Chaque année, environ 175 millions de personnes souffrent d’infection du tractus urinaire (ITU) dans le monde. Pour diagnostiquer une ITU, une culture d’urine est réalisée mais nécessite un long délai. Pendant ce temps les patients sont souvent traités avec un antibiotique à large spectre qui peut entrainer des complications et contribuer à l’augmentation du nombre de bactéries résistantes. La plupart des échantillons reçus au laboratoire sont négatifs (≤10[indice supérieur 5] ufc /mL) ou contiennent Escherichia coli. Nous avons mis au point une méthode de dépistage rapide des échantillons positifs afin de sauver des coûts et éviter des complications. D’abord un protocole d’extraction d’ADNg a été élaboré avec la même efficacité pour tous les microorganismes. Cette méthode, appelé EtNa, chauffe le microorganisme dans une solution de 70 % éthanol et NaOH. Cette solution permet l’adsorption de l’ADN directement sur une colonne de silice afin de favoriser sa purification par un robot pipeteur. Elle a été comparée favorablement avec d’autres méthodes retrouvées dans la littérature et trousses commerciales, mais a l’avantage d’extraire les bactéries Gram positifs, Gram négatifs et levures avec une efficacité similaire et ce, avec un même protocole simple et sans produits chimiques toxiques. La deuxième étape du projet a été de mettre au point une méthode pour dépister les microorganismes pouvant causer les ITU en utilisant la PCR en temps réel pour amplifier le gène d’ARNr 23S des bactéries et 28S des levures. Grâce à une stratégie innovatrice de dénaturation des sondes, le pathogène peut être détecté et partiellement identifié. Une valeur seuil permettant de distinguer les échantillons positifs a été évaluée et correspond à un Cp de 26 (10[indice supérieur 5] ufc/mL). Un témoin interne est utilisé et permet de contrôler l’extraction et l’amplification. La méthode de dépistage a été éprouvée in vitro avec des souches de bactéries et levures, puis essayée avec quelques échantillons d’urines en provenance de la clinique. Puisque les résultats obtenus étaient très encourageants, l’analyse d’autres échantillons est importante pour faire une validation complète.

Résumé : Le nucléole est considéré comme étant une « usine » à produire des ribosomes. Cette production est la fonction la plus énergivore de la cellule. Elle met en jeu les trois ARN polymérases et représente 80% de l’activité de transcription au sein d’une cellule. Les trois quarts de cette activité de transcription correspondent à la synthèse des ARNr par l’ARN polymérase I (ARNPI). Ainsi mieux comprendre les mécanismes cellulaires se déroulant à l’intérieur de ce compartiment permettra le développement de nouveaux traitements contre le cancer. La synthèse d’ARNr par l’ARNPI est régulée à trois niveaux : l’initiation de la transcription, l’élongation et le nombre de gènes de l’ARNr en transcription. La plupart des travaux qui se sont intéressés à ces niveaux de régulation ont été réalisés avec des cellules en phase exponentielle de croissance. Au cours de mes travaux, je me suis attardé sur la régulation de la transcription par l’ARNPI au cours de la phase G1 du cycle cellulaire et au début de la phase S. Ainsi mes résultats ont montré que si la chromatine des gènes de l’ARNr est essentiellement dépourvue de nucléosomes, la régulation de l’ARNPI diffère dans des cellules en G1 et au début de la phase S. J’ai pu de ce fait observer qu’en G1, la transcription de l’ARNPI se concentre sur un nombre réduit de gènes en transcription. Dans des cellules arrêtées au début de la phase S avec de l’hydroxyurée, la transcription de l’ARNPI est perturbée par un défaut de maturation de l’ARNR. Fort de ces résultats sur la nature des gènes ribosomaux en phase G1, je me suis attardé à la réparation de ces gènes lors de cette phase. Alors que dans des cellules en phase exponentielle de croissance irradiées avec des UVC, la chromatine des gènes de l’ARNr se ferme ; je n’ai pas observé la formation de nucléosomes suite à l’irradiation de cellules synchronisée en G1. Mes résultats montrent également que la réparation est plus efficace. Parallèlement, j’ai exploré l’assemblage du complexe de réparation par excision de nucléotides. Toutefois, les résultats obtenus sont peu concluants. / Abstract : The nucleolus is thought to be a “factory” involve in the production of ribosomes. This production is the most energetically consuming process in the cell. The three RNA polymerases are involved and this represents 80% of the total transcription activity of the cell. Three quarters of this transcriptional activity correspond to the synthesis of rRNA by the RNA polymerase I (RNAPI). So a better understanding of the cellular mechanisms taking place in this compartment may help for the development of new drugs against cancer. The synthesis of rRNA by RNAPI is regulated at three levels: initiation of transcription, elongation and the number of rRNA genes in transcription. Most of the works that characterized those levels of regulation were done in exponentially growing cells. During my work, I studied the regulation of RNAPI during the G1 phase of the cell cycle and during the early S phase. So my results have shown that if the chromatin of the rRNA genes mostly depleted of nucleosomes, the regulation of the RNAPI differs in cells in G1 and early S phase. I could observe that in G1, RNAPI transcription concentrates on a reduced number of transcribed rRNA genes. In cells arrested in early S phase with hydroxyurea, RNAPI transcription is disrupted by a defect in rRNA processing. With this results on the nature of the ribosomal genes in G1, I started the analysis of the DNA repair of those genes during this phase of the cell cycle. In UVC irradiated exponentially growing cells, the rRNA genes are closing. But in cells synchronized in G1, I could not observe the deposition of nucleosomes after UVC irradiation. Moreover, my results show an increase repair of the locus. In parallel, I have explored the assembly of the complex of nucleotide excision repair. However, the results were not conclusive.

Alors que la Guadeloupe possède la plus grande bordure littorale de mangroves des Petites Antilles, la microfaune et la microflore bactérienne marine associées à cet écosystème sont très mal connues. Pourtant, ces diverses communautés de micro-organismes sont à la base du réseau trophique des sédiments marins de mangrove. En effet, grâce à leurs activités basées sur des processus hétérotrophes, ces micro-organismes vont permettre de dégrader la litière constituée de feuilles et branches de palétuviers tombées à la surface du sédiment. En condition anoxique, la dégradation des substrats végétaux par des bactéries sulfato-réductrices entraine la production de sulfures qui vont soutenir l’activité de bactéries chimiosynthétiques. Les protistes ciliés sont des micro-organismes eucaryotes unicellulaires caractérisés par la présence de cils sur la surface cellulaire et appartenant au micro-zooplancton. Leur mode de nutrition basé sur la phagocytose permet non seulement de favoriser la reminéralisation de la biomasse microbienne, ce qui augmente le transfert de nutriments à d'autres organismes du réseau trophique, mais facilite surtout l’émergence de nombreuses associations symbiotiques. Les résultats obtenus durant cette thèse ont permis de mettre en évidence la présence d’associations symbiotiques entre des bactéries sulfo-oxydantes ou hétérotrophes et des espèces de protistes ciliés faisant parties du périphyton de mangrove. / While Guadeloupe has the largest coastal edge of mangroves in the Lesser Antilles, the microfauna and marine bacterial microflora associated with this ecosystem are very poorly understood. However, these diverse communities of microorganisms are at the base of the marine mangrove sediment food web. Indeed, thanks to their activities based on heterotrophic processes, these micro-organisms will make it possible to degrade the litter composed of mangrove leaves and branches that have fallen to the surface of the sediment. In anoxic conditions, the degradation of plant substrates by sulfate-reducing bacteria leads to the production of sulfides that will support the activity of chemosynthetic bacteria. Ciliates protists are unicellular eukaryotic microorganisms characterized by the presence of cilia on the cell surface and belonging to micro-zooplankton. Their phagocytosis-based nutrition not only promotes the remineralization of microbial biomass, which increases the transfer of nutrients to other organisms in the food web, but also facilitates the emergence of many symbiotic associations. The results obtained during this thesis allowed to highlight the presence of symbiotic associations between sulfur-oxidizing or heterotrophic bacteria and ciliates protist species that are part of the mangrove periphyton.

Gene regulation allows cells to control their metabolism, growth, division and adaptation to environmental changes. Every step of the genetic information transmission chain is regulated. One of the targets of gene regulation is the mRNA that acts as an intermediate between DNA and proteins. Regulation of the mRNA can happen at the level of its synthesis, processing and degradation. The RNase III of Saccharomyces cerevisiae , Rnt1p, is a nuclear enzyme implicated in the processing of many non-coding RNAs. Rnt1p binds and cleaves double-strand RNA structures capped by NGNN tetra-loops. Such structures can also be found in many mRNAs. Cleavage within the coding sequence of a mRNA results in its degradation and thus contributes to negatively regulate the expression of its gene. The work presented in this thesis characterized the effects of the loss of Rnt1p in yeast. A first publication highlighted the relationship between the localization of this enzyme and cell cycle progression. A change in localization of Rnt1p from the nucleolus to the nucleoplasm contributes to passage through G2/M. A second publication focused on the interaction between Rnt1p and the rRNA transcription machinery. Rnt1p was found to interact with RNA pol I and to be implicated in its transcription termination. We also used Rnt1p as a tool to uncover mRNAs that are posttranscriptionaly regulated in the nucleus. The case studied in this work shows a role for this nuclear degradation mechanism towards promoting the robustness of the cell wall stress response.

L’ARNr 5S est une petite molécule d'ARN codée par le noyau, qui est partiellement adressée dans les mitochondries dans les cellules humaines. Bien que le mécanisme d'importation a été étudié, la fonction de ce phénomène est mal comprise. Les données publiées suggèrent que l’ARNr 5S importé pourrait participer à la synthèse des protéines mitochondriales, éventuellement être associé aux mitoribosomes. Cependant, les études structurelles ne supportent pas ces observations. Pour comprendre le rôle de l’ARNr 5S dans les mitochondries humaines, nous avons exploité plusieurs approches. Nous avons montré que seule une petite fraction de l’ARNr 5S pourrait être associé à mitoribosomes humaines, insuffisante pour former un complexe stoechiométrique 1:1. Nous avons appliqué l’approche de chromatographie d'affinité à l’ARN MS2 pour identifier les partenaires protéiques de l’ARNr 5S importé. Les résultats suggèrent que l’ARNr 5S pourrait être associé à des protéines ribosomales et des facteurs mitochondriaux d'assemblage du ribosome mitochondrial. Cela nous a permis de formuler une hypothèse sur la participation de l'ARNr 5S dans la biogenèse mitoribosomale. Ces données ont été partiellement validées par des expériences de co-immunoprécipitation, bien que plusieurs expériences sont encore nécessaires pour valider la participation ARNr 5S dans cette voie. / 5S rRNA is a small nuclear-encoded RNA molecule, which is partially imported into mitochondria from cytoplasm in human cells. Although the import mechanism was studied in details, the functional significance of this phenomenon is poorly understood. Published data suggest that imported 5S rRNA might participate in mitochondrial protein synthesis, possibly associating with mitoribosomes. However, structural studies do not support these observations. We have exploited several approaches to figure out the function of 5S rRNA in human mitochondria. Our studies showed that only a minor part of 5S rRNA pool could be associated with human mitoribosomes, insufficient to form stoichiometric 1:1 complex. We applied MS2 affinity chromatography approach to identify protein partners of 5S rRNA in human mitochondria. The results suggested that 5S rRNA could associate with mitochondrial ribosomal proteins and mitochondrial ribosome assembly factors. This allowed us to formulate a hypothesis about possible participation of 5S rRNA in mitoribosome biogenesis. The data were partially validated by co-immunoprecipitation experiments, although subsequent studies are required to validate 5S rRNA involvement in this pathway.

Il est maintenant clairement établi que la biogenèse des ribosomes est l’un des nombreux processus cellulaires qui voit sa régulation profondément modifiée au cours de la transformation cellulaire.Toutefois, si il est bien décrit que le taux synthèse des ribosomes est augmenté au cours du processus tumoral, de plus en plus de données suggèrent que les étapes posttranscriptionnelles peuvent aussi être altérées. Dans ce contexte biologique, les objectifs de cette thèse sont de déterminer si : i) la maturation de l’ARNr est altérée en plus de l’augmentation de sa synthèse ; ii) cette altération peut conduire à la synthèse de ribosomes modifiés dont la fonction est altérée ; iii) ces modifications participent directement à la dérégulation traductionnelle observée dans les cellules cancéreuses. Pour cela, nous avons étudié les principales étapes de la biogenèse des ribosomes ainsi que la composition des ribosomes et leurs capacités fonctionnelles dans différents modèles de progression et/ou d’agressivité tumorale. Les résultats obtenus montrent qu’en plus de l’augmentation du taux de synthèse des ribosomes, les étapes post-transcriptionnelles sont modifiées, en particuliers le niveau de méthylation de l’ARNr. Ces modifications sont associées à des défauts importants de traduction (saut de codon stop, incorporation erronée des acide-amines) et particulièrement à une augmentation de la traduction IRES-dépendante de facteur clefs de la tumorigénèse. Dans leur ensemble, ces résultats suggèrent que les modifications de la biogenèse des ribosomes pourraient être une étape clef de la cancérogenèse, en modifiant les capacités traductionnelles des ribosomes cytoplasmiques / Ribosome biogenesis is a fundamental and extremely complex cell process. In mammals, ribosome synthesis coordinates the assembly of 80 proteins and 4 rRNA to form the two ribosomal sub-units. The maturation of the ribosome is a multi-step post-transcriptional process essential to obtain functional ribosomes. It is now well demonstrated that ribosome biogenesis and its regulation is altered during transformation process. However, if the increase of ribosome synthesis in cancer cell is well documented, there are numerous recent data suggesting that post-transcriptional steps could also be altered. In this biological context, the objectives of my Ph.D were to determine if: i) the maturation of rRNA is altered during the increase of ribosome synthesis; ii) these alterations could modify the ribosomes and alter their function and iii) these modifications directly participate to the deregulation of translation observed in cancer cells. We have explored the major steps of ribosome biogenesis as well as the structure of the cytoplasmic ribosomes and their functional capacity in different cellular models of tumor progression and/or aggressively. The results obtained show that in addition of the increase of the level of ribosome synthesis, post-transcriptional modifications are altered, particularly the level of rRNA methylation. These modifications are associated with strong defect of translation (stop codon bypass, misincorporation of amino-acid) and an increase of the IRES-dependant translation of important factors playing a crucial role in tumorigenesis. These results suggest that modifications of ribosome biogenesis could be a key step of cancer cell transformation

"Où peut-on trouver des microbes, et comment survivent-ils dans ces lieux ?" sont des questions essentielles afin de comprendre la vie sur Terre. Les populations bactériennes du sol sont connues pour jouer un rôle important dans les cycles biogéochimiques, l'entretien des sols, les effets climatiques et l'agriculture.Dans ce travail, j'ai utilisé la technique de pyroséquençage, via le produit d’une PCR d’ADNr 16S amplifiée extraite d’ADN totale, afin de révéler les populations bactériennes présentes dans quatre environnements inhabituels et oligotrophes différents:A. Les écosystèmes saumâtres sont largement distribués sur Terre et sont représentés par des systèmes aquifères salés et des sols salins. Nous avons examiné la composition bactérienne des sédiments des estuaires, sols saumâtres et des échantillons de sol sablonneux de la région de Camargue, échantillonnés pendant deux années consécutives. Les membres appartenant au phylum Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Acidobacteria et Actinobactéries ont été trouvés principalement dans les sols et sédiments. Nous avons constaté que les membres de ces groupes bactériens étaient associés principalement à des bactéries halophiles, sulfatoréductrices (SRB), nitratoréductrices et coliformes, dont leurs proportions ont probablement été affectées par la salinité et leurs localisations géographiques.B. Les bactéries associées à la rhizosphère des plantes sont connues pour jouer un rôle essentiel dans les cycles biogéochimiques, la nutrition des plantes et la lutte biologique contre les maladies végétales. Nous avons examiné les populations bactériennes de la rhizosphère du riz (Oryza sativa) en fin de croissance dans la région de la Camargue en 2013 et 2014. Les populations bactériennes les plus abondantes se sont révélées être des membres appartenant au phylum Proteobacteria, Acidobacteria, Chloroflexi et Gemmatimonadetes. Les genres bactériens auxquels appartiennent ces différents phylums sont connus pour participer dans des processus biogéochimiques du sol, tel que la nitrification, la dénitrification, l'oxydation, ainsi que comme agents de control biologique. Les proportions bactériennes trouvées varient considérablement en fonction de leur localisation géographique et selon l’année d’échantillonnage.C. Nous avons examiné les sols de surface de "Padza de Dapani" situés sur l'île de Mayotte au large de la côte est de l'Afrique, car cette région n’est pas un vrai désert, mais y ressemble due à l’érosion du sol. Les sols de Mayotte sont acides, oligotrophes et minéralisées, et leur population bactérienne principale appartient aux phylums des Actinobactéries, Proteobacteria et Acidobacteria. Un fait intéressant, les membres des genres Acinetobacter, Arthrobacter, Burkholderia et Bacillus sont prédominants dans nos échantillons, comme observé dans des déserts (asiatiques) chauds et jouant probablement un rôle dans la minéralisation des sols, expliquant la désertification.D. Les régions arides de la Terre constituent > de 30% de la surface continentale et les sols oligotrophes sont soumis à des facteurs environnementaux difficiles tels que la faible pluviométrie moyenne annuelle, l'exposition aux UV et les grandes fluctuations de température. Nous avons examiné les populations bactériennes présentes dans la rhizosphère des plantes pionnières et les sols de surface du désert de Jizan d'Arabie Saoudite. Les phylums bactériens les plus abondants appartiennent aux groupes des Bacteroidetes, Proteobacteria et Firmicutes qui diffèrent entre la rhizosphère des plantes étudiées par rapport à la surface du sol, à l'exception de la plante "Panicum Turgidum" qui contient des proportions élevées (70%) des membres appartenant au genre Flavobacterium. / “What microbes are where, and how do they live there” is now an essential question to understand life on Earth, even when comparing seemingly similar ecosystems in different locations. Soil bacterial populations are known to play important roles in biogeochemical cycles, soil maintenance, climatic effects and agriculture. I used pyrosequencing of PCR amplified 16S rDNA from total extracted DNA in order to reveal the bacterial populations living in four different unusual and oligotrophic environments: A. Saline areas are widely distributed on Earth’s and are represented by both saline lakes and saline soils. We examined the bacterial composition of estuary sediments, brackish and sandy soil samples from the Camargue region (Rhône delta in southern France) sampled in two consecutive years. Members belonging to the Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Acidobacteria and Actinobacteria phyla were found principally in saline sediment and soil samples. We found that members from these phyla were associated principally to halophilic bacteria, sulphate reducing bacteria (SRB), nitrate reducing bacteria and coliforms, and that their varying proportions were likely affected by salinity and geographical location. B. Bacterial populations associated with the rhizosphere of plants are known to play essential roles in biogeochemical cycles, plant nutrition and disease biocontrol. We examined the bacterial populations of the rhizosphere of rice (Oryza sativa) growing in the Camargue region in 2013 and 2014. The most abundant bacterial populations were found to be members belonging to the Proteobacteria, Acidobacteria, Chloroflexi and Gemmatimonadetes phyla. The genera members belong these phyla were found to participate in soil biogeochemical processes such as nitrification, denitrification, oxidation, as well as act as biocontrol agents. The bacterial populations were found to significantly vary by geographical location as well by year of collection. C. We examined the surface soils from “Padza de Dapani” on the island of Mayotte off the east coast of Africa, as this region is not a true (hot) desert, but resembles one due to extensive soil erosion. In the acidic, oligotrophic and mineralized soil samples from Mayotte, members of the Actinobacteria, Proteobacteria and Acidobacteria phyla dominated the bacterial populations. Interestingly, members of the genera Acinetobacter, Arthrobacter, Burkholderia and Bacillus were found to be predominant in our samples, as is also observed in hot (Asian) deserts and may play roles in soil mineral weathering, thus helping to understand desertification processes. D. Earth’s arid regions comprise >30% of the continental surface and the oligotrophic soils are subjected to harsh environmental factors such as low average annual rainfall, high UV exposure and large temperature fluctuations. We examined the bacterial populations present in the rhizosphere of pioneer plants and surface soils in the Jizan desert of Saudi Arabia. The most abundant bacterial phyla belonged to the Bacteroidetes, Proteobacteria and Firmicutes phyla that were different between the rhizosphere of plant versus these from surface sand, with the exception of the plant “Panicum Turgidum”, which contain in its rhizosphere high proportions (70%) of members belonging to the Flavobacterium genus.

Los Thraustochytriales o mejor conocidos como thraustochitridos son protistas pertenecientes al Grupo Chromista según los análisis del gen 18S rRNA. Considerados como una potencial fuente alternativa al aceite de pescado, estos microorganismos oleaginosos han sido aislados de diversos ambientes a nivel mundial encontrándose principalmente asociados a material vegetal en descomposición. Así, en este estudio se logró aislar cepas de thraustochitridos provenientes de todos los puntos muestreados en los manglares de Tumbes donde la caracterización bioquímica con acriflavina y rojo de nilo confirmaron su ocurrencia y los resultados de caracterización molecular permitieron determinar aislados pertenecientes a los géneros Aurantiochytrium (basónimo: Shizochytrium), Parietichytrium, Botryochytrium e Ulkenia sensu stricto. Asimismo se propone el posible descubrimiento de dos nuevas especies con potenciales biotecnológicos en base a información proporcionada de las características observadas en cultivo, de los análisis filogenéticos y de trabajos previos relacionadas a las cepas Aurantiochytrium sp. 15A-14a (Genbank Accesion N° AB811008) y Schizochytrium sp. S8 (Genbank Accesion N° DQ836630), los cuales dieron el mayor hit con los aislados 75, 507, 510, 512, 523, 526, 527 y C1, respectivamente. Finalmente, el presente estudio brindó los primeros reportes de la presencia de estos thraustochitridos en nuestro país.

Ki-67 maintient l'hétérochromatine constitutive lors de la prolifération cellulaire. La protéine Ki-67 est fortement exprimée dans le noyau des cellules de mammifères en prolifération. Sa présence est devenue un marqueur de référence en histopathologie diagnostic dans le cancer avec 330 millions de références sur des sites Internet et plus de 18 000 articles indexés avec le mot clé Ki-67 dans PubMed. Malgré son utilisation comme référence incontestable de la prolifération cellulaire, les rôles fonctionnels, les régulations et les mécanismes moléculaires où Ki-67 est impliquée demeurent obscurs. Depuis l'identification de Ki-67 en 1983, les différentes études avec l'utilisation d'outils moléculaires (anticorps, oligonucléotide antisens, shRNA, siRNA) qui inhibent l'expression de Ki-67 dans des cellules cancéreuses de tous types ont mis en évidence une forte régression à leur prolifération. La localisation prédominate de Ki-67 est dans le nucléole, son inactivation photodynamique abroge la transcription de l'ARN ribosomal qui est requis pour la prolifération cellulaire. Le consensus est que Ki-67 favorise la prolifération cellulaire, mais à ce jour aucune étude n'a mis en évidence ni un mécanisme d'action, ni un rôle essentiel de Ki-67 dans la prolifération cellulaire in vivo. Dans notre travail, nous abordons la question du rôle de Ki-67 dans les cellules humaines cancéreuses non transformées en culture ainsi qu'in vivo chez la souris. Nous avons montré que Ki-67 n'est pas nécessaire pour la prolifération cellulaire. En revanche, Ki-67 est indispensable pour maintenir la structure de l'hétérochromatine constitutive. Nous avons mis en évidence des nouveaux mécanismes de régulation de l'expression de Ki-67 au cours du cycle cellulaire, sa transcription étant contrôlé par CDK4/6 via la phosphorylation de la protéine rétinoblastome, et sa dégradation en G1 tardive via APC/C-Cdh1. Après extinction de l'expression de Ki-67 par ARNi ou par ablation du gène de Ki-67 par la nouvelle approche TALEN, nous n'avons observé aucun effet sur la synthèse de l'ARN ribosomique, sur le déroulement normal du cycle cellulaire, sur le développement embryonnaire ou la fertilité de la souris. Par contre, son extinction inhibe la progression des tumeurs dans des modèles de Xénogreffes, et induit un remodelage du paysage de l'expression de certain gènes. Notre étude par protéomique des protéines interragissant avec Ki-67 a identifié des protéines nucléolaires à l'interface entre l'hétérochromatine périnucléolaires et les composants granulaires nucléolaires. Ces complexes protéiques empêchent la dispersion de l'hétérochromatine constitutive au cours du cycle cellulaire. Au vu de nos résultats, nous concluons que dans les cellules non-proliférantes l'anémie de Ki-67 est associée à la diffusion de l'hétérochromatine constitutive. Ki-67 est indispensable à la maintenance de cette hétérochromatine qui serait essentielle pour le développement des tumeurs. / Ki-67 links constitutive heterochromatin maintenance to cell proliferation.Ubiquitous nuclear expression of Ki-67 in proliferating mammalian cells has led to its use as a benchmark diagnostic marker for cell proliferation, especially in cancer histopathology. Its importance is reflected by over 330 million hits when searching using the keyword “Ki-67” on Google, and over 18,000 papers on PubMed. In spite of its use as a surrogate marker for cell proliferation, the mechanisms of regulation of Ki-67 expression and its physiological functions in cell proliferation remain obscure. Early functional studies found that inhibition of Ki-67 expression by injection of antisense oligonucleotides or inactivating antibodies into cultured cancer cells inhibited cell proliferation. This is in agreement with later results obtained by peptide-nucleic acid, antisense oligonucleotide, siRNA or shRNA experiments in various cancer cell lines. Photodynamic inactivation of Ki-67 abrogates ribosomal RNA transcription, consistent with its predominantly nucleolar localisation and apparent requirement for cell proliferation. However, a recent study in HeLa cells found only minor effects on the cell cycle distribution upon Ki-67 knockdown. Nevertheless, Ki-67 is required for localising several nucleolar proteins to the mitotic chromosome periphery, potentially providing a mechanism for nucleolar assembly, as previously suggested by segregating nucleolar components upon cell division and chromosome segregation. Therefore, although the consensus is that Ki-67 promotes cell proliferation, this has not been clearly demonstrated, and no studies have ascertained requirements for Ki-67 in vivo.In this work, we address these questions in non-transformed human cells and cancer cells in culture and in vivo in mice. We have shown that Ki-67 is dispensable for cell proliferation but is required to maintain constitutive heterochromatin. We found that Ki-67 expression is cell cycle-dependent due to dynamic control by CDK4/6 and Cdh1. However, silencing of Ki-67 by RNAi or a TALEN-mediated Ki-67 gene ablation had no effect on ribosomal RNA synthesis, cell cycling, mouse development or fertility, but prevented tumour progression and led to remodelling of the gene expression landscape in cycling cells. Interaction proteomics and functional assays revealed that Ki-67 defines the boundary between perinucleolar heterochromatin and the nucleolar granular components, and prevents dispersal of constitutive heterochromatin during cell cycling. Conversely, Ki-67 downregulation in non-proliferating cells is associated with constitutive heterochromatin dispersal. The results suggest that Ki-67 mediates organisation of heterochromatin, and allows efficient tumour progression.

Plus de 200 facteurs pré-ribosomiques sont impliqués dans la maturation des ribosomes. La majorité de ces facteurs sont essentiels à la survie cellulaire, mais la fonction précise de la plupart d’entre eux demeure inconnue. Une des dernières étapes de maturation de la petite sous-unité du ribosome est le clivage du pré-ARNr 20S en ARNr 18S mature. Ce clivage est réalisé par l'endonucléase Nob1 et nécessite également la présence de la NTPase Fap7 ainsi que d’une pléthore d’autres facteurs pré-ribosomiques. La fonction de Fap7 est particulièrement intrigante, car l'homologue humain hCINAP possède une activité adénylate kinase, activité enzymatique qui n’est généralement pas liée à la biogenèse des particules ribonucléoprotéiques. En outre, la fonction de Fap7 est intimement liée à son interaction avec la protéine ribosomique Rps14. La partie C-terminale de Rps14 est essentielle pour le clivage au niveau du site D et est située à proximité de l’extrémité 3’ de l’ARNr 18S dans le ribosome mature. La suppression de cette protéine provoque le syndrome 5q qui est phénotypiquement proche de l’anémie de Diamond-Blackfan. Ces deux protéines interviennent également au niveau d’une voie de régulation de p53 qui est dérégulée dans de nombreux cancers. La combinaison d’études structurales par cristallographie aux rayons X, d’études enzymatiques sur des protéines recombinantes ainsi que des tests de maturation in vitro réalisés sur des pré-ribosomes purifiés, nous a permis de mieux appréhender la fonction de Fap7 au sein de la sous-unité pré-40S du ribosome. Nous avons également montré que l'interaction Fap7-Rps14 est impliquée dans un changement conformationnel majeur au cœur des pré-ribosomes et que cette réorganisation est nécessaire afin d'exposer le site D pour le clivage par l’endonucléase Nob1. / Over 200 pre-ribosomal factors involved in the maturation of ribosomes. Most of these factors are essential to cell survival, but the precise function of most of these factors remains elusive. One of the last steps of maturation of the small subunit of the ribosome is the cleavage of 20S pre-rRNA in 18S rRNA in the cytoplasm. This cleavage is carried out by the endonuclease Nob1 and also requires the presence of other factors such as the methyltransferase Dim1, and a plethora of NTPases including the Rio protein kinases, Prp43 and its cofactor Pfa1, the Ltv1 GTPase and the Fap7 NTPase. The function of Fap7 is especially intriguing since the human homologue bears Adenylate activity, an enzymatic activity not usually linked to ribonucleoprotein biogenesis. In addition, the function of Fap7 is intimately linked its interaction with the Rps14 ribosomal protein. The Rps14 C-terminal is essential of D site cleavage and is located in proximity to the 18S C-terminus in the mature ribosome. The deletion of this protein causes the 5q syndrome that is phenotypically close to Diamond Blackfan anemia. The link between the enzymatic activity of Fap7 and its role in ribosome biogenesis remains enigmatic. Using a combination of structural studies by X-ray crystallography, small angle X-ray scattering (SAXS) in solution, enzymatic studies on purified proteins, and in vitro D site cleavage reaction assays on purified pre-ribosomes, we were able to uncover the function of Fap7 within pre-40S ribosomes. We show that the Fap7/Rps14 interaction is involved in a major conformational change at the heart of the pre-ribosomes and that this structural rearrangement is necessary to expose the D-site for cleavage by the endonuclease Nob1.