L’interaction d’assemblées de moteurs et de filaments du cytosquelette donne naissance à des comportements actifs qui demeurent peu compris, malgré la large caractérisation de leurs molécules individuellement. En contrôlant la géométrie de polymérisation de l’actine via des micropatrons surfaciques de nucléation, nous avons observé in vitro l’émergence de battements de faisceaux de filaments parallèles d’actine en présence de myosines en solution (myosine V ou HMM II (Heavy MeroMyosine II)). La forme du battement est similaire pour les deux types de moteurs, mais avec des oscillations un ordre de grandeur plus rapides avec la myosine II qu’avec la myosine V. Dans les deux cas, une onde de déformation transverse se propage à vitesse uniforme de la base à la pointe du faisceau d’actine. Avec la polymérisation, les faisceaux d’actine s’allongent à vitesse constante : la période croît, mais la vitesse de l’onde mécanique reste inchangée. L’utilisation de myosines-GFP a révélé un pic de concentration et un recrutement localisé des myosines au sein du faisceau d’actine, avant qu’une onde de concentration ne se propage vers la pointe de concert avec l’onde mécanique de l’actine. Ces résultats présentent une nouvelle forme de couplage entre l’affinité des myosines à l’actine et la forme du faisceau d’actine. Ce travail de thèse décrit l’émergence de battements actifs imitant ceux des flagelles comme une propriété intrinsèque de l’interaction de filaments polaires et de moteurs moléculaires. Le contrôle de la structure lors du processus d’auto-organisation fournit des informations clés pour étudier les principes physiques génériques du battement flagellaire. / The emergent active behaviors of molecular motors assemblies and cytoskeletal filaments systems remain poorly understood, though individual molecules have been extensively characterized. By controlling the geometry of actin polymerization with surface micropatterns of a nucleation promoting factor, we were able to demonstrate in vitro the emergence of flagellar-like beating of bundles of parallel actin filaments in the presence of myosin motors. We worked with both myosin V and heavy-meromyosin II. The waveform of oscillation was similar for the two types of motors, but oscillations with myosin II were one order of magnitude faster than with myosin Va. In both cases, a bending wave traveled at a uniform speed from the anchored base of the actin bundle towards the tip. As polymerization occurred, the actin bundle elongated at a constant speed, resulting in an increase of the oscillation period, but the speed of the traveling bending wave remains constant. GFP-tagged myosin V revealed the presence of a myosin concentration peak within the actin bundle. Strikingly, myosin V motors were locally recruited within the actin bundle, before a concentration wave propagated towards the bundle’s tip in concert with the actin bending wave. These results revealed a novel form of coupling between the myosin affinity for actin and the actin bundle shape. Our work demonstrates that active flagellar-like beating emerges as an intrinsic property of polar bundles of filaments in interaction with molecular motors. Structural control over the self-assembly process provides key information to clarify the underlying physical principles of flagellar-like beating.

La détection des stimuli sensoriels est assurée par des cellules réceptrices spécialisées souvent grâce à des protrusions membranaires apicales telles que les microvillosités. La forme finale des extensions apicales microvilliées conditionne de nombreuses propriétés de la transduction sensorielle mais leur formation reste méconnue. Quels sont les facteurs moléculaires responsables de l’initiation et de l’élongation des filaments d’actine chez les cellules sensorielles microvilliées (CSMs) ? Peut-on décrire des éléments clés de la morphogenèse en commun ? Quel est le rôle structurel des microvillosités dans la fonction sensorielle ?J’ai étudié deux types sensoriels microvilliés : les neurones contactant le liquide cérébrospinal (NcLCS) et les cellules sensorielles des neuromastes (CSn). Mon projet visait à investiguer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la morphogenèse des CSMs par l’étude des NcLCS. J’ai décrit les étapes critiques menant à la formation de l’extension apicale des NcLCS auxquelles j’ai pu associer des candidats potentiels grâce l’analyse transcriptomique des NcLCS. J’ai démontré le rôle critique de l’interaction entre Espin et Myo3b dans l’élongation de l’extension apicale des NcLCS et j’ai établi un lien direct entre structure et fonction en montrant que le raccourcissement de l’extension apicale aboutissait à la réduction de la réponse sensorielle.Mon travail a permis d’apporter des éléments de réponse quant à la formation de l’organe sensoriel des NcLCS. L’analyse transcriptomique des CSn a par ailleurs révélé des facteurs de morphogenèse communs avec les NcLCS, suggérant que toutes les CSMs partagent des propriétés de différenciation conservées. / Sensory systems use specialized receptor cells, many of which detect sensory cues through specialized apical membrane protrusions, such as microvilli. The final shape of the microvilliated apical extension requires specific molecular machinery and determines many of the properties of sensory transduction. The establishment of this structure remains however elusive. What molecular factors orchestrate the initiation and elongation of actin filaments in microvilliated sensory cells (MSCs)? Can we find key elements of morphogenesis common to MSCs? What is the precise role of microvilli structure in sensory function? I investigated two sensory cell types harboring microvilli: spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons (CSF-cNs) and neuromast hair cells (nHCs). The primary goal was to unravel the molecular mechanisms underlying morphogenesis of MSCs by focusing on CSF-cNs. I was able to describe critical steps leading to the development of CSF-cN apical extension. My participation to the transcriptome analysis of CSF-cNs revealed candidate molecular factors associated with each of these steps. I demonstrated the importance of the interaction between Espin and Myo3b to ensure the proper lengthening of CSF-cN apical extension. In this system, I established a direct link between morphology and function by showing that shorter apical extensions lead to reduced sensory response. Altogether, my work shed light on the formation of CSF-cN sensory organelle and its functional role. In parallel, the establishment of the nHC transcriptome dataset revealed similar morphogenetic factors with CSF-cNs, supporting the idea that all MSCs share conserved features for their differentiation.

Les septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives. / Septins are highly conserved GTP-binding proteins deregulated in diseases such as cancer and neurodegenerative diseases. Septins scaffold other proteins and act as diffusion barriers at the plasma membrane and midbody during cytokinesis. They interact with the actin cytoskeleton and have been observed to form ordered complexes that can polymerize into higher-order structures such as filaments and rings. The principles of assembly and disassembly of such filaments and rings and their cellular roles are yet to be elucidated. Drosophila offers a simple system, as there are only 5 septin genes: peanut, sep1, sep2, sep4, and sep5 in contrast to 13 found in humans. We have previously found that Drosophila S2 cells contain unusual tubular structures that label with Peanut antibody. The goal of my Master’s project has been to characterise these structures, by defining their constituents, behaviours and properties, in the hope that this will shed light on the mechanisms by which septins can form higher-ordered structures and how they interact with other cytoskeletal elements such as actin. Using fluorescence microscopy, I show that these tubes are cytoplasmic and present in 30% of cells, both during mitosis and interphase, suggesting they are not cell cycle regulated. To investigate their composition and dynamic properties, I generated S2 cell lines stably expressing Sep2-GFP, which localizes to septin tubes and double stranded RNAs against all septins. The products of three septin genes were found to be essential for the assembly of septin tubes: Sep1, Sep2, and Pnut. The depletion of Sep1 led to the dispersal of the GFP signal into cytoplasmic clumps, whereas the depletion of Sep2 and Pnut led to its uniform distribution through the cell. FRAP analysis of Sep2-GFP revealed only slow recovery after many hours, indicating that the structures are very stable. I also discovered an unusual relationship between septin tubes and the actin cytoskeleton. Although the tubes did not label with conventional F-actin probes (Phalloidin, LifeAct), treatment with inhibitors of F-actin assembly (Latrunculin A) or disassembly (Jasplakinolide) led to their rapid (<30 min) dispersal into scattered rings. Furthermore, overexpressed Actin05C-mCherry localised to the septin tubes, while a polymerization-deficient mutant Actin05C-R62D-mCherry did not. Depletion of the actin severing protein Cofilin and the actin capping protein AIP1 also disrupted septin tubes dispersing them into cytoplasmic rings. A dynamic actin cytoskeleton is thus required for the formation and/or maintenance of higher ordered structures such as rings and tubes. Conclusion and Relevance: Ongoing studies aim to further elucidate how septins organize into such ordered structures and how actin regulates the process. This will clarify the septin network of interactions and facilitate the comprehension of their implication in cancer and neurodegenerative diseases. Key words: actin, septin, tube, ring, higher-order, hexamer, cofilin, AIP1

Dans une cellule en migration, la polymérisation d'actine permet de projeter la membrane plasmique dans une structure appelée le lamellipode. Dans le lamellipode, l'actine est polymérisée de manière branchée par le complexe Arp2/3. L'activation du complexe Arp2/3 au lamellipode est sous le contrôle du complexe WAVE. En réponse à une cascade d’activation moléculaire, une des sous-unités du complexe WAVE expose son domaine WCA (WH2-Connecteur-Acide) qui peut alors se lier au complexe Arp2/3 et l’activer afin d'initier la formation d’un nouveau filament d’actine. La voie d’activation du complexe Arp2/3 par le complexe WAVE a été bien étudiée. Cependant la migration cellulaire est finement régulée et cette unique voie de signalisation nous semblait insuffisante. Dans le but de trouver de nouveaux régulateurs de la migration et en particulier de nouvelles protéines se liant au complexe Arp2/3, nous avons réalisé un crible bioinformatique identifiant les protéines contenant un motif Acide. Ce dernier a abouti à l’identification d’une protéine non caractérisée. In vitro, cette protéine n'active pas le complexe Arp2/3. En revanche, elle est capable d'inhiber l'activation du complexe Arp2/3 induite par le domaine WCA d'un activateur et empêche la formation de branches par le complexe Arp2/3. Nous avons appelé cette nouvelle protéine Arpin pour « Arp2/3 Inhibitor ». De manière cohérente avec son rôle inhibiteur in vitro, la déplétion d'Arpin dans différents type de cellules, induit une augmentation de la vitesse de protrusion des lamellipodes et une demi-vie augmentée des lamellipodes. Ces effets se traduisent par une migration plus rapide et plus persistante en direction. Arpin joue donc le rôle d'un frein de la migration cellulaire et permet à la cellule de tourner. Pour jouer ce rôle-là, Arpin nécessite d’être régulée rigoureusement. Dans la cellule, Arpin est inactive et nécessite d’être activée par Rac. Cependant cette régulation n'est probablement pas directe. Pour mieux comprendre la régulation d'Arpin, nous avons donc recherché des protéines partenaires. Nous avons identifié Tankyrase comme protéine interagissant avec Arpin. De façon significative, le motif d’Arpin qui permet son interaction avec Tankyrase se superpose à la séquence Acide nécessaire à son interaction avec le complexe Arp2/3. Nous avons mis en évidence in vitro une compétition entre Tankyrase et le complexe Arp2/3 sur Arpin. Ces résultats suggèrent Tankyrase inhibe la protéine inhibitrice Arpin. En conclusion, nous avons découvert une nouvelle protéine Arpin, qui inhibe le complexe Arp2/3 et qui joue un rôle régulateur important dans la migration cellulaire. Nous avons identifié une protéine régulatrice de son activité, la Tankyrase. Nous nous attendons à ce qu’Arpin soit impliquée dans des nombreux processus physiologiques ou pathologiques, où la migration cellulaire joue un rôle important, en particulier lors de la formation de métastases dans le cancer. / In migrating cells, the Arp2/3 complex generates branched actin networks that power protrusion of the leading edge in a structure called lamellipodium. The Arp2/3 complex is activated at the leading edge by the Wave complex which is itself activated by the small GTPase Rac. WAVE which is in an inactive state, then exposes its WCA domain (WH2-Connector-Acidic) that can bind to the Arp2/3 complex and activate it to trigger the formation of a new daughter actin filament. This signalling pathway of the Arp2/3 complex has been well studied. However, cell migration is a fine-tuned process that is probably regulated in a more complex manner.To identify new regulators of cell migration, especially proteins that bind to the Arp2/3 complex, we performed a bioinformatics screen to identify proteins containing an acidic motif at its C-terminus, a characteristic motif of Arp2/3 activators. By this method we retrieved an uncharacterized protein. A combination of in vitro assays revealed, however, that this protein inhibits the Arp2/3 complex by competing with the activators. We called this protein Arpin for “Arp2/3 inhibitor”. Depletion of Arpin in different kind of cells, such as mammalian cells or amoeba, induces lamellipodia to protrude faster and to last longer, consistent with its inhibitory role on Arp2/3 complex activity. These effects observed lead to an increased velocity and a more directional migration in random migration assay. The function of the Arp2/3 inhibitory protein Arpin is thus to slow down and steer cell migration.In the cell, Arpin has been shown to be inactive until it is activated by Rac, most likely by an indirect manner. We identified Tankyrase as an interactor of Arpin. Interestingly, the binding motif of Arpin to Tankyrase overlaps the acidic motif required for the binding to the Arp2/3 complex. By a biochemistry approach, we showed a competition between Tankyrase and the Arp2/3 complex for the binding to Arpin. This observation suggests that Tankyrase inhibits the inhibitory protein Arpin in the cell. To conclude, we identified a new protein, Arpin which inhibits the Arp2/3 complex and plays an important role in the control of cell migration. We identified a protein which regulated its activity, Tankyrase. Thus, we can imagine that Arpin could be implicated in numerous physiological and pathological processes where cell migration is involved, particularly during metastases formation in cancer

La motilité cellulaire est un processus intégré essentiel à de nombreux phénomènes physiologiques tels que la formation du cône de croissance et la plasticité synaptique. Des dérégulations de la motilité cellulaire peuvent être à l’origine de la formation de métastases ou de pathologies neuropsychiatriques comme la schizophrénie et l'autisme. La compréhension des mécanismes régulant la migration cellulaire est donc un enjeu majeur. La motilité cellulaire repose sur la formation de diverses structures constituées de réseaux d’actine branchés telles que le lamellipode. La formation du lamellipode nécessite l’intervention de protéines régulatrices de l’actine telles que Rac1 et les complexes Wave et Arp2/3. Grâce à l’utilisation de suivi de protéine unique, nous avons pu comprendre comment la coordination spatio-temporelle de ces régulateurs contrôle la formation et la morphologie des lamellipodes de cellules migrantes. Nous avons ainsi découvert que l’activation et la localisation du complexe Wave étaient régulées de manière enzymatique mais également mécanique. Dans une première étude, nous avons montré que la RhoGTPase Rac1 active le complexe Wave spécifiquement à l’extrémité du lamellipode. Dans une seconde étude, nous avons révélé que la localisation du complexe Wave est régulée par la dynamique des filaments des réseaux branchés d’actine. Ces données soulignent l’importance du complexe Wave dans la formation du lamellipode et révèlent l’existence d’une régulation mécanique de la localisation du complexe Wave. / Cell motility is an integrated process involved in critical phenomena such as axonal pathfinding and synaptic plasticity. Dysregulation of cell motility can induce metastasis and abnormal spine shapes observed in neuropsychiatric disorders like autism and schizophrenia. Therefore it is essential to understand how cell motility is regulated. Cell motility requires the formation of branched actin networks propelled by actin polymerization that lead to the formation of membrane protrusions such as the lamellipodium. Several actin regulatory proteins are involved in this process, such as Rac1 and the WAVE and ARP2/3 complexes. Using single protein tracking, we revealed key phenomena concerning the spatio-temporal regulation of lamellipodium formation by actin regulatory proteins. We found that the localization and activation of the WAVE complex was enzymatically regulated, but also mechanically. First, we showed that the Rac1 RhoGTPase activates the WAVE complex specifically at the tip of the lamellipodium. We also showed that WAVE complex localization is regulated by the dynamics of branched-network actin filaments. This study confirms the crucial role of the WAVE complex in lamellipodium formation and reveals the existence of a mechanical regulation of the localization of this complex in the cell.

Le remodelage osseux est un processus physiologique de renouvellement de l’os ancien par de l’os nouveau. Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées géantes dont la fonction principale est de dégrader la matrice osseuse, première étape de ce remodelage. Le travail réalisé s’inscrit dans une thématique d’expertise de notre laboratoire, celle de l’organisation du cytosquelette d’actine dans les ostéoclastes résorbants. Nous avons pu élucider le rôle de la formation des podosomes et de leur organisation collective sur l’adhérence et la migration ostéoclastique. Nos résultats ont démontré que l’assemblage de podosomes sous forme de structures circulaires dites « anneaux » exerce une force centripète sur le substrat et ainsi déclenche la migration de l’ostéoclaste. L’alternance entre apparition et disparition de ces anneaux au sein de la cellule résulte en une migration saltatoire universelle pour tous les ostéoclastes.L’objectif principal de cette thèse était de trouver de nouveaux gènes impliqués dans l’organisation des podosomes. Nous avons mis en place une analyse transcriptomique comparant les ostéoclastes avec d’autres cellules multinucléées géantes qui présentent des podosomes mais sont incapables de résorber l’os. Parmi la liste de six gènes établie par cette méthode, nous avons étudié RhoE. En exploitant la culture d’ostéoclastes primaires déplétés de RhoE, nous avons démontré que ce gène est essentiel pour la migration ostéoclastique et la résorption osseuse. Nous avons ensuite établi que RhoE agit comme antagoniste de la voie de Rock pour assurer le renouvellement d’actine au sein des podosomes, ce qui entretien la fonction ostéoclastique. / Bone remodeling is a physiological process by which old bone is replaced by new bone. Osteoclasts are multinucleated giant cells of the monocytic lineage. Their function is bone resorption, the first step of bone remodeling. The work of this thesis is in continuity with a theme long developed in our laboratory, that of the actin cytoskeleton organization in bone-resorbing osteoclasts. Our first study investigated the role of the podosome organization in osteoclast spreading, adhesion and migration. Our results showed that podosome patterning into rings exerted outward tension upon the substrate and thereby triggered cell migration. Through cycles of assembly, growth and alternating disassembly, rings promote a saltatory mode of migration universal to all osteoclasts.The main objective of this thesis, however, was dedicated to finding new genes that govern podosome patterning in resorption-related processes such as osteoclast migration and sealing zone formation. To find such new genes, we employed a differential transcriptomic analysis of osteoclasts and osteoclast-like cells that exhibit podosomes but are unable to resorb bone. Among a list of six genes highly and exclusively expressed in osteoclasts, we chose to investigate RhoE, a constitutively active GTP-binding protein known for its regulation of actin structures. We provided evidence, using primary RhoE-deficient osteoclasts, that RhoE activity is essential to bone resorption. We unveiled a new role for RhoE in the control of actin turnover in podosomes through a Rock-antagonistic function. Finally, we demonstrated that the role of RhoE in osteoclasts is essential to their migration and sealing zone formation.

L’endocytose est le processus qui permet l’entrée spécifique et active dans la cellule du milieu extracellulaire et des substances qu’il contient. Ces dernières années, plusieurs mécanismes d’endocytose ont été identifiés, mais seule la voie impliquant la clathrine a été bien caractérisée. Il a été montré que certains récepteurs de cytokines comme celui de l’interleukine-2 (IL-2) empruntent une voie d’endocytose indépendante de la clathrine. Précédemment, mon laboratoire a identifié huit facteurs impliqués dans cette voie d’entrée dont l’actine et la dynamine. Nous savons notamment que l’activation de la RhoGTPase Rac1 permet l’induction des kinases Pak1 et Pak2 régulant ainsi la cortactine, le recrutement de N-WASP et la polymérisation d’actine nécessaire à l’internalisation de l’IL-2R. Cependant, les facteurs en amont de cette cascade Rac-Pak étaient inconnus et le rôle du cytosquelette d’actine restait mal défini. Les travaux que j’ai effectué durant mon doctorat ont mis en évidence que la PI3K en interagissant avec l’IL-2R, permettait la production locale de PI(3,4,5)P3 qui induisait le recrutement de Vav2; un facteur conduisant à l’activation de Rac1. De plus, j’ai montré que Rac1 activé était ensuite recruté par la PI3K, permettant ainsi l’activation locale de la cascade Rac/Pak lors de l’entrée de l’IL-2R. Ces données, qui ont fait l’objet d’une publication, ont montré que la PI3K n’était pas seulement impliquée dans la signalisation de l’IL-2, mais également dans son endocytose. Par la suite, la réalisation d’un crible par ARNi portant sur l’étude du rôle de 324 protéines humaines lors de l’entrée de l’IL-2R, a permis l’identification de 65 nouveaux facteurs impliqués dans ce mécanisme. Parmi ces protéines, j’ai étudié plus particulièrement le rôle du complexe WAVE connu pour être induit à la membrane plasmique par Rac1 et la PI3K. J’ai confirmé l’implication de ce complexe lors de l’entrée de l’IL-2R et mis en évidence qu’il interagissait avec le récepteur. De plus, cette étude a montré que le complexe WAVE était impliqué précocement dans ce mécanisme, probablement en permettant le recrutement du récepteur aux pieds de protrusions membranaires que le complexe pourrait induire. Cette localisation spécifique du récepteur suggère ainsi un nouveau mécanisme de formation des vésicules d’endocytose dont le puits s’initierait à partir des invaginations existantes à la base des protrusions membranaires. / Endocytosis is a basic and essential process used by eukaryotic cells to internalize, actively and specifically, a wide range of molecules. To date, several endocytic routes have been characterized, but the only well studied pathway is clathrin-dependent. This study focuses on a poorly characterized mechanism, the clathrin-independent endocytosis, used by several cytokine receptors such as the interleukin 2 receptors (IL-2R). Previously, my lab identified 8 factors in this process, most of them are related to actin polymerization and dynamin. We now know that the activation of the RhoGTPase Rac1 is required to induce Paks that regulate cortactin, N-WASP recruitment and actin polymerization essential for IL-2R uptake. However, upstream factors involved in the Rac-Pak cascade were unknown and the actin cytoskeleton function poorly characterised. During my PhD, I showed that IL-2R and the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) interact, leading to the local production of phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate (PIP3) and the recruitment by this lipid of the RacGEF Vav2, an activator of Rac1. In addition, I showed that activated Rac1 was able to interact with PI3K allowing the local activation of the Rac-Pak cascade during IL-2R entry. These published data highlight the dual role of PI3K as a regulator of both IL-2R endocytosis and IL-2 signaling. In an attempt to identify new actors involved in the endocytosis of IL-2R, I then performed a small interfering RNA (siRNA) screening, targeting 324 proteins involved mainly in membrane deformation. From this screening we identified 65 proteins and among them we found the WAVE complex as a new factor implicated in IL-2R uptake. Interestingly, to be recruited and activated at the plasma membrane, the WAVE complex required Rac1 and PI3K, two proteins essentials during IL-2R entry. First, I confirmed the results obtained from the screening and found that IL-2R can interact with the WAVE complex. In addition, I observed an early involvement of this complex during IL-2R uptake, which could be needed for the localization of the receptor at the basis of plasma membrane protrusions. These results reveal a new model for the formation of endocytic vesicles: IL-2R is recruited at the basis of WAVE-induced membrane protrusions initiating the pit and vesicle.

L'objectif de cette étude s'inscrit dans une démarche de développement de céramiques apatites phosphocalciques et de leur évaluation biologique. Les matériaux étudiés sont des hydroxyapatites silicatées ou carbonatés denses en monophasées. Il s'agit d'un travail interdisciplinaire, qui va de la synthèse et la mise en œuvre de matériaux céramiques à la biomécanique cellulaire et les essais de cultures cellulaires in vitro. La dimension originale du projet concerne le suivi de la réponse des cellules osseuses déposées sur ces céramiques par l'indentation à l'aide d'un AFM. Ces travaux montrent d'une part, que la bioactivité des matériaux étudiés était semblables et d'autre part, que la relaxation de cellules ensemencées sur TA6V et hydroxyapatite stochiométrique suivent une loi puissance (exposant ≈ 0.2) sur 2-200 secondes. La méthode originale utilisée montre par ailleurs que la relaxation d'une fibre d'actine est différentiable de la relaxation de la membrane cellulaire.

L'objectif de cette thèse est de caractériser l'influence de facteurs protéiques sur la dynamique du cytosquelette cellulaire au moyen d'outils de micromanipulation contrôlés. Nous avons déterminé la réponse microrhéologique du réseau d'actine pour des cellules uniques. Nous avons appliqué grâce à un système de pinces optiques des forces statiques et oscillantes à des microbilles de verres attachées de manière spécifique au réseau d'actine de divers types cellulaires. Dans le cas statique nous avons mesuré des modules élastiques dans la gamme 29

L'actine est une protéine très abondante dans les cellules eucaryotes, c'est un biopolymère qui s'assemble en filaments semiflexibles. La cellule contrôle au travers de protéines spécifiques (Actin Binding Proteins) la dynamique d'assemblage (et de désassemblage) des filaments d'actine, ainsi que l'arrangement de ces filaments en réseaux tridimensionnels. Les réseaux ainsi formés peuvent avoir des structures très variées, allant d'un arrangement en forme de câble où les filaments d'actine sont parallèles entre eux, jusqu'à une structure plus désordonnée en gel dans laquelle les filaments forment un réseau très interconnecté. Ces diverses organisations de l'actine lui permettent de jouer des rôles très divers au sein de la cellule. Parmi ces roles, l'un des plus remarquable est celui qu'elle tient dans la genèse de la morphologie de la cellule. En effet, aux bords de la membrane cellulaire, un réseau d'actine forme une partie du cytosquelette de la cellule et contribue à ce titre au maintient de sa forme. Pour se mettre en mouvement, la cellule doit acquérir une polarité, cela nécessite des restructurations importantes du cytosquelette. Au niveau de la membrane cellulaire, des protéines activent localement la polymérisation de l'actine, ce qui va contribuer à la déformation de la membrane et ainsi au mouvement de la cellule. Nous nous sommes intéressés au cours de cette thèse aux contraintes mécaniques qu'un gel d'actine peut produire. Pour cela nous avons mis au point un système biomimétique constitué d'une goutte d'huile microscopique dont on recouvre la surface avec une protéine qui active la polymérisation de l'actine, comme celles que l'on trouve au niveau de la membrane cellulaire. Lorsque l'on met une telle goutte dans des extraits cellulaires, on observe la croissance d'un gel d'actine autour de la goutte. L'actine finie par former une comète qui propulse la goutte. L'aspect "mou" de la goutte d'huile fait que cette dernière se déforme sous l'action des contraintes qu'exerce le gel l'actine et prend une forme en poire. L'observation de la déformation de la goutte nous renseigne sur l'amplitude et la répartition des contraintes développées par l'actine. Un second aspect de notre travail fut de modifier les propriétés élastiques du gel d'actine formé. Pour ce faire, nous avons ajouté dans les extraits cellulaires une protéine qui réticule les filaments d'actines entre eux. Les résultats que nous avons obtenus sont présentés dans ce manuscrit.