As poliaminas são essenciais para o controle dos mecanismos celulares nos seres vivos. A Migalina é uma acilpoliamina isolada de A. gomesiana com atividade microbicida contra E. coli, contudo, seu efeito imunomodulador é desconhecido. Sabendo que os mediadores imunes produzidos por macrófagos são críticos para a regulação da resposta imune, investigamos o efeito in vitro da Migalina sobre estas células. Demonstramos que a Migalina não induziu citotoxicidade, mas ativou iNOS, potencializando a síntese de nitrito. Aumentou a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">a, mas não de IL-12p40. IL-1<font face=\"Symbol\">b não foi detectada. Além disto, Inibiu a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">a e IL-12p40 induzida por LPS e quando associada à Polimixina B não alterou a síntese de TNF-<font face=\"Symbol\">a. Macrófagos deficientes de MyD88 não produziram TNF-<font face=\"Symbol\">a em resposta a Migalina, sugerindo que a sinalização mediada por TLR via MyD88 é requerida para a produção desta citocina. Comprovamos que a Migalina modula a atividade de macrófagos através de mediadores da resposta imune inata e pode ser explorada como estratégia no controle de infecções. / Polyamines are present in most living organisms. Mygalin is an acylpolyamine isolated from A. gomesiana that showed microbicide activity against E. coli, however, its immunomodulator effect has not been explored. Immune mediators produced by macrophages are essential for the regulation of immune responses. Our results showed that murine macrophages stimulated in vitro with Mygalin didnt induce cytotoxicity, but activated iNOS, inducing nitrite synthesis. The production of TNF-<font face=\"Symbol\">a was enhanced, but IL-12p40 was not. The presence of IL-1<font face=\"Symbol\">b was not detected. In higher concentrations, Mygalin inhibited significantly the production of IL-12p40 and TNF-<font face=\"Symbol\">a induced by LPS, and its association with Polymixine B did not altered the production profile of TNF-<font face=\"Symbol\">a. Macrophages deficient in MyD88 molecule activated with Mygalin did not induce the synthesis of TNF-<font face=\"Symbol\">a. Our results showed that Mygalin is capable of modulating the macrophage activity by inducing mediators of innate immune response and can be explored as a strategy in the studies to control pathogen infections.

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:06:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 haroldo_junior_ioc_dout_2015.pdf: 2633312 bytes, checksum: 02a75ad07873abdb519b939eb64b351c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus da Hepatite A (HAV) é o principal agente etiológico das hepatites virais agudas e estima-se que ocasione 1,5 milhão de novas infecções no mundo anualmente. Apesar da eficácia apresentada pelas vacinas comerciais, a replicação do HAV em cultura de células é lenta e apresenta baixo rendimento, o que torna a sua produção difícil e dispendiosa. Nesse contexto, o uso de proteínas recombinantes do HAV pode representar uma alternativa ao modelo de vacina existente. O presente trabalho teve como objetivo expressar e avaliar a imunogenicidade das partículas virais destituídas de ácido nucleico (VLPs) e da proteína VP1 do HAV. As VLPs foram geradas a partir do sistema baculovírus/células de inseto através da infecção de células de inseto com baculovírus recombinantes contendo as regiões P1-2A e P3 do genoma do HAV. A poliproteína P1-2A foi expressa, clivada e se organizou em estruturas que continham epitopos conformacionais de neutralização. Partículas com características similares ao HAV foram identificadas por microscopia eletrônica, sugerindo que as proteínas expressas se montaram em VLPs. Em paralelo, a VP1 foi expressa nos sistemas baculovírus/células de inseto e Escherichia coli Níveis mais elevados de expressão foram obtidos em E. coli, o que consequentemente aumentou a taxa de recuperação da proteína purificada. A VP1 derivada de E. coli foi utilizada nos ensaios de antigenicidade e mostrou reatividade frente aos soros de pacientes infectados pelo HAV, o que demonstra seu potencial como um marcador para diagnóstico. Para os estudos de imunogenicidade, a VP1 derivada de E. coli foi combinada a dois adjuvantes, o hidróxido de alumínio (A1(OH)3) e o adjuvante a base de saponina. A formulação VP1+A1(OH)3 induziu polarização da resposta Th2, enquanto que a formulação VP1r+saponina gerou um balanço maior entre as respostas Th1 e Th2. O adjuvante saponina permitiu a administração de uma dose menor da VP1 sem afetar a intensidade da resposta. Resultados preliminares sugerem que os anticorpos anti-VP1 induzidos pela formulação com saponina apresentaram reatividade cruzada com o HAV. Além disso, testes iniciais indicam que os camundongos imunizados com a VP1 em associação com ambos os adjuvantes apresentaram resposta anamnéstica contra o HAV. Os resultados aqui apresentados sugerem que a VP1 e as VLPs podem ser úteis para o desenvolvimento de uma nova vacina contra a Hepatite A / The hepatitis A virus (HAV) is the primary etiological agent of acute viral hepatitis and it is estimated to cause 1.5 million of new infections each year worldwide. Despite the effectiveness of commercial vaccines, the replication of HAV in cell culture is slow and has low yield, which makes it difficult and expensive to manufacture. In this context, the use of recombinant HAV proteins could represent an alternative model to the existing vaccines. This study aimed to express and evaluate the immunogenicity of virus-like-particles (VLPs) and VP1 protein of HAV. The VLPs were generated using the baculovirus/insect cell expression system by the infection of insect cells with recombinant baculovirus containing HAV P1-2A and P3 regions. The P1-2A polyprotein was successfully expressed, cleaved and organized into structures that contained neutralizing conformational epitopes. HAV-like particles were identified by electron microscopy, suggesting that the expressed proteins were assembled into VLPs. In parallel, VP1 was expressed in both baculovirus/insect cell and Escherichia coli expression systems. Higher protein levels were obtained in E. coli, which consequently increased the recovery rate after protein purification. The E. coli-derived VP1 was then used in antigenicity assays and showed reactivity against sera from patients infected with HAV, demonstrating its potential as a diagnostic marker. For immunogenicity studies, the E. coliderived VP1 was combined with two adjuvants, aluminum hydroxide (Al(OH)3) and the saponin-based adjuvant. The VP1+Al(OH)3 induced Th2 polarization, while VP1+saponin generated a Th1 and Th2 balanced immune response. Saponin-based adjuvant formulations allowed the administration of lower dose of VP1 without affecting the intensity of the response. Preliminary results suggest that the anti-VP1 antibodies induced by saponin-based adjuvant showed cross-reactivity with HAV. Furthermore, initial tests indicate that immunization of mice with VP1 in association with both adjuvants generated anamnestic response against HAV. The results presented here suggest that VP1 and VLPs might be useful to develop a new vaccine against hepatitis A. / 2016-07-10

As poliaminas são essenciais para o controle dos mecanismos celulares nos seres vivos. A Migalina é uma acilpoliamina isolada de A. gomesiana com atividade microbicida contra E. coli, contudo, seu efeito imunomodulador é desconhecido. Sabendo que os mediadores imunes produzidos por macrófagos são críticos para a regulação da resposta imune, investigamos o efeito in vitro da Migalina sobre estas células. Demonstramos que a Migalina não induziu citotoxicidade, mas ativou iNOS, potencializando a síntese de nitrito. Aumentou a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">a, mas não de IL-12p40. IL-1<font face=\"Symbol\">b não foi detectada. Além disto, Inibiu a produção de TNF-<font face=\"Symbol\">a e IL-12p40 induzida por LPS e quando associada à Polimixina B não alterou a síntese de TNF-<font face=\"Symbol\">a. Macrófagos deficientes de MyD88 não produziram TNF-<font face=\"Symbol\">a em resposta a Migalina, sugerindo que a sinalização mediada por TLR via MyD88 é requerida para a produção desta citocina. Comprovamos que a Migalina modula a atividade de macrófagos através de mediadores da resposta imune inata e pode ser explorada como estratégia no controle de infecções. / Polyamines are present in most living organisms. Mygalin is an acylpolyamine isolated from A. gomesiana that showed microbicide activity against E. coli, however, its immunomodulator effect has not been explored. Immune mediators produced by macrophages are essential for the regulation of immune responses. Our results showed that murine macrophages stimulated in vitro with Mygalin didnt induce cytotoxicity, but activated iNOS, inducing nitrite synthesis. The production of TNF-<font face=\"Symbol\">a was enhanced, but IL-12p40 was not. The presence of IL-1<font face=\"Symbol\">b was not detected. In higher concentrations, Mygalin inhibited significantly the production of IL-12p40 and TNF-<font face=\"Symbol\">a induced by LPS, and its association with Polymixine B did not altered the production profile of TNF-<font face=\"Symbol\">a. Macrophages deficient in MyD88 molecule activated with Mygalin did not induce the synthesis of TNF-<font face=\"Symbol\">a. Our results showed that Mygalin is capable of modulating the macrophage activity by inducing mediators of innate immune response and can be explored as a strategy in the studies to control pathogen infections.

As vacinas pertussis celulares apresentam certa reatogenicidade e as acelulares, menos reatogênicas, têm seu uso restrito, devido a seu alto custo. O Instituto Butantan desenvolveu uma vacina pertussis celular (Plow), com baixo teor de lipopolissacarídeo e outra acelular (Pa), por metodologia simples e econômica. Essas preparações, combinadas aos toxóides diftérico e tetânico (DTPlow e DTPa, respectivamente), foram comparadas à DTP tradicional, com diferentes adjuvantes: vitamina A, surfactante pulmonar, BCG, monofosforil lipídeo A (MPL) e Al(OH)3. A resposta humoral em camundongos foi semelhante para as diferentes formulações e independente do adjuvante utilizado. As vacinas induziram níveis equilibrados de IgG1/IgG2a anti-pertussis e a DTPlow mostrou-se menos reatogênica, induzindo níveis significativamente menores de IL-6 sérica. A adição de MPL sugeriu tendência de proteção contra a colonização nasotraqueal no grupo imunizado com DTPa e levou à indução de IFN-g nos grupos imunizados com DTP e DTPa, sugerindo possível atividade imunomodulatória para Th1. / The whole cell pertussis vaccines present some reactogenicity and the acellular, less reactogenic, have prohibitive use due to its high cost. Instituto Butantan developed a less reactogenic whole cell pertussis vaccine (Plow), with low lipopolysaccharide content and an acellular vaccine (Pa), by simple and economic methodology. These preparations, combined to diphtheria and tetanus toxoids (DTPlow and DTPa, respectively), were compared with the traditional DTP, with different adjuvants: vitamin A, pulmonary surfactant, BCG, monophosphoryl lipid A (MPL) and Al(OH)3. The humoral immune response induced in mice by the different vaccine formulations, was similar and independent of the adjuvant used. The vaccines induced balanced levels of IgG1/IgG2a anti-pertussis and DTPlow showed to be less rectogenic, inducing lower levels of serum IL-6. The use of MPL suggested to induce higher protection against nasotracheal colonization in DTPa group and induced IFN-g in the DTP and DTPa groups, suggesting a possible immunemodulatory activity for Th1.

Esporos de Bacillus subtilis podem ser utilizados como veículos vacinais capazes de expressar ou adsorver proteínas heterólogas em sua superfície. Estudos recentes indicaram que esporos de B. subtilis também conferem um forte efeito adjuvante para vacinas baseadas em proteínas purificadas administradas por via parenteral. Nesse cenário, o objetivo do presente projeto foi avaliar o papel adjuvante dos esporos de B. subtilis e viabilizar sua utilização como carregadores de vacinas de DNA pelo método da biobalística (gene gun). Nesta metodologia, os esporos foram utilizados como substitutos das micropartículas de ouro usualmente empregadas, mantendo a capacidade de transfecção de células eucarióticas in vitro, e produção de anticorpos específicos em camundongos C57BL/6 imunizados com o plasmídeo vacinal pgDE7h (que codifica para uma forma atóxica da oncoproteína E7 do HPV-16). Além disso, esporos de B. subtilis foram capazes de ativar células dendríticas in vitro e, quando coadministrados a pgDE7h pela via intramuscular, conferiram um aumento de 50% na proteção anti-tumoral de animais previamente transplantados com a linhagem tumoral TC-1 (que expressa a proteína E7 do HPV-16), em uma relação dose-dependente. / Bacillus subtilis spores can be used as vaccine vehicles capable of to display or adsorb heterologous proteins in its surface. Recent studies have indicated that spores of B. subtilis confer a strong adjuvant effect for vaccines based on purified proteins administered by the parenteral route. In this scenario, the objective of this project is to evaluate the adjuvant role of B. subtilis spores e viabilize its use as DNA vaccine carriers of biolistic method (gene gun). In this methodology, the spores are used as gold microparticles substitutes usually employed, maintaining the ability to transfect eukaryotic cells in vitro and production of specific antibodies in C57BL / 6 mice immunized with the vaccine plasmid pgDE7h (encoding a non-toxic form of the E7oncoprotein of HPV-16). Additionally, spores of B. subtilis were able to activate dendritic cells in vitro when co-administered intramuscularly to pgDE7h, conferring an increase of 50% of anti-tumor protection in animals previously transplanted with the TC-1 tumor cell line (expressing the E7 protein of HPV-16) in a dose-dependent manner.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica granulomatosa causada pelo fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. A gp43 é o principal antígeno diagnóstico que contém o peptídeo de 15 aminoácidos designado como P10, que desenvolve a resposta imune do tipo Th1 dependente de IFN-<font face=\"Symbol\">g. No presente trabalho, comparamos a efetividade de diferentes adjuvantes em camundongos BALB/c infectados intratraquealmente com o isolado virulento Pb18. Alúmen, Adjuvante Completo e Incompleto de Freund, FliC flagelina e o lipídeo catiônico, foram testados em associação ou não com P10. Após 52 dias de infecção, o lipídeo catiônico mostrou os melhores resultados, com o menor número de UFCs, redução de fibrose e baixo número de células fúngicas no tecido pulmonar, além do incremento significativo de IFN-<font face=\"Symbol\">g e TNF-<font face=\"Symbol\">a e a redução dos níveis de IL-4 e IL-10. Estes resultados sugerem que a interação do peptídeo P10 com o lipídeo catiônico pode gerar uma melhor resposta imune mediada por células do tipo Th1, evitando a rápida disseminação da PCM experimental. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. The gp43 is the major diagnostic antigen that contains the peptide P10. This peptide has 15 amino acids and develops a Th1- dependent IFN-<font face=\"Symbol\">g immune response. In this work, we compare the effectiveness of different adjuvants in BALB/c mice infected intratracheally with virulent isolate Pb18. Alum, Complete Adjuvant and Incomplete Freund\'s adjuvant, fliC flagellin from Salmonella enterica and cationic lipid were tested in combination or not with P10. After 52 days of infection, the cationic lipid showed the best results with the least number of colony forming units, reduction of fibrosis, low number of fungal cells in lung tissue and the significant increase of IFN-<font face=\"Symbol\">g and TNF-<font face=\"Symbol\">a with reduced levels of IL-4 and IL-10. These results suggest that, the interaction of peptide P10 with cationic lipids can lead to a better immune response mediated by Th1 type cells by avoiding the rapid spread of experimental PCM.

Toxina de Shiga produzida por linhagens de Escherichia coli (STEC) causa a Síndrome Hemolítica Urêmica (SHU), uma doença severa. A Stx é uma toxina AB5 formada pela monomérica subunidade A catalítica, com efeito inibitório da síntese proteica, e cinco subunidades B, envolvidas na ligação ao receptor glicolipídico na superfície das células alvo. A proteína Stx2DAB foi administrada em camundongos combinada com diferentes adjuvants: toxina termo-lábel (LT) derivada de E. coli enterotoxigênica, a flagelina FliCi de S. Typhimurium, hidróxido de alumínio ou adjuvante de Freund. Adicionalmente os animais foram imunizados com toxina desnaturada. Os resultados mostraram que os soros dos animais imunizados com a Stx2DAB e adjuvante de Freund apresentaram os maiores títulos de anticorpos anti-Stx2 com a proteção máxima de 77% ao desafio letal com a toxina Stx2, entretanto animais imunizados com a toxina desnaturada não apresentaram proteção. Os resultados mostram o potencial protetor do antígeno vacinal como vacina de subunidade e a importância da conformação na proteção. / Shiga toxin (Stx)-producing Escherichia coli strains (STEC) cause the Hemolytic Uremic Syndrome (HUS), a severe illness. The Stx is an AB5 toxin and comprises a single catalytic A subunit, endowed with protein synthesis inhibitory effect, and five B subunits, involved in the binding to glycolipid receptors on the surface of target cells. The protein Stx2DAB was administered to mice combined with different adjuvants: a heat-labile toxin (LT), derived from enterotoxigenic E. coli (ETEC) strains, the flagellin FliCi of S. Typhimurium, alum or Freund\'s adjuvant. Additionally mice were immunized with denatured toxin. The results showed that sera from mice immunized with recombinant Stx2DAB plus Freund adjuvant displayed the highest anti-Stx2 antibody titers with maximum protection of 77% to a lethal challenge with the Stx2 holotoxin, however animals immunized with denatured toxin showed no protection, despite high serum titers achieved. The results show the potential protector of vaccine antigen as a vaccine subunit and the importance of conformation in the protection.

As células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígenos (APCs). Foi proposto que as DCs selecionam os Ags que serão apresentados em MHC-II baseado na presença de ligantes para TLR na partícula fagocitada. Contudo, esse fenômeno não foi estudado em classe I. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar se o acoplamento de Ags particulados a um agonista de TLR melhoraria a apresentação cruzada (AC) dos mesmos por DCs humanas tratadas com as moléculas acopladas. Nós vimos que a presença de um ligante de TLR no material fagocitado não contribuiu nem para a maturação do fagossomo, nem para a via endossômica de AC. A AC não envolve acidificação endossômica e depende de moléculas de MHC recém-sintetizadas do retículo endoplasmático. Nossos dados confirmam também a importância do estado de maturação das DCs para a indução de proliferação de LT CD8+, embora este não tenha sido associado com o nível de apresentação do complexo MHC-I/peptídeo, ou com as moléculas normalmente utilizadas para indicar a maturação das DCs. / Dendritic cells (DCs) are the main antigen presenting cells (APCs). It was proposed that DCs select the Ags that will be presented at their surfaces on class II based on the presence of a TLR-ligand on the cargo. However, the relevance of the coupling of the Ag to a TLR-ligand on class I was not yet addressed. Thus, the goal of this study was to investigate whether the coupling of particulate Ags to a TLR-agonist improve the cross-presentation (CP). We saw that the CP does not involve endosomal acidification and it relies on newly synthesized MHC-I molecules from the endoplasmic reticulum. Also, the presence of a TLR-ligand on the cargo neither contributed to the phagosome maturation nor to the endosomic route of CP. Furthermore, the maturation status of DCs was crucial for the induction of CD8+ T cells proliferation. Although the coupling of the Ag to the adjuvant has neither changed the expression of the markers related to maturation nor the presentation of the complex MHC-I/peptide at the DC surface, it affected its capacity of stimulating CD8+ T cells.

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é um patógeno causador de infecções respiratórias que causa a morte de 1 milhão de crianças anualmente no mundo todo. Neste trabalho a propriedade adjuvante da vacina celular pertussis (wP) em combinação com o antígeno PspA5 de S. pneumoniae foi avaliada em modelos animais. Combinações de PspA5 com wP, wPlow (vacina celular pertussis com baixa quantidade de LPS) ou com a vacina DTPlow foram inoculadas em camundongos por via nasal ou subcutânea. A resposta protetora induzida pela imunização nasal com PspA5-wP e PspA5-wPlow ao desafio letal com pneumococo foi caracterizada pelo aumento de anticorpos anti-PspA5 sistêmicos e na mucosa respiratória e infiltração de linfócitos T CD4+, T CD8+ e B no pulmão dos animais. A inoculação subcutânea de PspA5-DTPlow também protegeu contra desafio letal com pneumococo e a resposta induzida foi caracterizada pelo aumento de IgG anti-PspA5 sistêmicos e na mucosa respiratória. Não houve prejuízo às respostas contra difteria, tétano ou pertussis quando PspA5 foi combinado à DTPlow. / Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is a pathogen that causes respiratory infections leading to the death of 1 million children per year, worldwide. Here, the adjuvant property of the whole cell pertussis vaccine (wP) in combination with the PspA5 antigen from S. pneumoniae was evaluated in animal models. Combinations of PspA5 with wP, wPlow (whole cell pertussis vaccine with low amount of LPS) or with the DTPlow vaccine were inoculated in mice by nasal or subcutaneous routes. The protective response induced by nasal immunization with PspA5-wP and PspA5-wPlow against the lethal challenge with pneumococci was characterized by increased systemic and mucosal anti-PspA5 antibodies and influx of TCD4+, TCD8+ and B cells in the lungs of mice. The subcutaneous inoculation of PspA5-DTPlow also protected against the lethal challenge with pneumococci and the response was characterized by increased levels of systemic and mucosal anti-PspA5 IgG. There was no prejudice to the responses against diphtheria, tetanus or pertussis when PspA5 was combined with DTPlow.

A busca por adjuvantes capazes de estimular eficiente resposta imunológica celular representa uma importante contribuição para a pesquisa de vacinas. No presente trabalho avaliamos o potencial adjuvante de flagelinas de Salmonella para a ativação de linfócitos T, com ênfase na ativação de linfócitos T CD8+, em animais imunizados com diferentes estratégias vacinais, desde vacinas baseadas em linhagens atenuadas de Salmonella; vacinas acelulares que empregaram flagelinas purificadas co-administradas, ou em fusão, a antígenos alvo e, ainda, vacinas de DNA. Nossos resultados demonstram que a utilização de flagelina na forma de vacina de DNA induziu maior proteção terapêutica que a mesma formulação utilizada na forma de vacinas de subunidades, sugerindo que os efeitos adjuvantes da flagelina para ativação de CTLs não estão relacionados apenas a ligação ao TLR5. Os resultados apresentados na presente tese contribuem para a compreensão dos mecanismos de adjuvanticidade da flagelina de Salmonella, particularmente no contexto da ativação de células T. / The search for adjuvants that are able to stimulate an efficient cellular immune response represents an important contribution in vaccine development. In this study, we evaluated the potential of Salmonella flagellin as adjuvant for activation of T lymphocytes, with emphasis on the activation of CD8+ T cells, on the mice immunized with different approaches such as vaccines based on attenuated Salmonella strains; acellular vaccines with purified flagellin co-administered or genetically fusioned to the target antigen; or even DNA vaccines. Our results demonstrate that the use of flagellin in the form of DNA vaccines induced greater therapeutic protection than the same formulation used in the form of subunit vaccines, suggesting that the adjuvant effects of flagellin to the activation of CTLs are related not only to link to TLR5. The results presented in this work contribute significantly to the understanding of the mechanisms of flagellin adjuvanticity, particularly in the context of activation of responses mediated by T cells.