Au centre du ribosome, lui-même centre de synthèse de toutes les protéines, se trouve quatre molécules d’ARN, nommées les ARNs ribosomiques. Ces ARNs sont synthétisés dans le nucléole des cellules eucaryotes à partir des gènes répétés en tandem, les gènes d’ARN ribosomiques. Ces gènes nécessitent une régulation très stricte de la transcription des ARN ribosomiques pour permettre un cycle cellulaire contrôlé et surtout contrôlable. En effet, un débalancement de la transcription des ARN ribosomiques a été observée dans de nombreuses maladies comme par exemple le cancer. En conséquence, l’étude de la régulation de la synthèse des ARN ribosomiques est d’une importance cruciale dans la compréhension et subséquemment le traitement de ces maladies. En raison du nombre de répétitions des gènes d’ARN ribosomiques, souvent évaluées aux alentours de 175 par génome haploïde pour les mammifères, l’étude in vivo de leur régulation est difficile par les techniques de mutagénèse. L’approche que j’ai développée durant cette thèse de doctorat est celle de l’immuno-précipitation de chromatine suivie de séquençage à haut débit (ChIP-Seq) en combinaison avec des lignées cellulaires conditionnelles pour des facteurs essentiels de la transcription ribosomique. Les gènes d’ARN ribosomique possèdent la particularité d’être transcrits grâce à une machinerie entièrement dédiée à sa transcription. Ces facteurs généraux de transcription agissent de concert pour effectuer efficacement leur rôle. Dans l’organisme modèle utilisé ici, à savoir Mus musculus, l’ARN polymérase I transcrit ces gènes avec l’aide, lors de l’initiation, des facteurs UBF, Rrn3/TIF-1A et SL-1/TIF-1B. Le facteur de terminaison TTF-1 permet de terminer la transcription de l’ARN précurseur, et joue plusieurs rôles dans la régulation de l’état des gènes. Dans un premier temps, nous avons été amenés à développer, en complément du séquençage à haut débit, une approche de déconvolution des données pour permettre d’améliorer l’interprétation subséquente. Cette approche a été validée par l’amélioration notamment des profils d’immuno-précipitation de chromatine obtenus avec l’ARN polymérase I qui montrent une distribution homogène le long des gènes d’ARNr comme montrée par la technique de Miller Spread. Cette amélioration des données a également pu mettre en avant un double rôle d’UBF en fonction soit de sa complémentarité avec SL-1 soit de son affinité pour les séquences riches en GC de l’ADN. Par la suite nous avons pu mettre en évidence la localisation des régions régulatrices et, en amont de ces régions, d’une barrière nucléosomique permettant de créer et maintenir une zone sans nucléosomes le long des gènes d’ARN ribosomiques. Cette barrière possède deux particularités. La première est d’être identifiée par les marques épigénétiques associées habituellement à l’activation de la transcription comme H3K4me3, H2A.Z ou encore l’acétylation de H2A.Z. La deuxième particularité est d’être indépendante de la présence d’UBF qui est elle-même indépendante de la transcription. Cependant, ce travail n’a pas détecté la présence des marques épigénétiques de l’activation de la transcription le long des gènes d’ARNr remettant en question certaines hypothèses sur la régulation de la transcription ribosomique. Finalement, les études en parallèle dans les cellules souche embryonnaires (mESC) et fibroblastes embryonnaires (MEF) a permis d’identifier 3 catégories de gènes ribosomiques dans une même cellule. Une première forme nucléosomale ou l’ADN est méthylé et hétérochromatique, une deuxième nucléosomale mais non méthylée et finalement une forme transcrite. Une comparaison quantitative de la synthèse d'ARNr dans les mESCs et les MEFs a montré que le nombre de gènes actifs n'est pas un facteur significatif dans la régulation de la synthèse d’ARNr. Dans des cellules souches embryonnaires, tous les gènes sont transcrits en même temps avec une faible efficacité. Dans des cellules différenciées, une faible portion des gènes est transcrite mais très efficacement, cette efficacité étant relié au nombre de polymérase en cours de transcription. Les différents profils d'interaction de Rrn3 et de PolI près du site d'initiation de la transcription suggèrent que cette différence est due à une régulation de l'initiation / At the heart of the ribosome, itself the center of synthesis of all proteins, are four RNA molecules, called ribosomal RNAs. These RNAs are synthesized in the nucleolus of eukaryotic cells from the tandemly repeated genes, the ribosomal RNA genes. A very strict regulation of the transcription of ribosomal RNA needs to be made to allow a controlled and above all a controllable cell cycle. Indeed, the imbalance of ribosomal RNA synthesis has been observed in many diseases such as cancer. Consequently, the study of transcriptional regulation of ribosomal RNAs is of crucial importance in the understanding and subsequent treatment of these diseases. Due to the number of repeats of ribosomal RNA genes, evaluated at around 175 per haploid genome for mammals, the in vivo study of their regulation by mutagenesis techniques is difficult. The approach I developed during this doctoral thesis is that of chromatin immunoprecipitation followed by high throughput sequencing (ChIP-Seq) applied to cell lines conditional for the basal transcription factors. The ribosomal RNA genes have the particularity of being transcribed thanks to an entirely dedicated transcriptional machinery. In mice, these general transcription factors act in concert to perform their role effectively. In the model organism used here, namely Mus musculus, RNA polymerase I transcribes the genes with the help, during initiation, of the factors UBF, Rrn3 / TIF-1A and SL-1 / TIF-1B. The TTF-1 termination factor makes it possible to terminate transcription of precursor ribosomal RNA, and also plays roles in gene regulation. In addition to high-throughput sequencing, we have developed a deconvolution approach to improve the interpretation of ChIP-Seq data. This approach has been validated by the improvement in particular of immunoprecipitation profiles obtained for RNA polymerase I that confirm the electron microscopy images of Miller spread type. This improvement of the data could also highlight a dual role of UBF depending on its complementarity with SL-1 and its affinity for GC-rich sequences of DNA. Subsequently we have been able to highlight the upstream localization of the regulatory regions and of a nucleosome barrier allowing to create and maintain a zone without nucleosomes along the rRNA genes. This barrier has two peculiarities, the first is that it contains the epigenetic marks usually associated with the activation of transcription such as H3K4me3, H2A.Z or the acetylation of H2A.Z. The second particularity is that it is independent of the presence of UBF, which is itself independent of transcription. Challenging certain assumptions about the regulation of ribosomal transcription, our work did not detect the presence of epigenetic markers of transcriptional activation throughout the rRNA gene body. Finally, parallel studies in embryonic stem cells (ESC) and embryonic fibroblasts (MEFs) made it possible to identify 3 categories of ribosomal genes in the same cell. First, a heterochromatic DNA methylated and nucleosomal form, a nucleosomal but non-DNA methylated form, and finally a transcribed form. A quantitative comparison of rRNA synthesis in ESCs and MEFs has shown that the number of active genes is not a significant factor in the regulation of rRNA synthesis. In embryonic cells, all genes are transcribed at the same time with low efficiency. In differentiated cells, a small portion of the genes are transcribed but very efficiently, this efficiency being related to the number of polymerase being transcribed. The different interaction profiles of Rrn3 and PolI near the transcription initiation site suggest that this difference is due to the regulation of initiation.

Chez la levure Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), la voie de l'interférence à l'ARN (iARN) est un mécanisme endogène de régulation génique transcriptionnelle et posttranscriptionnellc médié par de petits acides ribonucleiques (ARN) non-codants générés par la ribonucléase III Dicer (Dcrl). Le rôle et la fonction de Dcrl, cependant, demeure méconnus. Une étude réalisée au laboratoire a précédemment permis l'identification, par une analyse en spectrométrie de masse, de la protéine Byr3 dans des immunoprécipitats de Dcrl. Cette observation suggère la possibilité que Byr3 interagisse avec Dcrl et qu'elle soit impliquée dans la voie de l'iARN. L'homologue de Byr3 chez l'humain est la protéine CNBP, « ccllular nuclcic acid binding protein ». L'interaction entre CNBP et Dicer est donc également envisageable. L'objectif principal de mon travail est de déterminer si la protéine Byr3 et son homologue humain peuvent interagir avec la ribonucléase Dicer, et ainsi être impliquées dans la voie de l'iARN. Chez S. pombe, la création de lignées mutées et d'outils moléculaires a permis d'étudier la protéine Byr3. Chez l'humain, des approches de microscopic par immunofluorescenec et de co-immunoprécipitation (co-IP) ont permis de définir une interaction entre la CNBP et Dicer. Notre travail pave la voie à une caractérisation plus approfondie de l'importance et de la signification de l'interaction entre Byr3 et Dcrl dans la voie de l'iARN / In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), the RNA interference (RNAi) pathway is an endogenous mechanism of transcriptional and posttranscriptional gene regulation by non-coding small ribonuclcic acids (RNAs) generated by the ribonuclease III Dicer (Dcr1). The role and function of Dcr1 though remains unclear. A previous study in our laboratory allowed the identification, by mass spectroscopy, of the Byr3 protein in Dcr1 immunoprecipitates. This observation suggests the possibility that Byr3 interacts with Dcr1 and is involved in the RNAi pathway. The main objective of my project was to define whether Byr3 and its human homolog, the cellular nucleic acid binding protein, (CNBP), can interact with the ribonuclease Dicer and be implicated in the RNAi pathway. In S. pombe, the creation of mutated strains and molecular tools allowed the study of the protein Byr3. In the human cellular model, methods of immunofluorescence microscopy and co-immunoprecipitation allowed the delineation of an interaction between CNBP and Dicer. Our study paves the way to an in-depth characterization of the importance and significance of the interaction between Byr3 and Dcr1 in the RNAi pathway.

Cette thèse présente la découverte de nouveaux inhibiteurs de l’amidotranférase ARNt-dépendante (AdT), et résume les connaissances récentes sur la biosynthèse du Gln-ARNtGln et de l’Asn-ARNtAsn par la voie indirecte chez la bactérie Helicobacter pylori. Dans le cytoplasme des eucaryotes, vingt acides aminés sont liés à leur ARNt correspondant par vingt aminoacyl-ARNt synthétases (aaRSs). Ces enzymes sont très spécifiques, et leur fonction est importante pour le décodage correct du code génétique. Cependant, la plupart des bactéries, dont H. pylori, sont dépourvues d’asparaginyl-ARNt synthétase et/ou de glutaminyl-ARNt synthétase. Pour former le Gln-ARNtGln, H. pylori utilise une GluRS noncanonique nommée GluRS2 qui glutamyle spécifiquement l’ARNtGln ; ensuite, une AdT trimérique, la GatCAB corrige le Glu-ARNtGln mésapparié en le transamidant pour former le Gln-ARNtGln, qui lira correctement les codons glutamine pendant la biosynthèse des protéines sur les ribosomes. La formation de l’Asn-ARNtAsn est similaire à celle du Gln-ARNtGln, et utilise la même GatCAB et une AspRS non-discriminatrice. Depuis des années 2000, la GatCAB est considérée comme une cible prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques, puisqu’elle est absente du cytoplasme de l’être humain, et qu’elle est encodée dans le génome de plusieurs bactéries pathogènes. Dans le chapitre 3, nous présentons la découverte par la technique du « phage display » de peptides cycliques riches en tryptophane et en proline, et qui inhibent l’activité de la GatCAB de H. pylori. Les peptides P10 (CMPVWKPDC) et P9 (CSAHNWPNC) inhibent cette enzyme de façon compétitive par rapport au substrat Glu-ARNtGln. Leur constante d’inhibition (Ki) est 126 μM pour P10, et 392 μM pour P9. Des modèles moléculaires ont montré qu’ils lient le site actif de la réaction de transmidation catalysée par la GatCAB, grâce à la formation d’une interaction π-π entre le résidu Trp de ces peptides et le résidu Tyr81 de la sous-unité GatB, comme fait le A76 3’-terminal de l’ARNt. Dans une autre étude concernant des petits composés contenant un groupe sulfone, et qui mimiquent l’intermédiaire de la réaction de transamidation, nous avons identifié des composés qui inhibent la GatCAB de H. pylori de façon compétitive par rapport au substrat Glu-ARNtGln. Cinq fois plus petits que les peptides cycliques mentionnés plus haut, ces composés inhibent l’activité de la GatCAB avec des Ki de 139 μM pour le composé 7, et de 214 μM pour le composé 4. Ces inhibiteurs de GatCAB pourraient être utiles pour des études mécanistiques, et pourraient être des molécules de base pour le développement de nouvelles classes d’antibiotiques contre des infections causées par H. pylori. / This thesis describes the discovery of inhibitors of a tRNA-dependent amidotransferase (AdT) and summarizes the present state of our knowledge about the two-step biosynthesis of Gln-tRNAGln and Asn-tRNAAsn in Helicobacter pylori. In eukaryotic cytoplasm, twenty amino acids (aa) are generally attached to their cognate tRNAs by twenty corresponding aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs). These enzymes have a high specificity, and their function is important to the proper decoding of mRNA. However, in a number of bacteria including H. pylori, GlnRS and/or AsnRS are absent. To synthesize Gln-tRNAGln, H. pylori first uses a noncanonical GluRS2 which is specific for tRNAGln to form Glu-tRNAGln; then the trimeric AdT (GatCAB) transforms Glu-tRNAGln into Gln-tRNAGln which is proper for protein biosynthesis. In a similar manner, the biosynthesis of Asn-tRNAAsn also takes place in H. pylori by using the same GatCAB and a canonical nondiscriminating AspRS. The widespread use of these indirect pathways among prominent human pathogens, and their absence in the mammalian cytoplasm, identify AdT as a promising target for the development of new and highly specific antimicrobial agents. By using phage display, we discovered several cyclic peptides rich in tryptophan and proline that inhibit H. pylori GatCAB. Peptides P10 (CMPVWKPDC) and P9 (CSAHNWPNC) are competitive inhibitors of GatCAB with respect to its substrate Glu-tRNAGln. The inhibition constants (Ki) of P10 and P9 are 126 and 392 μM, respectively. Their docking models revealed that they bind to the transamidation active site of GatB via π-π stacking interactions with Tyr81, as does the 3’-terminal A76 of tRNA. We also discovered two small dipeptide-like sulfone-containing inhibitors of H. pylori GatCAB by mimicking the intermediate of its transamidation reaction. Although they are much smaller than the cyclic peptides mentioned above, they are competitive inhibitors of GatCAB with respect to GlutRNAGln, with Ki values of 139 μM for compound 7 and 214 μM for compound 4. These inhibitors could be useful not only to study the reaction mechanisms of GatCAB, but also could be lead compounds for the development of a new class of antibiotics to treat infections caused by H. pylori.

Une des causes principales de la Maladie d’Alzheimer et des autres Tauopathies est la présence d’enchevêtrements neurofibrillaires (ENF). Les ENF sont des agrégations intracellulaires de la protéine Tau hyperphosphorylée. Plusieurs études ont montré que les ENF sont associés à la pathogénèse des troubles neurodégénératifs et à la neurotoxicité. De plus, il a été démontré qu’une diminution du niveau de la protéine Tau permet de prévenir les déficits cognitifs dans les modèles murins. Basé sur ces études, notre hypothèse de recherche est que réduire le niveau total de Tau dans le cerveau, pourrait diminuer les ENF et retarder la pathologie. Notre objectif est de développer une molécule capable de cibler l’ARNm de Tau plutôt que la protéine Tau hyperphosphorylée. Ainsi, nous avons développé le SOFA-delta ribozyme, capable de cliver l’ARNm de Tau. Notre ribozyme a trois composantes soit le bloqueur, le biosenseur et l’effecteur. Nous avons développé des deltaribozymes capable cibler les exons constitutifs et l’exon 10 (spécifique au Tau4R) de l’ARNm de Tau, ainsi nous pouvons cibler tous les isoformes de Tau. Dans ce projet, nous avons tout d’abord synthétisé le deltaribozyme par clonage moléculaire et nous avons confirmé son effet grâce au clivage in vitro. Dans un second temps, nous avons transfecté le ribozyme dans des cellules neuronales, et nous avons caractérisé son effet sur l’ARNm de Tau par RT-PCR. Enfin, nous avons produit des virus AAV, infecté des cellules neuronales et caractérisé encore une fois l’effet du ribozyme sur l’ARNm de Tau par RT-PCR. Cette approche thérapeutique est basée sur la spécificité et l’efficacité du SOFA-delta-ribozyme, qui identifie et coupe l’ARNm de Tau. Ainsi, dans ce mémoire nous avons identifié le ribozyme 350 et 395 comme candidats potentiellement capable de cliver l’ARNm de Tau. / One of the main causes of Alzheimer’s disease and Tauopathies is the presence of neurofibrillary tangles (NFT). NFT consist in intracellular aggregation of the abnormally hyperphophorylated protein Tau. Several studies have shown that NFT are associated with the pathogenesis of neurodegenerative disorders and neurotoxicity. Moreover, it has been demonstrated that decreasing the level of Tau protein could prevent cognitive deficits in mouse models. Based on these studies, our hypothesis is that reducing the level of total Tau in the brain could decrease NFTs and delay the pathology. Our objective is to design a molecule that will target directly Tau mRNA instead of the hyperphosphorylated protein. We developed a modified delta-ribozyme, the SOFA (Specific On/Off Adaptor) ribozyme, which is able to cleave the Tau mRNA. Our ribozyme is composed of three components: the blocker, the biosensor, and the effector. We have designed delta-ribozymes that target constitutive exons of Tau mRNA as well as the exon 10 specific of Tau 4R. Therefore, we can target all the Tau isoforms. In this project, we first synthesized the delta-ribozyme by molecular cloning and we confirmed its effect by in vitro cleavage. Secondly, by transfecting it in neuronal cells we characterized its effects on Tau mRNA by RT-PCR. Finally, we produced AAV viruses and infected neuronal cells and characterized its effects on Tau mRNA by RT-PCR. This therapeutic approach is based on specificity and efficiency of the SOFA-ribozymes, which identify and cut the Tau mRNA. Thus, in this project we identified ribozymes 350 and 395 as potential good candidates able to cleave the Tau mRNA.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La sérine/thréonine kinase mTOR (mammalian target of rapamycin) participe à un rétrocontrôle négatif envers la voie IRS-1/PI3K/Akt. Dans les adipocytes et les myocytes, l'inhibition aiguë de la voie mTORCl/S6Kl augmente la signalisation de l'insuline par la voie IRS-1/PI3K/Akt et le transport du glucose en empêchant la phosphorylation négative d'IRS-1 sur serine. Dans cette étude, l'utilisation de l'interférence à l'ARN dans les adipocytes 3T3-L1 a confirmé le rôle des protéines mTOR, raptor et S6K1 dans le rétrocontrôle négatif sur la signalisation métabolique de l'insuline. Cependant, l'inhibition chronique de la voie mTORCl/S6Kl mène également à une réduction de l'action de l'insuline sur le transport du glucose. Cette dichotomie entre l'activation de la PI3K et le transport du glucose est attribuable à une diminution imprévue de l'activation d'Akt2 et de l'expression de GLUT4. Ainsi, l'inhibition chronique de la voie mTORCl/S6Kl pourrait ne pas être une approche efficace pour rétablir la sensibilité à l'insuline.

Des mutations dans plusieurs gènes ont été liés à la sclérose latérale amyotrophique (SLA),en particulier dans celui codant pour la protéine Fused in Sarcoma (FUS). Les mutations sont retrouvées dans la partie codant pour le signal de localisation nucléaire, rendant la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d’autres observations, ça suggère qu’un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l’origine de la neurodégénérescence. La SLA est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et cause une paralysie progressive. Les mécanismes moléculaires causant la maladies ont toujours inconnus. Une des pistes serait la perturbation de la traduction locale desARNm, qui permet aux synapses de répondre rapidement et indépendamment du corps cellulaire. Une traduction locale insuffisante pour soutenir l’activité synaptique à long terme mènerait à la perte des synapses et à la neurodégénérescence. Mon objectif est donc de déterminer le rôle de FUS dans régulation de la traduction des ARNm en caractérisant son interaction avec les composantes traductionnelles et d’évaluer sa fonction dans une condition reproduisant les caractéristiques de la SLA. J’ai montré que FUS s’associe aux polyribosomes inactifs, ce qui suggère que FUS jouerait un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en interagissant avec le cœur de la traduction. Il est également possible d’observer une augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme et de son interaction avec les polyribosomes suite à une inhibition de la traduction par mTOR, suggérant son rôle de régulateur négatif. De plus, les mutations liées à la SLA amplifient la fonction inhibitrice de FUS en rendant FUS cytoplasmique et en réduisant la synthèse des protéines. Mes résultats montrent que la protéine FUS aurait un rôle d’inhibiteur de la traduction quand celle-ci est cytoplasmique. Par conséquent, l’augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme dans la SLA entrainerait une inhibition de la traduction importante, à un niveau insuffisant pour soutenir l’activité synaptique. / Mutations in several genes have been linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS),particularly in the gene coding for the Fused in Sarcoma protein (FUS). Those mutations are found in the part encoding for the nuclear localization signal, making the protein abnormallyabundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it suggests that a toxic gainof function of FUS in the cytoplasm would be the cause of the neurodegeneration. ALS is a neurodegenerative disease that affects motor neurons and causes progressive paralysis. The molecular mechanisms causing the disease are still unknown. One of the hypotheses is the disruption of local translation of mRNAs, which allows synapses to respond quickly and independently from the cell body. Insufficient local translation to support long-term synapticactivity would lead to synaptic loss and neurodegeneration. Thereby, the objective of mystudy is to determine the role of FUS in the regulation of mRNA translation by characterizing its interaction with translational components and evaluate its function in an ALS-linked condition. I have shown that FUS is associated with stalled polyribosomes, which suggests that it plays a role in regulating mRNA translation by interacting with the core of translation.There is also an increase in the presence of FUS in the cytoplasm and in its interaction with polyribosomes following inhibition of translation through mTOR, suggesting its role as anegative regulator. In addition, ALS-related mutations amplify FUS inhibitory function bymaking FUS cytoplasmic and reducing protein synthesis. My results show that the FUSprotein would have a role as a translation inhibitor when it is cytoplasmic. There fore, increasing the presence of FUS in the cytoplasm in ALS would result in significant translation inhibition, at a level insufficient to support synaptic activity.

L'ataxie de Friedreich (FRDA est la plus fréquente ataxie neurodégénérative invalidante. Elle est une maladie héréditaire récessive progressive qui touche sévèrement le système nerveux et cardiaque. La FRDA pose non seulement un défis de thérapie curative mais aussi celui du modèle animal reproduisant la symptomatologie. Dépendant du nombre de répétitions GAA, les souris modèles, telles que les souris YG8sR contenant entre 250-300 GAA, présentent un phénotype plus ou moins sévère. Notre étude a pour but d'accentuer le phénotype des souris YG8sR en utilisant des short hairpin ARNs (shARNs) ciblant l'ARNm de la frataxine pour réduire l'expression de cette protéine. Nous avons pu, après un test d'efficacité des shARNs in vitro dans les cellules HeLa et HEK 293T, choisir 2 shARNs parmi les 4 testés capables de réduire le taux de frataxine. Nous avons sélectionné les shARN6 et shARN1 qui étaient capables après la transfection dans les cellules à 2 µg d'ADN de réduire respectivement de 40% et 70% le taux de frataxine dans les cellules. Lorsque nous avons injecté en intraveineuse 1.2X10¹² ou 2.4X10¹² copies d'AAV-PHP.B codant pour ces shARNs, nous avons observé une perte de poids, des troubles de la motricité et de la coordination, ainsi qu'une diminution de la force motrice chez les souris YG8sR ayant reçu du shARN1 à 1.2X10¹². Nous avons donc développé un modèle amélioré de souris (Imp-YG8sR) en réduisant davantage l'expression de la frataxine avec cette dose de shARN1. Le phénotype plus sévère de ces souris est plus proche de celui des patients atteints de l'ataxie de Friedreich que le modèle original YG8sR utilisé sans les shARNs. Notre modèle de souris Imp-YG8sR sera donc bénéfique pour des tests de thérapies géniques actuellement en développement. / Friedreich's ataxia (FRDA) is the most common disabling neurodegenerative ataxia. It is a progressive recessive inherited disease that severely affects the nervous and cardiac systems. FRDA poses not only a challenge of curative therapy but also that of the animal model reproducing the symptomatology. Depending on the number of GAA repeats, mouse models, such as YG8sR containing between 250-300 GAA, exhibit a more or less severe phenotype. Our study aims to enhance the phenotype of YG8sR mice by using short hairpin RNAs (shRNAs) targeting the frataxin mRNA to reduce the expression of this protein. We were able, after an in vitro efficacy test of the shRNAs in HeLa and HEK 293T cells, to choose 2 shRNAs among the 4 tested, to reduce the frataxin level. We selected shARN6 and shARN1 which were able to reduce the frataxin level by up to 40% and 70%, respectively in cells, when injected intravenously at 1.2X10¹² or 2.4X10¹² copies of AAV-PHP.B encoding these shRNAs. We observed a loss of weight, a disturbance of the motor skills, a reduced coordination and force in the YG8sR mice, which received the shRNA1 at 1.2X10¹². We have therefore developed an improved mouse model (Imp-YG8sR) by further reducing the expression of frataxin with this dose of shRNA1. The more severe phenotype of the Imp-YG8sR is closer to that of patients with Friedreich's ataxia than the original model used without the shRNAs. Our Imp-YG8sR mouse model will therefore be beneficial for gene therapies currently in development.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Titre de l'écran-titre (visionné le 23 octobre 2023) / Le norovirus humain (HuNoV) et le virus de l'hépatite A (VHA) ont été détectés plusieurs fois dans les petits fruits, tandis que le HuNoV, le VHA et le virus de l'hépatite E (VHE) ont été associés à des épisodes de contamination des huîtres et des moules dans les dernières années. Ces virus sont principalement transmis par la voie féco-orale, mais le VHE peut également être transmis par voie zoonotique. Le HuNoV et le VHA peuvent contaminer les aliments via l'eau, notamment lors de l'irrigation avec de l'eau contaminée ou en cas de déversement dans les zones de production. De plus, le VHE peut être transmis aux aliments par les fèces d'animaux contaminés. Cependant, les connaissances sur la contamination des aliments cultivés au Québec par ces virus sont limitées. Le but de ce projet était d'évaluer la contamination des canneberges par le HuNoV et le VHA ainsi que celle des huîtres par le HuNoV, le VHA et le VHE, entre deux zones de production. Pour ce faire, 234 échantillons de canneberges ont été récoltés chez 44 producteurs québécois et 260 huîtres ont été prélevées près de la côte, et 260 huîtres au large de la côte des Îles-de-la-Madeleine, chaque échantillon étant représenté par 10 huîtres. L'ARN viral a été détecté et quantifié par détection moléculaire, en respectant la méthodologie de la méthode ISO 15216-1 : 2017. Parmi les 234 échantillons de canneberges testés, seulement trois étaient positifs au HuNoV GI (1,28 %). Aucun des 52 échantillons d'huîtres n'a été considéré comme positif pour le HuNoV, le VHA ou le VHE. Ces résultats suggèrent que le risque de contamination par des canneberges et des huîtres cultivées au Québec est faible et que la contamination des huîtres près de la côte n'est pas significativement différente de celle des huîtres au large de la côte. / Human norovirus (HuNoV), hepatitis A virus (HAV) and hepatitis E virus (HEV) have been the cause of many global epidemics, such as those caused by HuNoV and HAV in berries or even HuNoV, HAV and HEV in shellfish in recent years. These viruses are primarily transmitted through the fecal-oral route, although HEV can also be transmitted through zoonotic routes. HuNoV and HAV can contaminate food through water, especially during irrigation with contaminated water when spilled in production areas. In addition, HEV can be transmitted to food through contaminated water but also when in contact with contaminated animal feces. However, limited information is available on the contamination of food grown in Quebec by these foodborne viruses. The objective of this project was to evaluate the levels of HuNoV and HAV contamination in cranberries, as well as levels of HuNoV, HAV and HEV contamination in oysters, between two production areas. For this purpose, 234 cranberry samples were collected from 44 Quebec producers. As for molluscs, 260 oysters were obtained near the coast and 260 oysters were collected offshore of Magdalen Islands, each sample consisting of 10 oysters. The presence of viral RNA was detected and quantified using molecular detection methods in accordance with ISO 15216-1:2017. Among the 234 cranberry samples tested, only three were positive for HuNoV GI (1.28%). None of the 52 oyster samples were found to be positive for HuNoV, HAV or HEV. These findings suggest that the risk of contamination of cranberries and oysters cultivated in Quebec is low, and that there is no significant difference in contamination between oysters near the coast and those offshore in this project.

La cellule a élaboré des mécanismes de surveillance afin d'assurer la fidélité de l'expression génique. Le nonsense-mediated mRNA decay (NMD) reconnaît et en général, dégrade rapidement les ARNm nonsens, qui contiennent des codons stop prématurés. Le NMD a longtemps été considéré comme un mécanisme de protection, permettant d'éviter la synthèse de protéines tronquées, potentiellement néfastes pour la cellule. Plus récemment, un nouveau rôle du NMD a émergé : il semble réguler l'expression génique, notamment lorsqu'il est couplé à l'épissage alternatif. D'autre part, bien que les mécanismes de reconnaissance et de dégradation des ARNm nonsens soient de mieux en mieux compris, une controverse subsiste quand à la localisation subcellulaire du NMD chez les mammifères. Ces deux aspects du NMD ont été abordés au cours de ma thèse dans le cas de l'étude du métabolisme des ARNm aberrants du gène de la fah, responsable de la tyrosinémie héréditaire de type I. Afin de mieux comprendre les bases moléculaires de la maladie, j'ai caractérisé les ARNm de la FAH contenant des mutations d'épissage (Q279R et V259L) ou nonsens (W262X) dans l'exon 9. Deux transcrits alternatifs du gène de la fah ont ainsi été mis en évidence pour ces trois mutations : del100 a éliminé l'exon 8 et del231 les exons 8 et 9. Del231 est fortement produit lorsque les mutations d'épissage Q279R et V259L sont présentes. L'étude des transcrits chez les patients avec ces deux mutations a permis de proposer un modèle d'épissage pour les exons 8 et 9. Une analyse plus poussée sur del100 et del231 a révélé que ceux-ci étaient en fait produits de façon minoritaire dans des cellules avec un gène normal de la fah, par épissage alternatif des exons 8 et 9. Del100, qui contient de nombreux PTCs suite à l'élimination de l'exon 8, est dégradé par NMD. Cependant, la quantité de transcrit restante semble suffisante pour la synthèse d'une protéine de 31-kDa, détectable dans plusieurs tissus humains. Ce premier transcrit alternatif de la fah est important à deux points de vue : premièrement, il semble illustrer le rôle possible du NMD couplé à l'épissage alternatif dans la régulation génique et deuxièmement, la protéine synthétisée pourrait être importante pour la tyrosinémie héréditaire de type I.

Le norovirus humain (HuNoV) et le virus de l'hépatite A (VHA) sont souvent associés à des maladies d'origine alimentaire incriminants des aliments minimalement transformés. Comme les méthodes de culture virale demeurent limitées pour une utilisation de routine, il est nécessaire de concentrer les virions présents à la surface des aliments avant leur détection. Le but ultime de cette étape est de séparer les virus de la matrice alimentaire, de les concentrer et d'éliminer les inhibiteurs pouvant affecter la détection. L'organisation internationale de normalisation (ISO) a publié des procédures de détection des virus dans les aliments. Cependant, elles varient grandement en fonction des aliments étudiés, tout en étant longues et laborieuses. Elles nécessitent aussi du personnel qualifié et comportent plusieurs étapes risquant de réduire la récupération virale, cela rendant leur utilisation difficile comme analyse de routine. C'est pourquoi le développement d'étapes de concentration, de purification et d'extraction du matériel génétique rapides et sensibles, limitant les étapes manuelles s'avère nécessaire. Le premier objectif de ce projet était de développer une nouvelle approche de concentration des virus en vue d'une meilleure surveillance dans les aliments. L'approche développée se base sur l'ultrafiltration pour une récupération des particules virales à la suite de leur élution de la surface d'aliments. La méthode optimisée a, par la suite, été comparée à la méthode de référence ISO 15 216-1 :2017 en utilisant des fraises, framboises et mûres fraîches et congelées ainsi que de la laitue et des oignons verts frais. Les résultats ont montré une réduction importante du temps d'expérimentation face à la méthode de référence, tout en conservant une détection à des faibles concentrations de VHA et des HuNoVs. Sauf pour la framboise, la méthode d'ultrafiltration était généralement équivalente à la méthode de référence, quel que soit le virus testé. Le deuxième objectif avait pour but de comparer une nouvelle méthode d'extraction automatisée optimisée pour les HuNoVs GI et GII puis le VHA à une méthode du commerce semi-automatisée applicable sur plusieurs matrices alimentaires à risque. Pour les framboises fraîches, les huîtres et la laitue romaine, les deux plateformes d'extraction ont été jugées équivalentes. Tandis que la méthode automatisée a permis une meilleure récupération pour les framboises congelées et une inhibition moindre pour les échantillons de mûres congelées. Le troisième objectif avait finalement pour but d'évaluer la persistance d'ARN de VHA provenant de virions inactivés à la chaleur. L'ARN était dilué à différentes concentrations puis ajouté à des solutions (eau et tampon phosphate salin) ou déposé sur des surfaces (acier inoxydable, polychlorure de vinyle et bleuets). La persistance de l'ARN était mesurée à différentes températures d'entreposage (-80 °C, -20 °C, 4 °C et 23 °C) sur une période de 90 Jours. En solution, sur le polychlorure de vinyle et sur les bleuets, l'ARN a été détecté dans la plupart des conditions jusqu'à 90 jours d'entreposage. Les résultats suggèrent cependant une dégradation plus rapide de l'ARN viral sur l'acier inoxydable. En conclusion, les résultats de cette thèse permettent de proposer une application de ces protocoles de concentration et d'extraction dans un contexte de routine, tout en mettant en lumière les enjeux liés à la persistance de l'ARN viral dans l'analyse des résultats de détection de virus dans les aliments. / Human norovirus (HuNoV) and hepatitis A virus (HAV) are often associated with foodborne illnesses involving minimally processed foods. As viral culture methods remain limited for routine use, it is necessary to concentrate virions present on foods before their detection. The goal of this step is to separate the viruses from the food matrix, to concentrate them and to eliminate inhibitors that may affect detection. The International Organization for Standardization (ISO) has published procedures for detecting viruses in food. However, they vary considerably depending on the foods to study, while being long and laborious. They also require trained personnel and involve several steps that may reduce viral recovery, making them difficult to use in routine analysis. This is why the development of rapid and sensitive concentration, purification, and extraction steps for genetic material, limiting manual steps, is necessary. The first objective of this project was to develop a new approach of virus concentration based on ultrafiltration of the eluted viral particles from the surface of food. The optimized method was subsequently compared to the reference method ISO 15 216-1:2017 using fresh and frozen strawberries, raspberries, and blackberries as well as fresh lettuce and green onions. The results showed a reduction in experimental time compared to the reference method, while maintaining detection at low concentrations of HAV and HuNoVs. Except for raspberry, the ultrafiltration method was generally equivalent to the reference method, regardless of the virus tested. The second objective was to compare a new automated extraction method optimized for VHA, HuNoVs GI and GII to a commercial semi-automated method applicable to several high-risk food matrices. For fresh raspberries, oysters, and romaine lettuce, the two extraction platforms were considered equivalent. While the automated method provided better recovery for frozen raspberries and less inhibition for frozen blackberry samples. The third objective was to evaluate the persistence of HAV RNA from heat-inactivated virions. RNA was diluted in water to different concentrations and then added to solutions (water and phosphate buffer saline) or laid on surfaces (stainless steel, polyvinyl chloride, and blueberries). RNA presence was measured at different storage temperatures (-80°C, -20°C, 4°C and 23°C) over a period of 90 days. In solution, on polyvinyl chloride and on blueberries, RNA was detected under most conditions for up to 90 days of storage. The results, however, showed a faster degradation of viral RNA on stainless steel. In conclusion, these concentration and extraction methods could be suitable for routine analysis of viruses throughout the food production and surveillance chain. The findings of this study also highlight the challenges associated with the persistence of viral RNA when interpreting results from virus detection in food.