mRNA by RT-PCR. This therapeutic approach is based on specificity and efficiency of the SOFA-ribozymes, which identify and cut the Tau mRNA. Thus, in this project we identified ribozymes 350 and 395 as potential good candidates able to cleave the Tau mRNA.

Au centre du ribosome, lui-même centre de synthèse de toutes les protéines, se trouve quatre molécules d’ARN, nommées les ARNs ribosomiques. Ces ARNs sont synthétisés dans le nucléole des cellules eucaryotes à partir des gènes répétés en tandem, les gènes d’ARN ribosomiques. Ces gènes nécessitent une régulation très stricte de la transcription des ARN ribosomiques pour permettre un cycle cellulaire contrôlé et surtout contrôlable. En effet, un débalancement de la transcription des ARN ribosomiques a été observée dans de nombreuses maladies comme par exemple le cancer. En conséquence, l’étude de la régulation de la synthèse des ARN ribosomiques est d’une importance cruciale dans la compréhension et subséquemment le traitement de ces maladies. En raison du nombre de répétitions des gènes d’ARN ribosomiques, souvent évaluées aux alentours de 175 par génome haploïde pour les mammifères, l’étude in vivo de leur régulation est difficile par les techniques de mutagénèse. L’approche que j’ai développée durant cette thèse de doctorat est celle de l’immuno-précipitation de chromatine suivie de séquençage à haut débit (ChIP-Seq) en combinaison avec des lignées cellulaires conditionnelles pour des facteurs essentiels de la transcription ribosomique. Les gènes d’ARN ribosomique possèdent la particularité d’être transcrits grâce à une machinerie entièrement dédiée à sa transcription. Ces facteurs généraux de transcription agissent de concert pour effectuer efficacement leur rôle. Dans l’organisme modèle utilisé ici, à savoir Mus musculus, l’ARN polymérase I transcrit ces gènes avec l’aide, lors de l’initiation, des facteurs UBF, Rrn3/TIF-1A et SL-1/TIF-1B. Le facteur de terminaison TTF-1 permet de terminer la transcription de l’ARN précurseur, et joue plusieurs rôles dans la régulation de l’état des gènes. Dans un premier temps, nous avons été amenés à développer, en complément du séquençage à haut débit, une approche de déconvolution des données pour permettre d’améliorer l’interprétation subséquente. Cette approche a été validée par l’amélioration notamment des profils d’immuno-précipitation de chromatine obtenus avec l’ARN polymérase I qui montrent une distribution homogène le long des gènes d’ARNr comme montrée par la technique de Miller Spread. Cette amélioration des données a également pu mettre en avant un double rôle d’UBF en fonction soit de sa complémentarité avec SL-1 soit de son affinité pour les séquences riches en GC de l’ADN. Par la suite nous avons pu mettre en évidence la localisation des régions régulatrices et, en amont de ces régions, d’une barrière nucléosomique permettant de créer et maintenir une zone sans nucléosomes le long des gènes d’ARN ribosomiques. Cette barrière possède deux particularités. La première est d’être identifiée par les marques épigénétiques associées habituellement à l’activation de la transcription comme H3K4me3, H2A.Z ou encore l’acétylation de H2A.Z. La deuxième particularité est d’être indépendante de la présence d’UBF qui est elle-même indépendante de la transcription. Cependant, ce travail n’a pas détecté la présence des marques épigénétiques de l’activation de la transcription le long des gènes d’ARNr remettant en question certaines hypothèses sur la régulation de la transcription ribosomique. Finalement, les études en parallèle dans les cellules souche embryonnaires (mESC) et fibroblastes embryonnaires (MEF) a permis d’identifier 3 catégories de gènes ribosomiques dans une même cellule. Une première forme nucléosomale ou l’ADN est méthylé et hétérochromatique, une deuxième nucléosomale mais non méthylée et finalement une forme transcrite. Une comparaison quantitative de la synthèse d'ARNr dans les mESCs et les MEFs a montré que le nombre de gènes actifs n'est pas un facteur significatif dans la régulation de la synthèse d’ARNr. Dans des cellules souches embryonnaires, tous les gènes sont transcrits en même temps avec une faible efficacité. Dans des cellules différenciées, une faible portion des gènes est transcrite mais très efficacement, cette efficacité étant relié au nombre de polymérase en cours de transcription. Les différents profils d'interaction de Rrn3 et de PolI près du site d'initiation de la transcription suggèrent que cette différence est due à une régulation de l'initiation / At the heart of the ribosome, itself the center of synthesis of all proteins, are four RNA molecules, called ribosomal RNAs. These RNAs are synthesized in the nucleolus of eukaryotic cells from the tandemly repeated genes, the ribosomal RNA genes. A very strict regulation of the transcription of ribosomal RNA needs to be made to allow a controlled and above all a controllable cell cycle. Indeed, the imbalance of ribosomal RNA synthesis has been observed in many diseases such as cancer. Consequently, the study of transcriptional regulation of ribosomal RNAs is of crucial importance in the understanding and subsequent treatment of these diseases. Due to the number of repeats of ribosomal RNA genes, evaluated at around 175 per haploid genome for mammals, the in vivo study of their regulation by mutagenesis techniques is difficult. The approach I developed during this doctoral thesis is that of chromatin immunoprecipitation followed by high throughput sequencing (ChIP-Seq) applied to cell lines conditional for the basal transcription factors. The ribosomal RNA genes have the particularity of being transcribed thanks to an entirely dedicated transcriptional machinery. In mice, these general transcription factors act in concert to perform their role effectively. In the model organism used here, namely Mus musculus, RNA polymerase I transcribes the genes with the help, during initiation, of the factors UBF, Rrn3 / TIF-1A and SL-1 / TIF-1B. The TTF-1 termination factor makes it possible to terminate transcription of precursor ribosomal RNA, and also plays roles in gene regulation. In addition to high-throughput sequencing, we have developed a deconvolution approach to improve the interpretation of ChIP-Seq data. This approach has been validated by the improvement in particular of immunoprecipitation profiles obtained for RNA polymerase I that confirm the electron microscopy images of Miller spread type. This improvement of the data could also highlight a dual role of UBF depending on its complementarity with SL-1 and its affinity for GC-rich sequences of DNA. Subsequently we have been able to highlight the upstream localization of the regulatory regions and of a nucleosome barrier allowing to create and maintain a zone without nucleosomes along the rRNA genes. This barrier has two peculiarities, the first is that it contains the epigenetic marks usually associated with the activation of transcription such as H3K4me3, H2A.Z or the acetylation of H2A.Z. The second particularity is that it is independent of the presence of UBF, which is itself independent of transcription. Challenging certain assumptions about the regulation of ribosomal transcription, our work did not detect the presence of epigenetic markers of transcriptional activation throughout the rRNA gene body. Finally, parallel studies in embryonic stem cells (ESC) and embryonic fibroblasts (MEFs) made it possible to identify 3 categories of ribosomal genes in the same cell. First, a heterochromatic DNA methylated and nucleosomal form, a nucleosomal but non-DNA methylated form, and finally a transcribed form. A quantitative comparison of rRNA synthesis in ESCs and MEFs has shown that the number of active genes is not a significant factor in the regulation of rRNA synthesis. In embryonic cells, all genes are transcribed at the same time with low efficiency. In differentiated cells, a small portion of the genes are transcribed but very efficiently, this efficiency being related to the number of polymerase being transcribed. The different interaction profiles of Rrn3 and PolI near the transcription initiation site suggest that this difference is due to the regulation of initiation.

Ce travail de thèse porte sur l’étude des ARN polymérases ARN dépendant impliquées dans le RNA silencing chez Arabidopsis thaliana. Durant ma thèse, la recherche d'interacteurs des RDR, parmi des protéines impliquées dans le RNA silencing, a permis la détection d'interaction entre RDR6 et SDE3, RDR6 et SGS3, mais aussi entre SDE3 et SGS3 en Co-IP et BiFC. Une co-localisation de ces protéines a été observée lorsqu'elles sont produites transitoirement dans des cellules épidermales de N. benthamiana.Un crible d’une banque d’ADNc d’A. thaliana par double hybride de levure, a permis d’isoler des interacteurs potentiels de RDR6. Deux interacteurs potentiels, AtUAP56-1 et U2B’’, sont impliqués dans l’épissage des précurseurs des ARNm. Un effet sur le RNA silencing dans des mutants de l’épissage en 3’ des ARNm était connu et nous avons confirmé l’interaction entre RDR6 et AtUAP56-1 par BiFC. L’étude de lignées mutantes pour AtUAP56-1 a donc été initiée.Une étude biochimique de RDR6 et de RDR2 a été réalisée. Des formes recombinantes de RDR2 et RDR6 ont été produites de façon transitoire dans des feuilles de N. benthamiana, et une étude comparative de RDR2 et RDR6 a été réalisée. Les deux RDR sont actives sur des matrices ARN et ADN, et montrent in vitro une activité amorce-indépendante. De plus, nous avons détecté pour la première fois une activité amorce-dépendante de RDR6 et RDR2. Ces résultats apportent de nouvelles données biochimiques qui sont en accord avec les études menées in vivo et enrichissent les modèles actuels du RNA silencing. / The aim of this work was to study RNA-dependent RNA polymerases involved in RNA silencing in Arabidopsis thaliana. During my thesis, the search for RDR interactors among proteins involved in RNA silencing allowed the detection of interactions between RDR6 and SDE3, RDR6 and SGS3, and also between SDE3 and SGS3 using Co-IP and BiFC. In addition, the co-localisation of these proteins was observed when produced transiently in epidermal cells of N. Benthamiana.A screen of an A. thaliana cDNA library by yeast two hybrid allowed us to identify some putative new RDR6 interactors. Two putative RDR6 interactors, AtUAP56 and U2B’’, are known to be involved in pre-miRNA splicing. Furthermore, a link between pre-mRNA 3’ splicing and RNA silencing was previously reported. We also confirmed the interaction between AtUAP56-1 and RDR6 by BiFC. An investigation of A. thaliana of AtUAP56-1 mutants has been initiated.Recombinant RDRs were produced transiently in N. Benthamiana, and a biochemical comparative study of RDR2 and RDR6 performed. We found that RDR2, like RDR6, has a de novo polymerase activity on DNA and RNA templates, and for both RDRs we also showed, for the first time, a primer-dependant synthesis of dsRNA from RNA template. These findings provide important new insights into our understanding of the molecular mechanisms of RNA silencing amplification in Arabidopsis.

L’objectif de cette thèse était de progresser dans la compréhension de la régulation génique ARN‑dépendante chez les procaryotes. Le développement de nouvelles approches bioinformatiques a permis de découvrir de nouveaux ARN régulateurs non-codant (ARNrnc), de les caractériser notamment évolutivement et d’identifier leurs cibles putatives. Les ARNrnc ont en commun de pouvoir modifier l’abondance de certaines protéines en interagissant avec l’ARN messager (ARNm) qui les code. Cet effet peut être obtenu selon divers modes d’action qui mènent à la distinction de trois classes d’ARNrnc, les petits ARN régulateurs (pARN), les ARN cis-régulateurs (ARNcis) et les ARN antisens (ARNa). Avec la généralisation des approches d‘identification expérimentale des ARN (transcriptomique), il devient plus facile d’obtenir la liste des pARN que d'identifier les ARNm qu’ils ciblent. Dans le cas des ARNcis, c’est l’inverse, les méthodes expérimentales ne permettent pas de les identifier, mais une fois connus leurs cibles sont évidentes.Pour répondre à ces problématiques, nous avons principalement développé deux nouvelles méthodes : la première permet de prédire des couples pARN/ARNm en se basant leurs profils d’expressions, les résultats nous ont permis de proposer un réseau de régulation pour lequel les pARN auraient un rôle central dans la sporulation bactérienne. La seconde permet d’identifier de nouveaux ARNcis dans les génomes sur la base d’un profilage phylogénétique. Nos résultats nous conduisent à penser que le nombre de pARN et d’ARNcis dans les génomes est actuellement sous estimé. Nous proposons aussi la présence de plusieurs ARNcis chez une Archée, dont un candidat capable de détecter des variations de températures.Les avancées réalisées lors de cette thèse ont permis de mieux appréhender l’importance des ARNrnc dans la régulation génique. Les ARNrnc sont présents dans plus d’organismes et en plus grand nombre que ce que nous le pensions jusqu’à présent. Ces résultats constituent des éléments supplémentaires en faveur d’un rôle plus central des pARN que ce qui était admis jusqu’alors. / The aim of this thesis was to improve our understanding of the RNA-dependent gene regulation in prokaryotes. Newly developed bioinformatics approaches revealed new non-coding regulatory RNAs and allowed us to identify putative targets.Regulatory RNAs can change the abundance of certain proteins by interacting with cognate messenger RNAs (mRNA). This effect is achieved through various modes of action that lead to the distinction of three RNA classes: small RNA (sRNA), cis-regulatory RNA (cisRNA) and antisense RNA (asRNA). With the generalization of experimental RNA identification (transcriptomics), it becomes easier to obtain the list of expressed RNA but most of their target mRNA remain unknown. Conversely, cisRNA cannot be easily identified through experimental procedures but their targets are obvious.To address these issues, we developed two new methods: the first predicts pairs of sRNA and mRNA targets based on the analysis of expression profiles and led us to propose a new regulatory network with sRNAs playing a central role in bacterial sporulation. The second identifies new RNAs in genomes based on the analysis of phylogenetic profiles. Our results suggest that the abundance of sRNAs and cisRNA were previously underestimated. We also suggest the presence of several cisRNAs in an Archaea, including a strong candidate of thermosensitive regulator.Progress made in this thesis contributed to a better understanding of RNA importance in bacterial cell regulation. Regulatory RNAs are abundant and present in more organisms than expected previously. These results are new evidences that the physiological roles of sRNAs are more central than was previously thought.

Les virus à ARN sont à l’origine de nombreuses épidémies depuis ces dernières décennies. Malgré des avancées thérapeutiques majeures, une majorité d’infection est orpheline de traitement. Le développement d’antiviraux à spectre large est une alternative thérapeutique pour maximiser le nombre de virus ciblés, minimiser les coûts de production et améliorer la prise pour les patients. Afin de trouver de nouvelles cibles cellulaires, la compréhension des mécanismes moléculaires utilisés par les virus pour infecter l’hôte est essentielle.Les virus utilisent des facteurs cellulaires pour survivre et se propager. Parmi ceux-ci, on trouve les microARNs (miARNs) et les longs ARNs non-codants (lncARNs) qui peuvent participer à la réponse antivirale mais peuvent également être détournés par les virus pour favoriser l’infection. Ces d’ARN non-codants peuvent interagir avec des protéines cellulaires (« RNA-binding protein » (RBP)) telles que la protéine KSRP. Cette RBP est impliquée dans le contrôle de l’expression des ARNs en participant à l’épissage de certains pré-ARNm, à la dégradation des ARNs contenant des séquences riches en AU et à la maturation de certains miARNs. Ses fonctions et sa localisation sont dépendantes de la phosphorylation de certains résidus par les kinases cellulaires Akt, ATM et p38/MAPK.Le but de ma thèse a été d’étudier la modulation de l’expression de ces deux classes d’ARN non-codants au cours de l’infection par des virus à ARN tels que le virus de l’Hépatite C (VHC) et la souche HCoV-229E des Coronavirus. Plus particulièrement nous avons cherché à étudier l’implication de KSRP dans la régulation d’ARN non-codants essentiels pour ces infections.Mes recherches ont commencé par l’étude de la maturation du microARN-122 (miR-122), un facteur proviral de l’infection par le VHC. Nous avons montré que KSRP phosphorylée sur le résidu S193 par Akt interagissait avec le complexe nucléaire DROSHA/DGCR8 et ainsi était essentielle à la maturation du pri-miR-122 en miR-122 favorisant la réplication virale. Notre avons ensuite étudié le rôle des phosphorylations de KSRP par ATM et p38/MAPK sur la réplication et sur la maturation du miR-122. La phosphorylation par ATM ne semble pas jouer un rôle majeur sur ces deux paramètres. En revanche, la phosphorylation de KSRP sur le résidu T692 par la kinase p38/MAPK semble jouer un rôle positif sur la réplication VHC.Dans un second temps, par homologie avec les résultats obtenus dans le cas du VHC, nous avons étudié le rôle de KSRP lors de l’infection par la souche HCoV-229E des Coronavirus. En transfectant un siKSRP ou un plasmide exprimant la protéine KSRP, nous avons pu démontrer que KSRP était un facteur proviral pour la réplication virale.Afin d’identifier les ARN non-codants modulés au cours de l’infection HcoV-229E et dont l’expression pouvait être régulée par KSRP, nous avons effectué deux analyses de séquençage à haut débit (« NGS »). L’analyse réalisée sur des cellules infectées vs non-infectées nous a permis d’identifier l’ensemble des miARNs et lncARNs dérégulés par le virus. Nous avons croisé ces résultats avec un second « NGS » fait sur des cellules infectées, inhibées pour KSRP et nous avons trouvé que l’expression du LinC00473 était modulée dans les deux conditions expérimentales. En étudiant ce facteur cellulaire au cours de l’infection nous avons observé une forte induction KSRP-dépendante du LinC00473 à 24 h post-infection, puis une diminution à 48 h post-infection. L’inhibition de ce facteur entraîne une diminution de la réplication virale suggérant que le LinC00473 est un facteur proviral au début de l’infection.Nos résultats ont permis de montrer le rôle proviral de la protéine KSRP lors de deux infections virales (VHC et HCoV-229E des Coronavirus). Son implication dans la régulation de l’expression des ARNs fait de cette protéine un outil efficace pour découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques ARN non-codants au cours d’autres infections virales. / Résumé en anglaisRNA viruses have been the cause of many epidemics in recent decades. Despite major therapeutic advances, a majority of infection is currently orphan for treatment. The development of new broad spectrum antivirals is a therapeutic alternative to maximize the number of targeted viruses, minimize production costs and improve access to population. In order to find new cellular targets for this type of therapeutic approach, understanding the molecular mechanisms used by RNA viruses to infect the host is essential.Viruses exploit cellular factors to survive and to disseminate. Among those factors, microRNA (miRNA) and long non-coding RNA (lnCRNA) can participate to cellular antiviral response but can also be hijacked by the virus to improve the infection. These two families of non-coding RNA could interact with cellular RNA-binding protein (RBP) such as KSRP. This ubiquitous protein is involved in RNA expression control via its participation to pre-mRNA splicing, decay of AU-rich element mRNA and maturation of microRNAs. The functions and localization of KSRP are dependent of post- modification by the cellular kinases Akt, ATM and p38/MAPK.The aim of my thesis was to study the modulation of the expression of these two classes of non-coding RNA during infection by RNA viruses such as the hepatitis C virus (HCV) and the HCoV-229E strain of the Coronaviruses. More specifically, we evaluated the involvement of KSRP in the regulation of non-coding RNAs essential for these infections.My research project began with the study of microRNA-122 (miR-122) the maturation. This miRNA is a proviral factor for HCV infection. We have shown that the Akt-dependent phosphorylation of S193-KSRP promoted the interaction of pri-miR-122 with the DROSHA / DGCR8 nuclear complex and thus was essential for the maturation of miR-122, finally promoting viral replication. We then investigated the role of KSRP phosphorylation by ATM and p38 / MAPK on viral replication and on miR-122 maturation. ATM phosphorylation does not seem to play a major role in these two parameters. In contrast, phosphorylation of KSRP on the T692 residue by p38 / MAPK kinase appears to play a positive role on viral replication.In a second step, by homology with the results obtained in the case of the HCV infection, we studied the role of KSRP during the infection with the HCoV-229E strain of Coronaviruses. After siKSRP transfection or exogenous expression of the KSRP protein, we were able to demonstrate that KSRP was a proviral cellular factor for HCoV-229E replication.In order to characterize the modulation of non-coding RNAs expression during HcoV-229E infection and to identify the non-coding RNAs whose expression could be regulated by KSRP, we performed two high-throughput sequencing ("NGS") assays. The analysis performed on infected and non-infected cells allowed us to identify all the miRNAs and lncRNAs whose expression was altered by the virus. We cross-examined these results with a second "NGS" performed on HCoV-229E infected cells inhibited for KSRP. We found that the expression of an InCARN (LinC00473) was modulated under both experimental conditions. We demonstrated a strong KSRP-dependent induction of LinC00473 expression at 24 h post-infection, then a decrease at 48 h post-infection. Inhibition of this factor results in decreased viral replication suggesting that LinC00473 is a proviral cell factor at the onset of infection.Our results have shown the proviral role of the KSRP protein during two viral infections (HCV and HCoV-229E of the coronaviruses). Its involvement in the regulation of RNA expression makes of KSRP an effective tool for discovering new non-coding RNA therapeutic targets for other viral infections

Les éléments transposables (ET) sont des parasites génomiques présents dans tous les génomes, dont une partie présente une structure similaire à celle de certains virus. Dans les cellules ovariennes d'insecte, l'abondance des transcrits d’ET est contrôlée par ARN interférence (ARNi), et plus particulièrement par la voie piARN (Piwi-interacting RNA). Une autre voie d'ARNi, la voie siARN (Small interfering RNA), constitue l'une des principales réponses immunitaires des insectes contre les infections virales, et est aussi dédiée au contrôle somatique des ET. Ces deux voies d'ARNi sont dirigées par des effecteurs moléculaires distincts et décrites comme indépendantes. Cependant, des similitudes structurales et de mécanisme de contrôle entre les ET et les virus suggèrent la possibilité d’une interaction. Nous avons utilisé la drosophile comme modèle et infecté l'organisme avec le virus Sindbis (SINV), un arbovirus (Arthropod-Borne virus), ou le virus Sigma (SV), un virus spécifique de drosophile. À l'aide d'un séquençage à haut débit, nous avons caractérisé les répertoires d'ARN et de petits ARN interférents produits par les drosophiles infectées, à partir des tissus de carcasses ou d'ovaires. Globalement, nos résultats démontrent un impact de l'infection virale sur les quantités de transcrits d’ET via la modulation des répertoires piARN et siARN, et représentent la première démonstration des effets d’infections virales sur l’activité des ET. Plus précisément, l’infection par SINV favorise une diminution globale des quantités de transcrits d’ET alors que l’infection par SV réactive de nombreux ET. Nos données suggèrent que la modulation résulte de substrats d'ARN partagés et de trans-régulateurs communs des voies de l'ARNi. Ces résultats ouvrent un nouvel axe de recherche en génomique, suggérant que les épidémies virales ou les infections chroniques peuvent avoir un impact sur l'activité des ET, et donc sur le taux de diversification génétique ultérieure / Transposable elements (TEs) are genomic parasites that are found in all genomes, a part of which display structure similarity to some viruses. In insect ovarian cells, TE transcript abundance is controlled by RNA interference (RNAi) machinery and more particularly by the piRNA pathway (Piwi-interacting RNA). Another RNAi pathway, named siRNA pathway (Small interfering RNA), is one of the key insect immune responses against viral infections and is also dedicated to TE somatic control. These two interfering RNA pathways are led by distinct molecular effectors and described as independent. However, similarities in structure and control mechanisms across TEs and viruses suggest that an interplay may exist. We used Drosophila as a model, and infected the organism with Sindbis virus (SINV), an arbovirus (Arthropod-Borne virus), or Sigma virus (SV), a Drosophila-specific virus. Using high-throughput sequencing, we characterized the RNA and small-RNA repertoires produced by Drosophila flies from carcass or ovary tissues. Overall, our results demonstrate an impact of viral infection on TE transcript amounts via modulation of the piRNA and siRNA repertoires and represent the first demonstration of the effects of viral infection on TE activity. More precisely, SINV infection promotes a global decrease of TE transcript levels while SV infection reactivates many TEs. Our data suggest that the modulation results from shared RNA substrates and common trans-regulators of the small RNA pathways. These results open new avenue of research in genomics, suggesting that viral epidemics or chronic infections can impact TE activity and thus the rate of subsequent genetic diversification

L'interférence par l'ARN (ARNi) désigne la dégradation spécifique de séquence des ARN induite par des ARN double brin. Dans les cellules de mammifères, l'ARNi peut être induite par des petits ARN interférants (siARN). L'ARNi est effectuée par le complexe RISC (RNA induced silencing complex) contenant, entre autre, la séquence d'ARN guide, qui permet la reconnaissance de la cible et la nucléase Ago2, responsable de son clivage.<br />Ces travaux ont porté sur l'analyse cinétique de la dégradation des ARNm induite par les siARN dans des cellules de mammifères. Nous avons mesuré les vitesses de dégradation des ARNm de β-globine et de lymphotoxine-α sous interférence et montré, d'une part, que les différences d'efficacité des siARN sont liées à des différences de vitesses de dégradation et, d'autre part, que ces vitesses s'accélèrent entre 16h et 24h après la transfection pour deux siARN inhibant 80 à 90% des messagers. Nous avons aussi observé qu'un même siARN induit des inhibitions différentes pour les deux messagers de la lymphotoxine-α, ce qui nous a amené à proposer l'existence d'une interaction entre la traduction et l'interférence par l'ARN. <br />Nous avons analysé l'impact de l'interférence sur le métabolisme nucléaire des ARNm. Nous avons ainsi démontré que les siARN induisent la dégradation des ARN nucléaires avec une efficacité qui dépend d'une compétition cinétique entre l'interférence et les réactions de maturation et d'export qui affectent le transcrit ciblé. De plus, nous avons observé que la dégradation d'un ARN messager pouvait s'accompagner d'une accumulation de ses précurseurs, probablement par une augmentation de synthèse. Ainsi, l'interférence permet-elle de mettre en évidence de nouvelles régulations du métabolisme nucléaire des ARN.

Durant ma thèse, je me suis intéressé à deux ARN régulateurs procaryotiques. Le premier, l'ARNIII, est un ARN multifonctionnel qui régule l'expression des gènes de virulence chez Staphylococcus aureus. Le second, CopA, est un ARN strictement complémentaire à sa cible et régule le taux de réplication du plasmide R1. L'ARNIII réprime l'expression des facteurs d'adhésion et active la synthèse des toxines en fin de phase exponentielle de croissance. Nous avons montré que le domaine 3' de l'ARNIII est nécessaire et suffisant pour l'inhibition de l'expression de deux protéines au niveau post-transcriptionnel, la protéine A et SA1000. La fixation de l'ARNIII à ses cibles est initiée par un contact boucle-boucle qui est rapidement converti en un duplex étendu. Ce duplex est ensuite la cible de la RNase III pour induire la dégradation rapide de l'ARNm. Nous avons également montré que la protéine Hfq est un ligand de l'ARNIII. Cette protéine est généralement impliquée dans des mécanismes de régulation basés sur des ARN régulateurs. La fonction de cette interaction dans la virulence de S. aureus est en cours d'étude.<br />L'ARN antisens CopA régule le taux de réplication du plasmide R1 en contrôlant la synthèse de la protéine initiatrice de la réplication, RepA. La fixation de CopA à sa cible, l'ARNm repA, inhibe la traduction et favorise la dégradation de l'ARNm par la RNase III. L'interaction entre les deux ARN conduit à la formation d'un complexe irréversible. Ce complexe n'est pas un duplex étendu, mais contient une jonction à quatre hélices stabilisée par une longue hélice intermoléculaire, l'hélice C. Nous avons montré que les structures des deux ARN ont évoluées afin de bloquer la progression du complexe irréversible vers le duplex étendu. De plus, nous avons montré que au sein du complexe irréversible, l'hélice C est reconnue efficacement par la RNase III au niveau de sites préférentiels.

Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche, provoque près de 200000 morts par an dans le monde. Malgré une forte couverture vaccinale, une réémergence de la maladie a été observée dans les pays développés, liée en partie à une adaptation à la pression vaccinale. Les souches capables d’échapper à la réponse immunitaire montrent des réarrangements génomiques importants, provoqués par des éléments génétiques mobiles (IS) présents en plus de 230 copies, qui pourraient impacter sur la transcription des gènes et ARN régulateurs du pathogène.Pour élucider l’impact des IS sur le transcriptome global de Bordetella pertussis, nous avons d’abord déterminé le transcriptome codant et non-codant du pathogène par des approches de séquençage d’ARN couplées à des prédictions bioinformatiques. Cette étude a permis d’identifier les structures codantes mono- et polycistroniques, incluant des structures régulatrices telles que des riboswitches, un excludon et de longs 5’ et 3’UTR chevauchants. Une cartographie de candidats ARN régulateurs non-codant a été édifiée à partir de nouveaux transcrits localisés en régions intergéniques (IGR) et de transcrits orientés en antisens de séquences codantes. Des prolongements de transcriptions des IS ont été observés, prenant leur origine de promoteurs internes à l’IS ou formés par insertion de celles-ci. Ces transcrits sont spécifiques d’une souche à l’autre du pathogène, et s’orientent en sens ou en antisens des gènes environnant, ou dans des IGR. Le potentiel caractère régulateur de ces transcrits a été étudié par la caractérisation et l’étude du mode d’action d’un ARN régulateur, BPnc264, orienté en antisens du gène de virulence fim2. / Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough, is responsible of more than 200000 deaths worldwide. Despite a high vaccine coverage in developed countries, a reemergence of the disease has been observed, which is in part linked to vaccine-pressure. Strains able to evade vaccine-induced immunity show high genome organization rearrangements, essentially due to mobile genetic elements (IS) present in more than 230 copies, which could impact on messenger and regulatory transcription of the pathogene.To assess the impact of IS on the global transcriptome of Bordetella pertussis, we first determined the coding and non-coding primary transcriptome by a combination of differents RNA-sequencing approaches and predictive bioinformatics analysis software packages. We identify mono- and polycistronic coding structures, including regulatories structures like riboswitches, excludon, and long overlapping 5’ and 3’UTR. A list of candidates regulating transcripts (small RNA) has been mapped from new transcripts located in intergenic regions (IGR) and transcripts oriented in antisense of annotated coding sequences. Extended transcriptions emerging from IS elements have been observed, originating from internal promoters or newly formed promoters by insertion in a specific genomic region. Those transcripts can extend in sense or in antisense of the flanking gene, or in IGR. The regulatory function of those transcripts has been studied from the characterization and the mode of action of an extended regulatory RNA, BPnc264, oriented in antisense of the virulence gene fim2.