No description available.

No description available.

No description available.

No description available.

The project goals for this dissertation were to manipulate Populus trichocarpa source-sink relationships to optimize this woody crop species for specific agricultural traits such as increased growth rate, stress tolerance and/or improvements in overall biomass accumulation. We targeted specific tissues such as xylem, where alterations in the relationship of source and sink tissues can lead to the control of xylem cell deposition or of various wood properties. This led to the characterization of 165 protein-protein interactions and 20 protein-DNA interaction which constitute numerous woody tissue related subnetworks. One such network, centered on the DIVARACATA and RADIALIS INTERACTING FACTOR (PtrDRIF), identified PtrWOX13c as an interacting protein. Characterization of PtrWOX13c shows that it displays the ability to control promoters related to lignin biosynthesis genes and overexpression phenotypes show alterations in axillary branch activity. Genes which control the differentiation and specialization of cells such as members of the WOX family are also highly responsive to abiotic stress which can force major changes in plant metabolism and nutrient mobilization. ABA, a prominent plant phytohormone with known roles in the adaptation to stress has shown novel connections in the regulation of growth promoting complexes such as TOR through antagonistic regulatory actions of the SnRK2 protein kinase in Arabidopsis. Characterization of the core ABA signaling in P. trichocarpa has identified a regulatory clade A protein phosphatase which interacts with numerous PtrSnRK2 proteins and when overexpressed in hybrid poplar results in increased height and node production potentially by indirect control of growth promoting complexes like TOR through SnRK2 inhibition. This work has also demonstrated that in addition to the involvement of phytohormones in the regulation of plant development, sugar phosphates such as T6P can exert significant control of plant architecture. Together, these studies comprise the discovery and subsequent characterization of novel wood associated networks, hormone pathways and sugar signaling in the manipulation of P. trichocarpa source-sink relationships for the promotion of biomass accumulation. / PHD / Detailed analyses of gene activity in different tissues or under the influence of various environmental conditions have identified numerous genes that control desirable traits and plant characteristics. However, the activities and functions of the proteins produced from these genes is less understood. One of the ways proteins work is through the formation of complexes with other proteins. Using the commercially valuable tree Populus trichocarpa (poplar) as our research model, we have identified novel complexes of interacting proteins with the potential to sense and respond to the environment and to promote plant growth. We tested the function of some of the members of these newly discovered protein complexes using transgenic poplar. As a result, we revealed previously unknown functions for two poplar proteins: PtrWOX13c promoted increased branching and PtrHAB2 promoted an increase in tree height. Independent of these functional analyses of poplar proteins, we also tested the ability of a sugar phosphate, trehalose6-phosphate, known from previous work to regulate plant growth, for its ability to promote poplar growth. We found that reducing levels of trehalose-6-phosphate resulted in increased branch growth, similar to the impact of the PtrWOX13c protein. In summary, identification of new protein complexes is a valuable strategy for the discovery of proteins that can increase tree growth. Additionally, combining targeted changes in both proteins and regulatory sugars may be a promising path toward future crop improvement and tree domestication.

[EN] ABSTRACT Abscisic acid (ABA) signaling plays a critical role in regulating root growth and root system architecture. ABA-mediated growth promotion and root tropic response under water stress are key responses for plant survival under limiting water conditions. In this work, we have explored the role of Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) PYR/PYL/RCAR receptors (PYRABACTIN RESISTANCE1 (PYR1)/PYR1 LIKE (PYL)/REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS) for root ABA signaling. As a result, we discovered that PYL8 plays a nonredundant role for the regulation of root ABA sensitivity. Unexpectedly, given the multigenic nature and partial functional redundancy observed in the PYR/PYL family, the single pyl8 mutant showed reduced sensitivity to ABA-mediated root growth inhibition. This effect was due to the lack of PYL8-mediated inhibition of several clade A phosphatases type 2C (PP2Cs), since PYL8 interacted in vivo with at least five PP2Cs, namely HYPERSENSITIVE TO ABA1 (HAB1), HAB2, ABAINSENSITIVE1 (ABI1), ABI2, and PP2CA/ABA-HYPERSENSITIVE GERMINATION3 as revealed by tandem affinity purification and mass spectrometry proteomic approaches. Membrane-delimited abscisic acid (ABA) signal transduction plays a critical role in early ABA signaling, but the molecular mechanisms linking core signaling components to the plasma membrane are unclear. We show that transient calciumdependent interactions of PYR/PYL/RCAR ABA receptors with membranes are mediated through a 10-member family of C2-domain ABA-related (CAR) proteins in Arabidopsis thaliana. Specifically, we found that PYL4 interacted in an ABA-independent manner with CAR1 in both the plasma membrane and nucleus of plant cells. CAR1 belongs to a plant-specific gene family encoding CAR1 to CAR10 proteins, and bimolecular fluorescence complementation and coimmunoprecipitation assays showed that PYL4-CAR1 as well as other PYR/PYL-CAR pairs interacted in plant cells. The crystal structure of CAR4 was solved, which revealed that, in addition to a classical calcium-dependent lipid binding C2 domain, a specific CAR signature is likely responsible for the interaction with PYR/PYL/RCAR receptors and their recruitment to phospholipid vesicles. This interaction is relevant for PYR/PYL/RCAR function and ABA signaling, since different car triple mutants affected in CAR1, CAR4, CAR5, and CAR9 genes showed reduced sensitivity to ABA in seedling establishment and root growth assays. In summary, we identified PYR/PYL/RCAR-interacting partners that mediate a transient Ca2+-dependent interaction with phospholipid vesicles, which affects PYR/PYL/RCAR subcellular localization and positively regulates ABA signaling. / [ES] RESUMEN La señalización por la hormona vegetal ácido abscísico (ABA) desempeña un papel crítico en la regulación del crecimiento de la raíz y en la arquitectura del sistema radical. La promoción de crecimiento de la raíz en condiciones de estrés hídrico mediada por ABA es clave para la supervivencia de las plantas bajo condiciones limitantes de agua. En este trabajo, hemos explorado el papel de los receptores PYR/PYL/RCAR (PYRABACTIN RESISTANCE1 (PYR1)/PYR1 LIKE (PYL)/ REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS) de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) en la ruta de señalización de ABA en raíz. Así, hemos descubierto que el receptor de ABA PYL8 juega un papel no redundante en la regulación de la percepción de ABA en raíz. Inesperadamente, dada la naturaleza multigénica y la redundancia funcional parcial observada en la familia PYR/PYL/RCAR, el mutante pyl8 fue el único mutante sencillo de pérdida de función de los receptores PYR/PYL/RCAR que mostraba una sensibilidad reducida a la inhibición del crecimiento mediada por ABA en raíz. Este efecto se debe a la falta de inhibición mediada por PYL8 de varias fosfatasas del grupo A tipo 2C (PP2Cs), ya que PYL8 es capaz de interactuar in vivo con al menos cinco PP2Cs, denominadas HYPERSENSITIVE TO ABA1 (HAB1), HAB2, ABAINSENSITIVE1 (ABI1), ABI2, and PP2CA/ABA-HYPERSENSITIVE GERMINATION3 según lo han revelado la purificación por afinidad en tándem (TAP por sus siglas en inglés) y estudios proteómicos de espectrometría de masas. La transducción de la señal del ABA localizada en la membrana plasmática celular juega un papel crucial en los pasos iniciales de la señalización de la fitohormona, pero los mecanismos moleculares que unen los componentes básicos de la señalización y la membrana plasmática no están claros. Estudiando las interacciones de los receptores del ABA PYR/PYL/RCAR con la membrana plasmática hemos encontrado que éstos pueden interaccionar transitoriamente con ella de forma dependiente de calcio gracias a una familia de proteínas con dominios C2 relacionadas con la ruta de señalización de ABA (denominadas C2-domain ABA-related (CAR) proteins). Específicamente, se encontró que PYL4 interacciona de manera independiente de ABA con CAR1 tanto en la membrana plasmática como en el núcleo de las células vegetales. La proteína CAR1 pertenece a una familia multigénica constituida por 10 miembros en Arabidopsis thaliana, desde CAR1 hasta CAR10, y que solo se encuentra en plantas. Los ensayos de complementación bi-molecular de fluorescencia y de co-immunoprecipitación confirmaron la interacción en células vegetales tanto de PYL4-CAR1 como de otras parejas de PYR/PYL-CAR. La cristalización de la proteína CAR4 reveló que, además de un dominio C2 clásico de unión a lípidos dependiente de calcio, las proteínas de la familia CAR presentan un dominio específico que probablemente es responsable de la interacción con los receptores PYR/PYL/RCAR y de su posterior reclutamiento a las vesículas de fosfolípidos. Esta interacción es relevante para la función de los receptores PYR/PYL/RCAR en la señalización del ABA, ya que diferentes mutantes triples car de pérdida de función, que tienen afectados los genes CAR1, CAR4, CAR5, y CAR9, demostraron una reducción de la sensibilidad al ABA en ensayos de establecimiento de plántula y crecimiento de la raíz. En resumen, hemos identificado nueva familia de proteínas que son capaces mediar las interacciones transitorias dependientes de Ca2+ con vesículas de fosfolípidos, lo que a su vez afecta localización de PYR/PYL/RCAR y regula positivamente la señalización de ABA. / [CAT] RESUM La senyalització per l'hormona vegetal àcid abcíssic (ABA) exerceix un paper crític en la regulació del creixement de l'arrel i també en l'arquitectura del sistema radical. La promoció del creixement de l'arrel en condicions d'estrés hídric, regulada per ABA és clau per la supervivència de les plantes sota condicions limitants d'aigua. Amb aquest treball, hem investigat el paper dels receptors PYR/PYL/RCAR (PYRABACTIN RESISTANCE1 (PYR1)/PYR1 LIKE (PYL)/ REGULATORY COMPONENTS OF ABA RECEPTORS) d'Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) en el camí de senyalització d'ABA en arrel. Així, hem descobert que el receptor d'ABA PYL8 exerceix un paper no redundant en la regulació de la percepció d'ABA en arrel. Inesperadament, donada la naturalesa multigènica i la redundància funcional parcial que s'observa en la família PYR/PYL/RCAR, el mutant pyl8 va ser l'únic mutant senzill de pèrdua de funció dels receptors PYR/PYL/RCAR que mostrava una sensibilitat reduïda a la inhibició del creixement mitjançada per l'ABA en l'arrel. Doncs aquest efecte es deu a la falta d'inhibició regulada per PYL8 de diverses fosfatases del grup A tipus 2C (PP2Cs), ja que PYL8 té la capacitat d'interactuar in vivo almenys amb cinc PP2Cs, anomenades HYPERSENSITIVE TO ABA1 (HAB1), HAB2, ABAINSENSITIVE1 (ABI1), ABI2, and PP2CA/ABAHYPERSENSITIVE GERMINATION3 segons ho han revelat per una banda la purificació per afinitat en tàndem (TAP són les seues sigles en anglés) i per altra banda, estudis proteòmics d'espectrometria de masses. Pel que fa a la transducció del senyal del l'ABA, la qual es localitza en la membrana plasmàtica cel¿lular, juga un paper molt important en els primers instants de la senyalització de la fitohormona, no obstant això els mecanismes moleculars que uneixen els components bàsics d'aquesta senyalització amb la membrana plasmàtica, no es troben del tot clars. Per tant, s'han estudiat les interaccions que tenen els receptors del ABA PYR/PYL/RCAR amb la membrana plasmàtica, i hem trobat que aquests tenen la capacitat d'interaccionar transitòriament amb la membrana de forma dependent al calci, gràcies a una família de proteïnes amb domini C2, les quals es troben relacionades amb la ruta de senyalització d'ABA(anomenades C2domain ABArelated (CAR) proteins).Específicament, es va trobar que PYL4 interacciona d'una manera independent al ABA amb CAR1, tant en la membrana plasmàtica, com en el nucli de les cèl¿lules vegetals. La proteïna CAR1 pertany a la família multigènica constituïda per 10 components en Arabidopsis thaliana, des de CAR1 fins CAR10, que tan sols es troba en plantes. Els assajos de complementació bimolecular de fluorescència i de co-immunoprecipitació, van confirmar la interacció en cèl¿lules vegetals, tant de PYL4CAR1 com d'altres parelles de PYR/PYL-CAR. La cristal¿lització de la proteïna CAR4 va revelar que, a més d'un domini C2 clàssic de unió a lípids dependent del calci, les proteïnes de la família CAR presenten un domini PYR/PYL/RCAR, i del seu posterior reclutament a les vesícules fosfolipídiques. Doncs, aquesta interacció és rellevant en la funció dels receptors PYR/PYL/RCAR, ja que participa en la senyalització del l'ABA. Aquesta interacció es clau per a la funció dels receptors, ja que diferents mutants triples car de pèrdua de funció, els quals posseïxen afectats els gens CAR1, CAR4, CAR5 i CAR9, van mostrar una reducció de la sensibilitat a l'ABA en assajos d'establiment de plàntula i creixement de l'arrel. En conclusió, hem identificat una nova família de proteïnes amb la capacitat d'organitzar les interaccions transitòries dependents del calci amb vesícules de fosfolípids, fet que al seu torn afecta la localització de PYR/PYL/RCAR i regula positivament la senyalització d'ABA. / Rodríguez Solovey, LN. (2015). IDENTIFICATION OF TARGETS AND AUXILIARY PROTEINS OF PYR/PYL/RCAR ABA RECEPTORS: PROTEIN PHOSPHATASES TYPE 2C (PP2Cs) AND C2-DOMAIN ABA-RELATED PROTEINS (CARs) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/58862 / TESIS

Dans le contexte de changement climatique, la compréhension des mécanismes régissant les pertes en eau de la vigne peut permettre d'adapter le matériel végétal pour maintenir la productivité de la vigne et la qualité du vin. L'adaptation à la sécheresse est un caractère complexe faisant intervenir des mécanismes physiologiques liés aux génotypes du greffon et du porte-greffe. Mais les effets du porte-greffe sur la régulation stomatique du greffon sont mal connus. La production par les racines de signaux chimiques tels que l'ABA et/ou hydraulique pourraient y contribuer. La réponse physiologique et moléculaire à la contrainte hydrique a été analysée sur de jeunes boutures pour 7 porte-greffes plus ou moins adaptés à la sécheresse et 2 cépages connus pour leur caractère iso ou anisohydrique. Puis 23 combinaisons greffon/porte-greffe issues de ces génotypes ont été étudiées. Une analyse métabolique sur l'accumulation de l'ABA et ses dérivés a été menée sur feuilles, racines et dans la sève xylémienne. Ces informations ont été couplées à des analyses transcriptomiques sur des gènes du métabolisme et de la signalisation de ABA, et codant des aquaporines de type PIP. L‘analyse conjointe des données physiologiques, métabolomiques et transcriptomiques ont permis d'identifier des composants moléculaires discriminant les porte-greffes selon leur fond génétique et leur adaptation à la sécheresse. Les réponses globales à la contrainte hydrique sont mieux coordonnées au sein d‘un même tissu qu‘entre racines et feuilles. A l‘échelle de la plante greffée, une prépondérance du signal hydraulique est probable. Certains gènes répondent spécifiquement aux interactions greffon/porte-greffe. / In the context of climate change, understanding the mechanisms governing the water loss of the vine is necessary to adapt the plant material to maintain the productivity of the vine and wine quality. The adaptation to drought is a complex trait involving physiological mechanisms related to scion and rootstock genotypes. But the effects of the rootstock on stomatal regulation graft are still unknown. Production by roots of chemical signals such as ABA and / or hydraulic ones be involved. Molecular and physiological responses to water stress were analyzed on young cuttings for 7 rootstocks more or less adapted to drought and 2 varieties known for their iso or anisohydric behaviour. Then 23 combinations scion / rootstock from these genotypes were investigated. Metabolic analyses for ABA and its derivatives was conducted in leaves, roots and in the xylem sap. The information was integrated with transcriptomic analyzes for genes involved in ABA metabolism and signaling, and encoding PIP aquaporins. Joint analyses of physiological data, metabolomic and transcriptomic allow the identification of the molecular components discriminating rootstocks according to their genetic background and their adaptation to drought. Global responses to water stress are better coordinated within the same tissue between roots and leaves. At the scale of the grafted plant, a preponderance of the hydraulic signal is likely. Some genes specifically respond to the scion / rootstock interactions.

La performance d'une plante repose en partie sur sa capacité à capturer l'énergie lumineuse via la croissance foliaire. La littérature souligne deux limitations majeures de la croissance, de nature métabolique ou hydraulique. Nous testons ici l'hypothèse originale que l'importance relative de ces deux limitations est structurée par l'ontogenèse de la feuille chez Arabidopsis thaliana. Nous montrons que la disponibilité en carbone restreint la croissance des jeunes feuilles, tandis qu'une compétition hydraulique entre croissance et transpiration s'accroît au cours de l'ontogenèse. La mise en place de cette limitation hydraulique s'explique par une dégradation de la capacité du xylème et probablement des aquaporines à approvisionner la feuille en eau, malgré une diminution ontogénétique de la transpiration. Cette dernière est la conséquence de l'acquisition progressive de la sensibilité des stomates aux signaux de fermeture, notamment l'obscurité et l'acide abscissique (ABA), hormone induite par la sécheresse. Enfin, nous mettons en évidence une nouvelle composante de la sensibilité stomatique à l'ABA, conservée chez des mutants décrits comme insensibles à cette hormone : l'ABA induit une diminution de la conductance hydraulique foliaire qui abaisse le potentiel hydrique foliaire et in fine la conductance stomatique. Ce mécanisme chez les feuilles développées contribuerait sous stress hydrique à rediriger le flux d'eau vers les feuilles en croissance. Plus généralement, le contrôle des stomates par des mécanismes hydrauliques induits par l'ABA pourrait être une composante majeure de l'ajustement entre offre et demande en eau chez les plantes soumises à un stress hydrique. / In plants, leaf growth is the central process allowing energy capture and space colonization. The literature suggests that leaf growth is predominantly determined by metabolic and hydraulic limitations. Here, we test the original hypothesis that the relative importance of metabolics and hydraulics on the control of leaf growth is organized according to leaf ontogeny in Arabidopsis thaliana. We show that leaf carbon balance limits growth of the young leaves which therefore grow at a slower rate in the nighttime, while a hydraulic limitation gradually establishes in the daytime, when growth and transpiration competes for water. This gradual hydraulic limitation is underlain by a deterioration of leaf venation and probably aquaporins capacity to supply water to the leaf, despite an ontogenetic decrease in transpiration. This decline in transpiration occurs because stomata acquire throughout leaf ontogeny their sensitivity to the major closure signals, including darkness and abscisic acid (ABA), a hormone induced by drought. Finally, we discover a novel component of stomatal sensitivity to ABA, conserved in mutants described as insensitive to ABA in isolated epidermis: ABA induces a decrease in leaf hydraulic conductance which lowers leaf water potential and stomatal conductance according to a hydraulic cascade. Decreasing leaf hydraulic conductance through ABA action in fully expanded leaves would contribute to redirect water flow to the young leaves under water stress. More generally, controlling stomata by ABA-induced hydraulic mechanisms could be a crucial component of the coordination between water supply and water demand in plants under water challenging conditions.

[ES] El crecimiento de las plantas se ve afectado por el estrés abiótico, sequía, salinidad o altas temperaturas. La transducción de señales de estrés abiótico es fundamental para generar una respuesta fisiológica adecuada, que implica la participación de diferentes hormonas vegetales, siendo el ácido abscísico (ABA) el regulador hormonal crítico en la regulación de la respuesta de la planta a situaciones de estrés por déficit hídrico. La vía de señalización de ABA y los componentes principales están bien caracterizados molecular y bioquímicamente. Los receptores de ABA "Pyrabactin Resistance 1"(PYR)/"PYR1-LIKE" (PYL)/ "Regulatory Component of ABA Receptor" (RCAR) juegan un papel importante en la regulación cuantitativa de la señalización ABA tanto en semillas como en tejidos vegetativos. Aunque la función bioquímica de los receptores PYR/PYL/RCARs de ABA, está bien caracterizada, se conoce poco sobre otros aspectos con relevancia biológica, como sus modificaciones postraduccionales o la regulación de su vida media. Uno de los avances recientes en este campo ha sido el descubrimiento de una nueva familia de E3 ligasas llamadas RSL1/RFAs ("RING-finger-ABA-related") que consta de al menos 10 miembros, reguladores clave de la estabilidad de los receptores PYR/PYL/RCAR de ABA en tejidos de raíces y hojas, regulando su degradación en diferentes ubicaciones celulares. Un estudio detallado de esta familia génica reveló que RSL1/RFA se caracterizan estructuralmente por la presencia de tres dominios RING putativos en tándem, denominados "RING1-IN BETWEEN RING-RING2" (RBR), y en consecuencia pertenecen a la familia de E3 ligasas de tipo RBR. Cinco miembros de la familia RSL1/RFA, RSL1 y RFA6-RFA9, contienen un dominio TM en el extremo C-terminal, lo que sugiere que RFA6-RFA9 también se localizan en la membrana plasmática. Sin embargo, otros miembros de las E3 ligasas como RFA1-RFA5 carecen del dominio TM C-terminal y su caracterización funcional, así como su ubicación celular, aún no se conocen. Nosotros mostramos que la E3 ligasa RFA1 se localiza en núcleo y citosol, mientras que RFA4 muestra una localización específica en el núcleo promoviendo la degradación nuclear de los receptores ABA. Por lo tanto, los miembros de la familia RSL1/RFA interactúan con los receptores ABA en la membrana plasmática, el citosol y el núcleo, dirigiéndolos a su degradación a través de la vía endosomal/vacuolar (en el caso de RSL1) o el proteosoma 26S (para RFA1 y RFA4). Proporcionamos información sobre la función fisiológica de estas E3 ligasas de tipo RBR. Realizando tanto mutagénesis como ensayos bioquímicos para identificar la cisteína 361 (Cys361) en RFA4 como la Cys del sitio activo, que es una característica distintiva de las E3 ligasas de tipo RBR. Demostramos mediante análisis de inmunotransferencia del mutante con pérdida de función de rfa1rfa4 que los niveles endógenos de los receptores de ABA PYR1 y PYL4 aumentan en comparación con las plantas de tipo silvestre. Hemos identificado una enzima E2, "Ubiquitin Conjugating Enzyme 26" (UBC26), como la enzima nuclear canónica E2 que interactúa con la E3 ligasa RFA4 y forma complejos UBC26-RFA4-Receptor, formando agregados nucleares. Generamos alelos ubc26 con pérdida de función que mostraban una mayor sensibilidad a ABA y acumulación de receptores ABA en comparación con el tipo silvestre. En definitiva, hemos revelado un sofisticado sistema de ubiquitinación de receptores ABA en diferentes ubicaciones subcelulares llevado a cabo a través de la familia de E3 ligasas RSL1/RFA de tipo RBR. Por otro lado, hemos iniciado pruebas bioquímicas para identificar la S-acilación en el dominio TM de RSL1. Generando RSL1C334S, RSL1 C5S y RSL1C6S mediante mutagénesis y RSL1ΔTM que presenta una delección del dominio TM. Los estudios iniciales han demostrado que los residuos de Cys cercanos al dominio TM están S-acilados. Finalmente, generamos nu / [CA] El creixement de les plantes es pot veure afectat per l'estrès abiòtic, sequera, salinitat o altes temperatures. La transducció de senyals d'estrès abiòtic és fonamental per a generar una resposta fisiològica adequada, que implica la participació de diferents hormones vegetals, sent l'àcid abscísic (ABA) el regulador hormonal crític en la regulació de la resposta de la planta a situacions d'estrès per dèficit hídric. La ruta de senyalització d'ABA i els components principals de la ruta estan ben caracteritzats molecularment i bioquímica. Els receptors "Pyrabactin Resistance 1"(PYR)/"PYR1-LIKE"(PYL)/"Regulatory Component of ABA Receptor" (RCAR) exerceixen un paper important en la regulació quantitativa en resposta a l'estrès tant en llavors com en planta. Encara que la funció bioquímica dels receptors PYR/PYL/RCARs d'ABA, està ben caracteritzada en els últims anys, es coneix poc sobre altres aspectes amb rellevància biològica, com les seues modificacions postraduccionals o la regulació de la seua vida mitjana. Un dels avanços recents en aquest camp ha sigut el descobriment d'una nova família d'E3 ligases anomenades RSL1/RFAs ("RING-finger-ABA-related") que consta d'almenys 10 membres, que són reguladors clau de l'estabilitat dels receptors PYR/PYL/RCAR d'ABA en teixits d'arrels i fulles, regulant la seua degradació en diferents ubicacions cel·lulars. Un estudi més detallat d'aquesta família gènica va revelar que RSL1/RFAs es caracteritzen estructuralment per la presència de tres dominis RING putatius en tàndem, denominats "RING1-IN BETWEEN RING-RING2" (RBR), i en conseqüència pertanyen a la família d'E3 ligases de tipus RBR. Cinc membres de la família RSL1/RFA, RSL1 i RFA6-RFA9, contenen un domini TM en l'extrem C-terminal, la qual cosa suggereix que RFA6-RFA9 també es localitzen en la membrana plasmàtica. No obstant això, altres membres d'aquesta família d'E3 ligases com RFA1-RFA5 manquen del domini TM C-terminal i la seua caracterització funcional, així com la seua ubicació cel·lular, encara no ha sigut investigada. Vam mostrar que l'E3 ligasa RFA1 es localitza tant en el nucli com en el citosol, mentre que RFA4 mostra una localització específica en el nucli promovent la degradació nuclear dels receptors ABA. Per tant, els membres de la família RSL1/RFA interactuen amb els receptors ABA en la membrana plasmàtica, el citosol i el nucli, dirigint-los a la seua degradació a través de la vía endosomal/vacuolar (en el cas de RSL1) o el proteosoma 26S (per a RFA1 i RFA4). Proporcionem informació sobre la funció fisiològica d'aquestes E3 ligases de tipus RBR. Realitzant tant mutagènesis com a assajos bioquímics per a identificar la cisteïna 361 (Cys361) en RFA4 com la Cys del lloc actiu, que és una característica distintiva de les E3 ligases de tipus RBR. Hem demostrat mitjançant una anàlisi d'immuno-transferència del mutant amb pèrdua de funció de rfa1rfa4 que els nivells endògens dels receptors d'ABA PYR1 i PYL4 augmenten en comparació amb les plantes de tipus silvestre. D'altra banda, hem identificat un enzim E2, "Ubiquitin Conjugating Enzyme 26" (UBC26), com l'enzim nuclear canònic E2 que interactua amb l'E3 ligasa RFA4 i forma complexos UBC26-RFA4-Receptor, formant agregats nuclears. També generem al·lels ubc26 amb pèrdua de funció que mostraven una major sensibilitat a ABA i acumulació de receptors ABA en comparació amb el tipus silvestre. En definitiva, hem revelat un sofisticat sistema d'ubiquitinació de receptors ABA en diferents ubicacions subcel·lulars dut a terme a través de la família d'E3 ligases RSL1/RFA de tipus RBR. Hem iniciat proves bioquímiques per a identificar la S-acilació en el domini TM de RSL1. Hem generat RSL1C334S, RSL1 C5S i RSL1C6S mitjançant mutagènesis, així com RSL1ΔTM que presenta una delecció del domini TM. Els estudis inicials han demostrat que els residus de Cys pròxims al domini TM estan S-acilados. Final / [EN] Plant growth is affected by abiotic stress, drought, salinity or high temperature. Signal transduction of abiotic stress is crucial to generate an appropriated physiological response, which involves the participation of different plant hormones, being abscisic acid (ABA) the critical hormonal regulator in regulating the plant's response to situations of stress due to water deficit. The ABA signaling pathway and the major components of the pathway are well characterized molecularly and biochemically. Pyrabactin Resistance 1 (PYR)/PYR1-LIKE (PYL)/Regulatory Component of ABA Receptor (RCAR) ABA receptors play an important role in quantitative regulation of ABA signaling both in seeds and vegetative tissues. Although the biochemical function of the PYR/PYL/RCAR ABA receptors has been well established in recent years, little is known about other aspects with biological relevance, such as their post-translational modifications or the regulation of their half-life. One of the recent advances in this field has been the discovery of a new family of E3 ligases called RSL1/RFAs (RING-finger-ABA-related) that consists of at least 10 members, which are key regulators of the stability of PYR/PYL/RCARs in root and leaf tissues, and regulate the degradation of ABA receptors at different cellular locations. Further inspection of the gene family revealed that RSL1/RFAs are structurally characterized by the presence of three putative RING domains in tandem, named as RING1-IN BETWEEN RING (IBR)-RING2, and accordingly they belong to the RBR-type E3 ligase family. Five members of the RSL1/RFA family, that is, RSL1 and RFA6-RFA9, contain a TM domain at the C-terminal end of the proteins, which suggests that RFA6-RFA9 are also localized in plasma membrane. However, other members of this family of E3 ligases such as RFA1-RFA5 lack the C-terminal TM domain and their functional characterization, as well as their cellular location, has not been investigated yet. In this study we show that the E3 ligase RFA1 is localized both in the nucleus and in the cytosol, while RFA4 shows a specific localization in the nucleus promoting the nuclear degradation of ABA receptors. Therefore, we members of the RSL1/RFA family interact with ABA receptors at the plasma membrane, cytosol and nucleus, targeting them for degradation via the endosomal/vacuolar pathway (in the case of RSL1) or the 26S- proteasome (for RFA1 and RFA4). We provide information on the physiological function of these RBR-type E3 ligases, which are hardly explored in plants. Additionally, we performed mutagenesis and biochemical assays to identify Cys361 in RFA4 as the active site cysteine, which is a distinctive feature of RBR-type E3 ligases. We have shown by immunoblot analysis of the rfa1rfa4 loss-of-function mutant that endogenous levels of ABA receptors PYR1 and PYL4 are increased compared to wild-type plants. On the other hand, we have identified an E2 enzyme, Ubiquitin Conjugating Enzyme 26 (UBC26), as the canonical nuclear enzyme E2 that interacts with the E3 ligase RFA4 and forms UBC26-RFA4-Receptor complexes, forming nuclear aggregates. We also generated loss-of function ubc26 alleles that exhibited higher sensitivity to ABA and accumulation of ABA receptors compared to wild type. We have revealed a sophisticated ubiquitination system of ABA receptors in different subcellular locations carried out through the RBR-type RSL1/RFA family of E3 ligases. We have proceeded with the biochemical and genetic study of the different members of the family. We have started biochemical tests to identify the S-acylation in the TM domain of RSL1. To this end, we have generated RSL1C334S, RSL1 C5S and RSL1C6S by mutagenesis as well as RSL1ΔTM, a deletion of the TM domain. Initial studies have shown that Cys residues close to the TM domain are S-acylated. Finally, we have also generated new combined mutants: rsl1rfa1, rsl1rfa5, rfa1rfa5 and rsl1rfa1rfa5. / Fernández López, MA. (2021). Regulación de la señalización del ABA mediante mecanismos que controlan vida media y actividad de los receptores PYR/PYL [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/172364 / TESIS

[EN] Mutants able to germinate and perform early growth in medium containing a high NaCl concentration were identified and named salt resistant (sre). The sre mutants also were able to germinate in high-osmoticum medium, indicating that they are osmotolerant in a germination assay. Complementation analyses revealed that sre1-1 and sre1-2 were alleles of the abscisic acid (ABA) biosynthesis ABA2 gene. A map-based cloning strategy allowed the identification of the ABA2 gene and molecular characterization of the new aba2 alleles. The ABA2 gene product belongs to the family of short-chain dehydrogenases/reductases, which are known to be NAD- or NADP-dependent oxidoreductases. Recombinant ABA2 protein produced in Escherichia coli exhibits a Km value for xanthoxin of 19 µM and catalyzes in a NAD-dependent manner the conversion of xanthoxin to abscisic aldehyde, as determined by HPLC-mass spectrometry. The ABA2 mRNA is expressed constitutively in all plant organs examined and is not upregulated in response to osmotic stress. The results of this work are discussed in the context of previous genetic and biochemical evidence regarding ABA biosynthesis, confirming the xanthoxin-->abscisic aldehyde-->ABA transition as the last steps of the major ABA biosynthetic pathway. The abscisic aldehyde oxidase 3 (AAO3) gene product of A. thaliana catalyzes the final step in abscisic acid (ABA) biosynthesis. An aao3-1 mutant in a Landsberg erecta genetic background exhibited a wilty phenotype in rosette leaves, whereas seed dormancy was not affected (Seo et al., 2000a). Therefore, it was speculated that a different aldehyde oxidase would be the major contributor to ABA biosynthesis in seeds (Seo et al., 2000a). Through a screening based on germination under high-salt concentration, we isolated two mutants in a Columbia genetic background, initially named sre2-1 and sre2-2. Complementation tests with different ABA-deficient mutants indicated that sre2-1 and sre2- 2 mutants were allelic to aao3-1, and therefore they were renamed as aao3-2 and aao3-3, respectively. Indeed, molecular characterization of the aao3-2 mutant revealed a T-DNA insertional mutation that abolished the transcription of AAO3 gene, while sequence analysis of AAO3 in aao3-3 mutant revealed a deletion of three nucleotides and several missense mutations. Physiological characterization of aao3-2 and aao3-3 mutants revealed a wilty phenotype and osmotolerance in germination assays. In contrast to aao3-1, both aao3-2 and aao3-3 mutants showed a reduced dormancy. Accordingly, ABA levels were reduced in dry seeds and rosette leaves of both aao3-2 and aao3-3. Taken together, these results indicate that AAO3 gene product plays a major role in seed ABA biosynthesis. / [ES] El ácido abscísico (ABA) es una fitohormona implicada en el control de procesos vegetales esenciales, principalmente el desarrollo de la semilla así como la respuesta de las plantas a diferentes estreses ambientales, particularmente frío, sequía y salinidad. En el presente trabajo se ha realizado la búsqueda en colecciones de Arabidopsis thaliana mutagenizadas con T-DNA de mutantes capaces de germinar en condiciones de alta sal (NaCl), identificándose tres loci mutantes, inicialmente denominados sre1, sre2 y sre3 (“salt resistant”). Los mutantes sre, además de su capacidad para germinar y establecer plántula en condiciones de estrés osmótico, mostraban una germinación resistente a paclobutrazol, latencia muy reducida, mayor transpiración y niveles de ABA en hojas de roseta significativamente menores que plantas silvestres. El análisis de complementación reveló que los mutantes sre1 eran alélicos al mutante aba2-1, los mutante sre2 eran alélicos al mutante aao3-1 y el mutante sre3 era alélico al mutante aba1-5. Así, el ABA bloquea la germinación y el establecimiento de la plántula en condiciones de bajo potencial hídrico, por lo que mutantes capaces de germinar en condiciones de estrés osmótico representan frecuentemente mutantes defectivos en la biosíntesis de ABA. Mediante una combinación de las estrategias de mapeo posicional y gen candidato se llevó a cabo la identificación del gen ABA2 y de las mutaciones sre1-1/aba2-11 y sre1- 2/aba2-12. El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena corta dependiente de NAD+ (SDR). La mutación sre1-1/aba2-11 es debida a una deleción de 53 pb que también supone un cambio en la pauta de lectura, generando un alelo nulo de ABA2. La mutación sre1-2/aba2-12 conduce a la sustitución Gly28Arg, afectando al sitio de unión del coenzima. Mediante un análisis HPLC-MS se ha demostrado que la proteína recombinante ABA2 cataliza la conversión de xantoxina en aldehído abscísico en una reacción dependiente de NAD+ . Los resultados obtenidos en el presente trabajo establecen inequívocamente que la conversión de xantoxina en aldehído abscísico representa el penúltimo paso de la ruta de biosíntesis de ABA y que este es catalizado por el producto génico del gen ABA2 (At1g52340). El último paso de la ruta de biosíntesis de ABA es la conversión de aldehído abscísico en ácido abscísico. Este paso está catalizado en Arabidopsis por el producto génico del gen AAO3. Los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutante aao3-1, muestran una reducción en los niveles de ABA en hojas de roseta y una mayor transpiración que las plantas silvestres. Además, y contrariamente el mutante aao3-1, muestran un fenotipo de osmotolerancia en germinación y establecimiento de plántula, germinación resistente a paclobutrazol, latencia reducida y poseen una reducción del 65% en los niveles de ABA en semillas. La caracterización molecular de la mutación sre2-1/aao3-2 revela una inserción de T-DNA que elimina la transcripción del gen AAO3, constituyendo por tanto un alelo nulo. La secuenciación del gen AAO3 en el mutante sre2-2/aao3-3 revela una deleción de tres nucleótidos y varias mutaciones de cambio de sentido. La evidencia genética y bioquímica resultante del análisis de los mutantes sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aaao3-3 indica que lesiones en el gen AAO3 conducen a niveles reducidos de ABA y fenotipos característicos en semillas. Por consiguiente, queda demostrado que el gen AAO3 desempeña un papel crucial en la biosíntesis de ABA en semillas. / [CA] L´àcid abscísic (ABA) és una fitohormona que ha estat implicada en el control de processos vegetals essencials, principalment en el desenvolupament de la llavor així com en la resposta de les plantes a diferents estressos ambientals, particularment fred, sequera i salinitat. En el present treball de tesi doctoral s´ha fet la recerca en coleccions d´Arabidopsis thaliana mutagenizades amb T-DNA de mutants capaços de germinar en condicions d´elevada sal (NaCl), identificant-se tres loci mutants, inicialment denominats sre1,sre2 i sre3 (“salt resistant”). Els mutants sre, a més de la seva capacitat per a germinar i establir plàntula en condicions d´estrès osmòtic, mostraven una germinació resistent a paclobutrazol, latència molt reduïda, major transpiració i nivells d´ABA en fulles de roseta significativament menors que les plantes silvestres. L´anàlisi de complementació va mostrar que els mutants sre1 eren al·lèlics al mutant aba2-1, els mutants sre2 eren al·lèlics al mutant aao3-1 i el mutant sre3 era al·lèlic al mutant aba1-5. Així, l´ABA bloqueja la germinació i l´establiment de la plàntula en condicions de baix potencial hídric, i aleshores mutants capaços de germinar en condicions d´estrès osmòtic representen normalment mutants amb defectes en la biosíntesi d´ABA. Mitjançant una combinació de les estratègies de mapeig posicional i gen candidat s´ha realitzat la identificació del gen ABA2 y de les mutacions sre1-1/aba2- 11 y sre1-2/aba2-12.El gen ABA2 (At1g52340) codifica una alcohol deshidrogenasa de cadena curta dependent de NAD+ (SDR). La mutació sre1-1/aba2-11 es deguda a una deleció de 53 pb que també suposa un camvi en la pauta de lectura, generant un al·lel nul de ABA2. La mutació sre1-2/aba2-12 produeix a la substitució Gly28Arg, afectant al lloc d´unió del coenzima. Mitjançant un anàlisi HPLC-MS s´ha demostrat que la proteïna recombinant ABA2 catalitza la conversió de xantoxina en aldehid abscísic en una reacció dependent de NAD+ . Els resultats obtinguts en el present treball estableixen inequívocament que la conversió de xantoxina en aldehíd abscísic representa el penúltim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA i que està catalitzat pel producte gènic del gen ABA2 (At1g52340). L´últim pas de la ruta de biosíntesi d´ABA és la conversió de l´aldehid abscísic en àcid abscísic. Aquest pas està catalitzat en A. thaliana pel producte gènic del gen AAO3. Els mutants sre2-1/aao3-2 y sre2-2/aao3-3, igual que el mutant aao3-1, mostraven una reducció en els nivells d´ABA en fulles de roseta i una major transpiració que las plantes silvestres. A més, i contràriament al mutant aao3-1, mostraven un fenotip de osmotolerancia en germinació i establiment de plàntula, germinació resistent a paclobutrazol, latència reduïda i posseeixen una reducció del 65% en els nivells d´ABA en llavors. La caracterització molecular de la mutació sre2-1/aao3-2 revela una inserció de T-DNA que elimina la transcripció del gen AAO3, constituint por tant un al·lel nul. La secuenciació del gen AAO3 en el mutant sre2-2/aao3-3 va revelar una deleció de tres nucleòtids i vàries mutacions de canvi de sentit. L´evidencia genètica i bioquímica resultant de l´anàlisi dels mutants sre2- 1/aao3-2 i sre2-2/aaao3-3 indica que lesions en el gen AAO3 condueixen a nivells reduïts d´ABA i fenotips característics en llavors. Aleshores, queda demostrat que el gen AAO3 poseeix un paper crucial en la biosíntesi d´ABA en llavors. / González Guzmán, M. (2005). Genética molecular de la biosíntesis del ácido abscísico. Clonación y caracterización del gen ABA2 [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/135830 / TESIS / Premios Extraordinarios de tesis doctorales