Mon sujet de thèse repose sur une observation initiale réalisée sur le panel de 60 lignées cellulaires tumorales humaines du National Cancer Institute (NCI) et concerne des polymorphismes de gènes impliqués dans la réponse aux agents anticancéreux, les gènes ERCC2 et ERCC5 ( à l'origine des protéines XPD et XPG) qui interviennent dans la réparation de l'ADN par le mécanisme du Nucléotide Excicion Repair (NER). Nous avons identifié une association entres ces polymorphismes et la cytotoxicité in vitro d'agents anticancéreux, en particulier celle des taxanes. A partir de ce travail initial, nos recherches se sont établies dans deux directions : (1) une approche clinique visant à chercher un lien significatif entre ces deux polymorphismes et la sensibilité aux taxanes chez des patients traités par chimiothérapie; (2) une approche biochimique visant à comprendre les mécanismes moléculaires expliquant l'association entre ces deux polymorphismes et la sensibilité cellulaire aux taxanes. Ce travail a permis de montrer que le niveau d'expression de ERCC2 modifié par le polymorphisme du codon 751, ainsi que la variation protéique entrainée par le polymorphisme du codon 1104 de ERCC5, étaient impliqués dans la régulation du cycle cellulaire par modification de l'activité CDK1. La réponse au paclitaxel se trouve ainsi modifiée du fait de ce mécanisme. A défaut d'être définitifs, nos résultats de l'étude clinique sont encourageants et montrent une tendance à une probabilité de réponse plus élevée chez les patientes de génotype ERCC2 homozygote variant et chez les patientes de génotype ERCC5 homozygote sauvage ou hétéroygote lorsque la chimiothérapie contient un taxane, le docetaxel.

La résistance aux agents chimiothérapeutiques (Multidrug Resistance ou MDR) est caractérisée par la surexpression de différentes protéines membranaires de type ABC, parmi lesquelles, MRP1 et ABCG2 sont largement impliquées. Ces transporteurs diminuent les concentrations intracellulaires des agents chimiothérapeutiques en augmentant leur efflux de la cellule cancéreuse. Dans le but de contrecarrer cette chimiorésistance, nous avons conçu, synthétisé et étudié des activateurs de MRP1 et des inhibiteurs d'ABCG2. Les activateurs de MRP1 sont des dérivés de flavonoïdes et de vérapamil. Ces activateurs sont capables d'induire un efflux rapide et massif de glutathion cellulaire via MRP1 qui entraîne l'apoptose des cellules cancéreuses. Nous avons également conçu et synthétisé de nouveaux composés, dérivés de chromone, inhibiteurs sélectifs d'ABCG2, afin de restaurer la sensibilité des cellules cancéreuses aux agents chimiothérapeutiques. Mots clés : MRP1, ABCG2, flavonoïdes, analogues de vérapamil, chromones, inhibiteurs, activateurs

Les glioblastomes (GBM) sont des tumeurs intracrâniennes caractérisées par une résistance très élevée aux thérapies classiques en raison d'un degré de néovascularisation accru et un phénotype extrêmement infiltrant. Malgré de nombreuses études menées à ce sujet, ce cancer du cerveau reste jusqu'à ce jour essentiellement incurable. Cet ouvrage traite de l'action moléculaire du TLN-4601, un nouvel agent anti-cancéreux capable de traverser la barrière hémato-encéphalique et de s'accumuler de manière préférentielle au niveau de la tumeur. Ces propriétés ont permis au composé d'être reconnu comme traitement thérapeutique pour combattre les tumeurs cérébrales. Ce projet se veut donc être à l'interface entre la caractérisation moléculaire du mécanisme d'action et le ciblage thérapeutique de la molécule envers différentes lignées de GBM humains. Dans le but d'étudier l'effet thérapeutique du médicament sur les GBM, trois modèles cellulaires ont été utilisés soit les U87 MG, les U87 EGFRwt et les U87 EGFRvIII. L'amplification du récepteur à l'EGF (EGFR) de type sauvage et du récepteur tronqué EGFRvIII sont des anomalies génétiques communément observées chez ce type de tumeur. Ces phénotypes tumoraux sont notamment corrélés à la résistance des GBM aux traitements conventionnels de chimiothérapie. Le premier volet de cette étude a permis de déterminer que TLN-4601 antagonise le caractère infiltrant des glioblastomes en ciblant deux voies de signalisation associées au développement tumoral soit les voies de RAS/MAPK et de P13K/AKT. Il a également été démontré que le médicament augmente la sensibilité des cellules tumorales à la mort cellulaire via un processus apoptotique impliquant une modulation à la baisse de la phosphorylation de BAD, une augmentation de l'activité caspasique et un clivage de PARP. D'autre part, les résultats montrent que les U87 EGFRvlII semblent être plus réfractaires au médicament comparativement aux deux autres lignées à l'étude. Le second volet de l'étude a permis de caractériser les propriétés anti-angiogéniques du TLN-4601. Il a été établi que le composé inhibe le recrutement des cellules endothéliales (CE) au foyer tumoral en antagonisant leur potentiel migratoire, la tubulogénèse et la synthèse de VEGF par les glioblastomes, un des principaux messagers biochimiques impliqués dans l'angiogenèse. Cet effet pourrait résulter de l'inhibition par TLN-4601 des voies de signalisation RAS/MAPK et PI3K/AKT également observée chez les CE. Finalement, une action cytotoxique du médicament plus spécifique envers le compartiment cérébral tumoral par rapport à l'endothélium vasculaire semble être relevée. Cette action serait associée à la surexpression des récepteurs périphériques benzodiazépines (PBR), chez les glioblastomes comparativement aux cellules endothéliales. De manière globale, nous rapportons que l'action thérapeutique du TLN-4601 semble réduire la nature extrêmement infiltrante des glioblastomes et l'angiogénèse tumorale qui sont des évènements indispensables à la progression des cancers cérébraux. De plus, la cytotoxicité préférentielle du médicament envers les tissus cancéreux plutôt que les tissus sains fait état de la sélectivité du produit. Ces effets thérapeutiques multiples répertoriés dans cette étude justifient son utilisation en tant qu'agent chimiothérapeutique dans la lutte contre le GBM. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : TLN-4601, Glioblastomes, Cellules endothéliales cérébrales, PI3K/AKT, RAS/MAPK, Angiogénèse, Invasion tumorale, Apoptose.

Nous nous sommes tout d'abord familiarisé à la synthèse de tétrahydroisoquinoléines incorporant des structures hétérocycliques. Cette méthode a été adaptée à la préparation d'intermédiaires synthétiques de type (1,3')-bis-tétrahydroisoquinoléines. Ces composés ont servi de plateforme à la synthèse des pipérazines polycycliques recherchées. Les propriétés biologiques de ces composés ont été étudiées par le biais d'une collaboration avec le « Centre for Molecular Drug Design » de l'Université de Salford (Grande-Bretagne) sous la supervision du Professeure Sylvie Ducki.<br />Pour la synthèse de dérivés des ecteinascidines, nous avons également étudié une nouvelle méthode de fonctionnalisation des positions benzyliques afin d'incorporer des fonctions soufrées nécessaires à la construction de ces alcaloïdes. Cette méthode a été développée sur un substrat modèle obtenu à partir de la L-DOPA par Substitution Nucléophile Oxydante (SNOx) en présence du réactif 1,3-dichloro-5,6-dicyanobenzoquinone.<br />Enfin, nous avons réalisé la synthèse de précurseurs hautement fonctionnalisés nécessaires à la synthèse des phthalascidines. La synthèse de précurseurs de type α-amino-alcool a été réalisée à partir de deux composés aromatiques commerciaux : le sésamol et le 3-méthylcathécol. Ces intermédiaires ont été envigagés dans la séquence réactionnelle mise au point préalablement et permettant d'accéder à la phthalascidine 650.

ÉTUDES VERS LA SYNTHESE TOTALE DE LA (+)-TAUTOMYCETINE: La (+)-tautomycétine (2 ,TTN), polycétide naturel isolé en 1989 à partir de souches de Streptomyces griseochromogenes possède, en plus de sa structure chimique unique, des activités biologiques prometteuses. Plus récemment, comme étant un inhibiteur spécifique des sérine/thréonine phosphatases de type 1 (PP1) et 2A (PP2A). Nous nous sommes intéressés au développement d'une voie de synthèse pour accéder à la (+)-tautomycétine. Nous avons réussi à synthétiser les deux fragments principaux de la tautomycétine, le fragment B2 correspondant à la partie C1-C12 et compos 260, qui constitue la partie C7'-C13. Ces deux fragments contiennent tous les carbones de la TTN. / STUDIES TOWARD THE TOTAL SYNTHESIS OF (+)-TAUTOMYCETIN: (+)-Tautomycetin is a polyketide natural product isolated in 1989 from Streptomyces griseochromogenes with antifungal activity. Currently, TTN is best known for its activity in serine/threonine phosphatase proteins. We developed a convergent synthetic route to this natural product. Two key fragments of (+)-tautomycetin were synthesized, the B2 fragment containing the C1-C12 chain and the compound 260, corresponding to the C7'-C13 fragment of (+)-tautomycetin. The synthesis of fragment B2 employed a stereoselective chiral epoxide opening reaction as a key step, which consist of a novel strategy to prepare the desoxypropionate moiety of TTN. The synthesis of 260 employed a novel method for bis-esterification of anhydrides developed in the Dias-Campagne groups

La Cathepsine D (CathD) est une protéase lysosomale surexprimée et sécrétée par de nombreuses tumeurs solides. Cette enzyme favorise la prolifération tumorale et le processus métastatique, faisant d’elle une cible intéressante pour la thérapie anticancéreuse. Il existe un très bon inhibiteur de la CathD, la pepstatine, mais celui-ci traverse trop difficilement la membrane cellulaire pour être actif. C’est pourquoi des vecteurs de pénétration cellulaire, basés sur l’oligomérisation de mimes contraints de dipeptide, ont été développés au laboratoire. De ce travail, un bioconjugué, le JMV4463, a été développé. Composé d’un vecteur AMPA4 (tétramère de l’acide 2-(aminométhyl)phénylacétique), de la pepstatine, et d’une partie hydrophile aidant à la solubilisation du conjugué, ce bioconjugué est capable d’entrer dans les cellules et possède une activité antiproliférative sur différentes lignées de cellules cancéreuses. Partant de ce travail, la synthèse de nouveaux vecteurs potentiels de pénétration cellulaire, oligomères de mimes contraints de dipeptide, a été réalisée. Leur capacité d’internalisation a été établie sous la forme de conjugués avec la pepstatine. Les monomères envisagés étaient des analogues des motifs AMPA et acide (S)-2-(3-amino-4-oxo-3,4-dihydrobenzo[b][1,4]thiazépin-5(2H)-yl)acétique (DBT), motif ayant également montré une importante capacité d’internalisation. Ainsi, des analogues de l’AMPA en série indole, pyrrole et cyclohexane ont été préparés. De plus, la synthèse d’analogues de l’AMPA possédant différentes substitutions a été réalisée, tels que les méta- et para-AMPA, un homologue inférieur ou les 4,5-diméthoxy-, 4,5-dihydroxy- et 4-bromo-AMPA. Un analogue en série benzodiazépine du DBT a également été étudié. Tous les vecteurs correspondants sont capables d’internaliser la pepstatine dans les cellules mais, de façon surprenante, aucun des conjugués n’a montré d’activité anti-proliférative, indiquant un rôle essentiel du vecteur AMPA4. Une étude des relations structure / activité du JMV4463 a confirmé que le vecteur AMPA4 possédait un mode d’action unique mais celui-ci n’a pu être identifié à ce jour. Dans cette étude, il a également été montré qu’il était possible de simplifier la structure de la pepstatine, en remplaçant un de ses motifs statine par un motif gamma-alanine, permettant un coût de production réduit. Enfin, une étude in vivo sur un modèle xénogreffé de souris a montré un fort potentiel anti-tumoral du conjugué JMV4463. / Cathepsin D (CathD) is an overexpressed lysosomal protease secreted by several solid tumors. This enzyme is involved in tumor proliferation and metastasis, which makes it a promising target for cancer therapy. There exists a potent CathD inhibitor called Pepstatin, but it presents a too poor ability to cross the plasmic membrane in order to be active. To overcome this drawback, the development of cell penetrating vectors based on the oligomerization of constrained dipeptide mimetics has been undertaken in our lab. From this work, the bioconjugate JMV4463 has been developed. This bioconjugate is made of an AMPA4 (2-(aminomethyl)phenylacetic acid) vector, the pepstatin and a hydrophilic part which increases its solubility. This bioconjugate is able to penetrate the cells and has an antiproliferative effect on different cancer cell lines. Based on this work, synthesis of new potential cell penetrating vectors, oligomers of constrained dipeptide mimetics, was performed. Their internalization ability was established as their conjugate with pepstatin. We developed analogues of AMPA scaffold and (S)-2-(3-amino-4-oxo-3,4-dihydrobenzo[b][1,4]thiazépin-5(2H)-yl)acetic acid (DBT), which showed an important internalization ability. Thus, AMPA derivatives in indole, pyrrole and cyclohexane series were prepared. Furthermore, the synthesis of AMPA analogues having different substitutions on its aromatic part was performed, such as meta- and para- AMPA, an inferior homologue or 4,5-dimethoxy-, 4,5-dihydroxy- and 4-bromo-AMPA. An analogue of DBT in the benzodiazepin series has also been studied. All the corresponding vectors were able to internalize the pepstatin into the cells. Surprisingly, none of the conjugates showed an anti-proliferative activity, indicating the essential role of the AMPA vector. A structure/activity relationships study was performed for JMV4463. The obtained results confirmed that the AMPA vector has a unique mode of action that has not been identified yet. Furthermore, it has been demonstrated that it was possible to simplify the pepstatin structure by replacing one of its statin residues by a gamma alanine, which allows decreasing the production cost. Finally, an in vivo study on a xenografted mouse model showed a high anti-tumour potential for the JMV4463 conjugate.

Le point de départ du projet de recherche rapporté dans le présent mémoire a été la synthèse dans notre laboratoire, d'une nouvelle famille de dérivés du 2P-piperazino-5a-androstane-3a, 17P-diol. Un premier criblage des produits synthétisés utilisant les cellules de la leucémie myéloïde aiguë HL-60, a révélé que huit de ces produits avaient une activité anti-leucémique certaine. Nous avons alors commencé par confirmer l'activité antiproliferative de ces produits sur les cellules HL-60, ensuite nous avons exploré leur potentiel antiprolifératif sur huit autres lignées cancéreuses ainsi que leur sélectivité d'action par rapport à deux lignées normales. Les produits sélectionnés ont inhibé la prolifération cellulaire de sept lignées cancéreuses avec des IC50 variant de 0.3 à 6.4 _iM. De plus, ils étaient faiblement toxiques sur les lignées normales. Ces résultats nous ont encouragés à entreprendre l'étude du mécanisme d'action de cette nouvelle famille d'aminostéroïdes sur les cellules leucémiques HL-60. C'est ainsi que trois produits ont été sélectionnés, leur effet sur le cycle cellulaire et sur la différenciation des cellules HL-60 a été déterminé et leur cytotoxicité par induction de l'apoptose a été confirmée. Une étude plus poussée, utilisant l'un des produits, a montré que l'apoptose induite par cette famille d'aminostéroïdes est initiée par l'activation catalytique des caspases. Afin d'étendre l'étude des relations structure-activité de ces produits, on a effectué la synthèse et le criblage de leurs analogues pregnanes. Les trois produits les plus intéressants ont inhibé la prolifération des cellules HL-60 avec des valeurs IC50 de l'ordre de 1.9 \iM, tout en étant faiblement toxiques envers les lymphocytes normaux (IC5_= 10-31 \iM). Une étude préliminaire de leur mécanisme d'action a montré qu'il serait similaire à celui de leurs analogues androstanes.

Le cancer est une cause majeure de décès dans le monde. Il est à présent établi que les mutations de l'information génétique des cellules initient et participent à son développement, et que certaines mutations transmises au sein des familles prédisposent à son apparition. C'est le cas notamment des mutations des gènes BRCA1 et BRCA2 qui prédisposent aux cancers du sein et de l'ovaire. Les protéines produites par ces gènes sont directement impliquées dans la protection de l'information génétique puisqu'elles participent à la réparation des cassures se produisant dans le support de cette information : l'ADN. L'ADN peut être endommagé par diverses lésions mais les plus déstabilisatrices de l'information génétique sont les cassures double-brin. Afin de protéger son génome, la cellule possède de nombreux mécanismes de réparation dont la recombinaison homologue qui permet une réparation fidèle, c'est-à-dire sans perte ou modification de l'information génétique, permettant ainsi de prévenir l'apparition du cancer. La recombinaison homologue repose principalement sur l'activité de la protéine RAD51 qui nécessite l'utilisation des médiateurs BRCA2 et PALB2. Tout comme les gènes BRCA1 et BRCA2, PALB2 est un gène suppresseur de tumeur et ses mutations ont été associées avec une susceptibilité aux cancers du sein, de l'ovaire et du pancréas. En plus de la chirurgie, le traitement de ces cancers implique la radiothérapie et la chimiothérapie. Celles-ci font l'objet d'intenses recherches afin de proposer de nouveaux traitements plus efficaces avec moins d'effets secondaires. De nouvelles stratégies chimiothérapeutiques ont notamment émergé et on s'oriente à présent vers le développement de traitements personnalisés qui sont basés sur une meilleure connaissance des spécificités moléculaires des tumeurs. Les travaux présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations concernant le rôle de PALB2 dans la protection du génome lors du stress réplicatif et sur la régulation de ses fonctions par le contrôle de sa localisation cellulaire. Plus précisément, nous montrons que PALB2 et BRCA2 permettent de maintenir la Polymérase η au niveau des fourches de réplication bloquées et stimulent son activité de synthèse de l'ADN pour réinitier la réplication. Grâce à l'analyse de mutations germinales identifiées dans des cancers du sein et de l'ovaire, nous révélons la présence d'une séquence d'export nucléaire qui provoque l'exclusion de PALB2 du noyau vers le cytoplasme. Enfin, nous rapportons le développement d'une nouvelle molécule chimiothérapeutique, SFOM-0046, qui provoque des cassures double-brin de l'ADN en induisant un stress réplicatif et qui potentialise les effets de l'UCN-01, une molécule qui a été étudiée en clinique. Nous proposons l'utilisation de cette nouvelle molécule comme agent d'amélioration de thérapies ciblées existantes ou pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses personnalisées.

Le gène du métabolisme des médicaments UDP-glucuronosyltransférase UGT1A est épissé alternativement entraînant la production d’enzymes actives nommées isoformes 1 ainsi que de protéines régulatrices (i2) plus courtes. Mon objectif principal était de développer un modèle cellulaire permettant de mieux caractériser l’impact des isoformes 2 sur l’activité de conjugaison des médicaments et sur la réponse cellulaire à un traitement pharmacologique, plus particulièrement à l’agent anticancéreux SN-38, un substrat des UGT1A utilisé dans le traitement du cancer colorectal. Par une approche d ’interférence à l’ARN (shRNA), nous avons réprimé significativement les formes endogènes i2 dans la lignée humaine dérivée d’une tumeur de côlon, HT115. La répression des isoformes i2 entraîne une augmentation significative de la formation de SN-38-glucuronide. De plus, la répression des i2 entraîne une augmentation significative de la viabilité cellulaire ainsi qu’une modification significative de l’expression génique de processus cellulaires tels que la prolifération et certains microARN, à la suite d ’une exposition au SN-38. Les résultats obtenus supportent que les isoformes i2 ont le potentiel de moduler la réponse pharmacologique à un médicament dont le métabolisme de phase II est effectué principalement par les enzymes UGT1A.

Les astrocytomes (gliomes) sont les tumeurs cérébrales primaires les plus communes chez les adultes et le deuxième neoplasme le plus fréquent chez l’enfant. Malgré les traitements qui sont disponibles par chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie, la résistance, la toxicité ainsi que les taux de guérison faibles conduisent à rechercher de nouvelles drogues plus efficaces. J'ai effectué un test de viabilité chimique avec une banque de molécules sur des lignées cellulaires dérivées de tumeurs cérébrales. J'ai découvert quatre nouveaux composés anti-cancéreux, à savoir: DK16, Bpv(pic), EM011 et le Targetin, qui ont démontré une efficacité élevée et constante dans toutes les lignées de cellules tumorales du cerveau testées. En utilisant une variété de techniques de biologie moléculaire et cellulaire j'ai découvert que ces composés ont une efficacité significative pour inhibent des voies de progression clés dans les lignées de cellules de gliome pédiatrique de bas grade, à savoir: la viabilité, la prolifération, la migration et invasion, et avec seulement peu d'effets indésirables sur les cellules normales. En outre, tous les composés peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique et inhiber la croissance de cellules de gliome pédiatrique de bas grade cultivées dans l'agarose mou. Une diminution de la viabilité cellulaire a été simultanément accompagnée à la fois pas l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose avec la modification concomitante de l'expression de nombreux gènes qui favorisent la progression du cancer. De plus, une induction de l'apoptose impliqué dans translocation phosphatidylsérine, augmentation du ratio BAX/BCL2, dépolarisation de la membrane mitochondriale et translocation nucléaire du AIF a été observé. Comme EM011, le Targetin est également doté de propriétés anti-angiogéniques. Les résultats pré-cliniques de cette thèse montrent que les composés: DK16, Bpv(pic), EM011 et Targretin, peuvent être utiles pour le traitement des gliomes pédiatriques. Les résultats de cette thèse servent de base pour futures études « in vivo » et des essais cliniques chez les patients pédiatriques atteints de gliomes. / Astrocytomas (Gliomas) are the most common primary brain tumors among adults and second most frequent neoplasm among children. Although gliomas are treated aggressively with surgery, chemotherapy and radiation, treatment resistance, drug toxicity and poor response rates among pediatric glioma patients, continue to drive the need to discover new and more effective chemotherapeutic agents. In line with this notion, I undertook a chemical viability screen involving a library of compounds to discover and characterize novel compounds with high efficacies in retarding the viability of a panel of brain tumor cell lines. I subsequently discovered four new anti-cancer compounds, namely DK16, Bpv(pic), EM011 and Targetin, which demonstrated high and consistent potency in the panel of all brain tumor cell lines and cancer stem cells tested. Using a variety of in-vitro molecular and cell biology techniques, I discovered that these compounds have significant efficacies in abrogating key cancer progression pathways in pediatric low grade glioma cell lines, namely: cell viability, proliferation, migration, and invasion, but with little/no adverse toxicity on normal cells. Furthermore, all compounds can cross the blood brain barrier and inhibit anchorage independent growth of pediatric low grade glioma cell lines in soft agarose. A decrease in cell viability was concurrently accompanied by both cell cycle arrest and apoptosis with the concomitant alteration in the expression of numerous genes that promote cancer progression. Moreover, an induction of apoptosis involved increases in phosphatidylserine translocation, the upregulation of BAX/BCL2 ratio and depolarization of the mitochondrial membrane. In addition, glioma cell lines treated with DK16 and EM011 showed further evidence of mitochondrial dissipation leading to the release and nuclear translocation of the apoptotic inducing factor (AIF), with subsequent nuclear fragmentation. Furthermore, two compounds namely, EM011 and Targetin were found to perturb angiogenesis. These pre-clinical findings suggest DK16, Bpv(pic), EM011 and Targetin, can be suitable for the treatment of pediatric gliomas and serve the basis for future in-vivo studies and clinical trials to further validate the mechanism of action and their efficacies among Pediatric patients with gliomas.