Made available in DSpace on 2014-08-20T14:06:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese _Mauricio_ Marini_ Kopp.pdf: 840580 bytes, checksum: aa13499ffc402e82213fc46d39ba5dd0 (MD5) Previous issue date: 2008-04-07 / Hydromorphic soils present as main feature a reduced natural drainage ability, being mostly used for growing irrigated rice. Thus, the occurrence of anaerobic conditions associated to the presence of organic matter enables the development of anaerobic microorganisms which, while decomposing the organic matter, generate phytotoxic substances represented mainly by short chain aliphatic organic acids. The selection of promising genotypes adapted for use in these situations requires complicated field evaluations, which can be simulated under hydroponic culture. The research was composed of four articles that had as major goals to establish an adequate methodology for growing rice under organic acid rich hydroponic culture. The first work aimed at determining the range of concentrations and response variables most indicated for evaluating rice genotypes under hydroponics. The effects of six different concentrations for the three major acids formed in the soil: acetic (0; 4; 8; 12; 16 and 20 mM), propionic (0; 3; 6; 9; 12 and 15 mM) and butyric (0; 2; 4; 6; 8 and 10 mM) acids in two genotypes of high divergence (BRS 7-TAIM and SAIBAN). The results indicated that the most adequate concentration range for organic acid studies in rice are between 15.8 and 8.4; 9.1 and 4.2 and 7.7 and 3.7 mM for acetic, propionic and butyric acids, respectively. Also, the most responsive variable was root length. The second experiment had as goal to determine, under hydroponics, the influence of the pH level used in the hydroponic solution on the phytotoxicity caused by acetic, propionic and butyric acids in rice, as well as the performance of some variables currently used in studies of abiotic stress tolerance in hydroponic systems. For this experiment, three acids (acetic, propionic and butyric) and four pH (4.0; 5.0; 6.0 and 7.0) levels were evaluated. The results allow one to conclude that reduced pH levels increase the phytotoxicity of all acids. The root and shoot lengths have independent behavior from the acid used, as opposite to root number and root and shoot dry matter. Root length was the variable most affected by the treatments. The third article had as objective to evaluate the response of 25 rice genotypes to the phytotoxic effect of acetic, propionic and butyric acids, individually. In this work, 4 treatments were used for each acid: 0 (control); 4; 8 and 12 mM for acetic; 0; 3; 6 and 9 mM for propionic and 0; 2; 4 and 6 mM for butyric acid, respectively. The variables measured were root (CR) and shoot (CPA) length, root number (NR) and root (MSR) and shoot (MSPA) dry matter. The relative performance of the variable CR was the most affected by the acids and the regressions established for this variable revealed ix ix tolerant and sensitive genotypes to organic acids, with 6; 6 and 9 tolerant genotypes for acetic, propionic and butyric acids, respectively. It was observed a higher number of tolerant genotypes on the japonica than on the indica group. The fourth experiment had as objective to evaluate the response of 20 rice cultivars to the interactive phytotoxic effect of acetic, propionic and butyric acids. In these work, four treatments, 0 (control); 3; 6 and 9 mM were used, consisting of the mixture of three acids (acetic, propionic and butyric) at a 6:3:1 ratio. The variables measured were root (CR) and shoot (CPA) length, root number (NR) and root (MSR) and shoot (MSPA) dry matter, phosphorus (P) and potassium (K) content. The results indicated significant differences between the genotypes evaluated for the characters CR, CPA, P and K. Four genotypes were ranked as tolerants. The variable CR associated to CPA, P and K are indicated for the selection of tolerant genotypes. The results obtained allowed one to establish an adequate methodology for the selection of rice genotypes under hydroponic systems combined with organic acid stress (acetic, propionic and butyric) as well as to select promising genotypes regarding their response to this stress. / Os solos do tipo hidromórfico apresentam como característica principal uma reduzida capacidade de drenagem natural, sendo utilizados principalmente para cultivo de arroz irrigado. Assim, a ocorrência de condições anaeróbias associada com a presença de matéria orgânica favorece o desenvolvimento de microrganismos anaeróbios que causam a fermentação desta matéria orgânica produzindo substâncias fitotóxicas representadas principalmente pelos ácidos orgânicos alifáticos de cadeia curta. A seleção de constituições genéticas de arroz promissoras e adaptadas para utilização nestas situações requer avaliações de difícil execução a campo, sendo simplificada com a utilização de sistemas hidropônicos. A pesquisa foi composta de quatro trabalhos que tiveram como objetivo principal estabelecer uma metodologia adequada para estudos com ácidos orgânicos em arroz mediante cultivo hidropônico. O primeiro trabalho determinou a faixa de concentrações e variáveis resposta mais indicadas para avaliações de genótipos de arroz em hidroponia. Foram estudados os efeitos de seis concentrações dos três principais ácidos formados no solo: ácido acético (0; 4; 8; 12; 16 e 20 mM), ácido propiônico (0; 3; 6; 9; 12; e 15 mM) e ácido butírico (0; 2; 4; 6; 8 e 10 mM) em dois genótipos de elevada divergência (BRS 7-TAIM e SAIBAN). Os resultados indicam que as faixas de concentração mais adequadas para estudos de tolerância de arroz a ácidos orgânicos estão entre 15,8 e 8,4; 9,1 e 4,2 e 7,7 e 3,7 mM para os ácidos acético, propiônico e butírico respectivamente, e a variável mais responsiva foi comprimento de raízes. O segundo experimento teve como objetivo determinar, em hidroponia, a influência do nível de pH utilizado na solução hidropônica na fitotoxidade causada pelos ácidos acético, propiônico e butírico em arroz, bem como o desempenho de algumas variáveis atualmente utilizadas em estudos de tolerância a estresses abióticos em sistemas hidropônicos. Neste experimento, foram avaliados três ácidos (acético, propiônico e butírico) e quatro níveis de pH (4,0; 5,0; 6,0 e 7,0). Os resultados permitem concluir que níveis reduzidos de pH aumentam a fitotoxidez de todos os ácidos. Os comprimentos de raízes e parte aérea têm comportamento independente do ácido utilizado, ao contrário do número de raízes e matérias secas de raízes e parte aérea. O comprimento de raízes foi a variável mais afetada pelo efeito das doses. O terceiro trabalho teve como objetivo avaliar a resposta de 25 genótipos de arroz à ação fitotóxica dos ácidos acético, propiônico e butírico individualmente. Neste trabalho foram utilizadas quatro doses para cada ácido: 0 vii vii (testemunha); 4; 8 e 12 mM para ácido acético; 0; 3; 6 e 9 mM para ácido propiônico e 0; 2; 4 e 6 mM para ácido butírico As variáveis mensuradas foram comprimento de raízes (CR) e parte aérea (CPA), número de raízes (NR) e matéria seca de raízes (MSR) e parte aérea (MSPA). O desempenho relativo da variável CR foi o mais afetado pelos ácidos e as regressões estabelecidas para essa variável revelaram genótipos tolerantes e sensíveis aos ácidos orgânicos, com seis; seis e nove genótipos tolerântes para os ácidos acético, propiônico e butírico, respectivamente. Foi constatado ainda maior número de tolerantes no grupo japonica do que no indica. O quarto experimento teve como objetivo avaliar a resposta de 20 genótipos de arroz a ação fitotóxica interativa dos ácidos acético, propiônico e butírico. Neste trabalho foram utilizados quatro doses, 0 (testemunha); 3; 6 e 9 mM, que foram constituídos da mistura dos três ácidos (acético, propiônico e butírico) na relação 6:3:1. As variáveis mensuradas foram comprimento de raízes (CR) e parte aérea (CPA), número de raízes (NR) e matéria seca de raízes (MSR) e parte aérea (MSPA), teor de fósforo (P) e de potássio (K). Os resultados demonstraram diferenças significativas entre os genótipos avaliados nos caracteres CR, CPA, P e K. Quatro genótipos foram classificados como tolerantes. A variável CR associada a CPA, P e K são indicadas para seleção de genótipos tolerantes. Os resultados obtidos pelos trabalhos permitiram estabelecer uma metodologia adequada para utilização em seleção de genótipos de arroz mediante sistemas de hidroponia sob estresse por ácidos orgânicos (acético, propiônico e butírico) bem como selecionar genótipos promissores quanto a resposta à este estresse.

Submitted by Michele Mologni (mologni@unoeste.br) on 2017-06-13T13:30:56Z No. of bitstreams: 1 Viviane Cacefo.pdf: 1556310 bytes, checksum: 3f9d8dc2ff4a08b8acc2ec7e1a731117 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T13:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Viviane Cacefo.pdf: 1556310 bytes, checksum: 3f9d8dc2ff4a08b8acc2ec7e1a731117 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / C4 plants have been classified into three groups based on the enzymes used to decarboxylate C4 acids in the bundle sheath: NADP-ME, NAD-ME and PEPCK subtypes. Numerous molecular, biochemical and physiological evidences indicate that C4 plants could exhibit a certain degree of flexibility in the use of the three established decarboxylation mechanisms, depending on environmental factors. In this context, the objective of this work was to evaluate the modulation of the pathways of decarboxylation of the C4 photosynthesis in sugarcane (NADP-ME specie) under water deficit. The experiment was realized with two genotypes - RB92579 (tolerant to water deficit) and SP80-3280 (susceptible to water deficit) submitted to four treatments: control (normal conditions of water supply), moderate stress (-1,5 to -1,8 MPa), severe stress (below -2,0 MPa) and recovery (48 hours after rehydration). Leaf water potential, leaf gas exchange and biomass production were measured for the physiological characterization of the plants. Changes in the transcriptional responses of genes encoding C4-cycle enzymes (NADP-ME, NAD-ME, PEPCK, AspAT, AlaAT, PEPC, NADP-MDH and PPDK) and the activities of the enzymes NADP-ME, NAD-ME, PEPCK, AspAT and AlaAT were analyzed by RT-qPCR and spectrophotometry, respectively. Under water deficit conditions the genotypes SP80-3280 was more sensitive to drought stress in terms of increased loss of above ground biomass and lower leaf water potential. It also showed less capacity of photosynthetic recovery following rehydration compared to the tolerant genotypes RB92579. The analysis of transcriptionals and of the activities of enzymes involved in the C4 photosynthetic pathway showed that sugarcane uses the PEPCK pathway as a decarboxylation mechanism in addition to the NADP-ME, which was more evident under water deficit conditions for both the drought tolerant and susceptible genotypes. Finally, the results here obtained, together with the existing information, do not support the established classification of sugarcane (Saccharum spp.) as a classical NADP-ME C4 subtype, but instead should be considered as a NADP-ME + PEPCK species. / As plantas C4 são classificadas em três grupos de acordo com as enzimas utilizadas para descarboxilação de ácidos C4 na bainha dos feixes vasculares: subtipos NADP-ME, NAD-ME e PEPCK. Inúmeras evidências moleculares, bioquímicas e fisiológicas indicam que plantas C4 podem exibir certo nível de flexibilidade na utilização dos três mecanismos de descarboxilação, dependendo de fatores ambientais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a modulação das vias de descarboxilação da fotossíntese C4 em cana-de-açúcar (espécie NADP-ME) sob déficit hídrico. O experimento foi realizado com dois genótipos - RB92579 (tolerante ao déficit hídrico) e SP80-3280 (suscetível ao déficit hídrico) submetidos a quatro tratamentos: controle (condições normais de suprimento de água), estresse moderado (-1,5 a -1,8 MPa), estresse severo (abaixo de -2,0 MPa) e recuperação (48 hrs após a reidratação). Foram realizadas análises de potencial de água foliar, trocas gasosas foliares e biomassa para caracterização fisiológica das plantas. As alterações nas respostas transcricionais dos genes codificadores de enzimas do ciclo C4 (NADP-ME, NAD-ME, PEPCK, AspAT, AlaAT, PEPC, NADP-MDH e PPDK) e atividades das enzimas NADP-ME, NAD-ME, PEPCK, AspAT e AlaAT, foram analisadas por RT-qPCR e espectrofotometria, respectivamente. Em condições de déficit hídrico, o genótipo SP80-3280 foi mais sensível ao estresse por seca em termos de aumento da perda de biomassa e menor potencial de água foliar. Também mostrou menor capacidade de recuperação fotossintética após reidratação do que o genótipo tolerante RB92579. As análises transcricionais e das atividades das enzimas envolvidas na via fotossintética C4 mostraram que a cana-de-açúcar utiliza a via PEPCK como mecanismo de descarboxilação, além da NADP-ME, mais evidente em condições de déficit hídrico tanto para genótipos tolerantes à seca como para suscetíveis. Finalmente, os resultados aqui obtidos, juntamente com a informação existente, não suportam a classificação estabelecida da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) como um subtipo C4 NADP-ME clássico, mas considerá-la como uma espécie NADP-ME + PEPCK.

Submitted by Michele Mologni (mologni@unoeste.br) on 2017-08-30T13:15:11Z No. of bitstreams: 1 Fláive Loyze Baldassarini Silva.pdf: 2001999 bytes, checksum: e6f3c3f0169423517f9b8ffac6f5f788 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-30T13:15:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fláive Loyze Baldassarini Silva.pdf: 2001999 bytes, checksum: e6f3c3f0169423517f9b8ffac6f5f788 (MD5) Previous issue date: 2017-06-27 / The association between proline metabolism in the plant and the pentose phosphate pathway has been proposed as a model to stimulate one of the biosynthetic routes of secondary metabolism related to the production of the different phenolic compounds in plants, known as the shikimic acid pathway. In transgenic plants in which overexpression of the P5CS gene Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase encoding the key enzyme of proline biosynthesis occurs, in addition to increased tolerance to abiotic stresses, there is the possibility of promoting the synthesis of phenolic compounds as a pleiotropic effect. The objective of this work was to evaluate the role of proline "per se" in relation to the production of phenolic compounds in transgenic tobacco plants accumulating this amino acid (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) and to verify if water stress would modify this answer. The experiment was carried out under greenhouse conditions, at Campus II of Universidade do Oeste Paulista, Presidente Prudente - SP. A completely randomized design was used in the factorial scheme 3x2 consisting of 3 genotypes (two transgenic events with constitutive expression 35S::P5CSF129A and untransformed control plants) and two levels of water regime, with daily water replenishment of 100% and 30% of field capacity (water stress). The role of proline "per se" was evaluated by means of biometric growth analyzes (plant height, shoot and root dry mass and leaf number) in addition to proline analyzes, glucose-6-phosphate dehydrogenase activity (G6PDH), phenylalanine ammonia lyase (PAL), total phenolic compounds in leaves and lignin. In a natural response to water stress, a reduction in biometric parameters was observed for all genotypes. The accumulation of proline occurred in a greater proportion in the transgenic plants as expected by the constitutive expression of the P5CS gene, but the activity of the G6PDH enzyme was lower in the transgenic plants. The link between increased proline endogenous content and increased phenol synthesis occurred both under normal hydration conditions (for E2 event) and in the presence of water stress (for both transgenic events), as well as PAL activity. Lignin contents increased in all genotypes in response to stress. Thus, the results of this research lead us to affirm the existence of distinct responses between exogenous application of proline reported in the literature and endogenous cellular metabolism. It was not possible to confirm the hypothesis that the proline metabolism linked to the pentose phosphate pathway induces the synthesis of phenolic compounds, since the activity of the G6PDH enzyme was lower in the transgenic plants in the two water conditions. It is suggested that the precursors to the pathway of phenolic compounds linked to proline may be provided by other metabolic pathways such as glycolysis and the Calvin cycle. Further study will be needed to clarify this issue. / A associação entre o metabolismo de prolina na planta e a via pentose fosfato tem sido proposta como um modelo para se estimular uma das rotas do metabolismo secundário relacionada à produção dos diferentes compostos fenólicos em plantas, denominada via do ácido chiquímico. Em plantas transgênicas nas quais ocorrem a superexpressão do gene P5CS Δ1-pirrolina-5-carboxilato sintetase, que codifica a enzima-chave da biossíntese de prolina, além do aumento de tolerância a estresses abióticos, existe a possibilidade de promoção da síntese de compostos fenólicos como um efeito pleiotrópico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da prolina “per se” em relação à produção de compostos fenólicos em plantas transgênicas de tabaco acumuladoras deste aminoácido (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) e verificar se o estresse hídrico modificaria essa resposta. O experimento foi realizado em condições de casa de vegetação, no Campus II da Universidade do Oeste Paulista, Presidente Prudente - SP. Utilizou-se o delineamento experimental em arranjo inteiramente casualizado, no esquema fatorial 3x2, formado por 3 genótipos (dois eventos transgênicos com expressão constitutiva 35S::P5CSF129A e plantas controle não transformadas) e dois níveis de regime hídrico, com reposições diárias de água de 100% e de 30% da capacidade de campo (estresse hídrico). O papel da prolina “per se” foi avaliado por meio de análises biométricas de crescimento (altura de plantas, massas seca de parte aérea e raiz e número de folhas) além das análises de prolina, atividade das enzimas glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PDH), fenilalanina amônia liase (FAL), compostos fenólicos totais nas folhas e lignina. Em resposta natural ao estresse hídrico, foi observado uma redução nos parâmetros biométricos para todos os genótipos. O acúmulo de prolina ocorreu em maior proporção nas plantas transgênicas como esperado pela expressão constitutiva do gene P5CS, porém a atividade da enzima G6PDH foi menor nas plantas transgênicas. A vinculação entre um maior conteúdo endógeno de prolina com a síntese aumentada de fenóis ocorreu tanto em condições normais de hidratação (para o evento E2) como na presença de estresse hídrico (para ambos os eventos transgênicos), assim como a atividade da FAL. Os teores de lignina aumentou em todos os genótipos em resposta ao estresse. Desta forma, os resultados dessa pesquisa levam-nos a afirmar a existência de respostas distintas entre aplicação exógena de prolina relatada na literatura e o metabolismo endógeno celular. Não foi possível confirmar a hipótese de que o metabolismo de prolina vinculado à via pentose fosfato induz a síntese de compostos fenólicos, pois a atividade da enzima G6PDH foi menor nas plantas transgênicas nas duas condições hídricas. Sugere-se que os precursores para a via dos compostos fenólicos ligados a prolina podem ser fornecidos por outras vias metabólicas tais como a glicólise e o ciclo de Calvin. Estudos mais aprofundados serão necessários para esclarecer esta questão.

[EN] Cold is one of the most important abiotic stresses, severely affects the growth and development of plants, and limits their geographical distribution. Given that cold, salinity and drought stresses overlap some of their molecular mechanisms of response, a cDNA library of sugar beet (Beta vulgaris), generated from leaves of plants subjected to saline stress, was used to try to identify genes for tolerance to cold stress by its overexpression in yeast. In this way it was identified, among others, the CRIO4 gene whose characterization has been the work of this thesis. CRIO4 encodes a SEC14-like protein, and it is ortholog to PATL family of Arabidopsis thaliana and it shares a conserved domain with SEC14 and SFH family of yeast. CRIO4 overexpression confers to the yeast cells the ability to grow at low temperatures and tolerance to tunicamycin (an inhibitor of protein glycosylation). The in silico analysis of the CRIO4 sequence confirms several motifs and domains conserved in the protein that seem to direct its function toward the vesicular trafficking, and it reveals multiple potential phosphorylation sites in CRIO4 suggesting a possible role in signaling. Sec14 domain is a phospholipid binding and transfer domain, and the obtained results indicate that CRIO4 binds to phosphatidylinositol and phosphatidylethanolamine. CRIO4 does not complement the function of Sec14p of yeast, and this could be due to the lack of phosphatidylcholine affinity by CRIO4. Tryptophan transport is the greatest limiting factor for growth at low temperatures in yeast. The results of the yeast coexpression assay of CRIO4 and TAT2 (a high-affinity tryptophan permease) displayed in this thesis, seem to indicate stimulation of Tat2p transport to the plasma membrane by CRIO4, which could develop into an enhanced tryptophan absorption, thereby explaining the greater cold tolerance conferred by overexpression of CRIO4 in yeast. The subcellular localization study has shown that CRIO4 is associated with the plasma membrane and intracellular membranes, being part of vesicles, which seems to confirm the role of CRIO4 in intracellular trafficking, function that it would share with its orthologous genes. The expression pattern of CRIO4 in sugar beet has shown that CRIO4 is expressed in all analyzed tissues, focusing its highest expression in leaf and root. It has also been shown that CRIO4 expression increases after shorter exposure to cold stress and heat stress. Phenotypic studies of several mutant lines of PATLs genes from Arabidopsis thaliana have been carried out and high variability in results was obtained, this could be due to functional redundancy among the members of this multigenic family. Phenotypic studies of transgenic lines of Arabidopsis thaliana overexpressing the CRIO4 gene have also been performed. These lines show an improvement in their growth and development at low temperatures, thereby increasing their tolerance to cold stress. Furthermore, expression of CRIO4, in A. thaliana transgenic lines, increases considerably after cold stress and heat shock. Moreover, accumulation points of CRIO4 were observed along the whole cell, after heat shock. Intracellular recycling of PIN2, a gravitropic response indicator, is affected by decreasing temperature. The results obtained in this thesis suggest that overexpression of CRIO4 reactivates intracellular transport of PIN2 under cold stress, which would imply that its phenotype is related to auxin traffic. / [ES] El frío es uno de los estreses abióticos más importantes, afecta severamente al crecimiento y desarrollo de las plantas, y limita su distribución geográfica. Puesto que el estrés por frío, por salinidad y por sequía solapan algunos de sus mecanismos moleculares de respuesta, se usó una biblioteca de ADNc de remolacha (Beta vulgaris) generada con hojas de plantas sometidas a estrés salino, para tratar de identificar genes de tolerancia a estrés por frío mediante su sobreexpresión en levadura. De este modo se identificó, entre otros, el gen CRIO4 cuya caracterización ha sido el trabajo de esta tesis. CRIO4 codifica una proteína tipo Sec14, y es ortólogo a la familia PATL de Arabidopsis thaliana y tiene un dominio conservado con SEC14 y la familia SFH de levadura. La sobreexpresión de CRIO4 confiere a las células de levadura la capacidad de crecer a temperaturas bajas y tolerancia a tunicamicina (inhibidor de la glicosilación de proteínas). El análisis in silico de la secuencia de CRIO4 confirma diversos motivos y dominios conservados en la proteína que parecen dirigir su función hacia el tráfico vesicular, y revela múltiples potenciales sitios de fosforilación en CRIO4 sugiriendo una posible función en señalización. El dominio Sec14 es un dominio de unión y transferencia de fosfolípidos, y los resultados obtenidos indican que CRIO4 establece unión con fosfatidiolinositol y fosfatidiletanolamina. CRIO4 no complementa la función de Sec14p de levadura, y esto podría ser debido a la falta de afinidad de CRIO4 por fosfatidilcolina. En levadura, el transporte de triptófano es el mayor factor limitante para el crecimiento a temperaturas bajas. Los resultados del ensayo de coexpresión de CRIO4 con TAT2 (una permeasa de alta afinidad para triptófano) en levadura mostrados en esta tesis, parecen indicar una estimulación del transporte de Tat2p hacia la membrana plasmática por parte de CRIO4, que podría devenir en una absorción de triptófano mejorada, explicando así la mayor tolerancia a frío conferida por la sobreexpresión de CRIO4 en levadura. El estudio de localización subcelular ha mostrado que CRIO4 está asociada a la membrana plasmática y en membranas intracelulares, formando parte de vesículas, lo que parece confirmar el papel de CRIO4 en el tráfico intracelular, función que compartiría con sus ortólogos. El patrón de expresión de CRIO4 en remolacha ha mostrado que CRIO4 se expresa en todos los tejidos analizados, concentrándose su mayor expresión en hoja y raíz. También se ha mostrado que la expresión de CRIO4 aumenta tras tiempos cortos de exposición a estrés por frío y estrés por calor. Se han realizado estudios fenotípicos de diferentes líneas mutantes en genes PATLs de Arabidopsis thaliana, obteniéndose una gran variabilidad en los resultados que podría ser debida a la redundancia funcional entre los miembros de esta familia multigénica. También se han realizado estudios fenotípicos de líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que sobreexpresan el gen CRIO4. Estas líneas muestran una mejoría en su crecimiento y desarrollo a temperaturas bajas, aumentando por tanto su tolerancia al estrés por frío. Además, la expresión de CRIO4, en las líneas transgénicas de A. thaliana, aumenta considerablemente tras el estrés por frío y tras un choque térmico, observándose en este último caso, acúmulos de CRIO4 a lo largo de toda la célula. El reciclaje intracelular de PIN2, indicador de la respuesta gravitrópica, se ve afectado por la disminución de la temperatura. Los resultados obtenidos en esta tesis parecen indicar que la sobreexpresión de CRIO4 reactiva el transporte intracelular de PIN2 bajo estrés por frío, lo que implicaría que su fenotipo está relacionado con el tráfico de auxinas. / [CA] El fred és un dels estressos abiòtics més importants, afecta severament al creixement i desenvolupament de les plantes, i limita la seua distribució geogràfica. Ja que l'estrès per fred, per salinitat i per sequera solapen alguns dels seus mecanismes moleculars de resposta, es va usar una biblioteca d'ADNc de remolatxa (Beta vulgaris) generada amb fulles de plantes sotmeses a estrès salí, per tractar d'identificar gens de tolerància a estrès per fred mitjançant la seua sobreexpressió en llevat. D'aquesta manera es va identificar, entre d'altres, el gen CRIO4 la caracterització del qual ha estat el treball d'aquesta tesi. CRIO4 codifica una proteïna tipus Sec14, i és ortòleg a la família PATL d'Arabidopsis thaliana i té un domini conservat amb SEC14 i la família SFH de llevat. La sobreexpressió de CRIO4 confereix a les cèl·lules de llevat la capacitat de créixer a temperatures baixes i tolerància a tunicamicina (inhibidor de la glicosilació de proteïnes). L'anàlisi in silico de la seqüència de CRIO4 confirma diversos motius i dominis conservats en la proteïna que semblen dirigir la seua funció cap al tràfic vesicular, i revelen múltiples potencials llocs de fosforilació en CRIO4 suggerint una possible funció en senyalització. El domini Sec14 és un domini d'unió i transferència de fosfolípids i els resultats obtinguts indiquen que CRIO4 estableix unió amb fosfatidiolinositol i fosfatidiletanolamina. CRIO4 no complementa la funció de Sec14p de llevat, i això podria ser a causa de la falta d'afinitat de CRIO4 per fosfatidilcolina. En llevat, el transport de triptòfan és el major factor limitant per al creixement a temperatures baixes. Els resultats de l'assaig de coexpressió de CRIO4 amb TAT2 (una permeasa d'alta afinitat per triptòfan) en llevat mostrats en aquesta tesi, semblen indicar una estimulació del transport de Tat2p cap a la membrana plasmàtica per part de CRIO4, que podria esdevindre en una absorció de triptòfan millorada, explicant així la major tolerància a fred conferida per la sobreexpressió de CRIO4 en llevat. L'estudi de localització subcel·lular ha mostrat que CRIO4 està associada a la membrana plasmàtica i en membranes intracel·lulars, formant part de vesícules, la qual cosa sembla confirmar el paper de CRIO4 en el tràfic intracel·lular, funció que compartiria amb els seus homòlegs. El patró d'expressió de CRIO4 en remolatxa ha mostrat que CRIO4 s'expressa en tots els teixits analitzats, concentrant-se la seua major expressió en fulla i arrel. També s'ha mostrat que l'expressió de CRIO4 augmenta després de temps curts d'exposició a estrès per fred i estrès per calor. S'han realitzat estudis fenotípics de diferents línies mutants en gens PATLs d'Arabidopsis thaliana, obtenint-se una gran variabilitat en els resultats que podria ser deguda a la redundància funcional entre els membres d'aquesta família multigènica. També s'han realitzat estudis fenotípics de línies transgèniques d'Arabidopsis thaliana que sobreexpressen el gen CRIO4. Aquestes línies mostren una millora en el seu creixement i desenvolupament a temperatures baixes, augmentant per tant la seua tolerància a l'estrès per fred. A més, l'expressió de CRIO4, en les línies transgèniques d'A. thaliana, augmenta considerablement després de l'estrès per fred i després d'un xoc tèrmic, observant-se en aquest últim cas, cúmuls de CRIO4 al llarg de tota la cèl·lula. El reciclatge intracel·lular de PIN2, indicador de la resposta gravitrópica, es veu afectat per la disminució de la temperatura. Els resultats obtinguts en aquesta tesi semblen indicar que la sobreexpressió de CRIO4 reactiva el transport intracel·lular de PIN2 sota estrès per fred, la qual cosa implicaria que el seu fenotip està relacionat amb el tràfic d'auxines. / Izquierdo García, AC. (2016). Caracterización del gen CRIO4 y su implicación en tolerancia a estrés por frío [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62826

[EN] When addressing the genetic dissection of a complex trait, what really matters is the identification of the genes with major effects, because their modification may result in qualitative changes in the phenotype. For this purpose, a mutagenesis-based approach has two advantages: first, the identification of a mutant reveals that the altered gene has a key effect on the trait; secondly, the phenotypic characterization of the mutant allows making an inference about the gene function. Insertion mutagenesis by T-DNA provides an additional advantage: a gene tagged by a T-DNA insert can be easily identified using PCR-based techniques (e.g. Anchor- PCR). In order to identify genes that control developmental traits and abiotic stress tolerance in tomato and wild related species, we are performing a program of insertion mutagenesis in collaboration with the groups of Dr. Rafael Lozano (University of Almeria) and Dr. MªCarmen Bolarín (CEBAS-Murcia). The objectives of the present Doctoral Thesis are framed in the context of this insertion mutagenesis program in tomato and wild relatives. First, in order to expand the collections of T-DNA lines previously generated in our group, 952 T-DNA lines of tomato, 405 of Solanum pimpinellifolium and 550 of S. cheesmaniae have been obtained. Secondly we performed the evaluation of progenies from 1545 T-DNA lines of tomato, 194 T-DNA lines of S. pimpinellifolium and 149 T-DNA lines of S. cheesmaniae. The screening in vitro of those progenies allowed us to identify 43 mutants altered in early developmental traits. In addition, we were able to detect three mutants of tomato and another one of S. cheesmaniae which are hypersensitive to salt stress. The phenotypic and genetic characterization of selected mutants has been carried out. Finally, we performed the functional analysis of the PMS (PROTECTING MERISTEMS AGAINST SALINITY) gene tagged in the pms-916 tomato mutant. Our results suggest that the PMS gene plays an essential role in the protection of the shoot apical meristem and young tissues of the tomato plant under salinity stress conditions. / [ES] Cuando se aborda la disección genética de un carácter complejo, lo que realmente importa es identificar los genes con efectos principales, ya que su alteración puede provocar cambios cualitativos en el fenotipo. Para este propósito, el uso de una aproximación basada en la generación de mutantes tiene dos ventajas: la identificación de un mutante revela que el gen alterado tiene un efecto clave sobre el carácter y, en segundo lugar, el fenotipo del mutante permite hacer una inferencia sobre la función del gen. La mutagénesis insercional con T-DNA aporta una ventaja adicional ya que si el gen queda etiquetado por un inserto su identificación es relativamente fácil, porque basta con amplificar a partir de una secuencia conocida del T-DNA mediante Anchor-PCR. Con el fin de identificar genes que controlan caracteres del desarrollo y tolerancia a estrés abiótico en tomate y especies silvestres relacionadas, en nuestro laboratorio se está llevando a cabo un programa de mutagénesis insercional en colaboración con los grupos del Dr. Lozano (Universidad de Almería) y la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia). Los objetivos de esta Tesis Doctoral se enmarcan en el contexto de este programa de mutagénesis insercional en tomate y especies relacionadas. En primer lugar, con el fin de ampliar la colección de líneas T-DNA que previamente se generó en nuestro laboratorio, se han obtenido 952 líneas T-DNA de tomate, 405 de Solanum pimpinellifolium y 550 de S. cheesmaniae. Se ha realizado el escrutinio de las progenies de 1545 líneas T-DNA de tomate, 194 líneas T-DNA de S. pimpinellifolium y 149 líneas T-DNA de S. cheesmaniae. La evaluación in vitro de estas progenies ha permitido detectar 43 mutantes alterados en caracteres del desarrollo temprano. Además, se han identificado tres mutantes de tomate y uno de S. cheesmaniae hipersensibles a estrés salino. El tercer objetivo de la Tesis ha consistido en la caracterización fenotípica y genética de los mutantes seleccionados. Por último, se ha realizado el análisis funcional del gen PMS (PROTECTING MERISTEMS AGAINST SALINITY) etiquetado en el mutante de inserción pms-916. Nuestros resultados sugieren que el gen PMS desempeña un papel esencial en la protección del meristemo apical y las hojas jóvenes de la planta de tomate en condiciones de estrés salino. / [CA] Quan s'aborda la dissecció genètica d'un caràcter complex, el que realment importa és identificar els gens amb efectes principals, ja que la seua alteració pot provocar canvis qualitatius en el fenotip. Per a este propòsit, l'ús d'una aproximació basada en la generació de mutants té dos avantatges: la identificació d'un mutant revela que el gen alterat té un efecte clau sobre el caràcter i, en segon lloc, el fenotip del mutant permet fer una inferència sobre la funció del gen. La mutagènesi insercional amb T-DNA aporta un avantatge addicional ja que si el gen queda etiquetat per un insert la seua identificació és relativament fàcil, perquè n'hi ha prou amb amplificar a partir d'una seqüència coneguda del T-DNA per mitjà d'Anchor-PCR. Per tal d'identificar gens que controlen caràcters del desenvolupament i la tolerància a estrés de tipus abiòtic en tomaca i espècies silvestres relacionades, en el nostre laboratori s'està duent a terme un programa de mutagènesi insercional en col¿laboració amb els grups del Dr. Lozano (Universidad de Almería) i la Dra. Bolarín (CEBAS-Murcia). Els objectius d'esta Tesi Doctoral s'emmarquen en el context d'este programa de mutagènesi insercional en tomaca i espècies relacionades. En primer lloc, per tal d'ampliar la col¿lecció de línies T-DNA que prèviament es va generar en el nostre laboratori, s'han obtingut 952 línies T-DNA de tomaca, 405 de Solanum pimpinellifolium i 550 de S. cheesmaniae. S'ha realitzat l'escrutini de les progènies de 1545 línies T-DNA de tomaca, 194 línies T-DNA de S. pimpinellifolium i 149 línies T-DNA de S. cheesmaniae. L'avaluació in vitro d'estes progènies ha permés detectar 43 mutants alterats en caràcters del desenvolupament primerenc. A més, s'han identificat tres mutants de tomaca i un de S. cheesmaniae hipersensibles a estrés salí. El tercer objectiu de la Tesi ha consistit en la caracterització fenotípica i genètica dels mutants seleccionats. Finalment, s'ha realitzat l'anàlisi funcional del gen PMS (PROTECTING MERISTEMS AGAINST SALINITY) etiquetat en el mutant d'inserció pms-916. Els nostres resultats suggerixen que el gen PMS exercix un paper essencial en la protecció del meristem apical i els fulls jóvens de la planta de tomaca en condicions d'estrés salí. / Sánchez Martín-Sauceda, S. (2016). Generación de mutantes de inserción de tomate cultivado y silvestre e identificación de genes implicados en procesos de desarrollo y tolerancia a estrés abiótico [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/63148

The total annual forage production of tropical grasslands in the Brazilian Central area is expected to increase, however, some studies also predict a higher variability of forage production between and within years. In the future, maintenance of many pastures áreas will probably depend on the use of technology and increased productivity, seeking a competitive advantage concerning other activities, or even on its relocation to marginal áreas where forage grasses will be more suitable to abiotic factors. The water stress, both by flooding and drought, may reduce the production and survival of grasses. The objective was to identify the strategies that some genotypes of Paspalum and Urochloa genus use to cope with the flooding and/or water deficiency in the soil. Two greenhouse experiments were conducted: 1 - morphological and physiological characteristics, survival rate and recovery index in five genotypes of Paspalum sp. (BRS Guará, BGP 289, BGP 293, BGP 402 and BGP 397) and U. brizantha cv. Marandu were evaluated under three water conditions (flooded, drought and control); 2 - dehydration tolerance and dehydration avoidance of three cultivars of Urochoa (\'Marandu\', \'BRS Paiaguás\' and \'Basilisk\') and a cultivar Mediterranean Dactylis glomerata L. cv. Medly. In experiment 1, the genotypes of Paspalum sp., especially BGP 289, BGP 402, BGP 397 and cv. Marandu previously submitted water déficit, presented high tiller survival rates after rehydration. The cv. Marandu and BGP 289 access were not tolerant to flooding, presenting a low tiller survival rate and root recovery index. The BGP 293 access was not resistant to flooding, but it was able to survive periods up to 28 days under water depth. The accesses of Paspalum BRS Guará, BGP 402 and BGP 397 presented resistance mechanisms and survival to flooding, related to a high concentration of chlorophyll in the leaf, leaf biomass, and root recovery and tiller survival after a recovery period under water regular condition. In experiment 2, the distinction of cultivars was in accordance with the resource-use strategy. Cultivars of Urochloa were less tolerant to dehydration than cv. Medly. But the most productive Urochloa cultivars (Marandu and Basilisk) further delayed dehydration due to high investment in the root system, and consequently were less dehydration tolerant, with less survival rates under severe drought. The cv. BRS Paiaguás was less productive under regular irrigation than other Urochloa cultivars, but under drought conditions it is closer to the cv. Medly, being highly dehydration tolerant, and presenting high survival rates under severe drought and dehydration avoidance strategies with roots elongation along the soil profile during the drought period. There are differences in responses to other deficit and flooding between and within the Paspalum and Urochloa genus morphophysiological traits used in this study are relevant for the understanding of the mechanisms and discrimination among genotypes. / A partir de predições de futuros impactos climáticos, é esperado um aumento na produção anual total de forragem tropical, contudo estudos também predizem aumento da variação da produção entre e dentro dos anos. Diante desses cenários, é imprescindível buscar vantagens competitivas e o conhecimento do grau de tolerância a estresse abióticos de gramíneas tropicais. O estresses hídrico, tanto por excesso quanto por deficiência, pode reduzir a produção e a sobrevivência da planta forrageira. Assim, objetivou-se identificar as estratégias que alguns genótipos do gênero Paspalum e Urochloa utilizam para lidar com o encharcamento e/ou com a deficiência hídrica no solo. Foram conduzidos dois experimentos em casa-de-vegetação: 1 - avaliou-se características morfofisiológicas, taxa de sobrevivência e índice de recuperação em cinco genótipos de Paspalum sp. (BRS Guará, BGP 289, BGP 293, BGP 402 e BGP 397) e U. brizantha cv. Marandu sob três condições hídricas (alagado, déficit e controle), em vasos pequenos; 2 - mensurou-se em pequenos vasos a tolerância a desidratação e em longos tubos o atraso a desidratação de três cultivares de Urochoa (\'Marandu\', \'BRS Paiaguás\' e \'Basilisk\') e uma cultivar mediterrânea de Dactylis glomerata L. cv. Medly, submetidos a condições sem limitação hídrica e posteriormente sob seca prolongada. Sob déficit hídrico, os genótipos de Paspalum sp., especialmente o BGP 289, o BGP 402 e o BGP 397, e a cv. Marandu, apresentaram altas taxas de sobrevivência de perfilhos após reidratação. A cv. Marandu e o acesso BGP 289 não são tolerantes ao alagamento, apresentaram baixas taxas de sobrevivência e de recuperação radicular. O acesso BGP 293 não é resistente ao alagamento, porém é capaz de sobreviver a períodos de até 28 dias sob lâmina d\'água. Os acessos de Paspalum BRS Guará, BGP 402 e BGP 397 apresentam mecanismos de resistência e sobrevivência ao alagamento, relacionados à alta concentração de clorofila na folha, de biomassa de folhas, e de recuperação radicular e sobrevivência de perfilhos após período de recuperação sob condição hídrica regular. No experimento 2, a distinção dos cultivares foi de acordo com a estratégia de uso dos recursos. Cultivares de Urochloa são menos tolerantes a desidratação que a cv. Medly. Mas as cultivares de Urochloa mais produtivas (Marandu e Basilisk) atrasaram mais a desidratação, devido ao alto investimento no sistema radicular, e consequentemente foram menos tolerantes a desidratação, com memores taxas de sobrevivência sob seca severa. A cv. BRS Paiaguás é menos produtiva sob irrigação regular em comparação as outras cultivares de Urochloa, mas sob seca aproximou-se mais da cv. Medly, mostrando-se altamente tolerante a desidratação, com altas taxas de sobrevivência sob seca severa, além de apresentar estratégia de atraso a desidratação com o alongamento de raízes ao longo do perfil do solo durante a seca. Existem diferenças entre e dentro de espécies dos gêneros Paspalum e Urochloa em relação as respostas sob duas formas de estresse hídrico. As caraterísticas morfofisiológicas utilizadas neste estudo auxiliaram na compreensão dos mecanismos de resposta ao estresse hídrico e na discriminação dos genótipos.

O trigo (Triticum aestivum L.) é uma importante cultura no Brasil. Poucas cultivares são recomendadas para produção do tipo sequeiro no Bioma Cerrado onde a escassez de água limita o rendimento de grãos. Aqui reportamos uma análise de transcriptoma do MGS1 Aliança (cultivar de trigo adaptada ao Cerrado) sob estresse de seca. Um grupo de 4.422 transcritos diferencialmente expressos foi encontrado em raízes e folhas. O número de transcritos reprimidos em raiz (1.102) foi menor que os transcritos induzidos (1.706), enquanto o oposto ocorreu em folhas (1,017 induzidos e 647 reprimidos). O número de transcritos comuns entre ambos órgaõs foi 1.249, enquanto 2.124 foram específicos para raíz e 1.049 específicos para folhas. Análises de RT-qPCR de 35 transcritos selecionados ao acaso revelou uma correlação de 0,78 com os dados de transcriptoma. Os transcritos diferencialmente expressos foram distribuídos por todos os cromossomos e componentes do genoma. O número de transcritos no genoma B foi maior do que nos genomas A e D. Ainda, um grande número de transcritos relacionados à seca foi mapeado nos cromossomos 3B, 5B e 2B. Quando consideramos ambos órgãos, 116 diferentes rotas metabólicas foram alteradas. Uma rota em comum, entre as três mais alteradas em ambos órgãos, foi o metabolismo do amido e da sacarose. A comparação de transcritos derivados de raiz e de folha permite a identificação de transcritos importantes relacionados à respota ao estresse de seca em cada um destes órgãos. Os dados obtidos, também, abrem caminho para o desenvolvimento de futuros marcadores e seleção de genes candidatos ligados à característica. Estes resultados são úteis para o entendimento de rotas metabólicas envolvidas na tolerância à seca em trigo. A informação gerada será usada, a mais longo prazo, para propósitos de transgenia. Para isto, a metodologia de duplo-haploides é desejável e uma primeira investigação sobre a eficiência de protocolo se mostrou necessária. Micrósporos são células gaméticas com capacidade de dar origem a uma nova planta via embriogênese in vitro. Plantas duplo-haploides geradas pela cultura de micrósporos isolados são completamente homozigotas e representam uma importante ferramenta para estudos genéticos e melhoramento de plantas O processo androgenético é desencadeado por diferentes pré-tratamentos de estresse, os quais são empregados para mudar os micrósporos da rota gametofítica para a rota esporofítica. Embora a cultura de micrósporos isolados tenha inúmeras vantagens, importantes limitações tem impedido sua apliação em larga escala. Diferenças genotípicas na resposta androgenética e na formação de plantas albinas ainda constituem desafios. Embora o albinismo seja principalmente uma característica genética, pré-tratamentos e meios de cultura apropriados podem evitar este fenômeno até certo ponto. A resposta androgenética de cinco genótipos de trigo brasileiro foi avaliada no presente estudo. Dois pré-tratamentos foram testados: frio (4°C) e ácido 2-hidroxinicotinico (100 mg/L). O frio foi melhor que o pré-tratamento químico, produzindo mais plantas verdes em quatro de cinco genótipos. Somente dois genótipos brasileiros tratados com ácido 2-hidroxinicotinico produziram plantas, e um deles apenas uma única planta albina. Nossos reultados mostram, também, que o meio semilíquido (contendo 10% de Ficoll) promoveu uma maior resposta androgenética que o meio líquido, aumentando o número de embriões e plantas regeneradas. / Wheat (Triticum aestivum L.) is an important crop cultivated in Brazil. Few cultivars are recommended for rainfed production in the Cerrado Biome where water scarcity limits grain yield. Here we report a transcriptome analysis of MGS1 Aliança (a wheat cultivar adapted to the Cerrado) under drought stress. A set of 4,422 differentially expressed transcripts was found in roots and leaves. The number of down-regulated transcripts in roots (1,102) was lower than the up-regulated transcripts (1,706), while the opposite occurred in leaves (1,017 induced and 647 repressed). The number of common transcripts between the two tissues was 1,249, while 2,124 were specific to roots and 1,049 specific to leaves. Quantitative RT-PCR analysis of 35 randomly selected transcripts revealed a 0.78 correlation with the transcriptome data. The differentially expressed transcripts were distributed across all chromosomes and component genomes. The number of transcripts on the B genome was greater than on the A and D genomes. Additionally, a greater number of drought related transcripts was mapped on chromosomes 3B, 5B and 5D. When considering both tissues, 116 different metabolic pathways were changed. One common pathway, among the top three changed pathways in both tissues, was starch and sucrose metabolism. The comparison of root- and leaf-derived transcripts allows the identification of important transcripts related to water stress response in each of these tissues. It also paves the way for future marker development and selection of candidate genes linked to that trait. These results are useful for understanding the metabolic pathways involved in wheat drought response. The information generated will be used for transgenic wheat purposes. For this the doubled-haploid method is desirable and an investigation about the protocol eficiency is needed. Microspores are gametic cells with capacity to give rise to a new plant via in vitro embryogenesis. Doubled haploid plants generated by isolated microspore culture are completely homozygous and represent an important tool for plant genetics and breeding research. This process is triggered by different stress pretreatments, which are employed to switch microspores from gametophytic to a sporophytic pathway. Although isolated microspore culture has innumerous advantages, important limitations have prevented its application on a large scale. Genotypic differences in androgenic response and the formation of albino plants remain great challenges. Although albinism is a major genetic characteristic, appropriated pretreatments and culture medium can avoid this phenomenon to some extent. The androgenic response of five Brazilian wheat genotypes was evaluated in the present study. Two pretreatments were tested: cold (4°C) and 2-hydroxynicotinic acid (100 mg/L). Cold was better than chemical pretreatment, producing more green plants in four out of five genotypes. Only two Brazilian genotypes treated with 2-hydroxynicotinic acid produced plants, and one of them produced a single albino plant. Our results also show that semi-liquid medium (containing 10% Ficoll) promoted a higher androgenic response than did liquid medium, increasing the number of embryos and regenerated plants.

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A soja constitui uma das culturas mais importantes mundialmente, tanto social quanto economicamente. Consequentemente, informações moleculares sobre processos de desenvolvimento, bem como conhecimento detalhado das interações entre condições estressoras e a resposta da planta a fatores ambientais são necessários. A identificação e caracterização de genes que respondem a condições ambientais específicas constituem um passo inicial no entendimento dos processos adaptativos. Proteínas ricas em glicina (GRPs) são polipeptídeos contendo um grande número do aminoácido glicina em sua estrutura primária. Os genes codificantes de GRPs são regulados ao longo do desenvolvimento e regulados por auxina, ABA, frio, ferimentos, luz, ritmo circadiano, salinidade, seca, patógenos e encharcamento. Entretanto, há pouca informação sobre GRPs de plantas e seus papéis no desenvolvimento e resposta a estresses. As GRPs podem ser divididas em quatro classes (I, II, III, IV) de acordo com sua estrutura primária e presença de domínios característicos. A classe IV é composta por proteínas ligantes de RNA. Domínios adicionais permitem dividir a classe IV de GRPs em quatro subclasses (IVa, IVb, IVc, IVd). A subclasse IVc é representada por proteínas contendo um cold-schock domain (CSD) e dedos de zinco CCHC tipo retrovirais. O objetivo do presente estudo foi: (i) identificar e caracterizar os genes codificantes de classe IV de GRPs, (ii) verificar a padrão de expressão dos genes codificantes da subclasse IVc de GRPs e (iii) produzir plantas de soja transgênicas expressando o gene AtGRP2, o qual foi mostrado estar envolvido na floração e desenvolvimento da semente em Arabidopsis, e também poderia desempenhar um papel na aclimatação ao frio. Um total de 47 genes codificantes da classe IV de GRPs foi identificado no genoma da soja: 19 da subclasse IVa, sete da IVb, seis da IVc e 15 da IVd. Análises in silico indicaram uma expressão preferencial de todos os genes codificantes da subclasse IVc em tecidos em desenvolvimento. Análises de RT-qPCR revelaram que plantas jovens e maduras exibem uma expressão mais alta em folhas do que em outros órgãos, com exceção dos genes GRP2L_4/5 que tiveram expressão mais alta em sementes. GRP2L_4/5 e GRP2L_2 foram induzidos em resposta a baixas temperaturas. Sob estresse com ABA a expressão de todos os genes foi reprimida em folhas e/ou raízes, com exceção do gene GRP2L_2 que foi induzido em raízes. Em resposta a infecção com Phakopsora pachyrhizi, a expressão de GRP2L_2 e GRP2L_3 foi mais alta e precoce no genótipo suscetível quando comparada com o resistente, enquanto que a resposta de GRP2L_4/5 e GRP2L_6 foi mais tardia no genótipo resistente. Ainda, embriões somáticos secundários das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora de soja foram usados para introduzir o gene AtGRP2 no genoma da soja por bombardeamento e sistema bombardeamento/Agrobacterium. Seis eventos de transformação independentes foram confirmados por PCR. No presente momento as plantas estão em desenvolvimento em frascos de vidro. No presente estudo a classe IV de GRPs em soja foi identificada e caracterizada. Este é o primeiro passo para elucidar o papel destas proteínas em plantas. / Molecular information on plant developmental process, as well as detailed knowledge of the interaction between stress conditions and plant response to environmental factors are essential for understanding the adaptive response. Glycine-Rich Proteins (GRP) have the amino acid glycine well represented in their primary structure. The genes encoding GRPs are developmentally regulated and induced by auxin, ABA, cold, wound, light, circadian rhythm, salinity, drought, pathogens, and flooding. However, there is scarce information about plant GRPs and its role on development and stress response. The GRPs can be divided into four classes (I, II, II and IV) according to their primary structure and the presence of characteristic domains. Class IV is composed by RNA-binding proteins. Additional domains permit to split class IV GRPs into four subclasses (IVa, IVb, IVc and IVd). Subclass IVc is represented by proteins containing a Cold-Shock Domain (CSD) and retroviral-like CCHC zinc fingers. The goal of the present study was: (i) to identify and characterize the genes encoding class IV GRPs, (ii) to verify the relative expression of genes encoding subclass IVc GRPs and (iii) to produce transgenic soybean plants expressing the AtGRP2 gene, which was shown to be involved in Arabidopsis flower and seed development, and can also play a role in cold acclimation. A total of 47 genes encoding class IV GRPs were found in the soybean genome: 19 from IVa, seven from IVb, six from IVc and 15 from IVd subclasses. In silico analyses indicated a preferential expression of all genes encoding subclass IVc GRPs in tissues under development. RT-qPCR analyses revealed that both young and mature plants exhibit relative higher expression of subclass IVc GRPs in leaves than in other organs, with exception of GRP2L_4/5 genes that have higher expression in seeds. The GRP2L_4/5 and GRP2L_2 were up-regulated in response to low temperatures. Under ABA stress the expression of all genes was down-regulated in leaves and roots, with exception of GRP2L_2 gene that was up-regulated in roots. In response to Phakopsora pachyrhizi infection, GRP2L_2 and GRP2L_3 expression was higher and earlier in the susceptible genotype when compared with that of the resistant one, while GRP2L_4/5 and GRP2_6 respond later in the resistant genotype. Furthermore, secondary somatic embryos of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora soybean cultivars were used to introduce the AtGRP2 gene into the soybean genome by particle bombardment and bombardment/Agrobacterium system. Six independent Bragg transformation events were confirmed by PCR. In the present moment the plants are under development in glass flasks. In the present study the soybean class IV GRPs were identified and characterized. This is the first step to elucidate the role of these proteins in plants.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os girinos são organismos diversos e abundantes nos pequenos riachos de cabeceira de florestas tropicais e constituem importantes componentes da diversidade biológica, da trófica e funcional dos sistemas aquáticos. Diferentes características estruturais e limnológicas dos ambientes aquáticos influenciam a organização das assembleias de girinos. Embora o estágio larvar dos anuros seja o mais vulnerável de seu ciclo de vida, sujeito a elevadas taxas de mortalidade, as pesquisas sobre girinos na região neotropical ainda são pouco representativas diante da elevada diversidade de anfíbios desta região e ferramentas que permitam a sua identificação ainda são escassas. Nesta tese, dividida em três capítulos, apresento uma compilação das informações relacionadas aos principais fatores que afetam as assembleias de girinos na região tropical (Capítulo 1), a caracterização morfológica dos girinos encontrados nos riachos durante o estudo e uma proposta de chave dicotômica de identificação (Capítulo 2) e avalio a importância relativa da posição geográfica e da variação temporal de fatores ambientais locais sobre as assembleias de girinos, assim como a correlação entre as espécies de girinos e as variáveis ambientais de 10 riachos, ao longo de 15 meses, nas florestas da REGUA (Capítulo 3). Há pelo menos oito tendências relacionadas à distribuição das assembleias de girinos: (1) o tamanho dos riachos e a diversidade de microhabitats são importantes características abióticas influenciando a riqueza e a composição de espécies; (2) em poças, o gradiente de permanência (e.g., hidroperíodo) e a heterogeneidade do habitat são os principais fatores moldando as assembleias de girinos; (3) a composição de espécies parece ser um parâmetro das assembleias mais relevante do que a riqueza de espécies e deve ser primeiramente considerado durante o planejamento de ações conservacionistas de anuros associados a poças e riachos; (4) a predação parece ser a interação biótica mais importante na estruturação das assembleias de girinos, com predadores vertebrados (e.g. peixes) sendo mais vorazes em habitats permanentes e predadores invertebrados (e.g. larvas de odonata) sendo mais vorazes em ambientes temporários; (5) os girinos podem exercer um efeito regulatório, predando ovos e girinos recém eclodidos; (6) o uso do microhabitat varia em função da escolha do habitat reprodutivo pelos adultos, presença de predadores, filogenia, estágio de desenvolvimento e heterogeneidade do habitat; (7) os fatores históricos restringem os habitats reprodutivos que uma espécie utiliza, impondo restrições comportamentais e fisiológicas; (8) a variação temporal nos fatores bióticos (e.g., fatores de risco), abióticos (e.g., distribuição de chuvas), e no padrão de reprodução das espécies pode interferir na estrutura das assembleias de girinos tropicais. A variação temporal na heterogeneidade ambiental dos riachos da REGUA resultou na previsibilidade das assembleias locais de girinos, sendo que os parâmetros ambientais explicaram 23% da variação na sua composição. Os parâmetros espaciais explicaram uma porção menor da variação nas assembleias (16%), enquanto uma porção relativamente elevada da variação temporal da heterogeneidade ambiental foi espacialmente estruturada (18%). As variáveis abióticas que apresentaram as maiores correlação com a composição das assembleias de girinos foram a proporção de folhiço e de rochas no fundo do riacho, e secundariamente a profundidade, a condutividade e a temperatura. O gradiente gerado pela proporção de folhiço e de rochas representou a transição entre riachos permanentes e intermitentes. Este gradiente proporcionou o turnover de espécies, o qual também seguiu um gradiente de condutividade, temperatura, profundidade, e em menor extensão, de hidroperíodo e largura, que estiveram fortemente associado ao grau de permanência dos riachos. Estes resultados corroboram tanto a hipótese do controle ambiental, como do controle biótico de comunidades e indicam que a variação temporal da heterogeneidade ambiental e a variação na posição geográfica são importantes para a estruturação local de assembleias de girinos da REGUA. Os resultados também permitiram distinguir entre assembleias de girinos exclusivas de riachos permanentes, exclusivas de riachos intermitentes e aquelas registradas nos dois tipos de riachos. Os resultados deste capítulo são relevantes para compreender em que extensão os efeitos da variação temporal na heterogeneidade ambiental e de processos espaciais afetam localmente a estruturação de assembleias de girinos. / Tadpoles are diverse and abundant organisms in headwater streams of tropical rainforests and constitute important components of biological, trophic and functional diversity. Furthermore, different structural (e.g. size, depth, microhabitat availability) and limnological (e.g. conductivity, temperature) characteristics affect tadpole organization. Although the larval stage is the most vulnerable in anurans, subject to high mortality rates, researches on tadpoles in the neotropics, as tools for their identification, remain scarce face the high diversity of anurans found in this region. In this thesis, I present a compilation of information on the main factors affecting tadpole assemblages in the tropics (Chapter 1), the morphological characterization of tadpoles found in streams during the study with a propose of dichotomous key of identification (Chapter 2), and evaluated the relative importance of geographical position and the temporal variation o local environmental factors on tadpole assemblages through 15 months in 10 small streams in the Atlantic Forest of Reserva Ecológica do Guapiaçu (REGUA), municipality of Cachoeiras de Macacú, Rio de Janeiro, Brazil. I also investigated the correlation between tadpoles and the environmental variables of streams (Chapter 3). We can recognize at least eigth major trends regarding the distribution and structure of tropical tadpole assemblages: (1) stream size and microhabitat diversity are important abiotic features influencing species richness and composition; (2) in ponds, the permanence gradient (e.g., hydroperiod), and the heterogeneity of habitat are the main factors modeling tropical tadpole assemblages; (3) species composition seems to be a more relevant assemblage parameter than species richness and should be first considered when planning conservation of both pond and stream-dwelling anurans; (4) predation seems to be the most important biotic interaction structuring tropical tadpole assemblages, with vertebrate predators (e.g., fishes) being more voracious in permanent habitats, while invertebrates (e.g., odonate naiads) are the most important in temporary ones; (5) tadpoles may play a regulatory effect preying upon anuran eggs and recently hatched tadpoles (6) microhabitat use varies in function of breeding habitat choice by adults, presence of predators, phylogeny, stage of development and heterogeneity of the habitat; (7) historical factors restrict the breeding habitats that species may use, and impose behavioral and physiologic constrains; (8) temporal variation in biotic (e.g., risk factors) and abiotic factors (e.g., rainfall distribution), and the reproductive patterns of the species may interfere in the structure of tropical tadpole assemblages. Future efforts regarding the study of tadpoles should contemplate assemblages associated with streams, and experimental studies. Temporal variation in the environmental heterogeneity resulted in predictability of local tadpole assemblages. The environmental component explained 23% of the variation in tadpole composition, while spatial parameters explained the smaller portion of the variation (16%). A comparatively high portion of temporal variation in the environmental heterogeneity was spatially structured (18%). The proportion of litter and rocks on the stream bottom, depth, conductivity, and temperature were correlated with tadpole composition. The gradient created by the proportion of litter and rocks represented the changes from permanent and intermittent streams. This gradient provided the species turnover, which also followed a gradient of conductivity, temperature, depth, and in a lesser proportion, hydroperiod and width, all being strongly associated with permanence of streams. The results also corroborate with both the environmental and the biotic control model and indicate that temporal variation in environmental heterogeneity and the spatial position are important to the structuring of local tadpole assemblages in the streams of REGUA. The results also allowed to distinguish between tadpoles assemblages exclusive of permanent, intermittent, and those inhabiting both streams. The results of this chapter are relevant to understand in which extension the effects of temporal variation in environmental heterogeneity and spatial processes affect the structure of tadpole assemblages, the most fragile life stage of anurans