Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T13:17:51Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Diego de Hollanda Cavalcanti Tavares.pdf: 2494574 bytes, checksum: e8dc89834e1cb3194cbb61de8f169119 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T13:17:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Diego de Hollanda Cavalcanti Tavares.pdf: 2494574 bytes, checksum: e8dc89834e1cb3194cbb61de8f169119 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / FACEPE / No Nordeste brasileiro, a Leishmaniose Visceral (LV), provocada pela infecção com a Leishmania chagasi, é um sério problema de saúde pública cujo controle depende de um diagnóstico precoce dos reservatórios caninos e indivíduos afetados. Antígenos recombinantes são a melhor solução para o uso no diagnóstico sorológico e, em trabalhos prévios, novos antígenos de L. chagasi foram identificados com este propósito. Quando analisados por reações imunoenzimáticas os mesmos apresentaram uma sensibilidade variável e uma alta especificidade no diagnóstico da LV, e em misturas com dois ou mais antígenos houve um aumento da sensibilidade sem prejuízo da especificidade. A produção de um sistema de diagnóstico com mais de um antígeno, entretanto, aumenta os custos de fabricação e padronização. Neste trabalho, partimos de genes sintéticos (dof1, dof2 e dof3) desenhados com as melhores características (domínios repetitivos, regiões polares, epítopos para MHC) de antígenos selecionados e clonados em vetores plasmidiais. A partir de várias etapas de subclonagem estes genes foram utilizados na construção de genes quiméricos, codificando para as regiões repetitivas dos antígenos em diferentes combinações (3-2-1, 3-1-2 e 1-3-2). Os genes quiméricos, clonados em vetores plasmidiais de expressão, foram usados para a produção das respectivas proteínas em Escherichia coli, fusionadas a um motivo de poli-histidinas na sua extremidade N-terminal. Após purificação, via cromatografia de afinidade, estas proteínas foram avaliadas por ensaios de ELISA-indireto com soros humanos, onde se obteve alta sensibilidade e especificidade para as três proteínas, mesmo em diluições elevadas de soro. Estes resultados confirmam o potencial de uso das proteínas quiméricas como alternativa no diagnóstico da LV.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:03:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8782_1.pdf: 273291 bytes, checksum: 2a96750488e896524818e83f5a20ad79 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2002 / A infecção pelo Tripanosoma cruzi resulta no desenvolvimento de intensa produção de anticorpos e resposta imune celular durante as fases aguda e crônica da doença. O presente trabalho investigou o grau de estimulação da resposta imune, humoral e celular em camundongos BALB/c imunizados com o Ag-Rec CRA de T. cruzi, visando sua utilização em ensaios de imunoproteção. Foram avaliados o perfil isotípico das imunoglobulinas IgG, a reação de hipersensibilidade cutânea, a resposta proliferativa de linfócitos esplênicos e a produção de citocinas intracitoplasmáticas. Os resultados mostraram que o Ag-Rec CRA induziu: 1) um aumento significativo na produção de anticorpos de isotipos IgG2a e IgG3: 2) a produção de IFN-γ por células CD4+ indicando que o CRA induz uma resposta celular tipo Th1 e 3) a produção de TNF-α por células CD8+. Não foi observada diferença significativa na resposta proliferativa associada aos linfócitos T esplênicos frente ao Ag-Rec CRA, quando comparado ao grupo controle sem estimulação. Os animais imunizados com Ag-Rec CRA manifestaram reações de hipersensibilidade imediata, alcançando um pico máximo e, 2 h após a injeção do antígeno, diminuindo lentamente em 24 h. Estes resultados mostraram que o Ag-Rec CRA ativa mecanismos imunes envolvidos na eliminação do parasita e poderá ser importante em induzir a imunidade protetora

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-07-08T18:14:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 598809 bytes, checksum: da4fcddb92f744134bf824e490839654 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-08T18:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 598809 bytes, checksum: da4fcddb92f744134bf824e490839654 (MD5) / CAPES / Em um estudo prévio, cinco antígenos recombinantes de Leishmania chagasi foram selecionados, através de soro de cão, para avaliação como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. Um desses antígenos, denominado Lc9, foi posteriormente utilizado isoladamente ou em combinação com diversos adjuvantes para imunizar camundongos. Após a injeção de Lc9 isoladamente ou em associação com saponina ocorreu indução de resposta imune do tipo Th2 ou mista (Th1/Th2), respectivamente. Interleucina-12 é uma citocina que pode promover o desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 a antígenos co-administrados. No presente trabalho, visando uma modificação adicional da resposta imune a Lc9, de Th1/Th2 para Th1, camundongos foram injetados com um plasmídeo codificando IL-12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) durante a sensibilização realizada com Lc9 e saponina. Grupos de camundongos BALB/c foram submetidos a três séries de injeções, com 21 dias entre cada duas séries consecutivas, por via subcutânea, com salina (G1), saponina em salina (G2), Lc9-saponina (G3). Durante a primeira série de injeções, os animais receberam 50 Mg pcDNA3.1 vazio (G4) ou 50 Mg (G5), 10 Mg (G6), 2 Mg (G7) e 0,4 Mg (G8) de pcDNA3.1-scmuIL-12, por via intramuscular seguida de eletroporação. A resposta imune humoral foi avaliada pela mensuração dos níveis de anticorpos em amostras de soro. A resposta celular foi avaliada por ensaio de linfoproliferação e produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5) por esplenócitos, estimulados in vitro com antígenos de Leishmania. Todos os grupos de animais que receberam Lc9 produziram anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a reativos ao antígeno recombinante Lc9. Nenhum dos grupos apresentou resposta linfoproliferativa significante. Contudo, os grupos (G3 a G7) produziram e todos os grupos que receberam Lc9 (G3 a G8) produziram IL-5. Além disso, apenas os grupos G4 e G8 apresentaram níveis elevados de produção de IL-4. Esses resultados sugerem que camundongos imunizados com Lc9 e saponina desenvolvem uma resposta mista Th1/Th2, e que, nenhuma das doses de plasmídeo codificando IL-12 é capaz de modificar a resposta imune para tipo Th1.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-07-28T15:38:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604063 bytes, checksum: 33f2042850962bea522205a8088c5d7f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T15:38:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604063 bytes, checksum: 33f2042850962bea522205a8088c5d7f (MD5) / CAPES / Em um estudo prévio, cinco antígenos recombinantes de Leishmania chagasi foram selecionados, através de soro de cão, para avaliação como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. Um desses antígenos, denominado Lc9, foi posteriormente utilizado isoladamente ou em combinação com diversos adjuvantes para imunizar camundongos. Após a injeção de Lc9 isoladamente ou em associação com saponina ocorreu indução de resposta imune do tipo Th2 ou mista (Th1/Th2), respectivamente. Interleucina-12 é uma citocina que pode promover o desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 a antígenos co-administrados. No presente trabalho, visando uma modificação adicional da resposta imune a Lc9, de Th1/Th2 para Th1, camundongos foram injetados com um plasmídeo codificando IL-12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) durante a sensibilização realizada com Lc9 e saponina. Grupos de camundongos BALB/c foram submetidos a três séries de injeções, com 21 dias entre cada duas séries consecutivas, por via subcutânea, com salina (G1), saponina em salina (G2), Lc9-saponina (G3). Durante a primeira série de injeções, os animais receberam 50 Mg pcDNA3.1 vazio (G4) ou 50 Mg (G5), 10 Mg (G6), 2 Mg (G7) e 0,4 Mg (G8) de pcDNA3.1-scmuIL-12, por via intramuscular seguida de eletroporação. A resposta imune humoral foi avaliada pela mensuração dos níveis de anticorpos em amostras de soro. A resposta celular foi avaliada por ensaio de linfoproliferação e produção de citocinas (IFN- , IL-4 e IL-5) por esplenócitos, estimulados in vitro com antígenos de Leishmania. Todos os grupos de animais que receberam Lc9 produziram anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a reativos ao antígeno recombinante Lc9. Nenhum dos grupos apresentou resposta linfoproliferativa significante. Contudo, os grupos (G3 a G7) produziram e todos os grupos que receberam Lc9 (G3 a G8) produziram IL-5. Além disso, apenas os grupos G4 e G8 apresentaram níveis elevados de produção de IL-4. Esses resultados sugerem que camundongos imunizados com Lc9 e saponina desenvolvem uma resposta mista Th1/Th2, e que, nenhuma das doses de plasmídeo codificando IL-12 é capaz de modificar a resposta imune para tipo Th1.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-08-02T13:40:35Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604067 bytes, checksum: 51a4b0b58210591c4a63d6fe7c4dc919 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T13:40:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604067 bytes, checksum: 51a4b0b58210591c4a63d6fe7c4dc919 (MD5) / CAPES / Em um estudo prévio, cinco antígenos recombinantes de Leishmania chagasi foram selecionados, através de soro de cão, para avaliação como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. Um desses antígenos, denominado Lc9, foi posteriormente utilizado isoladamente ou em combinação com diversos adjuvantes para imunizar camundongos. Após a injeção de Lc9 isoladamente ou em associação com saponina ocorreu indução de resposta imune do tipo Th2 ou mista (Th1/Th2), respectivamente. Interleucina-12 é uma citocina que pode promover o desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 a antígenos co-administrados. No presente trabalho, visando uma modificação adicional da resposta imune a Lc9, de Th1/Th2 para Th1, camundongos foram injetados com um plasmídeo codificando IL-12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) durante a sensibilização realizada com Lc9 e saponina. Grupos de camundongos BALB/c foram submetidos a três séries de injeções, com 21 dias entre cada duas séries consecutivas, por via subcutânea, com salina (G1), saponina em salina (G2), Lc9-saponina (G3). Durante a primeira série de injeções, os animais receberam 50 Mg pcDNA3.1 vazio (G4) ou 50 Mg (G5), 10 Mg (G6), 2 Mg (G7) e 0,4 Mg (G8) de pcDNA3.1-scmuIL-12, por via intramuscular seguida de eletroporação. A resposta imune humoral foi avaliada pela mensuração dos níveis de anticorpos em amostras de soro. A resposta celular foi avaliada por ensaio de linfoproliferação e produção de citocinas (IFN- , IL-4 e IL-5) por esplenócitos, estimulados in vitro com antígenos de Leishmania. Todos os grupos de animais que receberam Lc9 produziram anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a reativos ao antígeno recombinante Lc9. Nenhum dos grupos apresentou resposta linfoproliferativa significante. Contudo, os grupos (G3 a G7) produziram e todos os grupos que receberam Lc9 (G3 a G8) produziram IL-5. Além disso, apenas os grupos G4 e G8 apresentaram níveis elevados de produção de IL-4. Esses resultados sugerem que camundongos imunizados com Lc9 e saponina desenvolvem uma resposta mista Th1/Th2, e que, nenhuma das doses de plasmídeo codificando IL-12 é capaz de modificar a resposta imune para tipo Th1.

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-14T15:24:05Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - Samara Alves Sá Teles.pdf: 1106383 bytes, checksum: 1bb15f702feb2f073001225aaae2d132 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-29T13:56:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - Samara Alves Sá Teles.pdf: 1106383 bytes, checksum: 1bb15f702feb2f073001225aaae2d132 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T13:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - Samara Alves Sá Teles.pdf: 1106383 bytes, checksum: 1bb15f702feb2f073001225aaae2d132 (MD5) / CAPES / Com o aumento da prevalência de doenças inflamatórias, em especial as alérgicas, a busca por estratégias terapêuticas visando à melhoria de vida dos indivíduos doentes tornou-se um vasto campo de pesquisa. Neste âmbito, o uso de helmintos e derivados que possuem potencial imunomodulatório tem se mostrado eficiente na inibição da inflamação em modelos experimentais dessas doenças. Objetivo: Produzir e analisar, in silico, o antígeno recombinante do Trichuris trichiura homólogo ao fator inibidor de migração de macrófagos (rTt-MIF) e avaliar seu efeito em cultura de células monomorfonucleares de sangue periférico (CMSP) de indivíduos atópicos e não atópicos. Métodos: A análise in silico da proteína foi realizada utilizando diversas ferramentas de bioinformática. A sequência codificadora do antígeno recombinante foi sintetizada e clonada em um plasmídeo de expressão, a partir do qual foi realizada a expressão heteróloga da proteína em sistema procarioto, com posterior purificação por cromatografia de afinidade e determinação do conteúdo proteico e de endotoxina. Após teste cutâneo e dosagem de IgE por ImunoCAP, foram selecionados 12 indivíduos não atópicos e 14 indivíduos atópicos cujo sangue periférico foi coletado para realizar o cultivo de células monomorfonucleares. As células foram cultivadas sob três condições: estímulo do rTt-MIF, meio de cultivo sem estímulo e estimuladas por Pokeweed ou LPS. Após o cultivo, os sobrenadantes foram coletados para realização da dosagem das citocinas IL-10, IFN-γ, IL-5 e IL-17A. Resultados: A molécula caracterizada como estável e solúvel foi produzida, obtida na quantidade de 2,4 mg/mL com 1,9 EU/mL. O rTt-MIF induziu o aumento da produção de IL-10 pelas células dos indivíduos atópicos (P=0,0001) e dos não atópicos (P=0,0005). Em relação às citocinas IFN-γ, IL-5 e IL-17, o rTt-MIF não induziu a produção destas pelas células dos indivíduos atópicos e não atópicos. Conclusão: A ação do rTt-MIF sobre o cultivo de células momonucleares do sangue periférico, de aumentar a produção de IL-10 e não induzir a produção de IFN-γ, IL-5 e IL-17A, mostra o potencial imunomodulador dessa molécula, com possível efeito de reduzir a elevação de eosinófilos, neutrófilos e citocinas inflamatórias. / With the increasing prevalence of inflammatory diseases, in particular allergies, the search for therapeutic strategies aiming to improve life quality of sick individuals has become a vast field of research. In this context, the use of helminths and their derivatives that demonstrate potential immunomodulatory effect has been effective in inhibiting inflammation in experimental models of inflammatory diseases. Objective: To produce and analyze in silico the recombinant antigen from Trichuris trichiura homologous to the macrophage migration inhibitory factor (rTt-MIF) and evaluate its effect on peripheral blood mononuclear cells culture (PBMC) of atopic and non-atopic individuals. Methods: Bioinformatics tools made the analysis in silico. The Tt-MIF codifying sequence was synthesized and cloned into a plasmid, allowing the heterologous expression of the protein in a prokaryotic system, with subsequent purification by affinity chromatography and protein and endotoxin quantifications. After prick test and IgE dosage by ImmunoCAP test, 12 non-atopic individuals and 14 atopic individuals were selected, whose peripheral blood were collected to obtain the mononuclear cells (PBMC) for in vitro culture. Cells were stimulated with the rTt-MIF, as negative control cells were cultivated without stimuli and, as positive control, cells were cultivated with Pokeweed or LPS. After the culture, the supernatants were assayed to quantify IL-10, IFN-γ, IL-5 and IL-17A. Results: The protein characterized as soluble and stable was produced and obtained in the amount of 2,4 mg/mL with 1,9 EU/mL. The rTt-MIF induced a stimulatory effect on IL-10 production by cells from atopic individuals (P=0.0001) and by cells from non-atopic individuals (P=0,0005). The rTt-MIF did not induce the production of IFN-γ, IL-5 and IL-17A by cells from atopic and non-atopic individuals. Conclusion: The effects of rTt-MIF increasing IL-10 production and not inducing the production of IFN-γ, IL-5 and IL-17A on human PBMC cultures are indicative of its immunomodulatory potential, with possible effect of decreasing eosinophilic and neutrophilic presence and inducing immune regulation.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-11-21T15:24:13Z No. of bitstreams: 1 Luiz Cosme da Silva Junior.pdf: 2262385 bytes, checksum: 934698e0a82f5115f0317ed2075d1c57 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-21T15:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Cosme da Silva Junior.pdf: 2262385 bytes, checksum: 934698e0a82f5115f0317ed2075d1c57 (MD5) Previous issue date: 2017-08-30 / Financiadora de Estudos e Projetos - Finep / The economic impact caused by Aujeszky's disease (AD) has decreased with the use of vaccines deleted for the gE gene of the AD Virus and diagnostic tests for the detection of antibodies specific to the protein corresponding to the deleted gene for differentiation of infected animals from the vaccinated - DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated individuals). The goal of this work was to clone and express the gene related to the extramembrane portion of the gE glycoprotein of the DA virus in E. coli expression system using synthetic gene with optimized codons and thioredoxin fused protein (Trx), and to evaluate its potential use in ELISA. After cloning, expression and identification of recombinant gE protein (gErec*Trx) in Western blotting with anti-His antibody, gErec*Trx (approximately 60 kDa) was used as antigen in ELISA (ELISAgErec) using Protein G peroxidase as conjugate. Samples previously tested in virus neutralization (VN) and in commercial ELISA were tested in ELISAgErec, and the cutoff point (> 0.13) was defined by ROC curve analysis. A total of 599 sera from pigs were used, of which 208 were positive VN and 391 negative in commercial ELISA for the detection of antigE antibodies from the DA virus, of which 300 originated from Certified Porcine Breeding Farms (GRSCs) and 91 from Technological properties of the State of Pernambuco. ELISAgErec presented sensitivity of 97.6% and specificity of 96.4%. To evaluate the analytical sensitivity and limit of detection, the international reference serum for AD was used, and for analysis of the analytical specificity were tested sera from pigs Pathogen-Specific Free (SPF) vaccinated with the main vaccines used in pigs. ELISAgEr showed greater sensitivity than the commercial ELISA thus demonstrating its ability to distinguish healthy and vaccinated animals from infected animals. In addition, to showing good solubility, gErec remained immunoreactive in the same titre in ELISAgErec after several months stored at 4 °C, and even after thermal stress at 70 °C it presented the same results. / O impacto econômico causado pela Doença de Aujeszky (DA) tem diminuído com uso de vacinas deletadas para o gene gE do Vírus da DA e testes diagnósticos para detecção de anticorpos específicos para a proteína correspondente ao gene deletado, para diferenciação dos animais infectados dos vacinados - DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated individuals). O objetivo com este trabalho foi clonar e expressar o gene referente a porção extramembranar da glicoproteína gE do vírus da DA em sistema de expressão E. coli utilizando gene sintético com códons otimizados e proteína fusionada a tiorredoxina (Trx), e avaliar seu potencial uso em ELISA. Após a clonagem, expressão e a identificação da proteína gE recombinante (gErec*Trx) em Western blotting com anticorpo anti-His, a gErec*Trx (aproximadamente 60 kDa) foi usada como antígeno em ELISA (ELISAgErec) utilizando Proteina G peroxidase como conjugado. Amostras previamente testadas em virusneutralização (VN) e em ELISA comercial foram testadas no ELISAgErec, e o ponto de corte (>0,13) foi definido por análise da curva ROC. Foram utilizados 599 soros de suínos, sendo 208 positivos virusneutralização (VN) e 391 negativos em ELISA comercial para detecção de anticorpos antigE do vírus da DA, sendo 300 oriundas de Granjas de Reprodutores Suínos Certificadas (GRSCs) e 91 de propriedades tecnificadas do estado de Pernambuco. O ELISAgErec apresentou sensibilidade de 97,6% e especificidade de 96,4%. Para avaliar a sensibilidade analítica e o limite de detecção foi testado o soro internacional de referência para a DA, e para avaliação da especificidade analítica foram testados soros de suínos Livre de Patógenos Específicos (SPF) vacinados com as principais vacinas usadas em suínos. O ELISAgEr apresentou maior sensibilidade que o ELISA comercial demonstrando assim sua capacidade de distinguir animais sadios e vacinados dos animais infectados. Além de apresentar boa solubilidade a gErec se manteve imunorreativa no mesmo título no ELISAgErec após vários meses estocada a 4 °C, e mesmo após estresse térmico a 70 °C apresentou mesmos resultados.

A neurocisticercose (NC) é uma doença provocada por larvas de Taenia solium (Tso) no sistema nervoso central. Seu diagnóstico fundamenta-se em critérios clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. A utilização de antígenos parasitários no imunodiagnóstico apresenta desvantagens como: necessidade de animais, ausência de homogeneidade entre lotes, baixo rendimento, e contaminação com proteínas suínas. Assim, os antígenos recombinantes podem otimizar o imunodiagnóstico da NC, pois são reagentes simples e reprodutíveis, sem requerer animais. Este estudo teve como objetivo a obtenção, caracterização e análise da reatividade de proteína recombinante baseada em antígenos de líquido vesicular de Taenia crassiceps (Tcra). Assim, o cDNA foi obtido por amplificação a partir de RNAm de cisticercos de Tcra. A proteína recombinante Tc14 foi produzida em Escherichia coli (DE3) BL21 utilizando-se o vetor de expressão pET-22b e purificada por cromatografia de afinidade. A caracterização antigênica deu-se por Imunoblot (IB) utilizando anticorpos monoclonais (AcMo). Houve reatividade com todos os AcMo utilizados (AcMo anti-antígeno de excreção/secreção de Tcra, AcMo anti-líquido vesicular de Tcra, AcMo antilíquido vesicular de Tso e AcMo anti-antígeno total de Tso), exceto com o AcMo anti-antígeno de escólex de Tso. Utilizando-se 22 amostras de soro e 19 de líquor (LCR) de pacientes com NC, 48 soros e 28 LCR do grupo controle negativo (GCN) e 17 soros de hidatidose do grupo outras parasitoses (OP) em Imunoblot foi observada reatividade na região de 14kDa, correspondente a Tc14, em todas as amostras NC, mas não nos GCN e OP. Em ELISA com Tc14 obteve-se sensibilidade (S) e especificidade (E) de 100% com LCR (29 amostras de NC e 35 do GCN) e S de 95,1% e E de 100% com soro (41 amostras de NC, 52 do GCN). Dentre 51 soros de OP, mostraram-se reagentes um de hidatidose e outro de estrongiloidíase. A análise comparativa entre diferentes antígenos e testes sorológicos apresentou índice de positividade de 100% em IB utilizando os antígenos Tc14 ou LLG (antígeno purificado de Tso com lentil-lectina); já em ELISA, os índices foram de 83,4% para Tc14 e 91,6% para 18/14 (antígeno purificado de líquido vesicular de Tcra com AcMo). Em ensaios de linfoproliferação a porcentagem de respondedores no grupo NC foi de 16,6% (com 0,05 e 0,6 µg de Tc14/poço), 50% (com 0,4 µg de Tc14/poço), 44,4% (com 1,0 µg de Tc14/poço) e 20% (com 2,0 µg de Tc14/poço). Não houve proliferação no GCN. A dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura apresentou reatividade diferenciada entre o GCN e NC para IL-10, sendo uma amostra do GCN reagente e duas amostras de NC não reagentes. Não foi possível detectar IFN-γ. Em ELISA para IgG total 91,7% dos plasmas do grupo NC apresentaram reatividade, sendo a positividade para os isótipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 respectivamente, de 75; 33,3; 50 e 25%. O antígeno recombinante mostrou-se como ferramenta promissora para imunoensaios na NC, abrindo nova perspectiva envolvendo estudos a serem realizados sobre diferentes sistemas de expressão e antigenicidade frente a um número maior de amostras. / The neurocisticercosis (NC) disease is caused by the presence of Taenia solium (Tso) larvae in the central nervous system. Its diagnosis is based on clinical criteria, epidemiological studies and laboratorial exams. Nevertheless, the use of parasite antigenic extracts into the immunodiagnosis presents some disadvantages: it requires animals, lacks of homogeneity between lots, low yield and may become contaminated with swine proteins. Consequently, the utilization of recombinant antigens could optimize the immunodiagnostic of NC, as they are simple and reproducible reagents that do not require animals. This study aimed the capture, characterization and reactivity analysis of the recombinant protein based on antigens of the vesicular fluid of Taenia crassiceps (Tcra). In order to do so, the cDNA was obtained through the amplification deriving from RNAm of cysticerci of Tcra. The recombinant protein Tc14 was produced in Escherichia coli (DE3) BL21 using the expression vector pET-22b and purified by affinity chromatography (nickel resin). The antigenic characterization was performed by immunoblotting (IB) using monoclonal antibodies (MoAb). The recombinant protein presented reactivity with all the MoAb used (Anti-secretion/excretion antigens from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tso MoAb and anti- total antigen from Tso MoAb), except with the anti-antigen from Tso scolex MoAb. The immunoblot was performed using 22 serum samples and 19 cerebrospinal fluid (CSF) from patients with NC, 48 serum and 28 CSF from the negative control group (GCN) and 17 hydatidosis serum from other parasitosis\' group (OP). It showed reactivity in the 14kDa region, correlated to Tc14, in all NC samples, but not presented on GCN and OP. In ELISA with Tc14, the sensibility (S) and specificity (E) of 100% was obtained with CSF (29 NC samples and 35 GCN samples) and 95.1% of S and 100% of E with serum (41 NC samples, 52 GCN samples). Among 51 OP serums, one from hydatidosis and one from strongyloidiasis demonstrated reactivity. The comparative analysis amongst different antigens and serological tests demonstrated positivity of 100% in IB when using the Tc14 antigens or LLG (purified antigen of Tso with lentil lectin). In ELISA, the positivity indicated was of 83.4% for Tc14 and 91.6% for 18/14 (vesicular fluid purified antigen with MoAb from Tcra). In lymphoproliferation tests, the percentage of responders in NC group was of 16.6% (with .0.5 and 6 µg of Tc14/well), 50% (with 0.4 µg of Tc14/well). No proliferation occurred in GCN. The dosage of cytokines in culture supernatants presented different reactivity amongst GCN and NC for IL-10, as one sample of GCN reacted and two NC samples did not. It was not possible to detect IFN-γ. In ELISA for total lgG, 91.7 % of plasmas from NC group presented reactivity, with positivity for the isotypes lgG1, lgG2, lgG3 and lgG4, 75 %, 33.3 %, 50 % and 25 %, respectively. The recombinant antigen prevails as a promising tool for immunoassays in NC, opening a new perspective involving studies to be performed concerning different expression and antigenicity ahead of a larger number of samples.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-18T13:46:49Z No. of bitstreams: 2 TESE Jackeline Gomes da Silva Araujo.pdf: 1816435 bytes, checksum: 302ef3838fff12047ef9cfd5cdd9cc4d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-18T13:46:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Jackeline Gomes da Silva Araujo.pdf: 1816435 bytes, checksum: 302ef3838fff12047ef9cfd5cdd9cc4d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / O Circovírus Suíno (CVS) é um vírus de DNA fita simples, que pertence à família Circoviridae, com genoma de 1,7kilobases. Apresenta dois tipos principais, o CVS1 e o CVS2. O CVS1 não é patogênico, enquanto que o CVS2 está associado a um conjunto de doenças como a Síndrome Multissistêmica do Definhamento de Suínos (SMDS). Estes tipos virais possuem a proteína Rep, essencial para replicação e a proteína Cap, formadora do capsídeo. A pCap possui epítopos imunoreativos e imunodominantes e tem sido utilizada como um antígeno tanto para o diagnóstico, quanto para aplicação vacinal, contra infecções causadas pelo CVS2. Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica que utiliza metanol como única fonte de carbono e tem sido utilizada para expressar genes heterólogos por apresentar vantagens como, a realização de modificações pós-traducionais e sua fácil manipulação. Objetivou-se nesse estudo expressar o gene Cap códon-otimizado do CVS2 para expressar em Pichia pastoris, visando a produção secretória da pCap e sua aplicação como antígeno recombinante em imunoensaios. Para tanto, a construção pPICZαA/CVS2Capo obtida após clonagem gênica foi inserida no genoma da levedura por eletroporação e o sistema foi induzido com metanol, sob o controle do promotor AOX1, por 72h. Os clones expressos positivamente foram identificados em Colony blot e Dot blot, após a reação dos clones com anticorpo-antiHis. A rCap foi detectada com massa molecular de ~39 kDa em sobrenadante da P. pastoris por SDS-PAGE e Western blot. Neste último, a detecção foi feita pelo reconhecimento da rCap por anticorpos anti-CVS2 de soros de animais com histórico de SMDS. A rCap testada em ELISA indireto contra soros de animais sabidamente negativos e positivos, previamente determinados pela imunoperoxidase (IP), mostrou alta eficiência discriminatória com alta razão positivo/negativo de 597. Após análise preliminar de parâmetros concordantes e discordantes, entre o IP e ELISA, observou-se uma alta concordância entre eles. Os resultados representam a efetiva produção da rCap pela via secretória de P. pastoris, com sugestiva preservação dos epítopos imunoreativos na mesma. Isto demonstra a viabilidade do sistema eucarioto de expressão utilizado e o potencial uso da rCap para detecção de anticorpos anti-CVS2 como ferramenta auxiliar no diagnóstico de doenças causadas pelo CVS2 como a SMDS.

A neurocisticercose (NC) é uma doença provocada por larvas de Taenia solium (Tso) no sistema nervoso central. Seu diagnóstico fundamenta-se em critérios clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. A utilização de antígenos parasitários no imunodiagnóstico apresenta desvantagens como: necessidade de animais, ausência de homogeneidade entre lotes, baixo rendimento, e contaminação com proteínas suínas. Assim, os antígenos recombinantes podem otimizar o imunodiagnóstico da NC, pois são reagentes simples e reprodutíveis, sem requerer animais. Este estudo teve como objetivo a obtenção, caracterização e análise da reatividade de proteína recombinante baseada em antígenos de líquido vesicular de Taenia crassiceps (Tcra). Assim, o cDNA foi obtido por amplificação a partir de RNAm de cisticercos de Tcra. A proteína recombinante Tc14 foi produzida em Escherichia coli (DE3) BL21 utilizando-se o vetor de expressão pET-22b e purificada por cromatografia de afinidade. A caracterização antigênica deu-se por Imunoblot (IB) utilizando anticorpos monoclonais (AcMo). Houve reatividade com todos os AcMo utilizados (AcMo anti-antígeno de excreção/secreção de Tcra, AcMo anti-líquido vesicular de Tcra, AcMo antilíquido vesicular de Tso e AcMo anti-antígeno total de Tso), exceto com o AcMo anti-antígeno de escólex de Tso. Utilizando-se 22 amostras de soro e 19 de líquor (LCR) de pacientes com NC, 48 soros e 28 LCR do grupo controle negativo (GCN) e 17 soros de hidatidose do grupo outras parasitoses (OP) em Imunoblot foi observada reatividade na região de 14kDa, correspondente a Tc14, em todas as amostras NC, mas não nos GCN e OP. Em ELISA com Tc14 obteve-se sensibilidade (S) e especificidade (E) de 100% com LCR (29 amostras de NC e 35 do GCN) e S de 95,1% e E de 100% com soro (41 amostras de NC, 52 do GCN). Dentre 51 soros de OP, mostraram-se reagentes um de hidatidose e outro de estrongiloidíase. A análise comparativa entre diferentes antígenos e testes sorológicos apresentou índice de positividade de 100% em IB utilizando os antígenos Tc14 ou LLG (antígeno purificado de Tso com lentil-lectina); já em ELISA, os índices foram de 83,4% para Tc14 e 91,6% para 18/14 (antígeno purificado de líquido vesicular de Tcra com AcMo). Em ensaios de linfoproliferação a porcentagem de respondedores no grupo NC foi de 16,6% (com 0,05 e 0,6 µg de Tc14/poço), 50% (com 0,4 µg de Tc14/poço), 44,4% (com 1,0 µg de Tc14/poço) e 20% (com 2,0 µg de Tc14/poço). Não houve proliferação no GCN. A dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura apresentou reatividade diferenciada entre o GCN e NC para IL-10, sendo uma amostra do GCN reagente e duas amostras de NC não reagentes. Não foi possível detectar IFN-γ. Em ELISA para IgG total 91,7% dos plasmas do grupo NC apresentaram reatividade, sendo a positividade para os isótipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 respectivamente, de 75; 33,3; 50 e 25%. O antígeno recombinante mostrou-se como ferramenta promissora para imunoensaios na NC, abrindo nova perspectiva envolvendo estudos a serem realizados sobre diferentes sistemas de expressão e antigenicidade frente a um número maior de amostras. / The neurocisticercosis (NC) disease is caused by the presence of Taenia solium (Tso) larvae in the central nervous system. Its diagnosis is based on clinical criteria, epidemiological studies and laboratorial exams. Nevertheless, the use of parasite antigenic extracts into the immunodiagnosis presents some disadvantages: it requires animals, lacks of homogeneity between lots, low yield and may become contaminated with swine proteins. Consequently, the utilization of recombinant antigens could optimize the immunodiagnostic of NC, as they are simple and reproducible reagents that do not require animals. This study aimed the capture, characterization and reactivity analysis of the recombinant protein based on antigens of the vesicular fluid of Taenia crassiceps (Tcra). In order to do so, the cDNA was obtained through the amplification deriving from RNAm of cysticerci of Tcra. The recombinant protein Tc14 was produced in Escherichia coli (DE3) BL21 using the expression vector pET-22b and purified by affinity chromatography (nickel resin). The antigenic characterization was performed by immunoblotting (IB) using monoclonal antibodies (MoAb). The recombinant protein presented reactivity with all the MoAb used (Anti-secretion/excretion antigens from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tcra MoAb, anti-vesicular fluid from Tso MoAb and anti- total antigen from Tso MoAb), except with the anti-antigen from Tso scolex MoAb. The immunoblot was performed using 22 serum samples and 19 cerebrospinal fluid (CSF) from patients with NC, 48 serum and 28 CSF from the negative control group (GCN) and 17 hydatidosis serum from other parasitosis\' group (OP). It showed reactivity in the 14kDa region, correlated to Tc14, in all NC samples, but not presented on GCN and OP. In ELISA with Tc14, the sensibility (S) and specificity (E) of 100% was obtained with CSF (29 NC samples and 35 GCN samples) and 95.1% of S and 100% of E with serum (41 NC samples, 52 GCN samples). Among 51 OP serums, one from hydatidosis and one from strongyloidiasis demonstrated reactivity. The comparative analysis amongst different antigens and serological tests demonstrated positivity of 100% in IB when using the Tc14 antigens or LLG (purified antigen of Tso with lentil lectin). In ELISA, the positivity indicated was of 83.4% for Tc14 and 91.6% for 18/14 (vesicular fluid purified antigen with MoAb from Tcra). In lymphoproliferation tests, the percentage of responders in NC group was of 16.6% (with .0.5 and 6 µg of Tc14/well), 50% (with 0.4 µg of Tc14/well). No proliferation occurred in GCN. The dosage of cytokines in culture supernatants presented different reactivity amongst GCN and NC for IL-10, as one sample of GCN reacted and two NC samples did not. It was not possible to detect IFN-γ. In ELISA for total lgG, 91.7 % of plasmas from NC group presented reactivity, with positivity for the isotypes lgG1, lgG2, lgG3 and lgG4, 75 %, 33.3 %, 50 % and 25 %, respectively. The recombinant antigen prevails as a promising tool for immunoassays in NC, opening a new perspective involving studies to be performed concerning different expression and antigenicity ahead of a larger number of samples.