Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique, Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP. <p><p>Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire.<p><p>Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale).<p><p>Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes.<p><p>Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc.<p><p>Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2. <p><p>En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte. <p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules dendritiques plasmacytoides (pDCs), spécialisées dans la réponse antivirale, produisent de fortes quantités d’interféron (IFN) lorsqu’elles sont en contact avec des cellules infectées par des virus. Pourtant, les pDCs sont réfractaires à l’infection. Ce mécanisme d’activation de la réponse antivirale par le contact physique avec les cellules infectées, nouvellement découvert, constituerait un aspect général des voies de défense de l’hôte contre les virus.En utilisant le virus de l’Hépatite C et de la Dengue comme modèle viral, nous avons observé une réorganisation moléculaire au niveau des contacts entre les pDCs et les cellules infectées. La polarisation d’éléments cellulaires, notamment de régulateurs du cytosquelette d’actine et de molécules de la machinerie d’endocytose en direction du contact favoriserait son établissement et/ou sa stabilisation ainsi qu’une transmission efficace d’éléments viraux, ensuite reconnus par les pDCs. Nous avons également démontré que les pDCs effectuent des contacts plus stables et présentent une polarisation plus importante d’éléments cellulaires aux contacts avec des cellules infectées qu’avec des cellules non infectées. Ces interactions présentent des similarités avec les synapses, contacts cellulaires organisés impliqués dans la communication cellulaire. Notamment, les synapses immunologiques jouent un rôle important dans l’activation de la réponse immunitaire adaptative. Nous proposons donc de nommer ces contacts activateurs de pDCs des « synapses immunologiques innées ». Ce mécanisme représenterait un processus de reconnaissance des infections par les pDCs généralisable à différents types de virus, par « scan » du statut infectieux des cellules par contact. Nos résultats suggèrent également que des éléments viraux s’accumulent au niveau de ces contacts. Ces éléments diffèrent en fonction du type d’infection. Notamment, nous avons mis en évidence dans un contexte d’infection par le virus de la Dengue que des structures virales non canoniques et non infectieuses, différentes des particules virales infectieuses dites « classiques », jouent un rôle important dans l’activation de la réponse antivirale. Notre travail apporte un nouvel angle d’analyse de l’activation des pDCs et des stratégies de détection des infections virales par l’hôte. / Plasmacytoid dendritic cells (pDCs), specialized in the antiviral response, are important producers of interferons (IFN) after cell-cell contacts with virally infected cells. Nonetheless, they are poorly permissive to the majority of viral infections. This newly uncovered mechanism of the activation of an antiviral response by physical cell-cell contacts with infected cells could constitute a general aspect of the host defense against viral infections.Using Hepatitis C virus and Dengue virus as models, we observed a molecular reorganization of the contacts between pDCs and infected cells. The polarization toward contacts of cellular elements, such as regulators of the actin cytoskeleton and components of the endocytic machinery could favor their establishment and/or their stabilization, as well as the efficient transmission of viral elements that are recognized by pDCs. We also demonstrated that pDCs contacts with infected cells are more stable and present a higher polarization of cellular components than contacts with uninfected cells. These interactions present similarities with synapses, a type of organized contact involved in cell-to-cell communication. Notably, immunological synapses are known to play an important role in the activation of the adaptive immune response. We thus propose to call these pDC-activating contacts « innate immunological synapses ». This mechanism could represent a general process of recognition of viral infections by pDCs, by « scanning » the infectious status of the cells by cell-cell contacts. Our results also suggest that viral elements cluster at the level of contacts. These elements differ depending on the type of viral infection. Notably, we observed in the context of Dengue virus infection that non-infectious non-canonical viral structures, that differ from the « classical » viral infectious particles, play an important role in the activation of the antiviral response. Our work brings a new light in the mechanisms of pDC activation and in the host defense strategies against viral infection.

Spiroplasma citri est un mollicute phytopathogène transmis de plante à plante par des cicadelles du genre Circulifer selon un mode persistant circulant-multipliant. Les franchissements de l’épithélium intestinal et des glandes salivaires sont basés sur un mécanisme d’endocytose/exocytose. Ce processus d’invasion met en jeu, au sein de complexes protéiques, des protéines bactériennes spécifiques qui reconnaissent des motifs déterminés présents à la surface des cellules eucaryotes. La recherche de protéines de l’insecte vecteur interagissant avec S. citri a notamment conduit à l’identification de l’actine. Cette interaction a pu être confirmée à la fois in vitro et in vivo. L’interaction de l’actine avec son partenaire chez S. citri, qui s’est avéré être la phosphoglycérate kinase (PGK), est impliquée dans l’internalisation du spiroplasme dans les cellules de l’insecte. La région minimale de liaison à l’actine de la PGK a également été déterminée.La réalisation d’un mutant de S. citri dépourvu de PGK a été entreprise avec le plasmide navette pGOT mais n’a pas permis la sélection de spiroplasmes mutés dans ce gène essentiel. Néanmoins, la recherche de l’évènement de recombinaison chez les clones obtenus a permis de mettre en évidence la mutation de deux gènes chez ces derniers.L'ensemble des protéines impliquées dans la transmission du spiroplasme, identifiées au préalable chez ce dernier, n’étant pas essentielle au cours de ce processus, une étude préliminaire des complexes multi-protéiques contenant plusieurs de ces protéines a été réalisée. L’identification de complexes impliquant à la fois la PGK, la P32 et les ScARPs pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes régissant la vection de S. citri par son insecte. / Spiroplasma citri is a phytopathogenic mollicute transmitted from plant to plant by leafhoppers of the genus Circulifer in a persistent and propagative manner on condition to cross the intestinal and salivary glands barriers of the insect. These crossings are based on a endocytosis/exocytosis mechanism which involves bacterial protein complexes in order to recognize specific patterns on the surface of eukaryotic cells.Specific molecular interactions between S. citri proteins and those of C. haematoceps were investigated using far Western technology and had notably led to the identification of actin. This interaction has been confirmed both in vitro and in vivo. The interaction of actin with his partner in S. citri, which has been identified as the phosphoglycerate kinase (PGK), is involved in the internalization of spiroplasma into the insect cells. The minimal actin-binding region of PGK was also determined.The realization of a S. citri PGK mutant was carried out using the shuttle plasmid pGOT but the selection of spiroplasmas mutated in this essential gene failed. Nevertheless, findings in the localization of recombination events in S. citri chromosome, allowed us to identify mutations in two genes that could be tested in our experimental transmission system.The set of proteins involved in the spiroplasmal transmission, previously identified as non essential proteins in the invasion process, prompted us to study the role of multi-protein complexes containing several of these proteins. Identification of complexes involving both the PGK, the P32 and ScARPs should enable us to better understand mechanisms governing the transmission of S. citri by its insect.

La division cellulaire est un élément clé du développement. Pendant ce processus, le matériel génétique (chromosomes) est distribué entre les deux cellules filles. Cette distribution est effectuée par le fuseau mitotique ou méiotique ; une mauvaise formation de cette structure peut être critique. Le cytosquelette joue un rôle prédominant dans la division cellulaire. Malgré des progrès importants dans la compréhension de son rôle dans le processus de division cellulaire, de nombreuses questions restent encore sans réponse et des progrès techniques pour étudier ces phénomènes sont nécessaires. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de l’auto-organisation de l’actine cytoplasmique dans deux systèmes modèles : les extraits cellulaires de Xénope et les ovocytes de souris. En utilisant une approche interdisciplinaire, nous avons développé de nouveaux outils expérimentaux et analytiques pour étudier le rôle de l’actine cytoplasmique pendant la division cellulaire. En encapsulant les extraits cellulaires de Xénope dans des gouttes, nous pouvons mimer le volume cellulaire. Nous utilisons ce système pour étudier les interactions entre l’actine et les microtubules. Dans un premier projet, nous avons montré que l’auto-organisation de l’actine peut déclencher des cascades de signalisation. Grâce à l’ingénierie de deux propriétés de l’actine, nous avons démontré que l’auto-organisation de ce polymère peut permettre l’assemblage de microtubules. Dans un deuxième projet, nous avons montré que la dynamique de l’actine cytoplasmique peut induire des contraintes sur l’organisation et la dynamique des microtubules. Nos résultats suggèrent que les propriétés dynamiques du réseau d’actine sont un facteur important pour l’assemblage des microtubules. Dans l’ovocyte de souris, nous avons développé une méthode pour suivre de manière automatique le mouvement d’objets passifs avec des tailles variables. Nous avons utilisé ce système pour étudier l’effet de l’actine cytoplasmique sur le transport à longue portée. Nous avons ainsi validé l’existence d’un mécanisme de centrage non spécifique de gros objets pendant la prophase. Nous avons aussi démontré que ce mécanisme de centrage reste présent pendant le reste de la méiose, en même temps que la migration du fuseau vers le cortex de l’ovocyte. / Cell division is a key element of the development of an embryo throughout all his life. During cell division, the genetic material (chromosomes) is distributed between the two daughter cells. This distribution is achieved by the spindle and a misbehavior in the formation of this structure can be critical. The cytoskeleton polymers are playing a predominant role in cell division. Despite important progresses in the understanding of their role in cell division process, numerous questions still have to be answered and technical progresses to study these phenomena are still needed. In this PhD work, we studied the role of cytoplasmic F-actin self-organization in two model systems: Xenopus egg extracts and mouse oocytes. Using an interdisciplinary approach, we developed new experimental and analytical tools to study the role of cytoplasmic F-actin during cell division. By encapsulating Xenopus actin-intact egg extracts in droplets, we are able to mimic cellular environment. We use this system to study interactions between F-actin and microtubules. In a first project, we showed that F-actin self-organization can trigger signaling pathways. By engineering two properties of the microfilament self-organization and using Ran dependent microtubule nucleation, we found that F-actin dynamics promotes the robust assembly of microtubules. In a second project, we showed that the dynamics of cytoplasmic F-actin can induce constraints on the microtubule organization and dynamics in aster and spindle structures. Our results suggest that the dynamic properties of cytoplasmic F-actin meshwork are of a primary importance for the proper assembly of microtubule structures.In the mouse oocyte, we set-up a method to automatically track the movement of passive objects with tunable size. We used this system to examine the effect of cytoplasmic F-actin on long-range transport. We thus validated the existence of a non-specific mechanism for large objects centering during Prophase. We also demonstrated that this centering mechanism is still present during the rest of meiosis, coexisting with the spindle migration toward the cortex.

Les moteurs moléculaires permettent le transport actif de molécules et d’organelles le long de filaments polaires du cytosquelette de la cellule eucaryote. Les filaments peuvent s’organiser en réseaux parallèles, antiparallèles, ou désordonnés. Malgré son importance, l’influence de l’architecture du cytosquelette sur le transport de cargos par des moteurs moléculaires est souvent ignorée. Dans ce travail de thèse, nous avons utilisé des patrons surfaciques de nucléation pour contrôler la géométrie de polymérisation de filaments d’actine. Cette approche permet de reproduire in vitro les trois types de réseaux qui sont observés in vivo. En adsorbant des moteurs moléculaires purifiés à la surface de nano-billes fluorescentes (diamètre 200 nm), nous avons étudié le transport de ces cargos dans des réseaux antiparallèles émergeant de deux lignes de nucléation parallèles. Nous avons observé que les billes recouvertes de moteurs processifs HMM-V (Heavy Mero-Myosine V) génèrent des mouvements dirigés en direction du milieu du réseau où la polarité moyenne des filaments est nulle et où les billes s’accumulent. De plus, la distribution de positions des billes à l’état stationnaire peut être déduite des profils de vitesse et de diffu-sion des billes, indiquant que le transport actif suit un processus de convection-diffusion. Les billes recouvertes de moteurs non-processifs HMM-II (Heavy Mero-Myosine II) dé-montrent des comportements similaires. Cependant, bien que le gradient de vitesse des billes HMM-II soit plus important que pour les billes HMM-V au centre du réseau, le coeffi-cient de diffusion l’est bien davantage. Le centrage de ces billes est ainsi moins précis qu’avec la HMM V. A notre surprise, nous avons observé que la précision du centrage ne dépend pas de l’espacement entre les deux lignes de nucléation, donc de la taille du sys-tème. Le comportement des billes est décrit par un modèle à trois états dans lequel la bille sonde localement la polarité nette du réseau en se détachant et en se rattachant fré-quemment aux filaments. Une séquence stochastique de déplacements dirigés dans un état attaché aux filaments et d’explorations diffusives dans un état détaché, conduit à une marche aléatoire biaisée avec un coefficient de diffusion et une vitesse effectifs. Notre description physique indique que la précision du positionnement des billes dépend du gra-dient de polarité nette du réseau de filaments ainsi que de la distance moyenne de par-cours des billes dans l’état attaché à l’actine. Nos résultats démontrent ainsi le rôle clef que joue l’architecture du réseau de filaments sur les propriétés du transport. Dans la cellule, les moteurs moléculaires permettent également la réorganisation des filaments du cytosquelette. En ajoutant nos moteurs moléculaires en solution, nous avons observé qu’un réseau de filaments d’actine parallèles, polymérisés in vitro à partir d’une ligne ou d’un disque de nucléation, peut former spontanément des faisceaux oscil-lants. Ces oscillations ressemblent aux battements du flagelle du spermatozoïde. En parti-culier, le système génère des ondes de déformation transverses se propageant de la base à l’apex du faisceau oscillant à une vitesse de 0,5 µm/s. Au cours du temps, les faisceaux d’actine s’épaississent, ce qui conduit à un ralentissement de l’oscillation avec une période qui croît de 25 s à 40 s. De plus, nous avons observé que des faisceaux d’actine voisins sont capables de se synchroniser, comme c’est le cas entre les deux flagelles de l’algue Chlamydomonas. Notre système acto-myosine minimal permet donc d’imiter le battement de flagelles, bien que la nature des moteurs moléculaires et des filaments en jeu soit com-plètement différente. Ainsi, ce système fournit un nouvel outil pour étudier les propriétés physiques génériques du battement flagellaire. / Molecular motors navigate the cytoskeleton to position vesicles and organelles at specific locations in the cell. Cytoskeletal filaments assemble into parallel, antiparallel or disordered networks, providing a complex environment that constrains active transport properties. Using surface micro-patterns of nucleation-promoting factors to control the geometry of actin polymerization, we studied in vitro the interplay between the actin-network architec-ture and cargo transport by small myosin assemblies. With two parallel nucleation lines, we produced an antiparallel network of overlapping filaments. We found that 200nm beads coated with processive myosin V motors displayed directed movements towards the mid-line of the pattern, where the net polarity of the actin network was null, and accumulated there. The bead distribution was dictated by the spatial profiles of bead velocity and diffu-sion coefficient, indicating that a diffusion-drift process was at work. Interestingly, beads coated with skeletal heavy mero-myosin II motors showed a similar behavior. However, although velocity gradients were sharper with myosin II, the much larger bead diffusion observed with this non-processive motor resulted in less precise positioning. Strikingly, bead positioning did not depend on the spacing between the nucleation lines. Our observa-tions are well described by a three-state model of bead transport, in which active beads locally sense the net polarity of the filament network by frequently detaching from and re-attaching to the filaments. A stochastic sequence of processive runs and diffusive search-es results in a biased random walk with an effective drift velocity and diffusion coefficient. Positioning relies on spatial gradients of the net actin polarity, as well as on the run length of the cargo in the attached state. Altogether, our results on a minimal acto-myosin system demonstrate the key role played by the actin-network architecture on motor transport. Molecular motors can also deform and reorganize the cytoskeleton. Adding heavy mero-myosin II or V in bulk, we observed that parallel networks of actin filaments emerg-ing from a nucleation line or disk can self-assemble into bundles that beat periodically like the flagellum of the spermatozoid. In a preliminary analysis, we observed waves of defor-mation travelling from the base to the tip of the bundle at a speed of 0,5 µm/s. As time went by, the bundles grew thicker, resulting in an increase of the beating period (range: 25-40 s). In addition, neighboring actin ‘flagella’ were able to synchronize, as observed in vivo for instance with the the two flagella of the algae Chlamydomonas. Our minimal acto-myosin system thus mimicked key properties of microtubule-based flagellar beating, de-spite the different nature of the motors and cytoskeletal filaments involved. This system thus provides a new tool to study the generic physical properties of flagellar beating.

Les septines sont des protéines conservées de la levure à l’homme qui sont impliquées dans divers processus cellulaires tels que la cytokinèse, le transport vésiculaire et l’organisation du cortex cellulaire. Il existe 13 gènes de septines retrouvés en plusieurs isoformes chez l’humain, et seulement cinq chez Drosophila melanogaster, Sep1, Sep2, Pnut, Sep4 et Sep5, ce qui en fait un modèle idéal vu son génome simple. Les septines sont composées d’un domaine de liaison au GTP très conservé entre les espèces, dont le rôle reste à ce jour ambiguë, ainsi que de régions N et C-terminales variables. Les septines s’assemblent entre elles pour former un hexamère, composé de Sep1, Sep2 et Pnut chez Drosophila melanogaster, via l’interface N-C et G des septines. Ces hexamères s’assemblent bout à bout afin de former les filaments de septines. Ces filaments peuvent ensuite se regrouper et s’assembler en structures hautement ordonnées telles que des anneaux, des tubes, des faisceaux de filaments, des cages et elles sont retrouvées au sillon de clivage durant la cytokinèse. Le but était de déchiffrer les mécanismes d’assemblage des filaments de septines qui mènent à la formation des différentes structures, afin de mieux comprendre les mécanismes d’interaction entre les septines. Au sein des cellules S2 de Drosophila melanogaster, les septines sont retrouvées à trois structures hautement ordonnées et dépendantes de Pnut endogène : des tubes cytoplasmiques, des anneaux cytoplasmiques et le sillon de clivage durant la cytokinèse. Notre hypothèse est qu’il existe plusieurs mécanismes qui régissent la formation des structures hautement ordonnées et que ceux-ci sont dépendants des régions N et C terminales variables des septines qui sont impliquées dans plusieurs interactions. Divers mutants de Sep1, Sep2 et Pnut tronqués en N et en C-terminal ont été fusionnés à une protéine fluorescente et caractérisés par microscopie confocale. La localisation de ces mutants a été répertoriée et analysée en présence des septines endogènes ou lors de la déplétion de celles-ci. Nos résultats suggèrent que le domaine de liaison au GTP est suffisant pour le recrutement des septines au sillon de clivage durant la cytokinèse, mais que la région N-terminale est requise la formation des tubes et des anneaux cytoplasmiques dépendants de Pnut. / Septins are conserved from yeast to humans and are implicated in diverse cellular processes such as cytokinesis, vesicular transport and cellular cortical organization. There are 13 known genes that encode for human septins, which also have many isoforms, while there are only five septin genes in Drosophila melanogaster: Sep1, Sep2, Pnut, Sep4 and Sep5, which makes it an ideal model system. Septins have a conserved GTP binding domain, whose role is still not fully understood, and variable N-C-termini. Septins assemble together, via N-C and G interfaces, to form a hexamer, that is composed of Sep1, Sep2 and Pnut in Drosophila melanogaster, which assemble end-to-end to form non polar filaments. These filaments can subsequently assemble together to form higher-ordered structures, such as rings, tubes, bundles, and gauzes. Furthermore, septins are recruited to the cleavage furrow during cytokinesis although their organization there is unclear. The aim of this project is to define septin assembly mechanisms that can lead to the formation of different higher ordered structures. In Drosophila melanogaster S2 cells, septins are recruited to three, readily observable septin dependent structures: cytoplasmic rings, cytoplasmic tubes, and the cleavage furrow during cytokinesis. Our hypothesis is that multiple mechanisms govern septin incorporation into these structures and that these mechanisms differentially depend on septin N-C variable termini. A panel of mutants of Sep1, Sep2 and Pnut truncated in N-C-termini were fused to fluorescent proteins and their localization in S2 cells monitored by confocal microscopy, with or without depletion of endogenous septins. My results suggest that the GTP binding domain is sufficient for septin recruitment to the cleavage furrow during cytokinesis, but that the septin N-termini are required for recruitment to the cytoplasmic tubes and rings.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Lors de leur différenciation, les neurones développent deux types de prolongements cytoplasmiques, dendrites et axones. L'élaboration de ces prolongements est médiée par les éléments du cytosquelette, plus particulièrement, les microtubules et les microfilaments d'actine (actine-F). L'expression de la protéine associée aux microtubules-2 (MAP-2) est nécessaire au développement des neurites mineures, les premiers prolongements cytoplasmiques émis par un neurone. Ceux-ci n'ont pas une identité dendritique ou axonale. Par la suite, l'expression de MAP2 est nécessaire au développement et au maintien des dendrites. L'expression de MAP2 est régulée par épissage alternatif au cours de la différenciation neuronale. Il existe quatre isoformes de la protéine MAP2, MAP2a, MAP2b, MAP2c et MAP2d. MAP2b et MAP2c sont les isoformes les mieux caractérisées. Elles peuvent être subdivisées en deux domaines: un domaine de liaison aux microtubules situé en C-terminal et un domaine de projection en N-terminal. Le domaine de liaison aux microtubules est responsable de l'interaction de MAP2 avec les microtubules alors que le rôle du domaine de projection n1est toujours pas clairement défini. MAP2c est exprimée dans les neurones immatures alors que MAP2b est présente dans les neurones immatures et matures. Dans les neurones immatures, ces deux isoformes se retrouvent dans les neurites mineures et elles sont ciblées préférentiellement dans les dendrites au cours de la différenciation neuronale. Le rôle respectif de MAP2b et MAP2c dans l'élaboration de prolongements cytoplasmiques par un neurone demeure inconnu. MAP2b et MAP2c diffèrent par la présence d'une séquence additionnelle de 1372 acides aminés dans le domaine de projection de MAP2b. L'insertion d'une séquence aussi importante dans le domaine de projection de MAP2b indique que ce domaine joue un rôle important. Le but de la présente étude consiste à mieux comprendre le rôle de cette séquence dans la fotmation de prolongements cytoplasmiques. Pour cette analyse fonctionnelle, nous avons produit six formes tronquées de MAP2b qui contiennent des délétions dans le domaine de projection de MAP2b. Ces formes tronquées de MAP2b ont été exprimées dans les cellules ovariennes Spodoptera frugiperda (Sf9). En effet, ce système cellulaire est très intéressant puisque nous avons démontré que l'expression de MAP2b et MAP2c dans ces cellules résulte en la formation de prolongements cytoplasmiques. Cependant, ces deux isoformes de MAP2 induisent des patterns distincts de formation de prolongements cytoplasmiques. 60% des cellules qui expriment MAP2c développent des prolongements alors que 14% des cellules qui expriment MAP2b ont des prolongements. De plus, les cellules qui expriment MAP2c ont la tendance à développer des prolongements multiples alors que celles qui expriment MAP2b présentent un seul prolongement. Nos présents résultats démontrent que le domaine de projection de MAP2b a un effet inhibiteur sur la capacité du domaine de liaison aux microtubules à induire la formation de prolongements cytoplasmiques. En effet, 53% des cellules qui n'expriment que le domaine de liaison aux microtubules ont des prolongements en comparaison à 14% des cellules qui expriment MAP2b. De plus, l'expression de trois formes tronquées de MAP2b qui ont une délétion partielle de la séquence additionnelle de 1372 acides aminés induit un plus grand pourcentage de cellules avec prolongements (27%, 31 % et 41 % ). Toutefois, la séquence commune à MAP2c et MAP2b qui est située à l'extrémité 5' du domaine de projection semble favoriser la formation de plusieurs prolongements puisque sa délétion résulte en un plus faible pourcentage de cellules avec des prolongements multiples. Nos résultats suggèrent donc que l'insertion de la séquence additionnelle de 1372 acides aminés dans le domaine de projection de MAP2b diminue sa capacité à induire la formation de prolongements cytoplasmiques. Étant donné que MAP2b et MAP2c sont capables de se lier à l'actine-F et aux microtubules, nous avons examiné la distribution de ces deux éléments du cytosquelette dans les cellules Sf9 qui expriment les différentes formes tronquées de MAP2b. Toutes les formes tronquées de MAP2b induisent la formation de faisceaux de microtubules à l'exception des formes tronquées qui correspondent aux domaines de projection de MAP2c et de MAP2b. Dans les cellules qui présentent des prolongements, on note une réorganisation de l'actine-F. Dans les cellules qui expriment la forme mutante correspondant au domaine de projection de MAP2b, l'actine-F est distribuée sous forme d'un anneau sous la membrane plasmique. De plus, le domaine de projection a une distribution similaire. Ceci suggère que le domaine de projection de MAP2b interagit avec l'actine-F. Donc la séquence additionnelle de 13 72 acides aminés pourrait contenir un domaine de liaison à l'actine. En conclusion, nos résultats indiquent que MAP2b aurait une moins grande capacité que MAP2c à promouvoir la formation de neurites mais elle pourrait contribuer à leur stabilisation au cours de la différenciation neuronale par le fait qu'elle contient des domaines additionnels de liaison à l'actine.

Les encéphalopathies épileptogènes sont des maladies graves de l’enfance associant une épilepsie, souvent réfractaire, et un retard de développement. Les mécanismes sous-tendant ces maladies sont peu connus. Cependant, nous postulons que ces épilepsies puissent être causées par une dysfonction du réseau inhibiteur. En effet, des défauts de migration ou de maturation des interneurones GABAergiques (INs) corticaux induisent l’épilepsie, tant chez l’humain que chez la souris. Dans le but d’étudier les causes génétiques des encéphalopathies épileptogènes sporadiques inexpliquées, le laboratoire de la Dre Rossignol a procédé au séquençage d’exome entier d’une cohorte d’enfants atteints. Cela a permis d’identifier, chez un patient, une nouvelle mutation de novo, possiblement pathogène, dans le gène MYO9b. MYO9b est impliqué dans la migration de cellules immunitaires et cancéreuses et est exprimée durant le développement cérébral. Nous émettons l’hypothèse voulant que MYO9b puisse être importante pour la migration des INs corticaux. Les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que Myo9b est exprimé dès le stade embryonnaire par les progéniteurs des INs corticaux et que son expression se restreint aux INs dans le cortex mature. De plus, nous démontrons que la répression ex vivo de Myo9b sélectivement dans les INs au sein de tranches corticales organotypiques embryonnaires mène à des défauts morphologiques majeurs de ces cellules en migration. En effet, ces cellules présentent une morphologie multipolaire et des neurites rostraux plus longs et plus complexes. Ces changements morphologiques pourraient avoir un impact majeur sur la migration des INs et ainsi perturber le développement des réseaux inhibiteurs. / Epileptic encephalopathies are early-onset diseases characterized by refractory epilepsy with developmental delay. To identify the underlying genetic cause of these disorders, Dr Rossignol’s laboratory has performed whole-exome sequencing in children with sporadic epileptic encephalopathies. They have identified a novel de novo mutation in the MYO9B gene in one patient. Myo9b is known to regulate cell migration in the immune system and in cancer cells. It is expressed in the developing rodent brain, but its roles during brain development are largely unknown. Recent evidence suggests that epilepsy can be caused by an imbalance between inhibition and excitation in cortical circuits. Indeed, defects in the development or the functions of cortical GABAergic interneurons (INs) have been associated with epilepsy in human and in mouse models. Therefore, we postulated that Myo9b might play a role in the development of INs. In this thesis, I show that Myo9b is expressed in INs from early embryonic ages to post-natal ages. Furthermore, I demonstrate that the ex vivo downregulation of Myo9b in INs in cortical embryonic organotypic cultures causes morphological defects in migrating INs, including aberrant polarization of these cells. These morphological changes might result in aberrant IN migration, which would be expected to perturb the cortical inhibitory-excitatory ratio.

Le trafic intracellulaire consiste en la formation et le transport de vésicules ou tubules qui acheminent des composants protéiques et lipidiques entre les différents organites ou avec la membrane plasmique. L’élaboration de ces tubulo-vésicules est initiée par le remodelage local d’une membrane, tout d’abord en générant une courbure puis un bourgeon qui, s’allongeant, forme la tubulo-vésicule. Enfin, la rupture de la membrane, ou scission, libère le transporteur nouvellement formé. Ces étapes repose sur un sculptage profond de la membrane. Ceci requière des forces générées par des moteurs moléculaires, lesquels s’associent aux cytosquelettes comme les microtubules ou les filaments d’actine. Afin de mieux comprendre comment le cytosquelette et leurs moteurs façonnent ces transporteurs, nous avons examiné le rôle de l’actine et de la myosine VI dans la formation de tubules membranaires aux mélanosomes. Les mélanosomes sont des organites apparentés aux lysosomes, générés dans les mélanocytes de la peau et de la choroïde de l’œil, et qui sont le lieu de synthèse et de stockage d’un pigment, la mélanine. Dans l’épiderme, ces compartiments spécialisés évoluent par différentes étapes de maturation qui aboutissent à leurs transferts aux cellules voisines, les kératinocytes. Les mélanosomes sont des organites dynamiques qui reçoivent et recyclent constamment des composants membranaires, comme la SNARE VAMP7. Nous résultats montrent que la myosine VI et son adapteur optineurine se localisent à un sous-domaine spécifique de la membrane des mélanosomes, ou elles contrôlent la scission de tubules. En effet, l’activité motrice de la myosine VI et le réseau d’actine branchée, dépendant des complexes Arp2/3 et WASH, permettent la constriction des membranes du tubule et son détachement du mélanosome. Un défaut de scission de ces tubes engendre des mélanosomes plus pigmentés, enrichis en cargos et au pH plus acide. L’altération de l’homéostasie du mélanosome affecte sa fonction, comme sa capacité à être sécrété et transféré aux kératinocytes. Nos résultats démontrent que la myosine VI en coopération avec le cytosquelette d’actine permet la constriction et fission de membranes aux mélanosomes. Les intermédiaires de transport ainsi formés recyclent des protéines cargos pour leur possible réutilisation, et participent ainsi au maintien de l’homéostasie et de la fonction de ces organites. / Intracellular transport among organelles and the plasma membrane occurs through the formation and transport of vesicular and tubular membrane carriers. The formation of these carriers requires first the bending of membrane and the generation of a bud, followed by its elongation to form the tubule-vesicle. Lastly, the carrier is released from the membrane source by the scission of the membrane. Importantly, all these different steps need an accurate orchestration to properly deform the membrane. The actions exerted by molecular motors onto microtubule and actin cytoskeletons provide forces onto membrane that contribute to its remodeling during the biogenesis of carrier. Actin filaments (F-actin) and myosins are thought to participate in the initiation and the fission of carriers. However, the role of actin machinery during carrier biogenesis remains elusive. We thus decided to address the role of F-actin and the actin-based motor myosin VI in the formation of tubular intermediates at melanosome. Melanosomes are lysosome-related organelles of skin melanocytes and eye pigment cells that function in the synthesis and storage of the melanin pigment. Melanosomes originate from endosomes and progressively mature into fully pigmented compartments, which fate is to be secreted and transferred to neighboring keratinocytes. Melanosomes are dynamic organelles that constantly receive, but also recycle proteins such as the SNARE VAMP7 through the formation and release of tubular intermediates. Our work reveals that myosin VI, together with Arp2/3- and WASH-mediated branched actin localize at specific melanosomal subdomains where they promote the constriction and scission of tubular intermediates. This fission event allows the export of components such as VAMP7 from melanosomes and promotes their maturation and subsequent transfer to keratinocytes. Altogether, our results uncover a new role for myosin VI and F-actin in the constriction and scission of membrane tubules at melanosome that is required for organelle homeostasis and function.

L’émergence de comportements collectifs cellulaires n’est pas bien comprise. Nous l’abordons dans deux systèmes biologiques. A l'échelle du micromètre lors de la constriction de l’anneau cytokinétique, nous montrons que des complexes d’acto-myosine s’auto-organisent sous forme d’agrégats dans la levure à fission et dans la cellule de mammifères. Ces auto-organisations découlent de règles d'interactions communes mais pour des fonctions distinctes, le transport et la génération de stress respectivement. A l'échelle de 100 micromètres, nous observons des pulsations corrélées de cellules épithéliales. Nous montrons les rôles du frottement avec la surface, et le couplage entre l’aire cellulaire, sa hauteur et sa contractilité. Nous présentons aussi deux études, des polyamines synthétiques pour étudier la polymérisation d'actine in vivo, puis l’inversion de sens dans la migration - la ratchetaxie. Cette thèse illustre l'importance des phénomènes physiques dans la dynamique cellulaire. / The emergence of collective behavior from the interaction of individual units is not clear. In this thesis, we address this question in two different systems at different scales. At the micrometer scale during cytokinetic ring constriction, we show that acto-myosin self-organizes into rotating and static clusters in fission yeast and mammalian cells. These self-organizations arise from common interaction rules, but to serve distinct functions, transport and stress generation respectively. At 100 micrometers scale, we report correlated pulsations of cells in an epithelial monolayer. We show the key roles of substrate friction, and the tight coupling between cell area, cell height and contractility. We also present two other studies: synthetic polyamines for studying actin polymerization in vivo, and direction reversal in single cell migration during ratchetaxis. Altogether, this PhD illustrates the importance of physical phenomena in cellular dynamics.