A Leishmaniose visceral é uma doença parasitária crônica em homens e cães, causada por protozoários da espécie L. (Leishmania) chagasi. O diagnóstico parasitológico é confirmado pelo achado do agente em aspirados de medula óssea, linfonodo, baço e fígado, enquanto que a sorologia IgG especifica é usada em geral para estudos epidemiológicos, apesar dos altos níveis séricos de anticorpos IgG anti-Leishmania. Existem relatos anedóticos de resultados sorológicos negativos em doença ativa, atribuído à formação de imunocomplexos. Dado que imunocomplexos podem ser dissociados por tratamento ácido, nós buscamos a padronização de um teste simples de dissociação ácida dos imunocomplexos de amostras de soro, por tratamento ácido e neutralização em poços adsorvidos com antígenos de Leishmania, seguida de ELISA (ELISA dissociativo). A confirmação da presença de antígenos foi realizada pela detecção após adsorção ácida por DOT-ELISA, usando soro de coelho hiperimune anti-Leishmania. Amostras de hamsteres infectados experimentalmente com L. (L.) chagasi mostraram a presença e interferência de imunocomplexos na sorologia principalmente nas fases iniciais da infecção, por ELISA dissociativo e DOT-ELISA. Em amostras maiores de áreas endêmicas, o ELISA dissociativo aumentou a soropositividade em 10% em amostras de cães negativas e 3,5% de amostras humanas negativas, com confirmação por DOT-ELISA. Os resultados mostram que este teste poderia ser usado no diagnóstico da LV, como abordagem alternativa para a identificação sorológica de casos assintomáticos e para indicação de métodos parasitológicos invasivos confirmatórios. / Visceral leishmaniasis, caused by Leishmania (Leishmania) chagasi, is a chronic parasitic disease of humans and dogs. Confirmation of the protozoal agent in bone marrow, lymph node or spleen aspirate is diagnostic, while specific-IgG serology is used mainly for epidemiology despite the general presence of high levels of serum immunoglobulins. Anecdotal reports of false-negative serology in active disease cases are known and are ascribed to the formation of immune complexes. Because dissociation of immune complexes can be accomplished by acid treatment, we devised a simple, routine enzyme immunoassay (ELISA) for the dissociation of immune complexes in serum samples using acid treatment and neutralization in wells adsorbed with Leishmania antigen (dELISA). Confirmatory acid DOT-ELISA was also developed for antigen detection by anti-Leishmania rabbit antiserum. In experimental L. (L.) chagasi hamster models, immune complexes interfered with ELISA mostly in the early stages of infection, according to both dELISA and antigen DOT-ELISA results. In larger samples from endemic areas, dELISA increased seropositivity by 10% in negative dog samples (7/70) and 3.5% in negative human samples (3/85), showing that dELISA could be used in the serodiagnosis of visceral leishmaniasis. Moreover, dELISA could be used as an alternative approach to screening asymptomatic visceral leishmaniasis patients, instead of invasive confirmatory testing.

Linfomas são doenças originárias do sistema linfático, descritos por Thomas Hodgkin em 1932. São tradicionalmente classificados em dois grupos básicos: doenças de Hodgkin e linfomas do tipo não hodgkin (LNH). Inicialmente, pacientes com LNH foram tratados com radioterapia apenas ou combinada com imunoterapia usando-se anticorpo monoclonal anti-CD20 (ex., Rituximab-Mabthera, Roche). Porém, radioimunoterapia é uma nova modalidade de tratamento para pacientes portadores de LNH, na qual radiação citotóxica proveniente de radioisótopos terapêuticos é depositada nos tumores via anticorpos monoclonais (Acms). Este estudo concentrou-se nas condições de marcação do Acm anti-CD20 (Rituximab-Mabthera, Roche), com radioiodo (131I), pelo método direto, usando-se Cloramina-T como agente oxidante. Foram estudados parâmetros de marcação tais como: método de purificação, influência de tempo de incubação, influência de massa de agente oxidante, estabilidade in vitro e in vivo, imunoreatividade do anticorpo e distribuição biológica do anticorpo marcado em camundongos Swiss sadios. Produto de alta pureza radioquímica foi obtido, sem diferença notável entre os métodos aplicados. Não foi observada nenhuma influência direta do tempo de incubação na pureza radioquímica do anticorpo marcado. Um pequeno decréscimo na pureza radioquímica foi observado quando variou-se a massa do Acm sem variar a atividade do radioiodo. Após purificação, o anticorpo marcado apresentou pureza radioquímica de aproximadamente 100 %. Observou-se um produto de alta pureza radioquímica quando o anticorpo foi marcado na condição padrão. O anticorpo anti-CD20 apresentou variações de pureza radioquímica quando sua estabilidade foi testada em cinco condições estabilizadoras diferentes. Entretanto, a condição em que ácido gentísico foi combinado com congelamento demonstrou-se apropriada e capaz de minimizar os efeitos de autoradiólise do anticorpo marcado com alta atividade terapêutica de iodo-131. O anticorpo marcado apresentou imunoreatividade abaixo da relatada na literatura. A distribuição biológica em camundongos Swiss sadios revelou captação elevada no pulmão, fígado, e intestino delgado. O clareamento sanguíneo do anticorpo marcado foi relativamente rápido. Contudo, dados experimentais revelaram que anticorpos monoclonais anti-CD20 podem ser seguramente marcados com alta atividade de iodo-131 usando o método de Cloramina-T. O uso de cromatografia em camada delgada (ITLC-SG) na avaliação de pureza radioquímica mostrou-se apropriado, eficiente, prático, além de simples e rápido. O método de purificação utilizado demonstrou-se eficiente para a separação do anticorpo marcado do iodo livre. A abordagem inédita apresentada neste estudo, no sentido de viabilizar transporte e comercialização do produto marcado, referiu-se ao estudo de estabilidade do Acm marcado. A distribuição biológica do anticorpo demonstrou-se compatível com a distribuição do anticorpo íntegro indicando ótima estabilidade relativa in vivo. Os resultados deste estudo confirmam a potencialidade do anticorpo para a radioimunoterapia de linfomas do tipo não-Hodgkin. / Lymphomas are malignancies of the lymphatic system, described by Thomas Hodgkin in 1932. Traditionally, lymphomas are classified in two basic groups: Hodgkin disease and non-Hodgkin lymphoma (NHL). Patients with NHL were earlier treated with radiotherapy alone or in combination with immunotherapy using monoclonal antibody anti-CD20 (ex., Rituximab-Mabthera, Roche). However, Radioimmunotherapy is a new modality of treatment for patients with NHL, in which cytotoxic radiation from therapeutic radioisotopes is delivered to tumors through monoclonal antibodies. This study focused on labeling conditions of monoclonal antibody anti-CD20 (Rituximab-Mabthera, Roche) with iodine-131, by direct radioiodination method using Chloramine-T as oxidizing agent. Labeling parameters investigated were: Radiochemical purity (RP), method of purification, incubation time, antibody mass, oxidative agent mass, stability in vitro, stability in vivo, immunoreactivity and biological distribution performed in normal Swiss mouse. Product of high radiochemical purity was obtained with no notable difference between the methods applied. No clear evidence of direct influence of incubation time on radiochemical purity of the labeled antibody was observed. Whereas, a clear evidence of direct influence of activity on radiochemical purity of the labeled antibody was observed when antibody mass was varied. After purification, the labeled product presented radiochemical purity of approximately 100 %. Product of superior radiochemical yield was observed when standard condition of labeling was used. The labeled product presented variation in radiochemical purity using five different stabilizer conditions. The condition in which gentisic acid was combined with freeze appears more suitable and capable of minimizing autoradiolysis of the antibody labeled with high therapeutic activity of iodine-131. The labeled product presented low immunoreactivity when compared to the literature. Biological distribution in normal Swiss mouse demonstrated high uptake of the labeled antibody in lungs, liver, and small intestine. The progressive loss of activity in blood indicates fast blood clearance of the labeled antibody that is eliminated through the kidney, in urine. The experimental data proved that mAb anti-CD20 can be securely labeled with high therapeutic activity of iodine-131 using Chloramine-T method. Radiochemical purity determined by chromatographic plates (ITLC-SG) proved to be appropriate, efficient, practical and simple. The purification method demonstrated to be appropriate and efficient for separating the labeled antibody from free iodine. The results of stability of the labeled antibody presented in this study suggest that the product can be transported and commercialized using the condition in which gentisic acid was combined with freeze. In vivo distribution of the labeled antibody shows to be compatible with integral antibody distribution, indicating good in vivo stability. Results obtained in this study confirmed the potential of the labeled product anti-CD20-131I for radioimmunotherapy of non-Hodgkin lymphoma (NHL).

A leishmaniose é uma doença negligenciada causada por protozoários unicelulares do gênero Leishmania. De acordo com a Organização Mundial de Saúde, a doença é classificada em duas formas clínicas: leishmaniose tegumentar (LT) e leishmaniose visceral (LV). A LV, também conhecida como calazar, é a forma mais grave, sendo potencialmente fatal em indivíduos não tratados. Atualmente, um dos grandes desafios encontrados nos estudos acerca da crescente urbanização da leishmaniose visceral (LV), é o desenvolvimento de vacinas com elevada eficácia para induzir proteção contra infecção por Leishmania. Neste contexto, o presente estudo foi elaborado de modo a se realizar uma análise preliminar de segurança e imunogenicidade de um possível candidato vacinal contra LV, constituído por um peptídeo sintético da glicoproteína gp63 de Leishmania major com predição para MHC de classe I, utilizando o hamster (Mesocricetus auratus) como modelo experimental. Um total de nove animais foram distribuídos em três grupos experimentais, entre os quais: (i) grupo controle (C, n=3), que recebeu 100 μL de solução salina estéril a 0,85%; (ii) grupo inoculado com adjuvante Montanide ISA-61VG (ISA, n=3) que recebeu 30 μL de Montanide, diluída em 70 μL de solução salina estéril a 0,85% e (iii) grupo imunizado com peptídeo MCH-I de Leishmania major e o adjuvante Montanide ISA-61VG (Lm-ISA, n=3) que recebeu 30 μL do antígeno/dose, diluído em 40 μL de solução salina estéril a 0,85% e emulsionados com 30 μL do adjuvante oleoso Montanide ISA-61VG. Os inóculos foram administrados por via subcutânea em três doses com intervalos de 14 dias. Amostras de sangue, soro e fragmentos do baço foram coletados para realização de diferentes análises laboratoriais, em tempos distintos. Perfil bioquímico da função renal e hepática, quadro leucocitário, titulação de anticorpos e linfoproliferação de esplenócitos foram alvos deste trabalho. Nossos resultados revelaram que a formulação foi inócua e não tóxica para os animais, uma vez que os níveis séricos de ureia, creatinina e das enzimas hepáticas: alanina aminostranferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e fosfatase alcalina (FA), se mantiveram dentro dos padrões de normalidade descrito da literatura. Além disso, a formulação se mostrou capaz de induzir uma resposta humoral específica anti-Leishmania, através das dosagens de IgG total. Em resposta à série branca e à linfoproliferação das células do baço, foi verificado a existência de memória imunológica através do aumento significativo da população de leucócitos, bem como pela alta atividade linfoproliferativa obtida no grupo vacinal. / Leishmaniasis is a neglected disease caused by unicellular protozoa of the genus Leishmania. According to the World Health Organization, the disease is classified into two clinical forms: tegumentary leishmaniasis (LT) and visceral leishmaniasis (LV). LV, also known as calazar, is the most severe form, potentially fatal in untreated individuals. Actually, one of the major challenges encountered in studies of the increasing urbanization of visceral leishmaniasis (LV) is the development of highly effective vaccines to induce protection against Leishmania infection. In this context, the present study was elaborated in order to carry out a preliminary analysis of the safety and immunogenicity of a possible candidate vaccine against LV, constituted of a synthetic peptide of the glycoprotein gp63 of Leishmania major with prediction for MHC of class I, using the hamster (Mesocricetus auratus) as an experimental model. A total of nine animals were distributed in three experimental groups, among them: (i) control group (C, n = 3), that received 100 μL 0.85% sterile saline solution; (Ii) Montanide ISA-61VG (ISA, n = 3) adjuvant group that received 30 μL of Montanide, diluted in 70 μL of 0.85% sterile saline and (iii) group immunized with MCH-I peptide Leishmania Major and Montanide ISA-61VG adjuvant (Lm-ISA, n = 3) that received 30 μL of the antigen/dose, diluted in 40 μL of 0.85% sterile saline and emulsified with 30 μL of the Montanide ISA-61VG oily adjuvant. The inocula were administered subcutaneously in three doses at 14 day intervals. Samples of blood, serum and spleen fragments were collected for different laboratory tests at different times. Biochemical profile of renal and hepatic function, leukocyte framework, antibody titration and lymphoproliferation of splenocytes were the targets of this study. Our results revealed that the formulation was innocuous and non-toxic to the animals, since serum levels of urea, creatinine and hepatic enzymes: alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (AF) were maintained within the patterns of normality described in the literature. In addition, the formulation was capable to induce a humoral anti-Leishmania specific response by total IgG dosages. In response to the white series and lymphoproliferation of spleen cells, the existence of immunological memory was verified through a significant increase in the leukocyte population, as well as the high lymphoproliferative activity obtained in the vaccine group.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JULIENY AVELINA DE ASSUNCAO.pdf: 441572 bytes, checksum: ce985ae2332fc42340db886dc6268c1b (MD5) Previous issue date: 2006-06-06 / On September 13, 1987, it happened in Goiânia the largest radioactive accident of the western hemisphere. A capsule containing Cesium 137 (137Cs), originating from an unit of radiotherapy, was violated contaminating more than 200 people and taking 4 individuals to death. From the beginning of the accident, the health of the involved individuals started to be a constant concern of the authorities and mainly of Leide das Neves Foundation created to support and to attend involved people. The present study had for objective to evaluate, in the exposed patients to 137Cs in the accident of Goiânia, if this exposition induced immunological alterations such as the production of anti-nuclear antibodies against HEp-2 cells and rheumatoid factor, alteration in the global counting of leukocytes and in the values of serum immunoglobulins (IgG, IgM and IgA). It is known that the exhibition to ionizing radiation induces damages to ADN, resulting sometimes in mutation, mainly in the cells that present larger mitotic activity, like cells of the skin, intestinal covering and hematopoietic organs. With base in studies in the exposed patients to 137Cs, starting from the evaluation of the frequency of mutations, the possibility of an increase of carcinogenesis risk was considered in those individuals. Data obtained in studies of other radioactive accidents as that of Chernobyl and atomic bomb of Hiroshima and Nagasaki, demonstrate that radiation, besides acute effects, induces bone marrow alterations, larger predisposition to cancer development, thyroid auto-immune disease, gastritis, infectious diseases, among other illnesses. It has been suggested that abnormalities in the immunological response contribute to the appearance of those diseases, as alterations in the proportions of T cells and B cells, in serum antibodies levels, in cellular response and even in the production of autoantibodies. In this study, exposed patients did not presented more reactivity to auto-antigens, and did not presented no significant positivity to rheumatoid factor. Moretheless, we observed an increase in the global leukocyte number/mm3 in exposed individuals and also an increase in IgM level in individuals exposed to the lesser doses of ionizing radiation. / Em 13 de Setembro de 1987, ocorreu em Goiânia o maior acidente radioativo do hemisfério ocidental. Uma cápsula contendo Césio-137 (137Cs), proveniente de uma unidade de radioterapia, foi violada contaminando mais de 200 pessoas e levando quatro indivíduos a óbito. A partir do acidente, a saúde e o bem estar geral dos indivíduos envolvidos passou a ser uma preocupação constante das autoridades de saúde e principalmente da Fundação Leide das Neves, criada para apoiar e assistir as pessoas envolvidas. O presente estudo teve por objetivo avaliar, nos radioexpostos ao 137Cs no acidente de Goiânia, se esta exposição induziu alterações imunológicas como: a produção de auto-anticorpos anti-nucleares (FAN-HEp2) e fator reumatóide, alteração na contagem global de leucócitos e nos valores de imunoglobulinas séricas (IgG, IgM e IgA). É sabido que a exposição à radiação ionizante induz danos ao DNA, resultando em mutação, principalmente nas células que apresentam maior atividade mitótica, como células da pele, revestimento intestinal e órgãos hematopoiéticos. Com base em estudos nos pacientes expostos ao 137Cs, a partir da avaliação da freqüência de mutações, foi estimado um aumento do risco de carcinogênese nesses indivíduos. Os dados obtidos em estudos de outros acidentes radioativos como o de Chernobyl e da bomba atômica de Hiroshima e Nagasaki, demonstram que a radiação, além dos efeitos agudos, induz alterações medulares, maior predisposição ao desenvolvimento de neoplasias, doença auto-imune da tireóide, gastrite, doenças infecciosas, entre outras enfermidades. Tem sido sugerido que alterações na resposta imunológica contribuem para o surgimento dessas anormalidades, sobretudo aquelas relacionadas às proporções de células T e B, às concentrações de anticorpos séricos, prejudicando as respostas celulares e até mesmo a produção de auto-anticorpos. Neste estudo, os indivíduos expostos ao 137Cs no acidente de Goiânia, quando comparados aos não expostos, não apresentaram maior reatividade a auto-antígenos, assim como não apresentaram nenhuma alteração significativa nos níveis do fator reumatóide. Entretanto, observamos um aumento na contagem global de linfócitos por mm3 em indivíduos expostos e no nível de IgM nos indivíduos expostos a uma menor dose de radiação ionizante.

Linfomas são doenças originárias do sistema linfático, descritos por Thomas Hodgkin em 1932. São tradicionalmente classificados em dois grupos básicos: doenças de Hodgkin e linfomas do tipo não hodgkin (LNH). Inicialmente, pacientes com LNH foram tratados com radioterapia apenas ou combinada com imunoterapia usando-se anticorpo monoclonal anti-CD20 (ex., Rituximab-Mabthera, Roche). Porém, radioimunoterapia é uma nova modalidade de tratamento para pacientes portadores de LNH, na qual radiação citotóxica proveniente de radioisótopos terapêuticos é depositada nos tumores via anticorpos monoclonais (Acms). Este estudo concentrou-se nas condições de marcação do Acm anti-CD20 (Rituximab-Mabthera, Roche), com radioiodo (131I), pelo método direto, usando-se Cloramina-T como agente oxidante. Foram estudados parâmetros de marcação tais como: método de purificação, influência de tempo de incubação, influência de massa de agente oxidante, estabilidade in vitro e in vivo, imunoreatividade do anticorpo e distribuição biológica do anticorpo marcado em camundongos Swiss sadios. Produto de alta pureza radioquímica foi obtido, sem diferença notável entre os métodos aplicados. Não foi observada nenhuma influência direta do tempo de incubação na pureza radioquímica do anticorpo marcado. Um pequeno decréscimo na pureza radioquímica foi observado quando variou-se a massa do Acm sem variar a atividade do radioiodo. Após purificação, o anticorpo marcado apresentou pureza radioquímica de aproximadamente 100 %. Observou-se um produto de alta pureza radioquímica quando o anticorpo foi marcado na condição padrão. O anticorpo anti-CD20 apresentou variações de pureza radioquímica quando sua estabilidade foi testada em cinco condições estabilizadoras diferentes. Entretanto, a condição em que ácido gentísico foi combinado com congelamento demonstrou-se apropriada e capaz de minimizar os efeitos de autoradiólise do anticorpo marcado com alta atividade terapêutica de iodo-131. O anticorpo marcado apresentou imunoreatividade abaixo da relatada na literatura. A distribuição biológica em camundongos Swiss sadios revelou captação elevada no pulmão, fígado, e intestino delgado. O clareamento sanguíneo do anticorpo marcado foi relativamente rápido. Contudo, dados experimentais revelaram que anticorpos monoclonais anti-CD20 podem ser seguramente marcados com alta atividade de iodo-131 usando o método de Cloramina-T. O uso de cromatografia em camada delgada (ITLC-SG) na avaliação de pureza radioquímica mostrou-se apropriado, eficiente, prático, além de simples e rápido. O método de purificação utilizado demonstrou-se eficiente para a separação do anticorpo marcado do iodo livre. A abordagem inédita apresentada neste estudo, no sentido de viabilizar transporte e comercialização do produto marcado, referiu-se ao estudo de estabilidade do Acm marcado. A distribuição biológica do anticorpo demonstrou-se compatível com a distribuição do anticorpo íntegro indicando ótima estabilidade relativa in vivo. Os resultados deste estudo confirmam a potencialidade do anticorpo para a radioimunoterapia de linfomas do tipo não-Hodgkin. / Lymphomas are malignancies of the lymphatic system, described by Thomas Hodgkin in 1932. Traditionally, lymphomas are classified in two basic groups: Hodgkin disease and non-Hodgkin lymphoma (NHL). Patients with NHL were earlier treated with radiotherapy alone or in combination with immunotherapy using monoclonal antibody anti-CD20 (ex., Rituximab-Mabthera, Roche). However, Radioimmunotherapy is a new modality of treatment for patients with NHL, in which cytotoxic radiation from therapeutic radioisotopes is delivered to tumors through monoclonal antibodies. This study focused on labeling conditions of monoclonal antibody anti-CD20 (Rituximab-Mabthera, Roche) with iodine-131, by direct radioiodination method using Chloramine-T as oxidizing agent. Labeling parameters investigated were: Radiochemical purity (RP), method of purification, incubation time, antibody mass, oxidative agent mass, stability in vitro, stability in vivo, immunoreactivity and biological distribution performed in normal Swiss mouse. Product of high radiochemical purity was obtained with no notable difference between the methods applied. No clear evidence of direct influence of incubation time on radiochemical purity of the labeled antibody was observed. Whereas, a clear evidence of direct influence of activity on radiochemical purity of the labeled antibody was observed when antibody mass was varied. After purification, the labeled product presented radiochemical purity of approximately 100 %. Product of superior radiochemical yield was observed when standard condition of labeling was used. The labeled product presented variation in radiochemical purity using five different stabilizer conditions. The condition in which gentisic acid was combined with freeze appears more suitable and capable of minimizing autoradiolysis of the antibody labeled with high therapeutic activity of iodine-131. The labeled product presented low immunoreactivity when compared to the literature. Biological distribution in normal Swiss mouse demonstrated high uptake of the labeled antibody in lungs, liver, and small intestine. The progressive loss of activity in blood indicates fast blood clearance of the labeled antibody that is eliminated through the kidney, in urine. The experimental data proved that mAb anti-CD20 can be securely labeled with high therapeutic activity of iodine-131 using Chloramine-T method. Radiochemical purity determined by chromatographic plates (ITLC-SG) proved to be appropriate, efficient, practical and simple. The purification method demonstrated to be appropriate and efficient for separating the labeled antibody from free iodine. The results of stability of the labeled antibody presented in this study suggest that the product can be transported and commercialized using the condition in which gentisic acid was combined with freeze. In vivo distribution of the labeled antibody shows to be compatible with integral antibody distribution, indicating good in vivo stability. Results obtained in this study confirmed the potential of the labeled product anti-CD20-131I for radioimmunotherapy of non-Hodgkin lymphoma (NHL).

Staphylococcus aureus é um dos principais microorganismos causadores de infecção em humanos, podendo causar inclusive bacteremia e endocardite nos indivíduos infectados. Diversas cepas desta bactéria apresentam resistência a diferentes tipos de antibióticos, dentre eles os antibióticos meticilina e amoxicilina, como no caso da bactéria Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). A Proteína ligadora de Penicilina 2a (PBP2a) é a enzima responsável por conferir resistência para a MRSA aos antibióticos β-lactâmicos, sendo uma molécula promissora para terapia com AcM. No entanto, além das terapias os métodos de diagnóstico também são ineficientes, pois atualmente o diagnóstico leva vários dias para produzir um resultado confiável. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um radiofármaco utilizando o AcM anti-PBP2a, desenvolvido em Bio-Manguinhos/FioCruz, marcado com 99mTc, para identificação in situ do foco infeccioso causado por MRSA. Neste trabalho, incialmente o AcM anti-PBP2a foi reduzido com o agente redutor 2-mercaptoetanol (2-ME), para gerar grupos sulfidrilas (- SH). Logo após foram utilizados dois diferentes métodos da Marcação Direta: o Método 1, utilizando o reagente tartarato e o ácido gentísico, que atuam como agente transquelante e estabilizador, respectivamente; e o Método 2, utilizando um kit comercial de MDP, no qual o MDP atua como agente transquelante. Após a marcação do anticorpo, o radiofármaco foi submetido a ensaios de avaliação funcional, utilizando os métodos de eletroforese em gel SDS-PAGE não redutor; Immunoblotting; ELISA e o Ensaio de Neutralização in vitro. Como resultado foi visto que a quantidade média de grupos sulfidrilas produzida por AcM foi considerada satisfatória, cerca de 5 grupos SH por IgG, utilizando para isto a relação molar de 6.500:1 de 2-ME:AcM. O Método 2 foi o método que obteve melhor rendimento de marcação, com 73,5%, apresentando boa estabilidade depois de 2 horas (73,2%). A melhor formulação utilizada foi a seguinte: 0,5 mg de AcM anti-PBP2a; 10 μL do kit do MDP, depois de ser resuspendido com 5 mL de solução salina; e 75,48 MBq (2,04 mCi) de 99mTc, a reação ocorrendo em 15 minutos. Os Ensaios de Avaliação Funcional demonstraram que o AcM manteve a especificidade e afinidade de ligação à PBP2a. / Staphylococcus aureus is a major cause of life-threatening infections such as bacteremia and endocarditis. Unfortunately, many strains of this bacterial species have become resistant to certain antibiotics, including methicillin and amoxicillin. These strains are known as methicillin-resistant S. aureus (MRSA). The penicillin binding protein 2a (PBP2a) is the enzyme responsible for conferring resistance β-lactams antibiotics for MRSA, being one promising molecule for therapy with mAb. However, besides the therapy, the methods of diagnosis are also inefficient because the diagnosis currently takes several days to produce a reliable result. Taking into account, the objective of this research was radiolabeling one anti-PBP2a mAb developed by Bio-Manguinhos/FioCruz-RJ, utilizing 99mTc, for in situ diagnostic of the infectious caused by MRSA. First, anti-PBP2a mAb was reduced utilizing 2-mecaptoethanol (2-ME) for generate sulphydryl groups (-SH) and after to be labeled with 99mTc. In this work, were utilized two techniques of direct method: Method 1, using tartrate and gentisic acid reagents, acting like transchelant and stabilizer agents, respectively; and Method 2, using one commercial kit of MDP. Besides the radiolabeling, the mAb reduced and mAb labeled with 99mTc were submitted to immunoreactivity analysis, with SDS-PAGE non-reducing, Immunoblotting, ELISA and neutralization assay in vitro methods. The quantity produced of sulphydryl groups by mAb was satisfactory, approximately 5 per mAb, utilizing 6.500:1 of 2-ME:mAb molar ratio. The better labeling method was Method 2, with labeling yield of 73.5%, and showed a good stability after 2 hours (73.2%). The better formulation was: 0.5 mg of mAb anti- PBP2a, 10 μL of MDP kit, after resuspended with 5 mL of saline, and 75.48 MBq (2.04 mCi) of 99mTc, reacting by 15 minutes. The labeled mAb maintained the immunoreactivity, utilizing immunologic and in vitro experiments.

Orientador: Elenice Deffune / Resumo: A Hemorragia feto-materna (HFM) se dá pela transferência do sangue fetal para o compartimento intravascular materno, devido à ruptura na membrana vásculo-sincicial da placenta. A HFM pode ser responsável pela alosensibilização do sistema imune materno, levando a morbidade e mortalidade de gravidez corrente e/ou de futura, assim como também constitui a base da etiopatogenia de várias afecções, como se verifica na doença hemolítica perinatal que expõe a complicações fetais como, hidropsia, danos cerebrais hipóxicos e morte fetal. Detectar e quantificar hemácias fetais ajuda a prevenir as consequências devida a ocorrência da HFM. Entre os testes diagnósticos utilizados na detecção e quantificação têm - se os mais sensíveis o teste quantitativo de Kleihauer e Betke e o de Citometria de fluxo, sendo o primeiro considerado padrão ouro. Tendo em vista a importância do diagnóstico laboratorial da HFM foi desenvolvida a proposta da construção de imunossensor para detecção de amostras de sangue fetal na corrente sanguínea materna. Foi realizada a produção de anticorpo monoclonal com objetivo de produzir anticorpos contra antígenos de superfícies de hemácias fetais humana e também foram realizadas a construção de unidades sensoriais para detecção de sinal biológico de imunoafinidade entre anticorpos que detectam hemácias fetais e a hemoglobina fetal presente nestas células, a fim de se diagnosticar a ocorrência da HFM. Foram obtidos como resultados a produção de anticorpo monoclonal que... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Fetomaternal hemorrhage (FMH) occurs through the transfer of fetal blood into the maternal intravascular compartment, due to rupture in the placenta-syncytial membrane. FMH may be responsible for the alosensitization of the maternal immune system, leading to morbidity and mortality of current and / or future pregnancies, as well as being the basis of the etiopathogenesis of various conditions, as in perinatal haemolytic disease that exposes to fetal complications such as hydrops, hypoxic brain damage, and fetal death. Detecting and quantifying fetal erythrocytes helps to prevent the consequences due to the occurrence of FMH. Among the diagnostic tests used in the detection and quantification are the most sensitive the quantitative test of Kleihauer and Betke and the one of Flow cytometry, being the first considered gold standard. Considering the importance of the laboratory diagnosis of FMH, the proposal of the construction of immunosensor for the detection of fetal blood samples in the maternal blood was developed. The production of a monoclonal antibody was carried out with the objective of producing antibodies against antigens on human fetal red blood cells and also the construction of sensorial units for the detection of biological signal of immunoaffinity between antibodies that detect fetal red blood cells and the fetal hemoglobin present in these cells, in order to diagnose the occurrence of FMH. The results obtained are the production of monoclonal antibody that detec... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O presente trabalho foi realizado em duas etapas experimentais. O objetivo do Experimento 1 foi avaliar o perfil de produção de anticorpos anti-eCG em novilhas Bos taurus e Bos indicus tratadas uma, duas ou três vezes, com 400 e com 2000UI de eCG. O experimento foi realizado em duas réplicas com o mesmo desenho experimental, porém com padrões raciais distintos. Os animais foram divididos em 6 grupos: os grupos eCG2000UI_1x (n = 5), eCG2000UI_2x (n = 5) e eCG2000UI_3x (n = 5) receberam, respectivamente, um, dois e três tratamentos com 2000 UI de eCG, enquanto os grupos eCG400UI_1x (n = 5), eCG400UI_2x (n = 5) e eCG400UI_3x (n = 5) receberam os mesmos tratamentos porém com 400 UI de eCG. Foram realizadas coletas de sangue semanais por um período de 63 dias, em seguida o intervalo entre as coletas foi de 30 e 60 dias totalizando um período de 300 dias. A dosagem dos anticorpos anti-eCG foi realizada por teste ELISA. O número de tratamentos não influenciou a produção de anticorpos anti-eCG; a produção de anticorpos foi maior em fêmeas Bos taurus que em Bos indicus, e a aplicação de 2000 UI de eCG resultou em maiores concentrações de anticorpos que a aplicação de 400 UI nos primeiros 21 dias após o tratamento e na resposta tardia. O objetivo do Experimento 2 foi avaliar a memória imunológica celular e humoral de fêmeas Bos taurus previamente tratadas com 400 e 2000 UI de eCG, e verificar a influência dessa possível memória imunológica na atividade biológica da molécula de eCG. Além dos animais utilizados no experimento anterior, no Experimento 2 foram incluídos outros nove animais sem tratamento prévio com eCG: eCG2000UI_Controle (n = 5) e eCG400UI_Controle (n = 4). No D0 os animais receberam 2 mg de benzoato de estradiol e um dispositivo intravaginal de progesterona (DIB). Quatro dias mais tarde, as fêmeas dos grupos eCG2000UI_1x, eCG2000UI_2x, eCG2000UI_3x e eCG2000UI_Controle receberam 2000 UI de eCG, enquanto as fêmeas dos grupos eCG400UI_1x, eCG400UI_2x, eCG400UI_3x e eCG400UI_Controle receberam 400 UI de eCG. No momento da retirada do DIB (D8) os animais receberam PGF2 e 1 mg de cipionato de estradiol. Foram realizadas coletas de sangue semanais por 32 dias para dosagem de anticorpos, e duas coletas para avaliação da atividade celular proliferativa no D0 e D32. No momento da retirada do DIB as novilhas foram submetidas a exame ultrassonográfico para avaliação da resposta superestimulatória (no. de folículos > 6 mm) e para mensuração do diâmetro do maior folículo nas fêmeas tratadas com 2000 e 400 UI de eCG, respectivamente. O tratamento prévio não gerou memória imunológica humoral, independente da dose e do número de tratamentos realizados. No entanto, foi observada memória imunológica celular, sendo que esta memória foi maior nos animais submetidos a maior número de tratamentos prévios. Foi observada tendência de efeito de réplica na resposta superestimulatória, e correlação negativa entre a concentração de anticorpos e o número de folículos > 6 mm. O tratamento com 400 UI de eCG não mostrou os mesmos efeitos no diâmetro folicular. / The present study was carried out in two experimental steps. Experiment 1 was designed to evaluate the anti-eCG antibodies production in Bos taurus and Bos indicus heifers, in response to 400 and 2000UI of eCG, employed once, twice or three times. This experiment was performed in two identical experimental designs, however, using distinct genetic groups. Animals where randomly divided in six groups: eCG2000UI_1x (n = 5), eCG2000UI_2x (n = 5) and eCG2000UI_3x (n = 5) were respectively treated with one, two and three injections of 2000 UI of eCG. Groups eCG400UI_1x (n = 5), eCG400UI_2x (n = 5) and eCG400UI_3x (n = 5) were submitted to the same treatment protocol aforementioned; however, eCG dose was 400UI. Animals where then submitted to weekly blood sampling during a 63 days period, and then samples were collected within intervals ranging from 30-60 days, totalizing a period of 300 days. Anti-eCG dosage assay was performed by ELISA. Antibody production was not affected by the number of doses; however, was higher in Bos taurus females. Moreover, higher antibodies levels in the first 21 days after treatment and in the late response were observed when 2000 UI of eCG was applied. The Experiment 2 was focused on the evaluation of cellular and humoral immunological memory of Bos Taurus females previously treated with 400 and 2000 UI of eCG, as well as to figure out influence of the possible immunological response on biological activity of eCG molecule. Besides the animals that were used in the first experiment, nine additional heifers were included in the second trial, which were eCG2000UI_Control (n = 5) and eCG400UI_Control (n = 4). The treatment protocol was: on Day 0 (D0) all heifers received 2 mg of estradiol benzoate and one intravaginal progesterone device (DIB). Four days later, groups eCG2000UI_1x, eCG2000UI_2x, eCG2000UI_3x and eCG2000UI_Control received an injection of 2000 UI eCG, while groups eCG400UI_1x, eCG400UI_2x, eCG400UI_3x and eCG400UI_Control received 400 UI. By the time of DIB withdrawal (D8), animals were treated with PGF2 plus 1 mg of estradiol cipionate treatment. Afterwards, weekly blood samples were collected during 32 days for antibodies assay. Two additional blood samples were performed on day D0 and D32 to evaluate the cellular proliferative activity in response to eCG. In order to evaluate the ovarian stimulatory response (number of follicles > 6mm) in heifers treated with 2000 UI of eCG as well as the size of the largest follicle in those heifers treated with 400UI, ultrasound examination was carried by the time of DIB withdrawal. Humoral immunological memory response was not observed in animals previously treated with 400 or 2000 UI of eCG, regardless the number of treatments. Otherwise, cellular immunological memory response was observed and was higher in animals subjected to an increased number of treatments. A tendency of replicate effect in follicle numbers (> 6mm) was observed, as well as a high negative correlation between antibodies concentration and the number of follicles > 6mm. Same results were not observed when 400 UI of eCG treatment was performed.

Vários estudos que tentam compreender a gênese da aterosclerose têm demonstrado evidências que a oxLDL é peça importante para o desenvolvimento da doença, tornando-a um importante marcador. Os objetivos deste trabalho foram propor um novo imunossensor empregando anticorpos monoclonais anti-oxLDL e desenvolver um processo inovador de obtenção de anticorpos plásticos anti-oxLDL. Para construção do imunossensor, a região Fc do anticorpo foi ligada ao eletrodo de trabalho do dispositivo AuSPE (Screen-Printed Gold Electrodes), utilizando cisteamina. Posteriormente, foi adicionado BSA como bloqueador de possíveis regiões livres. Após o bloqueio, o imunossensor foi testado com oxLDL e outros antígenos, como forma de garantir a especificidade. Em relação aos anticorpos plásticos, chamados MAPS, estes foram desenvolvidos contruindo uma camada impressa de forma invertida ao anticorpo plástico SPAN, referência deste trabalho. Após obtenção dos MAPSs, estes passaram por diversos testes, similar ao imunossensor. Os resultados demonstraram excelente sensibilidade e especificidade às moléculas de oxLDL com detecção em tempo real em ambas as metodologias. / Increased levels of plasma oxLDL are associated with atherosclerosis, and the subsequent development of severe cardiovascular diseases that are today a major cause of death in modern countries. It is therefore important to find a reliable and fast assay to determine oxLDL. A new Immunosensor employing three monoclonal antibodies against oxLDL and a backside protein-surface imprinting process are proposed in this work. To generate the Immunosensor the mAbs were set-up by cysteamine on a gold layer of a disposable screen-printed electrode. BSA was immobilized further as bloker. All steps were followed by various characterization techniques such as electrochemical impedance spectroscopy and square wave voltammetry. To generate specific synthetic antibody materials, called MAPS, these were developed with a backside protein-surface imprinting process of the plastic antibody SPAN, the reference of the work. The devices were successfully applied to determine the oxLDL fraction in real serum, without prior dilution or necessary chemical treatment. Overall, these were promising results with the possibility to apply on the practical use of clinical.

Staphylococcus aureus é um dos principais microorganismos causadores de infecção em humanos, podendo causar inclusive bacteremia e endocardite nos indivíduos infectados. Diversas cepas desta bactéria apresentam resistência a diferentes tipos de antibióticos, dentre eles os antibióticos meticilina e amoxicilina, como no caso da bactéria Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). A Proteína ligadora de Penicilina 2a (PBP2a) é a enzima responsável por conferir resistência para a MRSA aos antibióticos β-lactâmicos, sendo uma molécula promissora para terapia com AcM. No entanto, além das terapias os métodos de diagnóstico também são ineficientes, pois atualmente o diagnóstico leva vários dias para produzir um resultado confiável. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um radiofármaco utilizando o AcM anti-PBP2a, desenvolvido em Bio-Manguinhos/FioCruz, marcado com 99mTc, para identificação in situ do foco infeccioso causado por MRSA. Neste trabalho, incialmente o AcM anti-PBP2a foi reduzido com o agente redutor 2-mercaptoetanol (2-ME), para gerar grupos sulfidrilas (- SH). Logo após foram utilizados dois diferentes métodos da Marcação Direta: o Método 1, utilizando o reagente tartarato e o ácido gentísico, que atuam como agente transquelante e estabilizador, respectivamente; e o Método 2, utilizando um kit comercial de MDP, no qual o MDP atua como agente transquelante. Após a marcação do anticorpo, o radiofármaco foi submetido a ensaios de avaliação funcional, utilizando os métodos de eletroforese em gel SDS-PAGE não redutor; Immunoblotting; ELISA e o Ensaio de Neutralização in vitro. Como resultado foi visto que a quantidade média de grupos sulfidrilas produzida por AcM foi considerada satisfatória, cerca de 5 grupos SH por IgG, utilizando para isto a relação molar de 6.500:1 de 2-ME:AcM. O Método 2 foi o método que obteve melhor rendimento de marcação, com 73,5%, apresentando boa estabilidade depois de 2 horas (73,2%). A melhor formulação utilizada foi a seguinte: 0,5 mg de AcM anti-PBP2a; 10 μL do kit do MDP, depois de ser resuspendido com 5 mL de solução salina; e 75,48 MBq (2,04 mCi) de 99mTc, a reação ocorrendo em 15 minutos. Os Ensaios de Avaliação Funcional demonstraram que o AcM manteve a especificidade e afinidade de ligação à PBP2a. / Staphylococcus aureus is a major cause of life-threatening infections such as bacteremia and endocarditis. Unfortunately, many strains of this bacterial species have become resistant to certain antibiotics, including methicillin and amoxicillin. These strains are known as methicillin-resistant S. aureus (MRSA). The penicillin binding protein 2a (PBP2a) is the enzyme responsible for conferring resistance β-lactams antibiotics for MRSA, being one promising molecule for therapy with mAb. However, besides the therapy, the methods of diagnosis are also inefficient because the diagnosis currently takes several days to produce a reliable result. Taking into account, the objective of this research was radiolabeling one anti-PBP2a mAb developed by Bio-Manguinhos/FioCruz-RJ, utilizing 99mTc, for in situ diagnostic of the infectious caused by MRSA. First, anti-PBP2a mAb was reduced utilizing 2-mecaptoethanol (2-ME) for generate sulphydryl groups (-SH) and after to be labeled with 99mTc. In this work, were utilized two techniques of direct method: Method 1, using tartrate and gentisic acid reagents, acting like transchelant and stabilizer agents, respectively; and Method 2, using one commercial kit of MDP. Besides the radiolabeling, the mAb reduced and mAb labeled with 99mTc were submitted to immunoreactivity analysis, with SDS-PAGE non-reducing, Immunoblotting, ELISA and neutralization assay in vitro methods. The quantity produced of sulphydryl groups by mAb was satisfactory, approximately 5 per mAb, utilizing 6.500:1 of 2-ME:mAb molar ratio. The better labeling method was Method 2, with labeling yield of 73.5%, and showed a good stability after 2 hours (73.2%). The better formulation was: 0.5 mg of mAb anti- PBP2a, 10 μL of MDP kit, after resuspended with 5 mL of saline, and 75.48 MBq (2.04 mCi) of 99mTc, reacting by 15 minutes. The labeled mAb maintained the immunoreactivity, utilizing immunologic and in vitro experiments.