Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Les suppresseurs de tumeurs Rb, p53, INK4a et ARF sont essentiels et ils sont partie intégrante d'un réseau complexe qui régule le cycle cellulaire ainsi que la réponse aux stress oncogéniques. La biogénèse des ribosomes, donc la synthèse et l'assemblage des ribosomes, est une activité essentielle pour la prolifération cellulaire et est fortement affectée par les changements environnementaux ainsi que différentes formes de stress. Il est donc peu surprenant d'apprendre que plusieurs suppresseurs de tumeurs et oncogenes, dont Rb, ARF, p53 et MDM2 travaillent de concert ou en opposition afin de maintenir le niveau de la production de ribosomes à un niveau optimal pour répondre à la demande cellulaire. ARF, un des produits du gène CDKN2A, est reconnu pour causer la stabilisation de p53 en inhibant son ubiquitine ligase MDM2 et ainsi induire l'arrêt du cycle cellulaire et/ou l'apoptose. ARF peut aussi être un suppresseur de tumeurs en l'absence de p53/TP53, car il peut causer un arrêt de prolifération en inhibant, en partie, la synthèse des ARN ribosomiques (ARNrs) dans des cellules p53-/-. ARF cause l'ubiquitination et la dégradation de la chaperonne NPM/B23 qui est impliquée dans la maturation de l'ARNr 28S, cependant ARF inhibe aussi la production de l'ARNr 18S ainsi que l'ARNr précurseur (47S). L'effet de ARF sur NPM n'explique pas l'ensemble des effets de ARF sur la production et la maturation des ARNrs. Nous avons démontré que ARF contrôle la localisation sub-nucléaire du Facteur de Terminaison de la Transcription de la Polymerase I, TTF-I. TTF-I est dynamique et se déplace entre le nucléoplasme et le nucléole avec l'aide de NPM et d'un signal de localisation nucléolaire dans son domaine de régulation en N-terminal. ARF inhibe la localisation nucléolaire de TTF-I en interagissant avec le signal de localisation nucléolaire causant son accumulation dans le nucléoplasme. La réduction de TTF-I récapitule les effets de ARF sur la synthèse et la maturation des ARNrs et le phénotype est récupéré par l'introduction d'un transgène de TTF-I. La surexpression de TTF-I affecte, de façon similaire à une réduction, la biogénèse des ribosomes et le niveau cellulaire de TTF-I est critique et régulé par l'ubiquitine ligase MDM2. ARF inhibe l'interaction de MDM2 avec TTF-I ainsi que son ubiquitination. De plus, ARF et Senp3 régulent la sumoylation de TTF-I. Nos résultats montrent comment ARF, NPM et MDM2 peuvent réguler et limiter la synthèse des ARNrs.

Les enképhalines (ENK), étant neuromodulateurs, ont un rôle prépondérant dans plusieurs circuits neuronaux tels que ceux de la récompense, la peur et l’anxiété. Dans cette étude, nous avons ciblé les ENK et atténué leur expression dans le noyau accumbens et l’amygdale centrale par le biais d’injections de vecteurs lentiviraux exprimant un shRNA spécifique à l’ENK. Les injections des lentivirus exprimant un shENK ont été comparées à des hémisphères intacts et à des injections du même vecteur exprimant un shRNA témoin, pour révéler des diminutions de l'ARNm des ENK de 62 %. Ces quantifications ont été validées in vivo par la comparaison du signal radioactif des sondes pour l’ARNm des ENK dans les régions infectées par le virus, ces régions ayant été identifiées par immunohistochimie. Nous démontrons une spécificité de l’atténuation de l’ARNm des ENK puisqu’aux sites des injections, il n'y a pas eu de diminution de l’ARNm de la GAD65. / Enkephalin (ENK), a prominent endogenous opioid mediator of the behavioural response, elicits its function in important circuits of the brain such as reward, fear and anxiety. In this study, we have targeted the downregulation of ENK expression by the delivery of a lentiviral vector with an expressing shRNA specific to ENK mRNA in ENK rich regions, such as the nucleus accumbens and central amygdala. By injecting a vector expressing an shENK and comparing it to non-injected hemispheres, as well as to injections of the same vector yet expressing a scrambled shRNA, we have observed an average downregulation of 62% ENK mRNA. Quantifications were performed in vivo, by collecting the in situ hybridization radioprobe signal for ENK mRNA of regions infected by the virus; the latter visualized immunohistochemically. Our results show a knockdown specificity of ENK mRNA and tissue integrity, as demonstrated by the lack of GAD65 mRNA disruption.

L'une des premières réponses observées lorsque des cellules sont soumises à un stress est la diminution de la traduction suite à la destruction des polyribosomes. Les ARNm, qui auparavant étaient traduits, ne sont pas détruits durant ce processus. Il est donc possible d'observer l'accumulation d'une réserve d'ARNm et de mRNP réprimées sous forme de granules de stress intimement liées à la matrice cellulaire résiduelle. La présence de plusieurs protéines impliquées dans la stabilisation et la destruction des ARNm et des protéines soulève l'hypothèse que ces granules de stress servent aussi de site de triage afin de ne conserver que les RNP résistantes au stress. Ces granules cytoplasmiques étant peu connus, nous avons cherché à mieux connaître les RNP impliquées dans ce phénomène. Nos tentatives d'isoler les granules de stress n'ayant pas réussi, vu leur forte association avec la matrice cellulaire résiduelle, nous avons concentré nos efforts sur la comparaison des profils protéiques de la matrice cellulaire résiduelle avant et après un choc thermique. Cette approche nous a permis d'observer une augmentation de la concentration de plusieurs protéines de la matrice cellulaire, protéines qui pourraient être identifiées dans le futur.

La croissance ovocytaire comprend l'établissement de projections transzonales formant un réseau de communication entre le gamète et les cellules somatiques entourant ce dernier. Une accumulation des ARNm dans le cytoplasme se produit lors des premiers stades de croissance de l'ovocyte afin de soutenir la maturation durant le silence transcriptionnel qui perdure jusqu'à l'activation du génome embryonnaire. Selon l'espèce, cette période peut durer des jours voir des semaines nécessitant une grande stabilité des ARNm maternels. Il est connu que la communication entre l'ovocyte et les cellules somatiques ainsi que l'utilisation des réserves d'ARNm sont essentielles pour l'acquisition des compétences de l'ovocyte afin de soutenir la fécondation et le développement embryonnaire précoce. Des modifications chimiques connues comme ayant un rôle stabilisateur, tel que la méthylation, ont également été détectées sur les ARNm. L'hypothèse est que des modifications chimiques de l'ARNm, soit l'ajout de groupements méthyles, sont impliquées dans la stabilisation des transcrits au sein de l'ovocyte durant le silence transcriptionnel. Le réseau de communication pourrait jouer un rôle en faisant le transfert de protéines permettant la méthylation de l'ARNm. Les objectifs sont de détecter les différentes modifications chimiques ayant lieu dans le transcriptome de l'ovocyte ainsi que localiser et caractériser les protéines ayant pour rôle de catalyser, détecter et inverser les modifications chimiques identifiées sur l'ARN. Différents types de modifications post-transcriptionnelles ont été détectées au sein de l'ovocyte et les résultats montrent que m⁶A et m⁵C sont les modifications les plus abondantes. La caractérisation des protéines impliquées dans ces modifications dans l'ovaire et l'ovocyte de la souris, du porc et du bovin montre une activité de méthylation différente selon l'espèce durant la folliculogenèse et l'ovogenèse. De plus amples recherches devront être réalisées afin de bonifier la compréhension des mécanismes impliqués dans la production d'un ovocyte de qualité. Les travaux présentés contribuent à l'avancement de ces connaissances. / Oogenesis, which occurs within the ovarian follicle, is a process closely link to folliculogenesis. The oocyte growth mainly involves the establishment of a communication network between the gamete and surrounding somatic cells. During the early stages of oocyte growth, the gamete accumulates mRNAs in its cytoplasm to support maturation and first cell division during transcriptional silencing until the embryonic genome activation. This period can last from days to weeks depending on the species requiring long stability from maternal mRNAs. It is known that communication between oocyte and somatic cells and use of mRNA reserves are essential for oocyte competence acquisition to sustain fertilization and early embryogenesis. Chemical modifications known to have stabilizing role, such as methylation, have also been detected on the mRNAs. The main hypothesis is the chemical modifications of mRNA, by the addition of methyl groups, that are involved in stabilizing and managing transcripts within oocyte during transcriptional silencing. The communication network could have a role in enabling proteins transfer from cumulus cells allowing mRNA methylation. Objectives are to detect various chemical modifications taking place in oocyte transcriptome and to locate and characterize proteins having role of managing the chemical modifications identified on RNA. Many post-transcriptional modifications have been detected within the oocyte and results have shown that m⁶A and m⁵C are modifications with higher abundant expression. Proteins characterization involved in these post-transcriptional modifications in ovary and oocyte of mouse, swine and bovine showed methylation activity during folliculogenesis and oogenesis. More research is needed to improve understanding of mechanisms involved in oocyte competences acquisition, but the present study has contributed to the advancement of this knowledge.

La protéine de liaison à l’ARN, Fragile Mental Retardation Protein (FMRP) est une protéine conservée dans l'évolution et particulièrement abondante dans le cerveau en raison de sa forte expression dans les neurones. L'absence de FMRP est responsable du syndrome du X Fragile, première cause du retard mental héréditaire. Cette protéine semble jouer un rôle important dans la régulation de la traduction des ARNm, puisqu’elle se retrouve sur les polyribosomes en traduction active. Elle se retrouve également dans des structures contenant des ARNm sous forme réprimée ce qui suggère qu’elle se comporte plutôt comme une protéine ayant un rôle de répresseur traductionnel. Il a déjà été montré que la surexpression de la protéine FMRP chez les mammifères peut induire la formation de granules cytoplasmiques d'ARN qui ressemblent aux granules neuronaux et aux granules de stress. Les mécanismes de formation de ces granules FMRP et leur dynamisme sont cependant totalement inconnus. Contrairement à FMRP chez les mammifères qui a deux homologues (FXR1 et FXR2), la drosophile possède un seul gène codant pour dFMRP. L'utilisation de ce modèle simple nous a permis d’étudier la formation des granules dFMRP et le rôle de dFMRP dans la formation des granules de stress. Nous avons pu montrer que l'expression de dFMRP dans les cellules de la drosophile induit la formation de granules dynamiques. La formation de ces granules dFMRP se fait sans activation d’une réponse générale au stress et leur mécanisme de formation ne ressemble pas à celui des granules de stress. La formation de ces granules implique le domaine de dimérisation de dFMRP. Ce domaine ne semble cependant pas important pour le recrutement de la protéine dans les granules de stress. Nos expériences de FRAP montrent que le domaine de dimérisation de dFMRP est plutôt nécessaire à la mobilité de la protéine entre les granules de stress et le cytoplasme. Dans l'ensemble, nos études suggèrent que la dimérisation de dFMRP est un événement important pour l’induction des granules-dFMRP et permet le trafic de dFMRP entre les granules à ARN et le cytoplasme.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La sérine/thréonine kinase mTOR (mammalian target of rapamycin) participe à un rétrocontrôle négatif envers la voie IRS-1/PI3K/Akt. Dans les adipocytes et les myocytes, l'inhibition aiguë de la voie mTORCl/S6Kl augmente la signalisation de l'insuline par la voie IRS-1/PI3K/Akt et le transport du glucose en empêchant la phosphorylation négative d'IRS-1 sur serine. Dans cette étude, l'utilisation de l'interférence à l'ARN dans les adipocytes 3T3-L1 a confirmé le rôle des protéines mTOR, raptor et S6K1 dans le rétrocontrôle négatif sur la signalisation métabolique de l'insuline. Cependant, l'inhibition chronique de la voie mTORCl/S6Kl mène également à une réduction de l'action de l'insuline sur le transport du glucose. Cette dichotomie entre l'activation de la PI3K et le transport du glucose est attribuable à une diminution imprévue de l'activation d'Akt2 et de l'expression de GLUT4. Ainsi, l'inhibition chronique de la voie mTORCl/S6Kl pourrait ne pas être une approche efficace pour rétablir la sensibilité à l'insuline.

Des mutations dans plusieurs gènes ont été liés à la sclérose latérale amyotrophique (SLA),en particulier dans celui codant pour la protéine Fused in Sarcoma (FUS). Les mutations sont retrouvées dans la partie codant pour le signal de localisation nucléaire, rendant la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d’autres observations, ça suggère qu’un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l’origine de la neurodégénérescence. La SLA est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et cause une paralysie progressive. Les mécanismes moléculaires causant la maladies ont toujours inconnus. Une des pistes serait la perturbation de la traduction locale desARNm, qui permet aux synapses de répondre rapidement et indépendamment du corps cellulaire. Une traduction locale insuffisante pour soutenir l’activité synaptique à long terme mènerait à la perte des synapses et à la neurodégénérescence. Mon objectif est donc de déterminer le rôle de FUS dans régulation de la traduction des ARNm en caractérisant son interaction avec les composantes traductionnelles et d’évaluer sa fonction dans une condition reproduisant les caractéristiques de la SLA. J’ai montré que FUS s’associe aux polyribosomes inactifs, ce qui suggère que FUS jouerait un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en interagissant avec le cœur de la traduction. Il est également possible d’observer une augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme et de son interaction avec les polyribosomes suite à une inhibition de la traduction par mTOR, suggérant son rôle de régulateur négatif. De plus, les mutations liées à la SLA amplifient la fonction inhibitrice de FUS en rendant FUS cytoplasmique et en réduisant la synthèse des protéines. Mes résultats montrent que la protéine FUS aurait un rôle d’inhibiteur de la traduction quand celle-ci est cytoplasmique. Par conséquent, l’augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme dans la SLA entrainerait une inhibition de la traduction importante, à un niveau insuffisant pour soutenir l’activité synaptique. / Mutations in several genes have been linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS),particularly in the gene coding for the Fused in Sarcoma protein (FUS). Those mutations are found in the part encoding for the nuclear localization signal, making the protein abnormallyabundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it suggests that a toxic gainof function of FUS in the cytoplasm would be the cause of the neurodegeneration. ALS is a neurodegenerative disease that affects motor neurons and causes progressive paralysis. The molecular mechanisms causing the disease are still unknown. One of the hypotheses is the disruption of local translation of mRNAs, which allows synapses to respond quickly and independently from the cell body. Insufficient local translation to support long-term synapticactivity would lead to synaptic loss and neurodegeneration. Thereby, the objective of mystudy is to determine the role of FUS in the regulation of mRNA translation by characterizing its interaction with translational components and evaluate its function in an ALS-linked condition. I have shown that FUS is associated with stalled polyribosomes, which suggests that it plays a role in regulating mRNA translation by interacting with the core of translation.There is also an increase in the presence of FUS in the cytoplasm and in its interaction with polyribosomes following inhibition of translation through mTOR, suggesting its role as anegative regulator. In addition, ALS-related mutations amplify FUS inhibitory function bymaking FUS cytoplasmic and reducing protein synthesis. My results show that the FUSprotein would have a role as a translation inhibitor when it is cytoplasmic. There fore, increasing the presence of FUS in the cytoplasm in ALS would result in significant translation inhibition, at a level insufficient to support synaptic activity.

L'ataxie de Friedreich (FRDA est la plus fréquente ataxie neurodégénérative invalidante. Elle est une maladie héréditaire récessive progressive qui touche sévèrement le système nerveux et cardiaque. La FRDA pose non seulement un défis de thérapie curative mais aussi celui du modèle animal reproduisant la symptomatologie. Dépendant du nombre de répétitions GAA, les souris modèles, telles que les souris YG8sR contenant entre 250-300 GAA, présentent un phénotype plus ou moins sévère. Notre étude a pour but d'accentuer le phénotype des souris YG8sR en utilisant des short hairpin ARNs (shARNs) ciblant l'ARNm de la frataxine pour réduire l'expression de cette protéine. Nous avons pu, après un test d'efficacité des shARNs in vitro dans les cellules HeLa et HEK 293T, choisir 2 shARNs parmi les 4 testés capables de réduire le taux de frataxine. Nous avons sélectionné les shARN6 et shARN1 qui étaient capables après la transfection dans les cellules à 2 µg d'ADN de réduire respectivement de 40% et 70% le taux de frataxine dans les cellules. Lorsque nous avons injecté en intraveineuse 1.2X10¹² ou 2.4X10¹² copies d'AAV-PHP.B codant pour ces shARNs, nous avons observé une perte de poids, des troubles de la motricité et de la coordination, ainsi qu'une diminution de la force motrice chez les souris YG8sR ayant reçu du shARN1 à 1.2X10¹². Nous avons donc développé un modèle amélioré de souris (Imp-YG8sR) en réduisant davantage l'expression de la frataxine avec cette dose de shARN1. Le phénotype plus sévère de ces souris est plus proche de celui des patients atteints de l'ataxie de Friedreich que le modèle original YG8sR utilisé sans les shARNs. Notre modèle de souris Imp-YG8sR sera donc bénéfique pour des tests de thérapies géniques actuellement en développement. / Friedreich's ataxia (FRDA) is the most common disabling neurodegenerative ataxia. It is a progressive recessive inherited disease that severely affects the nervous and cardiac systems. FRDA poses not only a challenge of curative therapy but also that of the animal model reproducing the symptomatology. Depending on the number of GAA repeats, mouse models, such as YG8sR containing between 250-300 GAA, exhibit a more or less severe phenotype. Our study aims to enhance the phenotype of YG8sR mice by using short hairpin RNAs (shRNAs) targeting the frataxin mRNA to reduce the expression of this protein. We were able, after an in vitro efficacy test of the shRNAs in HeLa and HEK 293T cells, to choose 2 shRNAs among the 4 tested, to reduce the frataxin level. We selected shARN6 and shARN1 which were able to reduce the frataxin level by up to 40% and 70%, respectively in cells, when injected intravenously at 1.2X10¹² or 2.4X10¹² copies of AAV-PHP.B encoding these shRNAs. We observed a loss of weight, a disturbance of the motor skills, a reduced coordination and force in the YG8sR mice, which received the shRNA1 at 1.2X10¹². We have therefore developed an improved mouse model (Imp-YG8sR) by further reducing the expression of frataxin with this dose of shRNA1. The more severe phenotype of the Imp-YG8sR is closer to that of patients with Friedreich's ataxia than the original model used without the shRNAs. Our Imp-YG8sR mouse model will therefore be beneficial for gene therapies currently in development.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Titre de l'écran-titre (visionné le 23 octobre 2023) / Le norovirus humain (HuNoV) et le virus de l'hépatite A (VHA) ont été détectés plusieurs fois dans les petits fruits, tandis que le HuNoV, le VHA et le virus de l'hépatite E (VHE) ont été associés à des épisodes de contamination des huîtres et des moules dans les dernières années. Ces virus sont principalement transmis par la voie féco-orale, mais le VHE peut également être transmis par voie zoonotique. Le HuNoV et le VHA peuvent contaminer les aliments via l'eau, notamment lors de l'irrigation avec de l'eau contaminée ou en cas de déversement dans les zones de production. De plus, le VHE peut être transmis aux aliments par les fèces d'animaux contaminés. Cependant, les connaissances sur la contamination des aliments cultivés au Québec par ces virus sont limitées. Le but de ce projet était d'évaluer la contamination des canneberges par le HuNoV et le VHA ainsi que celle des huîtres par le HuNoV, le VHA et le VHE, entre deux zones de production. Pour ce faire, 234 échantillons de canneberges ont été récoltés chez 44 producteurs québécois et 260 huîtres ont été prélevées près de la côte, et 260 huîtres au large de la côte des Îles-de-la-Madeleine, chaque échantillon étant représenté par 10 huîtres. L'ARN viral a été détecté et quantifié par détection moléculaire, en respectant la méthodologie de la méthode ISO 15216-1 : 2017. Parmi les 234 échantillons de canneberges testés, seulement trois étaient positifs au HuNoV GI (1,28 %). Aucun des 52 échantillons d'huîtres n'a été considéré comme positif pour le HuNoV, le VHA ou le VHE. Ces résultats suggèrent que le risque de contamination par des canneberges et des huîtres cultivées au Québec est faible et que la contamination des huîtres près de la côte n'est pas significativement différente de celle des huîtres au large de la côte. / Human norovirus (HuNoV), hepatitis A virus (HAV) and hepatitis E virus (HEV) have been the cause of many global epidemics, such as those caused by HuNoV and HAV in berries or even HuNoV, HAV and HEV in shellfish in recent years. These viruses are primarily transmitted through the fecal-oral route, although HEV can also be transmitted through zoonotic routes. HuNoV and HAV can contaminate food through water, especially during irrigation with contaminated water when spilled in production areas. In addition, HEV can be transmitted to food through contaminated water but also when in contact with contaminated animal feces. However, limited information is available on the contamination of food grown in Quebec by these foodborne viruses. The objective of this project was to evaluate the levels of HuNoV and HAV contamination in cranberries, as well as levels of HuNoV, HAV and HEV contamination in oysters, between two production areas. For this purpose, 234 cranberry samples were collected from 44 Quebec producers. As for molluscs, 260 oysters were obtained near the coast and 260 oysters were collected offshore of Magdalen Islands, each sample consisting of 10 oysters. The presence of viral RNA was detected and quantified using molecular detection methods in accordance with ISO 15216-1:2017. Among the 234 cranberry samples tested, only three were positive for HuNoV GI (1.28%). None of the 52 oyster samples were found to be positive for HuNoV, HAV or HEV. These findings suggest that the risk of contamination of cranberries and oysters cultivated in Quebec is low, and that there is no significant difference in contamination between oysters near the coast and those offshore in this project.

Chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) est un mécanisme endogène de régulation génique transcriptionnelle et posttranscriptionnellc médié par de petits acides ribonucleiques (ARN) non-codants générés par la ribonucléase III Dicer (Dcrl). Le rôle et la fonction de Dcrl, cependant, demeure méconnus. Une étude réalisée au laboratoire a précédemment permis l'identification, par une analyse en spectrométrie de masse, de la protéine Byr3 dans des immunoprécipitats de Dcrl. Cette observation suggère la possibilité que Byr3 interagisse avec Dcrl et qu'elle soit impliquée dans la voie de l'iARN. L'homologue de Byr3 chez l'humain est la protéine CNBP, « ccllular nuclcic acid binding protein ». L'interaction entre CNBP et Dicer est donc également envisageable. L'objectif principal de mon travail est de déterminer si la protéine Byr3 et son homologue humain peuvent interagir avec la ribonucléase Dicer, et ainsi être impliquées dans la voie de l'iARN. Chez S. pombe, la création de lignées mutées et d'outils moléculaires a permis d'étudier la protéine Byr3. Chez l'humain, des approches de microscopic par immunofluorescenec et de co-immunoprécipitation (co-IP) ont permis de définir une interaction entre la CNBP et Dicer. Notre travail pave la voie à une caractérisation plus approfondie de l'importance et de la signification de l'interaction entre Byr3 et Dcrl dans la voie de l'iARN / In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), the RNA interference (RNAi) pathway is an endogenous mechanism of transcriptional and posttranscriptional gene regulation by non-coding small ribonuclcic acids (RNAs) generated by the ribonuclease III Dicer (Dcr1). The role and function of Dcr1 though remains unclear. A previous study in our laboratory allowed the identification, by mass spectroscopy, of the Byr3 protein in Dcr1 immunoprecipitates. This observation suggests the possibility that Byr3 interacts with Dcr1 and is involved in the RNAi pathway. The main objective of my project was to define whether Byr3 and its human homolog, the cellular nucleic acid binding protein, (CNBP), can interact with the ribonuclease Dicer and be implicated in the RNAi pathway. In S. pombe, the creation of mutated strains and molecular tools allowed the study of the protein Byr3. In the human cellular model, methods of immunofluorescence microscopy and co-immunoprecipitation allowed the delineation of an interaction between CNBP and Dicer. Our study paves the way to an in-depth characterization of the importance and significance of the interaction between Byr3 and Dcr1 in the RNAi pathway.