A enzima L-asparaginase (ASNase) de Escherichia coli é amplamente utilizada para tratar a leucemia linfoblástica aguda (LLA). No entanto, a enzima nativa pode ativar o sistema imune do hospedeiro causando reações alérgicas. A forma peguilada da enzima (PEG-ASNase) não só reduz o efeito imunológico, mas também possui a vantagem de aumentar sua meia-vida plasmática devido à menor degradação por proteases. Não obstante, a conjugação de PEG à ASNase é de forma aleatória e resulta em elevado grau de polidispersão. Nesse trabalho, um protocolo de peguilação N-terminal sítio-específica para a enzima ASNase foi desenvolvido, empregando-se metoxi-polietilenoglicol carboximetil N-hidroxisuccinimidil ester (mPEG-NHS, MW = 10 kDa). Os parâmetros de reação investigados foram a força iônica do tampão, o pH e o tempo de reação para otimizar o rendimento e minimizar a polidispersão. Os resultados confirmaram a ocorrência da reação de peguilação e baixa polidispersão. A força iônica do tampão favoreceu a conjugação N-terminal em 100 mM de tampão fosfato salino (PBS). Também observamos que o aumento do pH e tempo de reação estão diretamente relacionados com o aumento de formas polipeguiladas. O maior rendimento de monoPEG-ASNase, 42%, correspondeu à condição de reação de pH 7,5, tempo de reação de 30 min e razão PEG:enzima de 25:1. A monoPEG-ASNase foi purificada em coluna aniônica forte com gradiente linear de NaCl até 170 mM e a fração monopeguilada foi eluída em NaCl 78 mM com grau de pureza de 70% (rendimento de 55%). A cromatografia de exclusão por tamanho aumentou a pureza da monoPEG-ASNase para 99% (rendimento final de 45%). A monoPEG-ASNase, 190 ± 10 kDa, manteve sua atividade específica por 21 dias à 4ºC, enquanto que a enzima não peguilada (controle), 146 ± 6 kDa, teve uma queda de aproximadamente 52% na atividade específica em 7 dias à 4ºC. Um estudo de cinética enzimática foi realizado e obtivemos valores de kM semelhantes para as formas da enzima nativa e monopeguilada, 20 µM e 35 µM respectivamente. A monoPEG-ASNase apresentou-se mais resistente às proteases plasmáticas asparagina endopeptidase e catepsina B, por 84 h à 37 °C e apresentou ser citotóxica para células leucêmicas (MOLT-4 e Reh). Portanto, a peguilação N-terminal sítio-específica resultou em uma nova variante da ASNase que reteve grande parte de seu poder catalítico e pode ser considerada promissora para o emprego no tratamento da LLA. / The enzyme L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli is widely used to treat acute lymphoblastic leukemia (LLA). However, it can activate the host causing allergic reactions. Hence, the pegylated form of the enzyme (PEG-ASNase) not only reduces the immune effect but also increases plasma half-life. Nonetheless, the available PEG-ASNase is randomly pegylated and, consequently, with high degree of polydispersity. In this work we developed a site-specific N-terminus pegylation protocol for ASNase using methoxy-polyethylene glycol carboxymethyl N-hydroxysuccinimidyl ester (mPEG-NHS, MW = 10 kDa). Reaction parameters investigated were ionic strength, pH and reaction time to optimize yield and minimize polydispersity. Results confirmed pegylation and low polydispersity. Buffer ionic strength favored N-terminal conjugation at 100 mM phosphate buffer saline (PBS). Additionally, pH and reaction time were found to increase polyPEGylated species. The highest yield of monoPEG-ASNase, 42%, corresponded to reaction conditions of pH 7.5, reaction time of 30 min and PEG:ASNase ratio of 25:1. The monoPEG-ASNase was purified in a strong anionic column with NaCl linear gradient up to 170 mM and monoPEG-ASNase was eluted with 78 mM NaCl, 70% pure (55% yield). Size exclusion chromatography was further performed and increased monoPEG-ASNase purity to 99% (45% final yield). The monoPEG-ASNase, 190 ± 10 kDa was stable for 21 days at 4ºC while nonpegylated ASNase (control), 146 ± 6 kDa, lost 52% of its activity within 7 days at 4ºC. Enzyme kinetics were studied and similar kM values were obtained for both native and monoPEG-ASNase, 20 µM and 35 µM respectively. The monoPEG-ASNase demonstrated to be resistant to the plasma proteases asparaginyl endopeptidase and cathepsin B, 84 h at 37 °C and also was cytotoxic to leukemic cells (MOLT-4 and Reh). Therefore, site-specific N-terminus pegylation of ASNase resulted in a novel enzyme variant with preserved catalytic activity and, therefore, promising for the treatment of LLA.

A leucemia linfoide aguda (LLA) compreende um grupo heterogêneo de neoplasias caracterizadas por proliferação anormal e acúmulo de células imaturas na medula óssea, o que prejudica a produção de eritrócitos, leucócitos e plaquetas. O fator de crescimento semelhante à insulina 1 (insulin-like growth factor 1; IGF1) e seu receptor (IGF1R) regulam o crescimento celular normal e contribuem para a transformação e crescimento de células malignas através da ativação de vias de sinalização intracelular. A via de sinalização do IGF1 é iniciada através da ativação de seu receptor seguido da ativação de seus substratos, incluindo o substrato 1 do receptor de insulina (insulin receptor substrate 1; IRS1). IRS1 é uma proteína predominantemente citosólica envolvida na transdução de sinal, e também desempenha um papel na transformação maligna, sendo altamente expresso em muitos tipos de câncer. Em fibroblastos de camundongos, Irs1, através da sinalização do Igf1, foi descoberto como uma proteína chave para a translocação nuclear da ?-catenina e ativação da transcrição de seus genes alvos, como o Myc e a ciclina D1. MYC e ciclina D1 podem atuar como oncogenes, contribuindo para o desenvolvimento de diversas neoplasias, inclusive as hematopoéticas. Deste modo, o objetivo deste projeto de pesquisa foi investigar a participação do IRS1 nuclear na via da ?-catenina em LLA. Foram utilizadas no estudo linhagens celulares de LLA (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa) e células hematopoéticas primárias de doadores normais (n=13) e de pacientes adultos com LLA (n=45) atendidos em nossa Instituição. Estudos de expressão gênica (PCRq), expressão, associação proteica (western blotting, imunoprecipitação) e localização celular (fracionamento subcelular e microscopia confocal) foram utilizados. Células da linhagem Jurkat foram submetidas à estimulação com IGF1 e/ou inibição farmacológica de IGF1R (OSI-906). Observamos elevada expressão gênica relativa de IRS1, ?-catenina e MYC nos pacientes com LLA quando comparada aos controles normais (p<0,05), mas não houve diferença na expressão gênica de ciclina D1 e IGF1R entre os dois grupos. Observamos uma correlação positiva entre a expressão gênica de ?-catenina e MYC (p=0.0004; r=0.50), e entre a expressão de IRS1 e MYC (p=0.001; r=0.45) na coorte de pacientes com LLA. Na análise univariada, idade e expressão de MYC correlacionaram-se negativamente com a sobrevida global de pacientes com LLA; idade foi fator independente de prognóstico para a sobrevida. Em linhagens celulares de LLA (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa), observamos co-localização de IRS1 e ?-catenina no núcleo e no citoplasma. Em células primárias de doador normal, IRS1 e ?-catenina localizaram-se predominantemente no citoplasma. Em células da linhagem celular Jurkat, observamos interação entre IRS1 e ?- catenina e o estímulo com IGF1 provocou o aumento da fosforilação em tirosina de IRS1. O tratamento com OSI-906 diminuiu a fosforilação em tirosina de IGF1R, a translocação nuclear de ?-catenina e a expressão proteica de MYC em células Jurkat. Em conclusão, nossos dados suportam uma relação entre a via de sinalização IGF1R/IRS1 e a ativação da ?- catenina em leucemia linfoide aguda, o que pode representar um importante eixo de sinalização envolvido na fisiopatologia da doença. / The acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous group of malignancies characterized by abnormal proliferation and accumulation of immature cells in the bone marrow, which impairs the production of erythrocytes, leukocytes and platelets. Insulin-like growth factor 1 (IGF1) and its receptor (IGF1R) regulate normal cell growth and contribute to transformation and growth of malignant cells through activation of downstream signaling pathways. The IGF1 signaling pathway is initiated through activation of its receptor followed by activation of its substrates, including insulin receptor substrate 1 (IRS1). IRS1 is well known as a cytosolic protein involved in signal transduction, but also plays a role in malignant transformation, being highly expressed in many cancers. In mouse fibroblasts, Irs1, through Igf1 signaling, was found to be the key protein for nuclear translocation of ?-catenin and transcription activation of its target genes, such as Myc and cyclin D1. MYC and cyclin D1 may act as oncogenes, contributing to the development of cancers, including hematopoietic neoplasm. Thus, the aims of this study were to investigate the role of nuclear IRS1 in the ?-catenin pathway in LLA. We used in the study ALL cell lines (Jurkat, MOLT-4, Namalwa and Raji) and primary hematopoietic cells from healthy donors (n=13) and from adult patients with ALL (n=45) treated at our Institution. Studies of gene expression (qPCR), protein expression, association (Western blotting and immunoprecipitation) and cell location (subcellular fractionation and confocal microscopy) were used. Jurkat cells were submitted to IGF1 stimulation and/or IGF1R pharmacological inhibition (OSI-906). IRS1, ?-catenin and MYC relative gene expression were significantly elevated in ALL patients compared to normal controls (p<0.05), but there was no difference in gene expression of cyclin D1 and IGF1R between the two groups. A positive correlation between ?-catenin and MYC relative expression (p=0.0004; r=0.50) and between IRS1 and MYC expression (p=0.001; r=0.45) was found. Univariate analysis revealed that increasing age and elevated expression of MYC are factors that adversely affect the overall survival; age was an independent prognostic factor for survival. IRS1 and ?-catenin co-localized in the nucleus and cytoplasm of ALL cell lines (Jurkat, MOLT4, Raji e Namalwa). In primary cell of normal donor, IRS1 and ?-catenin were found predominantly in the cytoplasm. In Jurkat cells, a constitutive IRS1 and ?-catenin protein interaction was observed and IGF1 stimulation increased IRS1 tyrosine phosphorylation. OSI-906 treatment decreased IGF1R tyrosine phosphorylation, nuclear translocation of ?-catenin and MYC protein expression in Jurkat cells. In conclusion, our data support a link between the signaling pathway IGF1R/IRS1 and activation of ?-catenin in acute lymphoblastic leukemia, which may represent an important axis involved in the pathophysiology of the disease.

A enzima L-asparaginase (ASNase) de Escherichia coli é amplamente utilizada para tratar a leucemia linfoblástica aguda (LLA). No entanto, a enzima nativa pode ativar o sistema imune do hospedeiro causando reações alérgicas. A forma peguilada da enzima (PEG-ASNase) não só reduz o efeito imunológico, mas também possui a vantagem de aumentar sua meia-vida plasmática devido à menor degradação por proteases. Não obstante, a conjugação de PEG à ASNase é de forma aleatória e resulta em elevado grau de polidispersão. Nesse trabalho, um protocolo de peguilação N-terminal sítio-específica para a enzima ASNase foi desenvolvido, empregando-se metoxi-polietilenoglicol carboximetil N-hidroxisuccinimidil ester (mPEG-NHS, MW = 10 kDa). Os parâmetros de reação investigados foram a força iônica do tampão, o pH e o tempo de reação para otimizar o rendimento e minimizar a polidispersão. Os resultados confirmaram a ocorrência da reação de peguilação e baixa polidispersão. A força iônica do tampão favoreceu a conjugação N-terminal em 100 mM de tampão fosfato salino (PBS). Também observamos que o aumento do pH e tempo de reação estão diretamente relacionados com o aumento de formas polipeguiladas. O maior rendimento de monoPEG-ASNase, 42%, correspondeu à condição de reação de pH 7,5, tempo de reação de 30 min e razão PEG:enzima de 25:1. A monoPEG-ASNase foi purificada em coluna aniônica forte com gradiente linear de NaCl até 170 mM e a fração monopeguilada foi eluída em NaCl 78 mM com grau de pureza de 70% (rendimento de 55%). A cromatografia de exclusão por tamanho aumentou a pureza da monoPEG-ASNase para 99% (rendimento final de 45%). A monoPEG-ASNase, 190 ± 10 kDa, manteve sua atividade específica por 21 dias à 4ºC, enquanto que a enzima não peguilada (controle), 146 ± 6 kDa, teve uma queda de aproximadamente 52% na atividade específica em 7 dias à 4ºC. Um estudo de cinética enzimática foi realizado e obtivemos valores de kM semelhantes para as formas da enzima nativa e monopeguilada, 20 &#181;M e 35 &#181;M respectivamente. A monoPEG-ASNase apresentou-se mais resistente às proteases plasmáticas asparagina endopeptidase e catepsina B, por 84 h à 37 °C e apresentou ser citotóxica para células leucêmicas (MOLT-4 e Reh). Portanto, a peguilação N-terminal sítio-específica resultou em uma nova variante da ASNase que reteve grande parte de seu poder catalítico e pode ser considerada promissora para o emprego no tratamento da LLA. / The enzyme L-asparaginase (ASNase) from Escherichia coli is widely used to treat acute lymphoblastic leukemia (LLA). However, it can activate the host causing allergic reactions. Hence, the pegylated form of the enzyme (PEG-ASNase) not only reduces the immune effect but also increases plasma half-life. Nonetheless, the available PEG-ASNase is randomly pegylated and, consequently, with high degree of polydispersity. In this work we developed a site-specific N-terminus pegylation protocol for ASNase using methoxy-polyethylene glycol carboxymethyl N-hydroxysuccinimidyl ester (mPEG-NHS, MW = 10 kDa). Reaction parameters investigated were ionic strength, pH and reaction time to optimize yield and minimize polydispersity. Results confirmed pegylation and low polydispersity. Buffer ionic strength favored N-terminal conjugation at 100 mM phosphate buffer saline (PBS). Additionally, pH and reaction time were found to increase polyPEGylated species. The highest yield of monoPEG-ASNase, 42%, corresponded to reaction conditions of pH 7.5, reaction time of 30 min and PEG:ASNase ratio of 25:1. The monoPEG-ASNase was purified in a strong anionic column with NaCl linear gradient up to 170 mM and monoPEG-ASNase was eluted with 78 mM NaCl, 70% pure (55% yield). Size exclusion chromatography was further performed and increased monoPEG-ASNase purity to 99% (45% final yield). The monoPEG-ASNase, 190 ± 10 kDa was stable for 21 days at 4ºC while nonpegylated ASNase (control), 146 ± 6 kDa, lost 52% of its activity within 7 days at 4ºC. Enzyme kinetics were studied and similar kM values were obtained for both native and monoPEG-ASNase, 20 &#181;M and 35 &#181;M respectively. The monoPEG-ASNase demonstrated to be resistant to the plasma proteases asparaginyl endopeptidase and cathepsin B, 84 h at 37 °C and also was cytotoxic to leukemic cells (MOLT-4 and Reh). Therefore, site-specific N-terminus pegylation of ASNase resulted in a novel enzyme variant with preserved catalytic activity and, therefore, promising for the treatment of LLA.

Introdução. A etiologia da leucemia linfocítica aguda (LLA), câncer mais comum na infância, não é completamente conhecida. Objetivo. Examinar a associação de infecções na infância e características maternas com a LLA em crianças residentes no Estado de São Paulo. Métodos. Estudo caso-controle com 241 casos recrutados em oito hospitais do Estado de São Paulo e diagnosticados com LLA de janeiro de 2003 a fevereiro de 2009. Os 598 controles foram selecionados na base de Declarações de Nascidos Vivos da Fundação Sistema Estadual de Análise de Dados. Entrevistas com a mãe ou responsável pela criança foram realizadas no hospital para os casos e no domicílio para os controles utilizando-se questionário semelhante. A análise dos dados foi conduzida com três grupos distintos: Grupo 1 - todos os subtipos de LLA, entrevistas com as mães ou outros responsáveis pelas crianças; Grupo 2 - todos os subtipos de LLA, entrevistas com as mães; Grupo 3 - LLA de precursores B, entrevistas com as mães. Para estimar o risco de LLA associado com as variáveis relacionadas a infecções e características maternas odds ratios (OR) e intervalos com 95 por cento de confiança (IC 95 por cento ) foram calculados por meio de análise de regressão logística multivariada não condicional. Três modelos de regressão logística foram conduzidos: a) com ajuste por sexo e idade da criança; b) com ajuste por sexo, idade da criança e escolaridade materna; c) com ajuste por todas potenciais variáveis de confusão via stepwise forward selection. Resultados. Os resultados correspondentes ao Grupo 3 e Modelo 3 de análise revelaram proteção para LLA em crianças com histórico de episódios de gripe (categoria frequentemente versus não OR = 0,27; IC 95 por cento 0,15-0,48), episódios de dor no ouvido (categoria raramente versus não OR = 0,48; IC 95 por cento 0,25-0,90), frequência à creche (categoria mais de 24 meses versus nunca OR = 0,37; IC 95 por cento 0,17-0,77), e contato com cães no primeiro ano de vida (categoria sim versus não OR = 0,76; IC 95 por cento 0,45-1,27). Foi observado tênue aumento do risco de LLA em crianças com mães que referiram consumo de álcool no passado (OR = 1,29; IC 95 por cento 0,62-2,68) e ainda bebe (OR = 1,53; IC 95 por cento 0,97-2,41) em comparação àquelas cujas mães referiram nunca ter consumido álcool. Baixo nível educacional das mães foi associado com aumento do risco de LLA em crianças (categoria 0 a 4 anos versus 12 e mais OR = 2,71; IC 95 por cento 1,26-5,81). Conclusões. Os resultados mostraram que exposição a infecções na infância, frequência à creche e contato com cães no primeiro ano de vida exercem papel protetor para LLA, por outro lado, o consumo de álcool e o baixo nível educacional das mães aumentaram o risco de LLA em crianças / Introduction. The etiology of acute lymphoblastic leukemia (ALL), the most common cancer in childhood, is not completely known. Objective. To examine the association of childhood infections and mother characteristics with ALL in children living in São Paulo. Methods. Case-control study with 241 cases recruited in eight hospitals in the state of São Paulo and diagnosed with ALL from January 2003 to February 2009. The 598 controls were selected from the São Paulo Birth Registry. Interviews with the mother or guardian were conducted in the hospital for cases and at home for controls through a similar questionnaire. Data analysis was performed in three distinct groups: Group 1 - all subtypes of ALL, interviews conducted with the mother or other childs guardian; Group 2 - all subtypes of ALL, interviews conducted with the mother; Group 3 - precursor B ALL, interviews conducted with the mother. In order to estimate the risk of ALL associated with variables related to infections and mother characteristics odds ratios (OR) and 95 per cent confidence interval (95 per cent CI) were calculated by unconditional multivariate logistic regression. Three logistic regression models were conducted: a) with adjustment for sex and age of child; b) with adjustment for sex, age of child and maternal education; c) adjusted for all potential confounders through stepwise forward selection. Results. The results corresponding to Group 3 and Model 3 revealed protection for ALL in children with episodes of influenza (category often versus no OR = 0.27; 95 per cent CI 0.15-0.48), episodes of earache (category rarely versus no OR = 0.48; 95 per cent CI 0.25-0.90), daycare attendance (category over 24 months versus never OR = 0.37; 95 per cent CI 0.17-0.77), and contact with dogs in the first year of life (category yes versus no OR = 0.76; 95 per cent CI 0,45-1.27). Slight increase was observed in the risk of ALL in children with mothers who reported alcohol consumption in the past (OR = 1.29; 95 per cent CI 0.62-2.68) and still drink (OR = 1.53; 95 per cent CI 0.97-2.41) compared to those whose mothers reported never having consumed alcohol. Low educational level of the mothers was associated with increased risk of ALL in children (category 0-4 years versus 12 and over OR = 2.71; 95 per cent CI 1.26-5.81). Conclusions. The results provided evidences that exposure to infections in the childhood, daycare attendance and contact with dogs in the first year of life have a protective role in ALL, on the other hand, alcohol consumption and low education level of mothers increase the risk of ALL in children

Este estudo randomizado, duplo-cego e controlado com placebo avaliou a eficácia do laser de baixa intensidade, infravermelho, na prevenção e tratamento da mucosite em pacientes pediátricos portadores de leucemia linfoblástica aguda (LLA) em uso do agente quimioterápico metotrexato em altas doses (MTX >1g/m2). Os pacientes foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: o grupo teste em que os pacientes receberam aplicação de laser profilático e o grupo controle com laser placebo. Os dois grupos receberam aplicação de laser nos dias D1, D2, D3. Realizada esta fase, os pacientes que desenvolveram mucosite oral tiveram acesso ao tratamento e aqueles que apresentaram mucosa normal foram orientados a retornar à consulta no 8º dia. Concomitante, foi solicitado exame hematológico prévio ao tratamento e no dia D8. Foi também mensurado o nível sérico do MTX 42 horas após a infusão da quimioterapia. Os resultados hematológicos prévios se mostraram satisfatórios e alguns apresentaram alterações no dia D8. No nosso estudo não foi possível comprovar se o nível sérico do MTX tem relação com toxicidade oral. A mucosite foi avaliada segundo a escala WHO e a avaliação da dor pré e pós-tratamento pelas escalas VAS, de faces e comportamental. Mucosite foi observada em 6 pacientes, 4 tratados com laser placebo e 2 tratados com laser profilático. Esta diferença não foi estatisticamente significante (P > 0.5). Os 6 pacientes desenvolveram grau 2 de mucosite oral. Média de laserterapia foi de 5.8 dias. Com relação à sintomatologia dolorosa 2 pacientes não apresentaram dor, 1 paciente apresentou dor moderada, nos outros a sintomatologia foi leve. Os resultados deste estudo demonstraram que o laser 780nm não foi eficaz na prevenção da mucosite oral mas constatamos o potencial efeito do laser terapêutico no controle da mucosite oral e da dor em pacientes pediátricos portadores LLA. / This randomized, double-blind, placebo-controlled study evaluated the efficacy of low intensity laser in the prevention and treatment of oral mucositis in pediatric patients with acute lymphoblastic leukemia undergoing chemotherapy with highdose methotrexate (MTX>1g/m2). The patients were divided into two groups: the test group, the patients who received prophylactic low-intensity laser, and the control group who received laser without radiation (sham laser). Nor the clinician neither the patients knew which type of laser was being used until the end of the trial. The patients of each group received laser application in the days D1, D2, D3. After that, the patients who developed oral mucositis were treated with low-intensity laser and those without oral mucositis were instructed to return on day 8 for clinical reevaluation. Concomitantly, patients were screening for previous hematological examination and in the day D8. The plasma level of MTX was measured at 42 hours starting the infusion. Hematological analyses revealed no abnormality and other with alterations. In this present study, there was no correlation between the plasma level MTX and oral toxicity. Mucositis was evaluated by the WHO scale and pain was measured by VAS, face scales and behavioral. Six patients developed oral mucositis and had grade 2 by WHO scale. There was no significant difference between laser group and the control group (P > 0.5). Average time of therapeutic laser was 5.8 days. Laser applications reduced oral pain. Low-intensity laser 780 nm wavelength showed no efficient method in the prevention of oral mucositis but produced some benefits in the control of the oral mucositis and pain in pediatric patients of LLA after chemotherapy.

A leucemia linfóide aguda (LLA) é caracterizada pelo acúmulo de células imaturas da linhagem linfóide, na medula óssea, sangue periférico e órgãos linfóides, sendo seu pico de incidência por volta dos cinco anos de idade. O prognóstico da LLA é determinado pela idade, imunofenótipo e alterações moleculares sendo que estas últimas são de fundamental importância para a estratificação em grupos de risco. Nesse estudo, realizamos uma análise retrospectiva das características imunofenotípicas e moleculares, de 35 casos de LLA pediátrica, tratados em duas grandes Instituições da cidade de Porto Alegre. Os pacientes foram classificados de acordo com critérios morfológicos, citoquímicos e imunofenotípicos. Em relação ao imunofenótipo, 8,8% dos pacientes foram classificados como LLA pró-B, 67,6% LLAB (B-comum e pré-B) e 23,5% LLA-T. O imunofenótipo Pré-B CD10+ foi o mais comum. A freqüência dos principais genes de fusão de significância prognóstica, realizada por RT-PCR foi de 15% para a t(12;21)/TEL-AML1 (19% entre as LLA de linhagem B); 4% t(4;11)/MLL-AF4, 4% t(1;19)/E2A-PBX1 e 4% t(9;22)/BCR-ABL. Nossos resultados mostram a importância do estudo molecular e sugerem que crianças com LLA tratadas nas Instituições referidas, apresentam as mesmas características biológicas de outras regiões do Brasil e de países desenvolvidos, suportando o uso de protocolos de regimes terapêuticos similares. Assim, o aumento do número de pacientes de alto risco com LLA na infância, parece não estar relacionado a um excesso de anormalidades genéticas desfavoráveis, e sim uma consequência do diagnóstico tardio, como sugerido pelo excesso de casos de hiperleucocitose. Embora a LLA pediátrica apresente um elevado índice de cura, o desafio atual é a busca de melhores testes diagnósticos e novas estratégias terapêuticas, através do conhecimento de genes alvos, permitindo o tratamento individualizado e uma maior sobrevida para o paciente. / The acute lymphoblastic leukemia (ALL) is characterized by the accumulation of immature cells of lymphoid lineage in the bone marrow, in the peripheral blood and lymphoid organs, with peak incidence around the age of five. The prognosis of ALL is determined by age, immunophenotype and molecular changes of which the latter have fundamental importance for determining the stratification in risk groups. In this study, we have conducted a retrospective analysis of immunophenotypic and molecular characteristics of 35 cases of pediatric ALL, treated at two major institutions of Porto Alegre city. Patients were classified according to morphological, cytochemical and immunophenotypical. Regarding the immunophenotype, 8.8% of patients were classified as pro-B ALL, 67.6% B-ALL (common B-and pre-B) and 23.5% T-ALL. The Pre-B immunophenotype CD10 + was the most common. The frequency of major fusion genes of prognostic significance performed by RT-PCR was 15% for a t(12;21)/TEL-AML1 (19% between the B-lineage ALL), 4% t (4;11)/MLL-AF4, 4% t(1;19)/E2A-PBX1 and 4% t(9;22)/ BCR-ABL. Our results show the importance of the molecular study and suggest that children with ALL that have been treated in those institutions have the same biological characteristics of the ones from other regions of Brazil and developed countries, what supports the use of similar therapeutic protocols. Thus, the increased number of high-risk patients with childhood ALL appears to be related to an excess of adverse genetic abnormalities, but as consequence of late diagnosis, as suggested by the excess of cases of hyperleucocytosis. Although pediatric ALL has a high cure rate, the current challenge is the search for better diagnostic tests and new therapeutic strategies through the knowledge of target genes enabling the individualized treatment and increased chances for patients to survive.

Introdução: o tratamento para leucemia aumentou a sobrevida de pacientes com leucemia aguda linfóide (LLA), mas a redução da força, a fadiga crônica e a qualidade de vida ainda são fatores de preocupação nessa população. Objetivo: comparar força isocinética em pacientes com LLA versus controles saudáveis. Além disso, investigar os efeitos de um programa de treinamento de força de alta intensidade combinado com exercício aeróbio de moderada intensidade em pacientes com LLA. Método: No intuito de responder aos objetivos distintos dessa dissertação, dois estudos sequênciais foram realizados. O primeiro deles trata-se de uma investigação transversal da força isocinética em pacientes com LLA versus controles saudáveis. Já o segundo teve como foco testar um programa de treinamento físico composto por exercícios intensos de força e aeróbios moderados por meio de um desenho prospectivo e longitudinal. No estudo 1, foram recrutados dez pacientes (grupo LLA) durante a fase de manutenção do tratamento de alto risco de LLA. Um grupo de dez crianças saudáveis, pareadas por idade, gênero, estatura e IMC foram selecionadas para o grupo controle (grupo CTRL). Para avaliar a força isocinética de membros inferiores e superiores, foram mensuradas a flexão e extensão concêntrica de joelho e cotovelo utilizando-se um dinamômetro isocinético. No estudo 2, os pacientes foram submetidos a 12 semanas de programa de treinamento intra-hospitalar envolvendo exercício de força de alta intensidade e exercício aeróbio a 70% do VO2 pico. Inicialmente e após 12 semanas, foram avaliados força submáxima (10 repetições máximas), qualidade de vida e os possíveis efeitos adversos. Resultados: No estudo 1, as crianças com LLA apresentaram menor torque máximo de extensão de joelho direito (-29,08%) e esquerdo (-30,8%), menor trabalho total de extensão de joelho direito (- 25,1%) e esquerdo (-23,9%), menor torque máximo normalizado de joelho direito (-24,3%) e esquerdo (-21,1%) e menor trabalho total de extensão de cotovelo (-9,5 e -9,4% para os membros direito e esquerdo, respectivamente) quando comparadas as crianças saudáveis. Além disso, o tempo de torque máximo de flexão concêntrica de joelho e cotovelo foi significantemente maior para o grupo LLA quando comparado ao grupo CTRL. No estudo 2, foi observada melhora significativa na força submáxima no supino (71%), puxada frontal (50%), leg press (73%), extensão do joelho (64%) como resultado do treinamento (p<0,01). Na avaliação dos pais sobre a qualidade de vida das crianças revelou melhora na fadiga e qualidade de vida, porém na autoavaliação das crianças, a qualidade de vida permaneceu inalterada. Não ocorreu nenhum efeito adverso. Conclusão: Crianças em manutenção do tratamento de LLA apresentam diminuição nas medidas de força isocinética quando comparadas às crianças saudáveis. Além disso, demonstramos que um programa de treinamento físico, composto por exercícios de força de alta intensidade e aeróbio de moderada intensidade, foi seguro e eficaz em melhorar a força em pacientes com LLA na fase de manutenção do tratamento. Interessantemente, a qualidade de vida dos pacientes foi melhor após a intervenção, somente na avaliação dos pais / Introduction: the treatment for acute lymphoblastic leukemia (ALL) has increased the survival rate, but reduced strength, chronic fatigue and quality of life are still concerns in this population. Objective: to compare isokinetic strength in patients with ALL versus healthy controls. Additionally, to examine the effects of an exercise program combining high-intensity resistance exercises and moderate-intensity aerobic exercises in patients who are undergoing treatment for ALL. Methods: In order to achieve the aforementioned objectives, two studies were performed. The first study is a cross-sectional study aimed to assess isokinetic muscle strenght in ALL patients versus healthy controls. The second study aimed to examine the effects of na exercise training program comprising high-intensity resistance exercises and moderate-intensity aerobic exercise by using a prospective longitudinal design. In study 1, ten patients with ALL (ALL group) during the maintenance therapy against high-risk were recruited. A group of ten age-, gender-, and BMI-matched healthy children were recruited by advertisement and served as a control (CTRL).To assess lower- and upper-limb isokinetic strength, we assessed concentric knee and elbow flexion and extension strength by using a isokinetic dynamometer. In the study 2, the patients (n = 6; 5-16 years of age) were submitted to a 12-week intra-hospital training program involving high-intensity strength exercises and aerobic exercise at 70% of the VO2 peak. At baseline and after 12 weeks, we assessed submaximal strength (10 repetition-maximum), quality of life and possible adverse. Results: In the study 1, patients with acute lymphoblastic leukemia presented lower knee extension peak torque (-29.8 and -30.8%, for the right and left limbs, respectively), knee extension total work (-25.1% and -23.9 for the right and left limbs, respectively), normalized knee peak torque (-24.3% and -21.1% for the right and left limbs, respectively), and elbow extensor total work (-9.5 and -9.4% for the right and left limbs, respectively) than controls. Additionally, concentric knee and elbow flexion time-to-peak torque was significantly higher for the patients with acute lymphoblastic leukemia group when compared to controls. In the study 2, a significant improvement was observed in the submaximal strength for bench press (71%), lat pull down (50%), leg press (73%) and leg extension (64%) as a result of the training (p n - reported quality of life was not changed. No adverse effects occurred. Conclusions: We demonstrated that patients receiving maintenance treatment against ALL present lower isokinetic strength when compared with their healthy counterparts. We demonstrate that a 12-week in-hospital training program that includes high-intensity resistance exercises and moderate-intensity aerobic exercise promotes marked strength improvements in patients during the maintenance phase of the treatment for ALL without side-effects. Interestingly, the parents\' evaluations of their children revealed an improvement in the quality of life

Objetivo: Avaliar as características clínicas e laboratoriais para diferenciar leucemia linfoblástica aguda (LLA) da artrite idiopática juvenil forma sistêmica (AIJs) no início da doença. Métodos: Cinquenta e sete pacientes com LLA com envolvimento musculoesquelético, sem blastos no sangue periférico e sem terapia com glucocorticoide no início da doença e 102 pacientes com AIJs (critérios ILAR) foram retrospectivamente avaliados. Foram estudadas as seguintes características: febre, exantema reumatoide, artrite, dor em membros, hepatomegalia, esplenomegalia, pericardite, miocardite, pleurite, perda de peso, sangramento, anemia, leucopenia, neutropenia, plaquetopenia, níveis séricos elevados de velocidade de hemossedimentação (VHS) e de desidrogenase lática (DHL). Resultados: A mediana da idade de início da doença foi significativamente maior em pacientes com LLA comparada com AIJs (5,8 vs. 3,8 anos, p=0,0006). As frequências de dor em membros, hepatomegalia, perda de peso e manifestações hemorrágicas foram significativamente maiores em LLA versus AIJs (70% vs. 1%, p<0,0001; 54% vs. 32%, p=0,0075; 30% vs. 8%, p=0,0005; 98% vs. 0%, p=0,0053; respectivamente). Igualmente, as frequências de anemia, leucopenia, neutropenia, plaquetopenia e DHL elevado foram significativamente maiores em LLA versus AIJs (88% vs. 57%, p<0,0001; 39% vs. 1%, p<0,0001; 60% vs. 1%, p<0,0001; 77% vs. 1%, p<0,0001; 56% vs. 14%, p<0,0001; respectivamente). Consideravelmente, a análise multivariada mostrou que dor em membros (OR=553; 95% IC=46,48-6580,42; p<0,0001) e plaquetopenia (OR=754,13; 95% IC=64,57-8806,72; p<0,0001) permaneceram como variáveis independentes que diferenciaram pacientes com LLA de pacientes com AIJs. O R2 de Nagelkerke foi de 0,91. A curva de sobrevida de Kaplan-Meier foi similar em pacientes com LLA com e sem dor em membros (p=0,8347). Conclusão: O presente estudo enfatiza a importância de investigar pacientes com LLA que apresentam manifestações musculoesqueléticas, particularmente dor em membros com plaquetopenia / Objective: To assess clinical and laboratorial features which differentiate acute lymphoblastic leukemia (ALL) from systemic onset juvenile idiopathic arthritis (SoJIA) at disease onset. Methods: Fifty seven ALL patients with musculoskeletal involvement, without blasts on peripheral blood and glucocorticoid therapy at onset of disease and 102 SoJIA patients (ILAR criteria) were retrospectively evaluated. The following features were studied: fever, rheumatoid rash, arthritis, limb pain, hepatomegaly, splenomegaly, pericarditis, myocarditis, pleuritis, weight loss, bleeding, anemia, leukopenia, neutropenia, thrombocytopenia, high erythrocyte sedimentation rate and high lactic dehydrogenase (LDH) levels. Results: The median age at disease onset was significantly higher in ALL compared to SoJIA patients (5.8 vs. 3.8years, p=0.0006). The frequencies of limb pain, hepatomegaly, weight loss and hemorrhagic manifestations were significantly higher in ALL versus SoJIA patients (70% vs. 1%, p<0.0001; 54% vs. 32%, p=0.0075; 30% vs. 8%, p=0.0005; 98% vs. 0%, p=0.0053; respectively). Likewise, the frequencies of anemia, leukopenia, neutropenia, thrombocytopenia and high LDH levels were significantly higher in ALL versus SoJIA patients (88% vs. 57%, p<0.0001; 39% vs. 1%, p<0.0001; 60% vs. 1%, p<0.0001; 77% vs. 1%, p<0.0001; 56% vs. 14%, p<0.0001; respectively). Remarkably, multivariate analysis showed that limb pain (OR=553; 95% CI=46.48-6580.42; p<0.0001) and thrombocytopenia (OR=754.13; 95% CI=64.57-8806.72; p<0.0001) remained as independent variables that differentiate ALL from SoJIA patients. The R2 of Nagelkerke was 0.91. The Kaplan-Meier survival curves were similar in ALL patients with and without limb pain (p=0.8347). Conclusion: The present study emphasizes the importance to investigate ALL patients who have musculoskeletal manifestations, particularly limb pain associated with thrombocytopenia

A leucemia linfóide aguda (LLA) é considerada uma doença grave dos glóbulos brancos, sendo mais comum e mais agressiva em crianças e adolescentes. O tratamento para a LLA tem avançado devido aos estudos para a otimização de drogas já utilizadas em quimioterapias. Entre essas drogas estão as enzimas L- asparaginases (ASPases) que atuam reduzindo a concentração de L-asparagina (Asn) na corrente sanguínea, impedindo a proliferação das células cancerosas, visto que essas não conseguem sintetizar quantidades apropriadas desse aminoácido. No entanto, o medicamento por ser oriundo de um procarioto causa severas reações alérgicas aos usuário, afim de diminuir a imunogenicidade deste quimioterápico, é importante gerar um biofármaco oriundo de um eucarioto. Neste âmbito, obtivemos a Pichia pastoris recombinante responsável pela produção da enzima ASPase intermembranar, oriunda do gene ASP3 de Saccharomyces cerevisiae. Através do planejamento experimental, foi possível ter um aumento de 5 vezes na atividade obtida na condição inicial. O clone Mut+ alcançou sua melhor atividade de 8,6 U/g de célula nas seguintes condições: 20°C, pH inicial 6 e 1,5% de concentração de indutor. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is considered a serious disease of white blood cells, is more common and more aggressive in children and adolescents. Treatment for ALL has advanced due to studies for drug optimization already used in chemotherapy. Among these drugs are the enzymes L-asparaginases (ASPases) which act by reducing the concentration of L-asparagine (Asn) in the bloodstream, preventing the proliferation of cancer cells, since these can not synthesize appropriate amounts of this amino acid. However, the drug to be derived from a prokaryote causes severe allergic reactions to the user, in order to decrease the immunogenicity of the chemotherapy, it is important to generate a biopharmaceutical derived from a eukaryote. In this context, we obtained the recombinant Pichia pastoris responsible for producing the enzyme ASPase intermembrane, coming from the ASP3 gene of Saccharomyces cerevisiae. Through the experimental design, it was possible to have a 5-fold increase in activity obtained at the initial condition. The Mut + clone achieved their best activity of 8.6 U/g cell under the following conditions: 20 °C, initial pH 6 and 1.5% of inducer concentration.

A L- asparaginase é uma enzima aplicada no tratamento de Leucemia Linfoide Aguda, que atua na hidrólise da L- asparagina, privando a célula tumoral de um aminoácido essencial para o seu crescimento. A L- asparaginase, como outros biofármacos, deve ser estável, manter sua atividade específica e formar poucos agregados. A fim de manter a integridade do biofármaco, são utilizados adjuvantes nas formulações farmacêuticas, e dentre os mais importantes estão os osmólitos. Essas moléculas protegem a estrutura nativa da proteína, sendo capazes de interferir na formação de agregados e garantir a estabilidade proteica. O presente trabalho teve o objetivo de estudar o efeito dos osmólitos sacarose, sorbitol, arginina e glicina na atividade específica, estabilidade, cinética e caracterização de agregados na solução de L- asparaginase II de Erwinia chrysanthemi. Os resultados mostraram que a maioria dos osmólitos testados aumentou a atividade específica e a estabilidade da enzima, o que pode estar relacionado com o aumento da velocidade máxima e do kcat observados no ensaio cinético realizado com sacarose e sorbitol. Um perfil diferente de agregados foi encontrado para cada tipo de osmólito. A presença de sacarose ou sorbitol resultou na menor quantidade de agregados na faixa de, respectivamente, 100 a 200 e 200 a 300 nm em relação a enzima sem osmólito. Por outro lado, aumento no número total de agregados e presença de moléculas de alto peso molecular (300 a 500 nm) foram observados nas soluções enzimáticas contendo, respectivamente, glicina e arginina. Dessa forma, os resultados obtidos neste trabalho poderão auxiliar na produção e escolha da formulação de biofármacos, e, consequentemente, melhorar o tratamento medicamentoso de pacientes. / L L-Asparaginase is an enzyme applied in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia, which acts on the hydrolysis of L- asparagine, depriving the tumor cell of an essential amino acid for its growth. L-asparaginase, as other biopharmaceuticals, must be stable, maintain its specific activity and form few aggregates. In order to maintain the integrity of the biopharmaceutical, adjuvants are used in the pharmaceutical formulations, and among the most importants adjuvants are the osmolytes. These molecules protect the native structure of the protein, being able of interfering in the formation of aggregates and guarantee protein stability. The present work had the objective of studying the effect of the osmolytes sucrose, sorbitol, arginine and glycine in the specific activity, stability, kinetic and aggregates characterization, in L- asparaginase II solution of Erwinia chrysanthemi. The results showed that the majority of the tested osmolytes increased the specific activity of the enzyme and its stability, which may be related to the augment of maximum velocity and kcat observed in the kinetic assay performed with sucrose and sorbitol. A different profile of aggregates was found for each type of osmolyte. The presence of sucrose or sorbitol resulted in the least amount of aggregates in the range of, respectively, 100-200 and 200-300nm in relation to the enzyme without osmolyte. On the other hand, increase in the total number of aggregates and the presence of high molecular weight molecules (300 to 500 nm) were observed in the enzymatic solutions containing, respectively, glycine and arginine. Thus, the results obtained in this work may help in the production and choice of the formulation of biopharmaceuticals and, consequently, improve the drug treatment of patients.