Notre travail a permis tout d’abord d’investiguer les effets des nucléotides extracellulaires sur les cellules dendritiques (DCs) qui sont des cellules présentatrices d’antigènes capables d’initier et de réguler la réponse immunitaire. Afin d’avoir une vue globale de l’action des nucléotides extracellulaires sur les DCs, un profil d’expression génique de l’ATPgS – dérivé stable de l’ATP - a été réalisé par microarray dans les cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDCs). Notre groupe a préalablement montré que malgré que l’ATP est considéré comme un signal de danger, il confère des propriétés immunosuppressives aux DCs (Marteau et al, 2005). Nous nous sommes focalisés sur des régulations géniques pouvant être mises en relation avec un action anti-inflammatoire de l’ATP. Nous avons ainsi démontré que l’ATP était capable d’inhiber la sécrétion des chimiokines MCP-1 et MIP- 1a initiée par l’action du LPS, ce qui a pour conséquence de diminuer la capacité des DCs à recruter des monocytes ou d’autres DCs. Ce travail a fait l’objet d’une publication en tant que premier auteur (Horckmans et al, 2005). Un grand nombre d’autres gènes régulés liés à la réponse immune et à l’inflammation a été identifiée dans le profil microarray de l’ATPgS. Nous avions notamment pu identifier une augmentation de la sécrétion de VEGF-A en réponse à l’ATP, amplifiée en présence de LPS. Cette régulation est extrêmement intéressante au vu de l’action immunosuppressive du VEGF sur les DCs. Par ailleurs, cette régulation pourrait constituer un lien entre les DCs et l’angiogénese. Ce travail a fait l’objet d’une publication en tant que premier co-auteur dans la revue Journal of Immunology (Bles et al, 2007). En conclusion, nos données nous ont ainsi permis de montrer que les nucléotides adényliques peuvent avoir par leur action sur les cellules dendritiques une action anti-inflammatoire voire pro-angiogénique, en inhibant le recrutement leucocytaire et une action immunosuppressive en stimulant la sécrétion de VEGF.

La circulation des cellules, du sang vers les tissus, est guidée par des molécules exprimées spécifiquement au niveau des cellules endothéliales constituant les vaisseaux sanguins. Les molécules conférant la spécificité de la localisation sont différentes selon l'organe et le microenvironnement considérés. A partir de lignées endothéliales spécifiques d'organes, les études menées sur le rôle des chimiokines et de leurs récepteurs dans la spécificité de l'endothélium ont montré que l'activité biologique de certaines chimiokines est restrictive à une lignée endothéliale en terme de recrutement des lymphocytes et par leur capacité à augmenter la formation de vaisseaux sanguins (angiogénèse) in vitro. De plus, notre modèle d'inflammation cutanée basé sur les cellules endothéliales de la peau, a permis des études plus appliquées mettant en évidence des molécules anti-inflammatoires vis-à-vis de l'endothélium de la peau en collaboration avec la Société BioEurope du groupe Solabia.

Malgré les progrès considérables qui ont été réalisés depuis une trentaine d'années, le cancer demeure un ennemi redoutable. Néanmoins, de nombreuses études épidémiologiques ont montré qu'une alimentation riche en fruits et légumes réduit les risques de développer le cancer. Nous savons également que l'angiogenèse, ou la formation de nouveaux vaisseaux à partir de capillaires préexistants, joue un rôle crucial dans la croissance des tumeurs et dans leur dissémination sous forme de métastases. En conséquence, l'objectif de ce projet est de caractériser les effets antiangiogéniques d'une famille de composés omniprésents dans notre alimentation, les flavonoides, en particulier, les flavonols, kaempférol et myricétine, et les flavones, lutéoline et apigénine. Pour y parvenir, nous avons d'abord procédé à des tests de migration cellulaire et d'invasion de Matrigel™ en chambre de Boyden à l'aide de cellules musculaires lisses d'artère pulmonaire (PASMCs). Les données obtenues montrent qu'apigénine, lutéoline el myricétine inhibent grandement la migration et l'invasion cellulaire, et que les niveaux d'inhibition sont comparables à ceux observés avec des médicaments synthétiques. Ensuite, nous avons réalisé des études de marqueurs moléculaires tels que la phosphorylation du récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR-β), de la protéine kinase régulatrice des signaux extracellulaires (ERK) et de la protéine Akt, el ce, toujours avec des PASMCs. L'inhibition de la phosphorylation du récepteur PDGFR-β, de la protéine ERK et Akt par I'apigénine et la lutéoline a également été observée. Nous nous sommes également assurés que les effets observés n'étaient pas dus à la toxicité des molécules étudiées en effectuant des tests de viabilité cellulaire au bleu de trypan. Nous avons poursuivi en analysant la sécrétion de la proMMP-2 et du VEGF par les PASMCs lorsqu'elles sont stimulées au PDGF-BB. Les résultats obtenus montrent que la sécrétion de VEGF est inhibée par les flavones alors que seule la lutéoline affecte la sécrétion de la proMMP-2. Finalement, nous avons réalisé des études in vivo sur un modèle animal de souris immunosupprimées, soit des souris CrI:CDl® Foxnlnu. Ce modèle a permis de mettre en lumière le potentiel antiangiogénique in vivo des flavones. En somme, tous les résultats obtenus in vivo et in vitro indiquent que les flavones, lutéoline et apigénine. ont un fort potentiel antiangiogénigue. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cancer, Angiogenèse, Flavonoïdes, Cellules musculaires lisses, PDGFR.

Depuis les observations du Professeur Trousseau en 1865, le lien entre la progression tumorale et les désordres thrombotiques a été établi. Les patients atteints de cancer sont plus à risque de développer des coagulopathies dues au caractère pro-coagulant des cellules tumorales. Celles-ci induisent une hypercoagulation afin de synthétiser une matrice de fibrine qui servira de support pour la croissance tumorale. Suite à sa stabilisation matricielle, la tumeur sécrète plusieurs agents angiogéniques afin d'induire sa propre vascularisation. La suractivation du système de coagulation contribue alors à la croissance et à l'angiogenèse tumorale et le maillon commun semble être le facteur tissulaire. Cette glycoprotéine transmembranaire est exprimée de manière ubiquitaire dans les tissus subendothéliaux. Son rôle est d'initier la coagulation extrinsèque; lorsque l'intégrité vasculaire est atteinte, le facteur tissulaire est exposé au flux sanguin qui contient son ligand naturel, le facteur VIl. Ces derniers s'associent et le complexe pro-coagulant formé active la thrombine qui convertit le fibrinogène soluble en caillot de fibrine insoluble qui se loge au niveau de la blessure afin de rétablir l'hémostase. Le facteur tissulaire est également impliqué dans la vascularisation embryonnaire car selon certaines études, une délétion totale du gène entraîne une mort in utéro de l'embryon directement causé par un déficit de vascularisation. À l'inverse, sa surexpression entraîne un phénotype pathogénique tel qu'observé chez plusieurs lignées tumorales. Les objectifs de cette étude ont été d'évaluer l'effet de la surexpression du facteur tissulaire sur les propriétés angiogéniques des cellules endothéliales de l'aorte bovine ainsi que de caractériser la capacité du complexe pro-coagulant à induire la migration des cellules épithéliales issues de carcinome rénal humain. Les résultats indiquent que la surexpression endothéliale du facteur tissulaire induit la migration et la formation de structures de type capillaire de manière dépendante et indépendante des mécanismes de l'hémostase. De plus, le complexe pro-coagulant induit la migration des cellules épithéliales métastatiques de carcinome rénal mais non de leur contrepartie non-métastasique qui est caractérisée par une plus haute expression du facteur tissulaire. Finalement, les cellules épithéliales métastatiques et non-métastatiques induisent des différents profils d'activation de la protéine extracellular signal regulated kinase qui régule plusieurs processus cellulaires dont la migration. Ces résultats indiquent alors que le facteur tissulaire est impliqué dans l'angiogenèse et dans la progression tumorale selon des mécanismes qui impliquent ou non l'activité du complexe pro-coagulant. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Facteur tissulaire, Complexe pro-coagulant, Angiogenèse, Cellules endothéliales tumorales, Coagulopathies et cellules épithéliales de carcinome rénal.

La mélanotransferrine (MTf) a tout d'abord été identifiée comme étant un antigène majeur des mélanomes. Son expression a par la suite été rapportée dans plusieurs cellules néoplasiques et quelques tissus sains. Bien que la majorité de la MTf soit associée à la membrane plasmique, une faible portion est sécrétèe dans le milieu extracellulaire sous forme soluble. Notre équipe a récemment démontré que la MTf régulait l'activation du plasminogène et la motilité cellulaire in vitro. Les activateurs du plasminogène sécrétés par les cellules cancéreuses catalysent la conversion du plasminogène en protéase active. La plasmine joue un rôle central dans la progression tumorale en dégradant les protéines de la membrane basale et de la matrice extracellulaire (MEC). Ce remodelage tissulaire facilite grandement l'angiogenèse et l'invasion des cellules cancéreuses vers les tissus adjacents. Le premier objectif de cette thèse fut de démontrer que la MTf favorise l'activation du plasminogène par son activateur de type tissulaire (tPA). À cet effet, une forme recombinante tronquée de la MTf (sMTf) a été utilisée. En présence de plasminogène et de tPA, la sMTf stimule la formation de plasmine dans le milieu extracellulaire de cellules endothéliales (CE) et accroît la dégradation de la fibronectine, une des composantes de la MEC. La dégradation de la MEC conduit au détachement des CE et à leur mort par anoïkis. Ces données suggèrent que la sMTf possède des propriétés anti-angiogéniques en induisant l'anoïkis des CE. Nous avons ensuite évalué ses effets sur le développement angiogénique et sur la croissance tumorale in vivo. Les résultats montrent que la sMTf inhibe significativement la croissance de tumeurs sous-cutanées dérivées de glioblastome et de carcinome pulmonaire humains chez la souris immunosupprimée. Nous démontrons également que le traitement à la sMTf entraîne une réduction de l'expression du marqueur vasculaire d'endogline, de même qu'une diminution de la quantité d'hémoglobine au sein des tumeurs sous-cutanées de glioblastomes. L'ensemble de ces résultats démontre clairement que la sMTf réduit l'angiogenèse et la croissance tumorale in vivo. Tout comme la forme recombinante tronquée, la MTf membranaire (mMTf) interagit avec le système d'activation du plasminogène. La formation de plasmine à proximité de la membrane plasmique favorise l'invasion des cellules tumorales et le développement métastatique. La participation de la mMTf dans la formation de métastases cérébrales a donc été évaluée pour une lignée cellulaire de mélanome humain. Les résultats indiquent la présence de cellules exprimant la MTf humaine dans les cerveaux de souris ayant reçu une injection intraveineuse de cellules de mélanome humain. De même, l'administration d'un anticorps monoclonal dirigé contre la MTf humaine (L235) a réduit de moitié le développement de métastases cérébrales de mélanomes chez la souris. Ces résultats démontrent que l'implication de la mMTf dans l'activation du plasminogène faciliterait la migration des cellules cancéreuses à travers la barière hémato-encéphalique (BHE) et l'invasion du système nerveux central. Les principales contributions de ce travail sont d'avoir démontré d'une part que la sMTf induit le détachement des cellules endothéliales par stimulation de la cascade d'activation du plasminogène. D'autre part, la sMTf entraîne l'inhibition du développement angiogénique et de la croissance tumorale chez la souris. Puis, l'expression de la MTf à la surface des cellules cancéreuses facilite leur migration à travers la BHE dans le but de produire des métastases cérébrales. Cette étude identifie la MTf clairement comme une cible intéressante dans la progression tumorale, tout en suggérant des outils thérapeutiques comme la sMTf recombinante ou une forme humanisée du L235. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Croissance tumorale, Angiogenèse, Métastases cérébrales, Barrière hémato-encéphalique, Mélanotransferrine, Mélanome, Plasminogène.

Les leucémies aigües se caractérisent par une prolifération incontrôlée et par l'augmentation accrue de cellules hématopoïétiques immatures dans la circulation sanguine conduisant à l'infiltration de nombreux organes. Un certain nombre de mécanismes tels que la protéolyse matricielle, l'adhérence cellulaire et l'angiogénèse participent à ce processus d'infiltration extramédullaire et favorisent l'apparition de rechute suite au traitement chimio-thérapeutique. Notre projet s'intéresse à l'éthoxyfagaronine, une benzo(c)phénantridine dérivée de la fagaronine. Au cours de notre étude, nous avons mis en évidence la capacité de l'Etxfag à réduire le potentiel invasif des cellules L1210 impliquant une diminution de l'expression de la MT-MMP à la membrane plasmique ainsi qu'une inhibition du système activateur du plasminogène. Nous mettons également en évidence la capacité de l'Etxfag à diminuer l'adhérence des cellules L1210 au peptide de fibronectine WQPPRARI. Cette diminution implique une déstructuration des radeaux lipidiques empêchant le clustering des intégrines beta1 et leur interaction avec le peptide de fibronectine. Nous montrons également la diminution de l'activation des voies de signalisation dépendantes des intégrines telles que FAK, PYK2 et la PI3-kinase. Notre étude a également porté sur les effets anti-angiogéniques de l'Extfag. Nous montrons la capacité de l'Extfag à réduire l'angiogénèse par l'utilisation de modèle in vitro, ex vivo et in vivo. Cet effet anti-angiogénique semble être lié à une altération des propriétés migratoires des cellules endothéliales. L'ensemble de ces résultats souligne le potentiel anti-leucémique de l'Extfag qui pourrait représenter un nouvel agent chimio-thérapeutique capable de prévenir la dissémination des cellules leucémiques. / Acute leukemias are characterized by uncontrolled proliferation and increased immature hematopoietic cells in the bloodstream leading to the infiltration of many organs. A number of mechanisms such as matrix proteolysis, cell adhesion and angiogenesis are involved in extramedullary infiltration process and promote the appearance of relapse after chemotherapeutic treatment. Our project focuses on the ethoxyfagaronine (Extfag), a benzo(c)phenanthridine derivative of fagaronine. In our study, we demonstrated the ability of the Extfag to reduce the invasive potential of L1210 cells by decreasing MT1-MMP expression to the plasma membrane and by inhibiting the plasminogen activator system. We also demonstrated the ability of Extfag to reduce the adhesion of L1210 cells to fibronectin peptide WQPPRARI. This reduction implies a disorganization of lipid rafts preventing clustering of beta1 integrins and their interaction with fibronectin peptide. We also have shown a decrease of integrin-dependent signaling pathways activation such as FAK, PYK2 and PI3-kinase. We have also studied the anti-angiogenic effects of Extfag. We have shown the ability of the Extfag to reduce angiogenesis by using in vitro, ex vivo and in vivo model. This antiangiogenic effect seems to be related to altered migratory properties of endothelial cells. Taken together, these results highlight the anti-leukemic potential of Extfag which could represent a new chemotherapeutic agent capable of preventing leukemic cells dissemination.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le médulloblastome est la tumeur maligne du cerveau la plus répandue chez l'enfant. C'est un cancer très agressif, avec près de 30 % des enfants qui présentent des métastases lors du diagnostic initial. En réponse à divers signaux, les cellules cancéreuses s'échappent de la tumeur primaire et empruntent généralement les nombreux vaisseaux sanguins immatures issus de l'angiogenèse tumorale afin de se disséminer dans l'organisme. Les récepteurs à tyrosine kinase sont responsables de la majorité des signaux cellulaires cruciaux dans les processus d'angiogenèse tumorale et de formation de métastases. Dans un contexte de prévention et de traitement du cancer par l'alimentation, ces derniers représentent des cibles de choix pour de nombreuses molécules issues de la diète telles que certains flavonoïdes. La croissance de la plupart des cancers, incluant les cancers cérébraux, dépend d'une vascularisation adéquate et l'inhibition de l'angiogenèse tumorale pourrait être une stratégie efficace afin de bloquer ou retarder la croissance tumorale. Récemment, les approches antiangiogéniques se sont diversifiées afin de viser non seulement les cellules endothéliales, mais également les cellules musculaires lisses qui contribuent à la maturation et à la stabilisation des vaisseaux sanguins. Nous avons démontré précédemment que la delphinidine, un constituant actif majeur des baies, inhibe la phosphorylation du « vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-2 » ou VEGFR-2 induite par le VEGF et bloque l'angiogenèse in vitro et in vivo. Dans cette étude, nous démontrons que la delphinidine inhibe également l'activation du « platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) receptor-β » ou PDGFR-β dans les cellules musculaires lisses et que cette inhibition contribuerait à l'effet antitumoral de cette molécule. L'effet inhibiteur de la delphinidine sur PDGFR-β est très rapide et mène à l'inhibition de l'activation de ERK-1/2 et de la motilité des cellules musculaires lisses induite par le PDGF-BB. De plus, la delphinidine empêche la différenciation et la stabilisation des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses en un réseau de tubes similaires à des capillaires dans un modèle de coculture en trois dimensions. Dans un modèle d'implant de Matrigel chez la souris, nous avons démontré qu'un extrait de baies riche en anthocyanes est en mesure d'inhiber la formation synergique de vaisseaux sanguins par le « fibroblast growth factor-2 » ou FGF-2 et le PDGF-BB. Le gavage de souris nues avec ce même extrait a également retardé de manière significative la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe de cancer du poumon. Ensemble, ces résultats permettent de mieux comprendre les mécanismes responsables de l'activité antiangiogénique de la delphinidine, procurant des informations importantes dans le développement de stratégies efficaces de prévention du cancer par l'alimentation. Récemment, le « hepatocyte growth factor » ou HGF et son récepteur à tyrosine kinase Met, se sont imposés comme des éléments clés de la croissance et de la propension à former des métastases dans les médulloblastomes chez l'humain, suggérant que l'inhibition de cette voie de signalisation pourrait être une cible intéressante dans la prévention et le traitement de cette maladie. Au cours de cette étude, nous avons démontré que différents flavonols d'origine alimentaire, soit la quercétine, le kaempferol et la myricétine, inhibent l'axe de signalisation HGF/Met dans une lignée de cellules de médulloblastomes (DAOY). Cet effet prévient la formation de sites riches en actine corticale à la membrane et résulte en l'inhibition de la migration cellulaire induite par Met. De plus, la quercétine et le kaempferol diminuent fortement l'activation de Akt induite par le HGF et ce, à des concentrations pouvant être atteintes par l'alimentation. Ces résultats indiquent que la quercétine, le kaempferol et la myricétine sont des inhibiteurs de l'activité de Met issus de l'alimentation, ce qui suggère que cet effet inhibiteur pourrait contribuer aux propriétés chimiopréventives de ces molécules. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cancer, Alimentation, Prévention, Angiogenèse, Médulloblastomes, Flavonoïdes.

Les glioblastomes (GBM) sont des tumeurs intracrâniennes caractérisées par une résistance très élevée aux thérapies classiques en raison d'un degré de néovascularisation accru et un phénotype extrêmement infiltrant. Malgré de nombreuses études menées à ce sujet, ce cancer du cerveau reste jusqu'à ce jour essentiellement incurable. Cet ouvrage traite de l'action moléculaire du TLN-4601, un nouvel agent anti-cancéreux capable de traverser la barrière hémato-encéphalique et de s'accumuler de manière préférentielle au niveau de la tumeur. Ces propriétés ont permis au composé d'être reconnu comme traitement thérapeutique pour combattre les tumeurs cérébrales. Ce projet se veut donc être à l'interface entre la caractérisation moléculaire du mécanisme d'action et le ciblage thérapeutique de la molécule envers différentes lignées de GBM humains. Dans le but d'étudier l'effet thérapeutique du médicament sur les GBM, trois modèles cellulaires ont été utilisés soit les U87 MG, les U87 EGFRwt et les U87 EGFRvIII. L'amplification du récepteur à l'EGF (EGFR) de type sauvage et du récepteur tronqué EGFRvIII sont des anomalies génétiques communément observées chez ce type de tumeur. Ces phénotypes tumoraux sont notamment corrélés à la résistance des GBM aux traitements conventionnels de chimiothérapie. Le premier volet de cette étude a permis de déterminer que TLN-4601 antagonise le caractère infiltrant des glioblastomes en ciblant deux voies de signalisation associées au développement tumoral soit les voies de RAS/MAPK et de P13K/AKT. Il a également été démontré que le médicament augmente la sensibilité des cellules tumorales à la mort cellulaire via un processus apoptotique impliquant une modulation à la baisse de la phosphorylation de BAD, une augmentation de l'activité caspasique et un clivage de PARP. D'autre part, les résultats montrent que les U87 EGFRvlII semblent être plus réfractaires au médicament comparativement aux deux autres lignées à l'étude. Le second volet de l'étude a permis de caractériser les propriétés anti-angiogéniques du TLN-4601. Il a été établi que le composé inhibe le recrutement des cellules endothéliales (CE) au foyer tumoral en antagonisant leur potentiel migratoire, la tubulogénèse et la synthèse de VEGF par les glioblastomes, un des principaux messagers biochimiques impliqués dans l'angiogenèse. Cet effet pourrait résulter de l'inhibition par TLN-4601 des voies de signalisation RAS/MAPK et PI3K/AKT également observée chez les CE. Finalement, une action cytotoxique du médicament plus spécifique envers le compartiment cérébral tumoral par rapport à l'endothélium vasculaire semble être relevée. Cette action serait associée à la surexpression des récepteurs périphériques benzodiazépines (PBR), chez les glioblastomes comparativement aux cellules endothéliales. De manière globale, nous rapportons que l'action thérapeutique du TLN-4601 semble réduire la nature extrêmement infiltrante des glioblastomes et l'angiogénèse tumorale qui sont des évènements indispensables à la progression des cancers cérébraux. De plus, la cytotoxicité préférentielle du médicament envers les tissus cancéreux plutôt que les tissus sains fait état de la sélectivité du produit. Ces effets thérapeutiques multiples répertoriés dans cette étude justifient son utilisation en tant qu'agent chimiothérapeutique dans la lutte contre le GBM. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : TLN-4601, Glioblastomes, Cellules endothéliales cérébrales, PI3K/AKT, RAS/MAPK, Angiogénèse, Invasion tumorale, Apoptose.