Resumo: O Aedes aegypti, culicídeo de hábitos diurnos, é originário do continente africano e está globalmente distribuído pelos trópicos em associação com as populações humanas. É considerado de grande importância epidemiológica por ser o principal vetor dos quatro sorotipos do vírus da dengue e da febre amarela. Uma das primeiras detecções da presença do mosquito no Estado de São Paulo aconteceu na década de 80 na cidade de Santos. Atualmente não há disponível nenhuma vacina ou medicamento eficiente contra a dengue, assim o controle da doença está restrito ao controle do vetor. Uma das alternativas de controle e entendimento das relações vetor-patógeno-homem se baseiam no desenvolvimento de ferramentas moleculares que utilizam técnicas baseadas em PCR, as quais têm possibilitado o estudo genético das populações do Ae. aegypti. Em tais estudos, vários marcadores foram envolvidos, tais como os SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) e marcadores mitocondriais. Nós desenvolvemos ensaios utilizando metodologia TaqMan® para o estudo genético populacional de duas populações do mosquito Aedes aegypti de cidades portuárias do Estado de São Paulo, utilizando nove marcadores SNPs. Verificamos que esta metodologia é reprodutível, rápida, de baixo custo e eficiente para estudos em larga escala. Pela análise AMOVA encontramos uma baixa, mas significativa diferenciação genética entre as populações do estudo (FST = 0,0324; P < 0,01), e uma alta taxa de migrantes por geração (8,72 entre as populações 2007 e 5,39 entre as populações 2008), indicando fluxo gênico entre as populações. A análise implementada no software Structure 2.3.1, evidenciou a existência de três clusters baseados em semelhanças genotípicas, distribuídos em dois grupos, confirmando uma moderada estruturação populacional. Verificamos através da análise de fragmentos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Aedes aegypti, is a diurnal mosquito, originated from the African continent and is globally distributed through the tropics in association with human populations. It is considered of great epidemiological importance for being the main vector of the four serotypes of Dengue and Yellow Fever. One of the first detections of the presence of the mosquito in the State of São Paulo happened in the 80's, in the city of Santos. Currently there is no available vaccine or effective medicine against dengue fever, and disease control is restricted to vector control. An alternative to control and understanding of vectorpathogen- man relationships are based on the development of molecular tools that use PCR-based techniques, which have enabled the genetic study of populations of Ae. aegypti. In such studies, several markers were involved, such as SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) and mitochondrial ones. We have developed assays using TaqMan® methodology for population genetic studies of two populations of Aedes aegypti from the port cities of São Paulo, using nine SNPs markers. We found that this methodology is reproducible, fast, inexpensive and efficient for large-scale studies. AMOVA analysis found a low but significant genetic differentiation between the studied populations (FST = 0.0324, P <0.01), and a high rate of migrants per generation (8.72 among populations in 2007 and 5.39 among populations in 2008), indicating gene flow between populations. The analysis implemented in software Structure 2.3.1, revealed the existence of three clusters based on genotypic similarities, divided into two groups, confirming a moderate population structure. We verified through the analysis of the mitochondrial gene fragments NADH dehydrogenase subunit 4 (ND4) a high genetic differentiation between the two study populations (FST = 0.18034, P <0.01), and a rate of migrants per generation considered high... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Coorientador: Karina dos Santos Paduan / Mestre

Orientador: Jayme Augusto de Souza Neto / Resumo: Dengue é a arbovirose de maior crescimento nos últimos anos, repercutindo em impactos sociais e econômicos devido às altas taxas de morbidade e mortalidade desencadeadas pela infecção. O vírus dengue tem como principal vetor o mosquito Aedes aegypti. Por apresentar hábito hematofágico, antropofílico, de rápido desenvolvimento, é um excelente transmissor do vírus. Medidas de controle estão restritas à eliminação do mosquito vetor, uma vez que um tratamento específico ou uma vacina não estão disponíveis à população. E uma característica que determina a disseminação de doenças é a alta competência vetorial de seus mosquitos vetores, a qual tem sido associada à fatores genéticos do mosquito e ambientais. Sabe-se que a variabilidade genética dos mosquitos é um dos fatores que pode determinar o sucesso da relação mosquito-patógeno específico. Com isso, no presente trabalho foram estudadas as competências vetoriais de mosquitos Aedes aegypti da cidade de Botucatu infectados com DENV-2 e DENV-4 a fim de entender melhor a competência vetorial desses mosquitos. Além disso, foram feitas tentativas para selecionar linhagens resistentes e susceptíveis desses mosquitos infectados com ambos os sorotipos. Os mosquitos infectados com DENV-2 foram genotipados pela metodologia de SNP chip e posteriormente foram realizadas análises de estudo global do genoma (GWAS) afim de encontrar fatores genéticos relacionados com os diferentes fenótipos susceptív... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Dengue is the arboviruses with the greatest growth in recent years, with social and economic impacts due to the high morbidity and mortality rates triggered by the infection. Dengue has as main vector the mosquito Aedes aegypti. Because of the haematophagic habit, been antropophilic, fast development, Aedes aegypti mosquitoes are excellent transmitter of the dengue virus. Control measures are restricted to vector mosquito elimination since a specific treatment or vaccine is not available to the population. The characteristic that determinates the diseases dissemination is the high vector competence of the mosquitoes, which has been associated with mosquito genetic and environmental factors. It is known that the genetic variability of mosquitoes is one of the factors that can determine the success of the specific mosquito-pathogen relationship. In the present study, the vector competence of Aedes aegypti mosquitoes from Botucatu city infected with DENV-2 and DENV-4 were compared in order to understand the vector competence of these specific mosquitoes. In addition, we tried to do resistant and susceptible strains selections of these mosquitoes infected with both serotypes. And mosquitoes infected with DENV-2 were genotyped by the SNP chip methodology and later analyzes were carried out to study the genome (GWAS) in order to find genetic factors related to the different susceptible and resistant phenotypes of them. As results we observed different vector competence of the same ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Letícia Tiemi Egami Oda (leticia.e.o@gmail.com) on 2018-11-19T14:17:39Z No. of bitstreams: 1 Tese DR LTEO-corrigida final.pdf: 2530249 bytes, checksum: 4783af91c3819b7b7b372559ab20f01a (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-11-21T10:42:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oda_lte_dr_bot.pdf: 2530249 bytes, checksum: 4783af91c3819b7b7b372559ab20f01a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-21T10:42:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oda_lte_dr_bot.pdf: 2530249 bytes, checksum: 4783af91c3819b7b7b372559ab20f01a (MD5) Previous issue date: 2018-05-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Dengue é a arbovirose de maior crescimento nos últimos anos, repercutindo em impactos sociais e econômicos devido às altas taxas de morbidade e mortalidade desencadeadas pela infecção. O vírus dengue tem como principal vetor o mosquito Aedes aegypti. Por apresentar hábito hematofágico, antropofílico, de rápido desenvolvimento, é um excelente transmissor do vírus. Medidas de controle estão restritas à eliminação do mosquito vetor, uma vez que um tratamento específico ou uma vacina não estão disponíveis à população. E uma característica que determina a disseminação de doenças é a alta competência vetorial de seus mosquitos vetores, a qual tem sido associada à fatores genéticos do mosquito e ambientais. Sabe-se que a variabilidade genética dos mosquitos é um dos fatores que pode determinar o sucesso da relação mosquito-patógeno específico. Com isso, no presente trabalho foram estudadas as competências vetoriais de mosquitos Aedes aegypti da cidade de Botucatu infectados com DENV-2 e DENV-4 a fim de entender melhor a competência vetorial desses mosquitos. Além disso, foram feitas tentativas para selecionar linhagens resistentes e susceptíveis desses mosquitos infectados com ambos os sorotipos. Os mosquitos infectados com DENV-2 foram genotipados pela metodologia de SNP chip e posteriormente foram realizadas análises de estudo global do genoma (GWAS) afim de encontrar fatores genéticos relacionados com os diferentes fenótipos susceptível e resistente dos mosquitos. Como resultados observou-se diferentes competências vetoriais dos mesmos mosquitos infectados com diferentes sorotipos. Os mosquitos infectados com DENV-2 foram aproximadamente 70% susceptíveis, e mosquitos infectados com DENV-4 aproximadamente 70% foram resistentes, possuindo assim competências vetoriais opostas. Já no estudo da seleção dos fenótipos foi possível uma seleção de 80% até a geração F3 de mosquitos infectados com DENV-2, apesar do número baixo de indivíduos nas seleções. Os mosquitos infectados com DENV-4 não obtiveram uma taxa de seleção muito elevada, visto que as seleções foram feitas só até a geração F-2. Os resultados das análises de GWAS mostraram possíveis associações dos SNPs com os fenótipos estudados, apesar de não serem estatisticamente significantes para a correção de Bonferroni. Com isso, concluímos que a diferença vetorial é bastante dependente do sorotipo viral; para as análises de seleção e formação de linhagem é necessário um maior número de indivíduos nas primeiras infecções; e no estudo GWAS apesar da associação não ter sido significativa, devido ao baixo número de indivíduos, e dos parâmetros de correção estatística não serem ideais para indivíduos de uma única população, acredita-se que as associação encontradas de alguns SNPs com os fenótipos estudados sejam verdadeiras. / Dengue is the arboviruses with the greatest growth in recent years, with social and economic impacts due to the high morbidity and mortality rates triggered by the infection. Dengue has as main vector the mosquito Aedes aegypti. Because of the haematophagic habit, been antropophilic, fast development, Aedes aegypti mosquitoes are excellent transmitter of the dengue virus. Control measures are restricted to vector mosquito elimination since a specific treatment or vaccine is not available to the population. The characteristic that determinates the diseases dissemination is the high vector competence of the mosquitoes, which has been associated with mosquito genetic and environmental factors. It is known that the genetic variability of mosquitoes is one of the factors that can determine the success of the specific mosquito-pathogen relationship. In the present study, the vector competence of Aedes aegypti mosquitoes from Botucatu city infected with DENV-2 and DENV-4 were compared in order to understand the vector competence of these specific mosquitoes. In addition, we tried to do resistant and susceptible strains selections of these mosquitoes infected with both serotypes. And mosquitoes infected with DENV-2 were genotyped by the SNP chip methodology and later analyzes were carried out to study the genome (GWAS) in order to find genetic factors related to the different susceptible and resistant phenotypes of them. As results we observed different vector competence of the same mosquitoes infected with different serotypes. Mosquitoes infected with DENV-2 were approximately 70% susceptible, and mosquitoes infected with DENV-4 were approximately 70% resistant, thus the opposing vector competence. In the selection study it was possible to select 80% up to the F3 generation of mosquitoes infected with DENV-2, despite the low number of individuals in the selections. Mosquitoes infected with DENV-4 did not obtain a very high selection rate, since the selections were made only up to the F-2 generation. The results of the GWAS analysis showed possible associations of the SNPs with the studied phenotypes, although they were not statistically significant for the Bonferroni correction. With this, we conclude that the vector competence difference is quite dependent on the viral serotype; for the analysis of selection and formation of lineage is necessary a greater number of individuals in the first infections; and in the GWAS study, although the association was not significant because of the low number of individuals, and the statistical correction parameters are not ideal for individuals from the same population, it is believed that the association of some SNPs with the studied phenotypes is true.

Submitted by Jaqueline Jarusevicius (jaquejaru@ibb.unesp.br) on 2018-08-10T12:31:45Z No. of bitstreams: 1 Manuscrito Defesa - Jaqueline Jarusevicius.pdf: 1898282 bytes, checksum: d3ff76c36419bc9f757606d4e8af71c7 (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-08-10T16:49:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 jarusevicius_j_dr_bot.pdf: 1898282 bytes, checksum: d3ff76c36419bc9f757606d4e8af71c7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-10T16:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 jarusevicius_j_dr_bot.pdf: 1898282 bytes, checksum: d3ff76c36419bc9f757606d4e8af71c7 (MD5) Previous issue date: 2018-07-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Aedes aegypti (Ae. aegypti) é o principal vetor de dengue e é também responsável por transmitir outras arboviroses de importância em saúde pública, como as febres zika e chikungunya. Devido a falhas no controle da transmissão destas arboviroses, que tem como base a eliminação do mosquito vetor, o Brasil é um país endêmico para a dengue e a cada ano nos deparamos com epidemias cada vez mais graves. Ao se alimentar de sangue humano infectado o primeiro local de interação do vírus com o organismo do mosquito é o intestino. Além das respostas imunológicas antivirais para conter a infecção, neste ambiente também está presente a microbiota intestinal do mosquito, um importante modulador na infecção de patógenos. Compreender como a microbiota intestinal de mosquitos é definida e se modifica em uma determinada população é de grande interesse uma vez que isso pode elucidar a relação entre mosquitos e seus organismos simbiontes, e consequentemente auxiliar em processos de paratransgênese. A principal forma de aquisição das bactérias intestinais é através do contato com o ambiente, mas outros mecanismos como transmissão transestadial e vertical também devem influenciar no estabelecimento da microbiota intestinal. Neste estudo, nós analisamos a composição da microbiota intestinal de mosquitos Ae. aegypti de uma população de campo, coletados na cidade de Botucatu, SP, através do sequenciamento em larga escala da região hipervariavel V4 do gene 16S rRNA, e acompanhamos como esta composição é alterada durante colonização em insetário. Nossos resultados revelaram uma transição da composição da microbiota intestinal, principalmente pela diminuição progressiva da diversidade de bactérias como efeito da colonização. Os gêneros mais abundantes encontrados, como Pantoea, Burkholderia e Enterobacter, permaneceram em proporções similares ao longo destas gerações. Estes dados sugerem que existe transmissão de bactérias entre as gerações e que o ambiente intestinal possui mecanismos para manter a composição original de sua microbiota. / 2016/16952-9

Associações simbióticas, comensais e parasitárias são amplamente relatadas em insetos. Pelo fato de larvas de culicídeos e amebas de vida livre (AVL) habitarem meios aquáticos similares, objetivou-se verificar a prevalência de Acanthamoeba spp. em populações silvestres de Aedes aegypti. Esta AVL foi investigada em 60 pools contendo 10 larvas de A. aegypti, as quais foram coletadas através de ovitrampas instaladas em diversos bairros da cidade de Porto Alegre (RS, Brasil). Os isolados de Acanthamoeba spp. foram caracterizados morfologicamente e submetidos à técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para confirmação do gênero. Ademais, realizouse análise genotípica e testes presuntivos de patogenicidade para algumas cepas. Entre os pools, 54 (90%) foram positivos para AVL, dos quais 47 (87%) isolados eram pertencentes ao gênero Acanthamoeba. Os grupos genotípicos T4, T3 e T5 foram identificados, correspondendo a 14 (53,8%), 10 (38,5%) e dois (7,7%) isolados, respectivamente. De acordo com testes fisiológicos empregados para 14 cepas, 12 (85,7%) foram consideradas não patogênicas e duas (14,3%) foram consideradas com baixo potencial patogênico. Estes resultados servem como base para um maior conhecimento acerca da interação entre estes protozoários e mosquitos vetores, em seu habitat natural. Além disso, é o primeiro estudo dedicado ao isolamento de Acanthamoeba spp. a partir de culicídeos coletados do ambiente. / Symbiotic, commensal and parasitic associations are widely reported in insects. By the fact of mosquito larvae and free-living amoebae (FLA) occupy the similar aquatic sites, the aim of this study was to determine the prevalence of Acanthamoeba spp. in Aedes aegypti larvae collected in the environment. The amoebae were investigated in 60 pools, each containing 10 larvae of A. aegypti which were collected by using larvitraps installed in various districts of Porto Alegre (RS, Brazil). Acanthamoeba isolates were morphologically characterized and submitted to Polymerase Chain Reaction technique to confirm the genus. In addition, genotype analyses as well as presumptive tests for pathogenicity in some samples were performed. Among the pools, 54 (90%) were positive for FLA. From those isolates, 47 (87%) belong to the genus Acanthamoeba. The genotype groups T4, T3 and T5 have been identified corresponding to 14 (53.8%), 10 (38.5%) and two (7.7%) isolates respectively. The physiological tests performed in 14 strains showed that 12 (85.7%) were non pathogenic, while two (14.3%) were considered with low pathogenic potential. These results provide a basis for a better understanding between these protozoan and mosquitoes interaction in their natural habitat. Moreover, this study is the first to report isolation of Acanthamoeba spp. from mosquitoes collected in the environment.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T16:05:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Mestrado Mariana David 2012.pdf: 1696669 bytes, checksum: ff73fe73b0384a563249fdbf4aedec8a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T16:05:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Mestrado Mariana David 2012.pdf: 1696669 bytes, checksum: ff73fe73b0384a563249fdbf4aedec8a (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Considera-se que a resistência a inseticidas estaria associada a custos na aptidão dos indivíduos resistentes, uma vez que recursos energéticos seriam realocados para a produção e manutenção dos mecanismos responsáveis pela resistência. Neste contexto, este estudo visa avaliar temporalmente como alguns parâmetros biológicos relacionados à capacidade vetorial de A. aegypti estão associados à resistência aos inseticidas em populações provenientes de Campo Grande/MS (CG), Duque de Caxias/RJ (DC), Parnamirim/RN (PN) e Santarém/PA (ST). A variação temporal do perfil de resistência a temephos (organofosforado) e deltametrina (piretróide) foi monitorada a cada três meses, durante um ano, assim como algumas características biológicas deste mosquito. O tempo de desenvolvimento de larvas L1 até a fase adulta foi medido através da observação de 120 indivíduos de cada população e para cada mês. Além disso, observou-se o sexo, a tolerância ao jejum e comprimento de asa dos adultos resultantes. Com a finalidade de avaliar a sobrevivência e aspectos relacionados à fecundidade, 60 fêmeas adultas foram mantidas individualmente em tubos de plástico cilíndricos. Todos os experimentos foram realizados em paralelo com a linhagem Rockefeller, como controle ambiental. As populações das diferentes localidades e Rockefeller mostraram diferenças significativas para alguns dos parâmetros estudados, o que provavelmente reflete a adaptação às condições ambientais locais e ao laboratório, respectivamente. As fêmeas apresentaram menor tolerância ao jejum que os machos. Há evidências de que a resistência a ambos os inseticidas esteja negativamente correlacionados com algumas das características biológicas avaliadas para todas as populações, sugerindo uma menor aptidão dos indivíduos resistentes na ausência dos inseticidas. Mosquitos da CG apresentaram menor tolerância ao jejum (~ 72h para fêmeas e 111h para os machos), tamanho de asa e sucesso de oviposição (muitas fêmeas não puseram ovos) associados à maior resistência a deltametrina. População DC parece ser a mais afetada pela resistência a inseticidas, já que o desenvolvimento larval, tolerância ao jejum (~ 66h para fêmeas e 116h para os homens), tamanho da asa, sobrevivência (~ 15 dias) e fecundidade (apenas durante a primeira semana de experimentos) de fêmeas adultas foram associados à resistência ao temephos. Considerando PN, a sobrevivência de fêmeas adultas de Ae. aegypti variou de acordo com a resistência ao temephos (~ 23 dias), enquanto isso, o sucesso de oviposição (para a primeira semana de monitoramento) e a fecundidade foram, aparentemente, associados à resistência à deltametrina. Há evidências de que o tempo de desenvolvimento e a fecundidade de ST estejam associados à resistência ao temephos, bem como a tolerância ao jejum (~79h para fêmeas e 116h para os machos) e comprimento de asas pareceram variar de acordo com a resistência à deltametrina. Estas observações suportam a hipótese de que a resistência a inseticidas é positiva durante as intervenções baseadas no controle químico, por exemplo. No entanto, na ausência destes compostos, a resistência pode resultar em custos sobre a aptidão dos indivíduos resistentes, o que reforça a hipótese de que a resistência aos inseticidas possa alterar capacidade vetorial de mosquitos. / Insecticide resistance is considered to be associated with fitness costs due to the re-allocation of metabolic resources to production and maintenance of mechanisms responsible for resistance. In this context, this study aimed to assess how insecticide resistance is associated with some life history traits related to vectorial capacity of A. aegypti in Brazilian populations from Campo Grande/MS (CG), Duque de Caxias/RJ (DC), Parnamirim/RN (PN) and Santarém/PA (ST). The profile and temporal variation in temephos (organophosphate) and deltamethrin (pyrethroid) resistances were monitored every three months, during one year, as well as some mosquito traits. The development time elapsed between L1 larvae and the adult stage was measured through the observation of 120 individual larvae from each population and for every month. Additionally, it was observed sex, starvation time and wing length for resulting adults. In order to evaluate survival and fecundity aspects, 60 adult females were kept individually in cylindrical plastic tubes. All experiments were performed in parallel with the Rockefeller strain, as a control of insecticide susceptibility. The populations of different localities and Rockefeller showed significant differences for some of the parameters studied, which probably reflects adaptation to local environmental conditions and to the laboratory, respectively. Females showed shorter starvation time than males. There is evidence that insecticide resistance for both insecticides is negatively correlated with some of the biological traits evaluated for all populations evaluated, suggesting lower fitness of resistant individuals in the absence of insecticide. Mosquitoes from CG showed lower starvation time (~72h for females and 111h for males), wings size and oviposition success (many females did not lay eggs) associated with increased deltamethrin resistance. DC population seemed to be the most affected by insecticide resistance, since larval development, starvation time (~66h for females and 116h for males), wing size; survival (~ 15 days) and fecundity (only during the first week of experiments) of adult females were somehow associated with temephos resistance. With respect to PN, Ae. aegypti female survival varied according to temephos resistance (~ 23 days); meanwhile, oviposition success (for the first week of monitoring) and fecundity were apparently associated with deltamethrin resistance. There is evidence that the development time and fecundity of ST were associated with temephos resistance, as well as starvation time (~ 79h for females and 116h for males) and wings length appeared to vary in accordance to deltamethrin resistance. These observations support the hypothesis that insecticide resistance is positive during chemical control interventions, for instance. However, in the absence of these compounds, resistance may result in fitness costs on those resistant indiviaduals, reinforcing the hypothesis that insecticide resistance affect mosquito vectorial capacity.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-13T15:14:43Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1203710 bytes, checksum: 13bfbcd1c9950629b1067c5108f7e184 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-13T15:14:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1203710 bytes, checksum: 13bfbcd1c9950629b1067c5108f7e184 (MD5) Previous issue date: 2009-07-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Dengue vírus, membro da família Flaviviridae, é o agente etiológico da dengue e é transmitido através da picada do mosquito Aedes aegypti. Até o momento não existe tratamento específico, e o controle da doença baseia-se na tentativa de conter o mosquito vetor, desse modo a Organização Mundial de Saúde considera de extrema importância o desenvolvimento de uma vacina eficaz contra esta doença. Neste contexto, foi construído um candidato vacinal pCID2Et expressando a proteína E truncada do vírus dengue-2, sem a expressão concomitante de prM. Testes demonstraram correta, porém reduzida expressão de E, e apenas uma pequena porcentagem de camundongos imunizados foi protegida quando desafiados com vírus dengue-2. Estes resultados justificam o aprimoramento desta construção vacinal, buscando o aumento da expressão de proteína E e assim proporcionar uma imunização mais eficaz. Desse modo, nosso objetivo foi aprimorar este plasmídeo através da inserção das proteínas prM/DENV-2 e prM/DENV-3. Neste ínterim foram construídos dois plasmídeos pCID2EtprMD2 e pCID2EtprMD3, cujas análises bioquímicas já realizadas indicaram aumento de expressão relativo de proteína E de 67,02% por pCID2EtprMD3 com relação a pCID2EtprMD2. Para avaliar os efeitos da expressão aumentada de proteína E na imunogenicidade dos plasmídeos foi realizada a avaliação imunogênica dos mesmos. Os plasmídeos pCID2EtprMD3, pCID2EtprMD2 e pCID2Et foram utilizados na imunização de camundongos e os resultados demonstraram que pCID2EtprMD3 apresentou maior indução do sistema imune, tanto em relação à expressão de células TCD4 + e TCD8 + de memória quanto em relação à secreção de anticorpos específicos para a proteína E. / The Dengue virus, member of the Flaviviridae family, is the etiological agent of the dengue disease, and its transmitted trough the bite of Aedes aegypti mosquitoes. There isn t a specific treatment so far, and the disease control is based on trying to control the mosquito vectors. Thus, the development of an efficient vaccine has been considered high priority by the World Health Organization (WHO). In this context, a vaccinal candidate pCID2Et expressing the truncated DENV-2 - E protein, without the concomitant expression of prM has been constructed. Tests demonstrated that the E protein was correctly expressed but in reduced quantity and only a small percentage of the immunized mice was protected when challenged with DENV-2. These results justify the improvement of this vaccine candidate aiming the increasing of E protein expression in order to achieve a more efficient immunization. This way, our objective was the improvement of this plasmid through the insertion of the prM/DENV-2 e prM/DENV-3. So, we constructed two recombinant plasmids pCID2EtprMDEN2 e pCID2EtprMD3, witch reveled by biochemical analysis that there was a relative expression increase of 67,02% by pCID2EtprMDEN3 in relation to pCID2EtprMDEN2. In order to evaluate the effects of this better expression on plasmid immunogenicity, we performed some immunologic analysis of these plasmids. The plasmids were utilized in animal vaccination and the results showed that pCID2EtprMD3 had increased induction of the immune system xiiiwhen compared to pCID2EtprMD2 an pCID2Et, both in relation to the expression of TCD4 + e TCD8 + total and memory cells, as on the secretion of specific anti-E antibodies. / Dissertação antiga, sem ficha catalog. e Folha de aprov.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000004.pdf: 691391 bytes, checksum: c2676ae4df935413ee508028e9a02a22 (MD5) Previous issue date: 2006 / O Bacillus thuringiensis svar. israelensis (Bti) é um importante entomopatógeno utilizado na produção de larvicidas para o controle do Aedes aegypti, vetor da dengue. A toxicidade do Bti está baseada no cristal, produzido durante a esporulação, que contém quatro protoxinas Cry11Aa (70 kDa), Cry4Aa (125 kDa), Cry4Ba (130 kDa) e Cyt1A (28 kDa). Sua ação ocorre através da ingestão dos cristais que são solubilizados no mesêntero, onde as protoxinas são liberadas e clivadas por serina-proteases em toxinas ativas que agem em sinergia no epitélio intestinal e provocam a morte das larvas. Apesar da alta seletividade do Bti, ainda não foi completamente elucidado como as toxinas Cry interagem com os receptores específicos presentes no epitélio das larvas. O objetivo principal do trabalho foi caracterizar, através de ensaios in vitro de natureza quantitativa, a capacidade de ligação de cada toxina Cry (4Aa, 4Ba e 11Aa) às preparações de microvilli intestinal (BBMF) de larvas de Ae. aegypti. Para tal, cada componente Cry foi produzido a partir de cepas recombinantes, Bt cepa 4Q2-81, para produção de biomassas. A atividade inseticida das biomassas para larvas do 3o/4o estádios foi determinada através de bioensaios e, outra parte da biomassa foi utilizada para a obtenção dos cristais. Os cristais contendo cada protoxina foram processados in vitro e uma amostra de cada uma delas foi marcada com iodo (I125). Para realizar os estudos de ligação foram feitas preparações BBMF, a partir de larvas do 3o/4o estádios. Os estudos da capacidade de ligação da toxina foram realizados através de ensaios de competição, de saturação e de cinética, através de incubações entre a toxina- I125 e preparações de BBMF, na ausência ou na presença de um competidor. (...) Os resultados obtidos mostraram que as toxinas Cry competem pelos mesmos sítios e partilham receptores presentes na BBMF. Em todos os casos estudados, a afinidade do complexo toxinareceptor não foi elevada, e não foi detectada sinergia entre as toxinas Cry para a ligação à BBMF. A ligação entre as toxinas-I125 e a BBMF é irreversível, e observou-se uma forte tendência à oligomerização nos três casos. Os resultados obtidos nesse trabalho sugerem que a toxicidade das toxinas Cry para larvas de Aedes está relacionada à etapa irreversível de ligação com os receptores, e não é caracterizada por um padrão elevado de afinidade do complexo toxina-receptor ...

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000007.pdf: 1680152 bytes, checksum: 709e25ec35951be347a85e578b3804c5 (MD5) Previous issue date: 2006 / O objetivo deste estudo foi caracterizar a estrutura genética de populações naturais de Ae. albopictus coletadas na Região Metropolitana do Recife, no Rio de Janeiro e Minas Gerais e avaliar o seu papel como possível vetor na transmissão do Dengue. Para a análise de variabilidade genética foram utilizados dois genes do DNA mitocondrial: citocromo c oxidase II (COII) e nicotinamida adenina dinucleotídeo desidrogenase subunidade 4 (ND4). Nesta análise utilizando a técnica de SSCP foi identificado um total de oito haplótipos para o gene COII em 252 amostras analisadas e onze haplótipos para o gene ND4 em um total de 273 amostras. Os resultados sobre a análise da variância molecular (AMOVA) para ambos os genes sugeriram que essas populações estão sob forte influência da deriva genética, pois foi identificada uma alta diferenciação genética entre essas populações. Os resultados mostraram que as populações provenientes do município de Moreno foram as mais polimórficas para os dois genes, pois identificamos nestas populações a maioria dos haplótipos encontrados. O município de Moreno é circundado por uma área de mata onde podem existir populações de Ae. albopictus com uma alta variabilidade genética. As populações do Rio de Janeiro e Minas Gerais foram consideradas idênticas, pois apresentaram os mesmos haplótipos para o gene ND4. A análise do DNA mitocondrial associado à técnica de SSCP, constitui uma ferramenta eficiente na caracterização da estrutura genética de populações naturais. Este marcador também poderá ser útil na epidemiologia molecular para traçar rotas de dispersão desta espécie e monitorar o impacto das intervenções dos programas de controle de uma maneira rápida e precisa. Com a finalidade de investigar o envolvimento deste culicídeo na transmissão do vírus dengue foram coletados espécimes de Ae. albopictus em áreas randômicas e em residências onde foram relatados casos com suspeita de Dengue. Estas amostras foram testadas por RT-PCR e isolamento viral em culturas de células C6/36. Dos 217 pools de Ae. aegypti e Ae. albopictus testados para a detecção do vírus Dengue na técnica de RTPCR, 10 pools foram positivos. Destes, 9 pools foram de Ae. aegypti e apenas um pool de Ae. albopictus proveniente do município de Moreno contendo 2 fêmeas coletadas na fase adulta

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-07T15:58:08Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Alessandra Orfanó.pdf: 10376056 bytes, checksum: 69183dcae9646089fc702958e90fc51d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-07T15:58:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Alessandra Orfanó.pdf: 10376056 bytes, checksum: 69183dcae9646089fc702958e90fc51d (MD5) / A malária é responsável por cerca de 350 a 500 milhões de casos clínicos anuais, permanecendo como um dos maiores problemas de saúde mundial. Estudos sobre a influência da microbiota intestinal do vetor no desenvolvimento do ciclo de vida dos parasitos vêm sendo desenvolvidos. Em mosquitos, as pesquisas vêm mostrando que infecções por bactérias do intestino podem inibir o desenvolvimento esporogônico dos parasitas da malária. No presente trabalho, o papel da microbiota intestinal do Aedes aegytpi infectado com Plasmodium gallinaceum foi avaliado. Os insetos foram submetidos a cinco diferentes antibióticos (canamicina, carbenicilina, espectinomicina, gentamicina e tetraciclina). Somente canamicina e carbenicilina tiveram efeito sob a infecção com o parasito. Para esses dois antibióticos e o controle, técnicas de cultivo bacteriano de isolamento e sequenciamento do DNA ribossomal 16S foram feitas. Asaia bogorensis, Asaia Krungthepensis, Asaia siamensis, Bacillus licheniformis e Chryseobacterium meningosepticum foram identificadas para o grupo controle. No grupo tratado com carbenicilina foram identificadas Chryseobacterium meningosepticum e uma bactéria da família Microbacteriaceae, e para o grupo com canamicina Microbacterium lacticum. Este trabalho sugere que a interação entre espécies de Asaia e C. meningosepticum são relevantes na resistência/suscetibilidade do A. aegypti ao P. gallinaceum. Para observar o efeito do tratamento com os dois antibióticos que mostraram efeito na infecção na expressão de peptídeos antimicrobianos, os níveis de gambicina e defensina foram medidos utilizando-se a técnica de Real-time PCR. Os níveis de defensina se mostraram super-expressos quando os mosquitos foram submetidos aos tratamentos com canamicina e carbenicilina, enquanto gambicina se mostrou super-expressa nos mosquitos tratados com canamicina e sub-expressa naqueles com carbenicilina. A expressão desses dois AMPs também foi medida quando esses grupos de insetos se alimentaram com sangue e com sangue infectado. Nossos resultados mostraram que a expressão de defensina e gambicina no grupo tratado com carbenicilina alimentado com sangue apresentou um aumento de 24h para 36h, e uma queda no grupo controle alimentado com sangue. Insetos tratados com canamicina infectados aumentaram a expressão de defensina 24h e 36h após a alimentação, diminuídas nos tratados com carbenicilina. É observada uma inibição do mRNA de gambicina no grupo carbenicilina infectado sugerindo assim que a ativação desse peptídeo não ocorre somente pelo parasita e necessita da ação da microbiota. Estes resultados indicam que as bactérias associadas ao intestino do A. aegypti tem um papel importante na infecção e resposta imune ao parasito. / Malaria is responsible for about 350 to 500 million clinical cases annually, remaining as one of the largest health problems worldwide. Studies on the influence of the vector gut microbiota in the life cycle of the parasites are being performed. In mosquitoes, studies have shown that infection with midgut microbiota may inhibit the sporogonic development of malaria parasites. Here, the role of intestinal microbiota of Aedes aegytpi infected with Plasmodium gallinaceum was assessed. The insects were subjected to five different antibiotics (kanamycin, carbenicillin, spectinomycin, gentamicin and tetracycline). Only kanamycin and carbenicillin had effect over the infection process. The response of treated groups and control was analyzed by: bacterial culture techniques of isolation and sequencing of 16S ribosomal DNA. Asaia bogorensis, Asaia krungthepensis, Asaia siamensis, Bacillus licheniformis and Chryseobacterium meningosepticum were identified for the control group. In the carbenicillin treated group Chryseobacterium meningosepticum and Microbacteriaceae family bacterium were identified. In the kanamycin treated group Lacticum microbacterium was found. This work suggests that the interaction between C. meningosepticum and Asaia species is relevant in the resistance/susceptibility balance in the A. aegypti/P. gallinaceum model. To observe the effect of treatment over the expression of antimicrobial peptides, gambicin and defensin levels were measured by Real-time PCR. Levels of defensin proved to be up-regulated when the mosquitoes were subjected to treatment with kanamycin and carbenicillin. Gambicin levels were be up-regulated in mosquitoes treated with kanamycin and down-regulated in those treated with carbenicillin. The expression of these two AMPs was also measured when these groups of insects were fed with blood and infected blood. Our results showed that the expression of defensin and gambicin in carbenicillin treated blood fed group increased between 24 to 36 hours, and decreased in the blood fed control group. Infected insects treated with kanamycin increased the expression of defensin between 24 to 36 hours after feeding, while it decreased in those treated with carbenicillin. An inhibition in the expression of gambicin in the infected group treated with carbenicillin was observed, suggesting that activation of these peptides does not occur only by the parasite, or microbial action, but by both. These results indicate that the microbiota associated with A. aegypti has an important role in infection and immune response to the parasite.