Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3461.pdf: 3248917 bytes, checksum: b02925f28a9fc50ea71c3af6beebca5c (MD5) Previous issue date: 2011-03-04 / Financiadora de Estudos e Projetos / The desintegrinas are cys-rich polypeptides without enzymatic activity, some found in snake venoms with an adhesive motif to integrin, unleashing distinct responses. Several research groups have been studying snake venom disintegrins with focus in pharmacological applications in tumor progression and proliferation, angiogenesis, blood clotting, and osteoporosis. This work shows the results of the construction of cDNA library of Rhinocerophis alternatus venom gland, cloning and expression of ALT-C, a disintegrina-like protein, in bacterial system. The library was comprised of 812 sequences that were classified into: (i) coding for hypothetical protein or mismatched in databases (unknown) corresponding to 20.94%; (ii) transcripts for cellular process 17.86%; and (iii) transcripts coding for toxic protein with 61.21%. Among toxic proteins the SVMPs were the most abundant transcripts 58.59%. Other toxic transcripts were C-type lectins (15.56%), bradykinin potentiating peptides (11.8%), serineproteases (5.18%), cys-rich secretory proteins (2.28%), vascular endothelial growth factors (2.28%), L-amino acid oxidases (1.86%) and phospholipases A2 (1.45%). The percentages correspond to this snake venom effects, low enzymatic activity and hemorrhagic and clotting activity as main action, derived from the SVMPs, C-type lectin and serineproteases. One of the SVMPs contigs were chosen based on the similarity with ALT-C, the defined sequence was called ALT-Ch (ALT-C homologue) since there has 4 conservative substitutions compared to the previously determined sequence. The ALT-C-h sequence was used in PCR to inclusion the restriction site for BamHI and EcoRI, cloned in pGEX4T-1 and transformed into E. coli AD494 (DE3) for expression. The cell culture was grown until the log fase and induced with IPTG for 3 hours, the expressed protein's identity was confirmed by Western Blotting using Polyclonal antibody Anti-ALT-C. The construction of the R. alternatus venom gland cDNA library provides a source of interesting active biomolecules, such as desintegrinas, to pharmacological applications in pathologies involving integrins like angiogenesis, tumor progression and metastasis. / As desintegrinas são polipeptídeos sem atividade enzimática, ricos em cisteína, geralmente encontrados no veneno de serpentes, possuidoras de um motivo adesivo reconhecedor de integrinas antagonizando ou agonizando a atividade das mesmas. Diversos grupos de pesquisa vêm estudando desintegrinas de venenos de serpentes com o foco em aplicação farmacológica nos processos de progressão e proliferação tumoral, angiogênese, coagulação sanguínea, e osteoporose. Este trabalho apresenta os resultados da construção da biblioteca de cDNA da glândula venenífera de Rinocerophis alternatus e a clonagem e expressão da ALT-C, uma tipo desintegrina, em sistema bacteriano. A biblioteca foi composta por 812 sequências que foram classificadas em: (i) codificantes para proteínas hipotéticas ou sem equivalência nos bancos de dados (unknown) correspondendo a 20,94%; (ii) transcritos para produtos celulares 17,86%; e (iii) transcritos codificantes para proteínas tóxicas 61,21%. Dentre as proteínas tóxicas as SVMPs foram os transcritos mais abundantes com 58,59% dos compostos tóxicos do tecido. Os demais transcritos tóxicos encontrados foram as lectinas do tipo-C (15,56%), peptídeos potenciadores de bradicinina (11,8%), serinoproteases (5,18%), proteínas secretórias ricas em cisteína (2,28%), fatores de crescimento endotelial vascular (2,28%), L-aminoácido oxidases (1,86%) e fosfolipases A2 (1,45%). As percentagens encontradas correspondem aos efeitos do veneno dessa serpente, que possui baixa atividade enzimática e predominate ação hemorrágica e de alteração na coagulação sanguínea derivada da ação das SVMPs, lectinas do tipo-C e serinoproteases. Um dos contigs para SVMPs foi eleito pela similaridade com a ALT-C. A sequência determinada por esse contig foi denominada ALT-C-h (homóloga da ALT-C) por apresentar 4 substituições conservativas da sequência determinada anteriormente. A sequência foi utilizada em PCR para inclusão de sítio de restrição para BamHI e EcoRI, clonado em pGEX4T-1 e transformados em E. coli AD494(DE3) para ensaios de expressão. O cultivo foi crescido até a fase log e a indução expressão realizada com IPTG por 3 horas, a identidade da proteína expressa foi confirmada por western blotting utilizando anticorpo policlonal anti-ALT-C. A construção da biblioteca de cDNA da glândula venenífera de R. alternatus fornece uma fonte de estudo interessante de biomoléculas ativas nos venenos como, por exemplo, as desintegrinas visando aplicações farmacológicas para patologias envolvendo integrinas como angiogênese, progressão e metástase tumoral.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1862.pdf: 1263155 bytes, checksum: 230b57f6daf87a4e312a03d9e4a26d73 (MD5) Previous issue date: 2008-07-02 / Universidade Federal de Sao Carlos / Este estudo avaliou os efeitos da inflamação pulmonar alérgica crônica e do treinamento aeróbio de baixa e moderada intensidades em esteira ergométrica na área de secção transversa (AST) e nos níveis de RNAm da atrogina-1 e MuRF1 no músculo tibial anterior (TA) de camundongo. Foram utilizados 30 animais, divididos em 6 grupos: (1) animais não sensibilizado e não treinado (controle), (2) sensibilizado com ovalbumina (OA); (3) não sensibilizado e treinado a 50% da velocidade máxima - baixa intensidade (Ex50%), (4) não-sensibilizado e treinado a 75% da velocidade máxima - intensidade moderada (Ex75%); (5) sensibilizado com OA e treinado a 50% (OAEx50%), (6) sensibilizado com OA e treinado a 75% (OAEx75%). Não houve diferença na AST entre os grupos. Além disso, não houve diferença na expressão da atrogina-1 e MuRF1 entre os grupos controle e OA. No entanto, todos os grupos treinados apresentaram diminuição da expressão desses genes, quando comparado com os grupos controle e OA. Desse modo, o curto período de OA não induziu atrofia muscular no TA de camundongos. Além disso, o treinamento aeróbio em esteira, em diferentes intensidades regulou de forma negativa as vias de atrofia muscular, independentemente da inflamação alérgica pulmonar. Estes resultados iniciais sugerem que o treinamento aeróbio pode ser usado para impedir degradação mioprotéica inerente ao desuso muscular periférico em doenças respiratórias.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2038.pdf: 5348158 bytes, checksum: 8a697074e2ede1b8364027f59658d726 (MD5) Previous issue date: 2008-05-07 / Universidade Federal de Sao Carlos / Angiogenesis and wound repair are mediated by several growth factors that are strictly released. Alternagin-C (ALT-C), a disintegrin-like protein from the venom of Bothrops alternatus induces in vivo angiogenesis as well as the cyclic peptide derived from its primary structure, with the ECD motif (ALT-C PEP). This study investigated the effects of ALT-C and ALT-C PEP on angiogenesis and expression of growth factors in a model of wounded rat skin. The rats were anaesthetized; one cutaneous excision (4 mm diameter) was made on the back of each animal, close to the cervical area. Animals were then divided into 7 groups (five rats/group): control (treated with vehicle); locally treated with 10, 60 and 100 ng ALT-C or 10, 20 and 100 ng ALT-C PEP ALT-C PEP for 1, 3, 5 or 7 consecutive days. At the end of experiments animals were killed, the skin was removed; the cranial portion was used for histological analysis and from the caudal portion; protein were extracted, separated by SDS-PAGE and VEGF, FGF-1, TGFβ1, PDGF, IGF1 e TGFα expression was analyze a by Western blotting. The results show that both, ALT-C and ALT-C PEP induced the formation of new vessels, stimulate collagen synthesis and modulated the expression of growth factors, mainly VEGF and FGF1. The increase in VEGF expression could be detected up to 7 days after injury. FGF1 was also significantly increased, but at a lesser extension than VEGF. In conclusion, we present a protein belonging to the disintegrin group of snake venom toxins stimulates angiogenesis and collagen synthesis in an injured tissue. ALT-C may exert its effects via integrin binding and growth factor modulation. As angiogenesis is an important event for wound healing, ALT-C and ALT-C PEP could be candidates to the development of a new drug for wounded skin repair or regeneration. / A angiogênese e o reparo tecidual são mediados por vários fatores de crescimento estritamente liberados. A Alternagina-C (ALT-C), uma proteína tipo-desintegrina derivada do veneno de Bothrops alternatus induz angiogênese in vivo, bem como, o peptídeo cíclico derivado de sua estrutura primária contendo o motivo ECD (ALT-C PEP). O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos da ALT-C e do ALT-C PEP sobre a angiogênese e a expressão de fatores de crescimento em um modelo de lesão em pele de rato. Os animais foram anestesiados e foi induzida uma lesão esférica, com punch de 4 mm, na região interescapular. Os animais foram divididos em 7 grupos (5 ratos/grupo): controle (tratado com veículo); tratados com ALT-C (10, 60 ou 100 ng) e ou de ALT-C PEP (10, 20 ou 100 ng) por 1, 3, 5 e 7 dias consecutivos. Ao final do experimento, os animais foram submetidos à eutanásia, a pele lesada foi removida e dividida ao meio. A porção cranial foi usada para análise histológica e da porção caudal, as proteínas foram extraídas, separadas por SDS-PAGE e a expressão de VEGF, FGF-1, TGFβ1, PDGF, IGF1 e TGFα foi analisada por Western blotting. Os resultados demonstram que ambos, ALT-C e ALT-C PEP induzem a formação de novos vasos, estimulam a síntese de colágeno e modulam a expressão de fatores de crescimento, principalmente VEGF e FGF1. O aumento da expressão de VEGF pôde ser detectado até 7 dias após a lesão. O FGF1 também aumentou significativamente, mas em menor extensão do que o VEGF. Em conclusão, apresentamos uma proteína pertencente ao grupo das desintegrinas de veneno de serpentes que estimula a angiogênese e induz a síntese de colágeno em tecido lesado. A ALT-C pode exercer os seus efeitos via ligação com integrina vinculada à modulação de fatores de crescimento. Como a angiogênese é um acontecimento importante para a cicatrização, ambos, ALT-C e ALT-C PEP parecem ser bons candidatos para o desenvolvimento de um novo fármaco auxiliar da regeneração de pele lesada.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5684.pdf: 2471155 bytes, checksum: f035dbceafb88325d3cb0d3fb8280603 (MD5) Previous issue date: 2013-12-10 / Financiadora de Estudos e Projetos / Matrix metalloproteinases (MMPs) are key factors in tumor progression that allow tumor cells to modify the extracellular matrix (ECM) and to release cytokines, growth factors being activated by cell surface molecules such as the integrins. Integrins are major adhesion receptors of cell surface that connect the cells to the external environment enabling its movement. Integrins activate signaling cascades that influence the adhesion, survival and cell proliferation. Important inhibitors of these molecules were found in snake venoms called disintegrins. Alternagin-C (ALT-C) a disintegrin from Rhinocerophis alternatus snake venom has affinity with α2β1 integrin therfore modulating cell adhesion, migration and proliferation. However, the effect of ALT-C on MMP activity has not been described yet. Here, we have found that, ALT-C increased cell migration in MDA-MB-231 at lower concentration (10 nM) and it decreased cell migration at higher concentrations (40, 100 and 1000 nM). ALT-C was able to inhibit MMP-9 activity in human breast cancer (MDA-MB-231) conditioned medium and MMP-2 activity in fibroblastas and human microvascular endothelial cells (HMEC-1) conditioned medium. ALT-C also modulated the expression of angiogenic genes such as VEGF, c-MYC, MMP-2 and MMP-9 and it was able to inhibit transendothelial migration of MDA-MB-231 cells at all concentrations (10, 40, 100 and 1000 nM). In conclusion, ALT-C affects the extracellular matrix remodeling by modulating the activity of MMPs and expression of angiogenic genes essential for tumor growth as well as decreased cell migration. / As metaloproteinases de matriz (MMPs) são fatores chave na progressão tumoral, pois participam do remodelamento da matriz extracelular (ECM), liberam citocinas, fatores de crescimento e são reguladas por moléculas da superfície celular (integrinas). As integrinas são os principais receptores de adesão da superfície celular. Elas interagem com proteínas presentes na matriz extracelular conectando as células ao meio no qual estão inseridas possibilitando sua locomoção e a participação em cascatas de sinalização que influenciam a adesão, sobrevivência e a proliferação celular. Importantes inibidores dessas moléculas foram encontrados em venenos de serpentes denominados de desintegrinas. Alternagina-C (ALT-C), uma desintegrina de veneno da serpente Rhinocerophis alternatus, tem afinidade para a integrina α2β1, modula a adesão, migração e a proliferação celular mas não há nenhum estudo publicado sobre sua influência na atividade das MMPs. Nesse estudo, a ALT-C foi capaz de aumentar a migração celular em MDA-MB-231 em baixa concentração (10 nM) e diminuir a migração em concentrações mais elevadas (40, 100 e 1000 nM). ALT-C também inibiu a atividade de MMP-9 em meio condicionado de células de carcinoma de mama (MDAMB- 231) e atividade de MMP-2 em meio condicionado de fibroblastos e células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1). A desintegrina também foi capaz de modular a expressão de genes angiogênicos como VEGF, c-MYC, MMP-2 e MMP-9 e inibir a transmigração das células tumorais através das células endoteliais. Conclui-se que a ALT-C atua no remodelamento da matriz extracelular do microambiente tumoral por modular a atividade de MMPs e a expressão de genes angiogênicos essenciais no crescimento tumoral, bem como diminuindo a migração celular.