El síndrome antifosfolípido (SAF) es una enfermedad autoinmune sistémica, que se caracteriza por la presencia conjunta de trombosis vascular o complicaciones obstétricas (pérdida fetal o abortos espontáneos a repetición) y la presencia de anticuerpos antifosfolípidos (aFLs) en el plasma de los pacientes. El mecanismo por el cual esos anticuerpos producen la enfermedad no se comprende totalmente, y esto se debe a la poli especificidad de estos anticuerpos, la multiplicidad de los sitios de acción y por la variabilidad del contexto clínico en donde se presenta la enfermedad. Mediante estudios in vitro e in vivo se demostró que la actividad trombogénica de los aFLs esta determinada entre otras por la interferencia que producen estos anticuerpos con el sistema hemostático: inhiben el camino de la proteína C activada, impiden la normal fibrinolisis y producen la activación celular, principalmente células endoteliales, monocitos y plaquetas. En las células endoteliales (CE) y en los monocitos, los aFLs incrementan la expresión de FT y moléculas de adhesión, mientras que en las plaquetas se observó un aumento en la producción plaquetaria de TXA2, agregación y liberación de los gránulos plaquetarios en presencia de dosis subagregantes de diferentes agonistas. Con el fin de dilucidar los mecanismos intracelulares involucrados en la activación celular mediada por los aFLs, se estudió el rol de la p38 MAPK, una proteína serina/treonina quinasa, que constituye la mayor cascada de transducción de señales inflamatorias desde la superficie celular hacia el núcleo. En este trabajo de tesis se comprobó que los aFLs producen la activación de la p38 MAPk en las plaquetas y en las CE, y que esta vía de activación intracelular es en gran parte responsable del incremento de la activación plaquetaria y de las CE, debido a que los efectos protrombóticos y proinflamatorios de los aFLs son disminuyen significativamente cuando se inhibe la p38MAPk con el inhibidor especifico SB20380. / Antiphospholipid Syndrome (APS) is a systemic autoimmune disease, characterized by the joint presence of vascular thrombosis or obstetric complications (fetal loss or recurrent spontaneous abortions) and the presence of antiphospholipid antibodies (aPL) in the plasma of patient. The mechanism by which these antibodies cause disease is not fully understood, and this is due to the poly specificity of these antibodies, multiple sites of action and variability of clinical context where the disease occurs. Using in vitro and in vivo showed that the thrombogenic activity of aPL is determined among others by the interference caused by these antibodies with the hemostatic system: the way to inhibit activated protein C, prevent normal fibrinolysis and cell activation occur mainly endothelial cells, monocytes and platelets. In endothelial cells (EC) and monocytes, AFLS increase TF expression and adhesion molecules, whereas in platelets was observed an increase in platelet production of TXA2, platelet aggregation and release in the presence of doses of subagregantes different agonists. In order to elucidate the intracellular mechanisms involved in mediated cell activation by the aPL, we studied the rol of p38 MAPK, a protein serine / threonine kinase, which constitutes the major transduction cascade of inflammatory signals from the cell surface to the nucleus. In this thesis aPLs were found to produce the activation of p38 MAPK in platelets and EC, and that the intracellular activation pathway is largely responsible for the increased platelet activation and EC, because that prothrombotic and proinflammatory effects of aPLs are significantly diminished when p38MAPK was inhibited with specific inhibitor SB20380.

El presente trabajo de tesis tuvo como objetivo titular anticuerpos neutralizantes contra una cepa endémica del virus Chikungunya que circula en la costa norte peruana. Para desarrollar esta investigación, se empleó la prueba de neutralización por reducción en placas (PRNT), la cual se realizó en el Instituto Nacional de Salud (INS)– Laboratorio de Aislamiento y Cultivo Celular perteneciente al área de Metaxénicas Virales. La justificación de la investigación se basa en la necesidad de comprobar que los anticuerpos detectados por la prueba de ELISA son neutralizantes y logran inhibir la dispersión del CHIKV en el cuerpo humano. Además, la prueba es necesaria para evaluar drogas antivirales y futuras vacunas que lleguen al Perú. El diseño metodológico utilizado fue analítico y experimental. La cepa y las muestras fueron proporcionadas por el INS y provinieron del departamento de Tumbes. Las muestras positivas fueron previamente diagnosticadas con ELISA utilizando IgM e IgG y las muestras negativas fueron de individuos sanos sin contacto previo con arbovirus. La prueba de PRNT se realizó en 24 horas usando la línea celular VERO CCL-81 en monocapa. La valoración de la prueba se realizó al 50% de neutralización. Se obtuvo como resultado títulos de anticuerpos en el rango de 1/8 y 1/16. Ésta variación responde a una relación inversa con el inicio de los días de síntomas. Por lo tanto, se concluye que la población de la costa norte del Perú sí está desarrollando anticuerpos neutralizantes para contrarrestar el virus Chikungunya endémico en la región.The present thesis aims to titrate neutralizing antibodies against an endemic strain of the Chikungunya virus that circulates in the northern coast of Peru. In order to develop this research, the plaque reduction neutralization test (PRNT) has been used, which has been carried out at the National Institutes of Health (INS) - Isolation and Cell Culture Laboratory belonging to the Viral Metaxenics area. The justification of the investigation is based on the need to verify that the antibodies detected by the ELISA test are neutralizing and manage to inhibit the dispersion of CHIKV in the human body. In addition, the test is necessary to evaluate antiviral drugs and future vaccines that arrive in Peru. The methodological design used was analytical and experimental. The strain and samples were provided by the INS. The strain is endemic to the department of Tumbes. The positive samples were previously diagnosed with ELISA using IgM and IgG and the negative samples were from individuals that had not had contact with any arbovirus. The PRNT test was performed in 24 hours using the VERO CCL-81 cell line in monolayer. The titration of the test was performed at 50% neutralization. Antibody titres were obtained in the range of 1/8 and 1/16. This variation responds to an inverse relationship with the onset of symptom days. Therefore, it is concluded that the population of the northern coast of Peru is developing neutralizing antibodies to counteract the endemic Chikungunya virus in the region.

El cáncer colorectal ocupa el sexto lugar en el Perú, más de 350 personas son diagnosticadas anualmente con esta enfermedad, ante tal incidencia, el presente trabajo contribuye con el desarrollo de un kit liofilizado de anticuerpo monoclonal Anti-CEA para ser marcado con el radionucleido Tc 99m, para el diagnóstico precoz de tumores adenocarcinoma embrionario. Ante la falta de un generador de adsorción de 99Mo/ 99mTc en el país, se utiliza el Tc 99m proveniente de un generador de extracción, que emplea la metiletilcetona (MEC) como solvente. Primero, se han diseñado sistemáticamente 4 formulaciones liofilizadas y mediante la determinación de la pureza radioquímica del 99mTc-Anti-CEA, se han evaluado el efecto de la relación molar del AcMo: 2-ME (1:1000 y 1:2000), el incremento del agente reductor (3,50 a 5,95 μg SnF2) y de la proteína reducida (1,0 a 1,2 mg Anti-CEA). Segundo. Sobre la base de la evaluación de los resultados de estas 4 formulaciones liofilizadas, se han preparado 4 lotes experimentales. La metodología desarrollada se inicia con la reducción de la proteína por el método directo con 2-ME, la purificación en columna de PD10, luego la adición del SnF2 y MDP, y finalmente la liofilización. El kit liofilizado es marcado con Tc 99m por el método directo para obtener el 99mTc-Anti-CEA y se determina la pureza radioquímica por cromatografía en ITLC-SG y HPLC, soporte de actividad y volumen de Tc 99m, distribución biológica en ratones sanos, inmunoreactividad determinada por cromatografía de afinidad y el desafío con L-cisteína determinada por cromatografía en ITLC-SG. Se complementa con estudios de estabilidad en tiempo real tanto para el kit liofilizado como para el 99mTc-Anti-CEA. Los resultados de la primera parte, la 1º; 2º; 3º y 4º formulación liofilizada tuvieron una pureza radioquímica del 71, 92, 94 y 97% respectivamente, a un pH de marcación entre 7,0 a 7,5. Los resultados de la segunda parte, los 4 lotes experimentales tuvieron en promedio una pureza radioquímica mayor del 95%, soporta 50 mCi de Tc 99m en un volumen máximo de 5 mL. / --- The colorectal cancer places the sixth place in Peru, more than 350 persons are diagnosed annually with this illness, for that reason, the present work contributes with the development of a lyophilized kit of monoclonal antibody Anti-CEA to be labelled by the radionuclide Tc 99m, for the early diagnosis of tumours embryonic adenocarcinoma. For the lack of a generator of adsorption of 99Mo / 99mTc in the country, the Tc 99m is used instead of this, coming from a generator of extraction, that use the methylethylketone (MEK) like solvent. First, it was designed systematically 4 lyophilized formulations and through the determination of the radiochemical purity of 99mTc-Anti-CEA, the effect of the molar relation has been evaluated of the MoAb: 2-ME (1:1000 and 1:2000), the increasing of the reductor agent (3,50 to 5,95 µg SnF2) and the reduced protein (1,0 to 1,2 mg Anti-CEA). Second. On the base of the evaluation of the results of these 4 lyophilized formulations, 4 experimental lots have been prepared. The developed methodology initiates with the reduction of the protein for the direct method with 2-ME, the purification in column of PD10, then the addition of the SnF2 and MDP, finally the lyophilization. Lyophilized kit is labeled by Tc 99m by the direct method to obtain 99mTc-Anti-CEA and the radiochemical purity is determined by chromatography in ITLC-SG and HPLC, activity support and volume of Tc 99m, biological distribution in healthy mice, inmunoreactivity is determined by chromatography of affinity, challenge with L-cisteína determined by chromatography in ITLC-SG. It complements itself with studies of stability in real-time for the lyophilized kit and for 99mTc-Anti-CEA.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La diarrea viral bovina (DVB) es una de las enfermedades que afecta cuantiosamente la producción del ganado bovino, responsabilizándosele de producir significativas pérdidas económicas. Es producida por el virus diarrea viral bovina (VDVB) un virus del género Pestivirus que infecta naturalmente a los animales ungulados del orden Artiodactila. Dentro de este orden se ubican los camélidos sudamericanos (CS) constituidos por dos especies de camélidos sudamericanos silvestre (CSS), el guanaco y la vicuña, y dos especies de camélidos sudamericanos domésticos (CSD), la alpaca y la llama. En Chile, se ha detectado la presencia de CSD, que habitan la Región Metropolitana, infectados con el VDVB, pero, se desconoce si los CS del Altiplano de la Región de Tarapacá (lugar donde se concentra sobre el 90% de la población de alpacas, llamas y vicuñas de Chile) están infectados con pestivirus. Los CSD alpacas y llamas, son animales muy importantes para la sobrevivencia de los habitantes de la zona altiplánica del país, razón por la cual es necesario que estas especies estén en óptimas condiciones sanitarias. El objetivo de este estudio es conocer si los CSD del altiplano chileno están infectados con pestivirus a través de la pesquisa de animales que han respondido inmunológicamente a la infección de campo del agente viral. Considerando que un 1% de los animales poseen anticuerpos seroneutralizantes contra Pestivirus y trabajando con un 95% de confianza para detectar la presencia de un animal positivo, se analizó un total de 136 muestras de suero de llamas y 30 sueros de alpacas, de 12 localidades del altiplano de la Región de Tarapacá. En la prueba de seroneutralización se enfrentó diluciones en base dos del suero de cada animal con 100 dosis infecciosas cultivo de tejido 50% (DICT50) de la cepa citopatogénica NADL del VDVB. Los resultados mostraron que ningún suero de los animales estudiados presentó anticuerpos neutralizantes para la cepa NADL del VDVB. Se concluye que menos del 1% de los CSD procedentes de las 12 localidades del altiplano de la Región de Tarapacá, de donde se obtuvieron las muestras de suero, podrían estar infectadas con el VDVB o con algún otro Pestivirus que compartan antígenos neutralizables comunes con el VDVB

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo se describe la evolución de anticuerpos caninos contra Brucella canis, de dos perras inoculadas experimentalmente, mediante un ensayo inmunoenzimático indirecto (ELISA-I) usando como antígenos el lipopolisacárido rugoso (LPS-R) y proteínas citosólicas de Brucella abortus Cepa RB51. El objetivo fue discriminar el momento en que se hacen detectables los anticuerpos para cada ELISA-I y describir la evolución de éstos en el tiempo. Se utilizaron sueros de dos perras infectadas con B. canis, A y B, con un total de 20 y 16 muestras de sueros seriados, respectivamente. Para ambos ELISA-I se usaron líneas de corte obtenidas por metodología “Receiver-Operator Characteristic” (ROC), que determinaron la positividad o negatividad a la prueba. Ambos ELISA-I fueron capaces de detectar anticuerpos tempranamente y fue posible constatar su permanencia en el tiempo. La detección de anticuerpos mediante ELISA-I, tanto con antígeno de proteínas citosólicas como con antígeno LPS-R de B. abortus Cepa RB51, se mantuvo detectable, al menos, hasta la semana 38 post infección

El cáncer colorectal ocupa el sexto lugar en el Perú, más de 350 personas son diagnosticadas anualmente con esta enfermedad, ante tal incidencia, el presente trabajo contribuye con el desarrollo de un kit liofilizado de anticuerpo monoclonal Anti-CEA para ser marcado con el radionucleido Tc 99m, para el diagnóstico precoz de tumores adenocarcinoma embrionario. Ante la falta de un generador de adsorción de 99Mo/ 99mTc en el país, se utiliza el Tc 99m proveniente de un generador de extracción, que emplea la metiletilcetona (MEC) como solvente. Primero, se han diseñado sistemáticamente 4 formulaciones liofilizadas y mediante la determinación de la pureza radioquímica del 99mTc-Anti-CEA, se han evaluado el efecto de la relación molar del AcMo: 2-ME (1:1000 y 1:2000), el incremento del agente reductor (3,50 a 5,95 μg SnF2) y de la proteína reducida (1,0 a 1,2 mg Anti-CEA). Segundo. Sobre la base de la evaluación de los resultados de estas 4 formulaciones liofilizadas, se han preparado 4 lotes experimentales. La metodología desarrollada se inicia con la reducción de la proteína por el método directo con 2-ME, la purificación en columna de PD10, luego la adición del SnF2 y MDP, y finalmente la liofilización. El kit liofilizado es marcado con Tc 99m por el método directo para obtener el 99mTc-Anti-CEA y se determina la pureza radioquímica por cromatografía en ITLC-SG y HPLC, soporte de actividad y volumen de Tc 99m, distribución biológica en ratones sanos, inmunoreactividad determinada por cromatografía de afinidad y el desafío con L-cisteína determinada por cromatografía en ITLC-SG. Se complementa con estudios de estabilidad en tiempo real tanto para el kit liofilizado como para el 99mTc-Anti-CEA. Los resultados de la primera parte, la 1º; 2º; 3º y 4º formulación liofilizada tuvieron una pureza radioquímica del 71, 92, 94 y 97% respectivamente, a un pH de marcación entre 7,0 a 7,5. Los resultados de la segunda parte, los 4 lotes experimentales tuvieron en promedio una pureza radioquímica mayor del 95%, soporta 50 mCi de Tc 99m en un volumen máximo de 5 mL. / The colorectal cancer places the sixth place in Peru, more than 350 persons are diagnosed annually with this illness, for that reason, the present work contributes with the development of a lyophilized kit of monoclonal antibody Anti-CEA to be labelled by the radionuclide Tc 99m, for the early diagnosis of tumours embryonic adenocarcinoma. For the lack of a generator of adsorption of 99Mo / 99mTc in the country, the Tc 99m is used instead of this, coming from a generator of extraction, that use the methylethylketone (MEK) like solvent. First, it was designed systematically 4 lyophilized formulations and through the determination of the radiochemical purity of 99mTc-Anti-CEA, the effect of the molar relation has been evaluated of the MoAb: 2-ME (1:1000 and 1:2000), the increasing of the reductor agent (3,50 to 5,95 µg SnF2) and the reduced protein (1,0 to 1,2 mg Anti-CEA). Second. On the base of the evaluation of the results of these 4 lyophilized formulations, 4 experimental lots have been prepared. The developed methodology initiates with the reduction of the protein for the direct method with 2-ME, the purification in column of PD10, then the addition of the SnF2 and MDP, finally the lyophilization. Lyophilized kit is labeled by Tc 99m by the direct method to obtain 99mTc-Anti-CEA and the radiochemical purity is determined by chromatography in ITLC-SG and HPLC, activity support and volume of Tc 99m, biological distribution in healthy mice, inmunoreactivity is determined by chromatography of affinity, challenge with L-cisteína determined by chromatography in ITLC-SG. It complements itself with studies of stability in real-time for the lyophilized kit and for 99mTc-Anti-CEA.

Microorganisms are present in a variety of sources, including food, water, animals, environment as well as the human body. They can be harmless or harmful. The latter is also called pathogenic and their detection is extremely important due to health and safety reasons. It is well known that food contaminated with bacteria can produce a number of foodborne diseases. As a consequence, thousands of euros are invested each year in medical treatments trying to keep the population healthy. There are more than 250 known foodborne diseases. For example, outbreaks of salmonellosis have increased in many countries in the last decades being Salmonella Infantis one of the most important etiological agents associated with this enteric disease. Moreover, due to the wide distribution of the microorganisms, they can also contaminate foods in the field as well as during the storage stage. In that sense, filamentous fungi are one of the etiological agents responsible for most post-harvest food spoilage producing quality losses and economic devaluation. On the other hand, the invasive fungal infections due to yeast have risen considerably in recent years. Candidiasis is the so-called disease produced by Candida albicans. This is an opportunistic infection that affects immunocompromised patients requiring costly treatment with advanced medicine. Several methods have been proposed so far to detect pathogenic microorganisms. Conventional culture is highly selective and sensitive but they also require several days to yield the results. To simplify and automate the identification of both bacteria and fungi rapid biochemical kits have been developed. Although the results obtained with these kits are comparable to the traditional biochemical tests they also need 1 or 2 days to obtain results. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can be applied for the direct identification of pathogenic microorganisms in real samples. This immuno-based method has been widely used in both food and the medical sector with high sensitivity. Nevertheless, the main disadvantage of this method is that it can also be time-consuming because a pre-enrichment of the sample is often required in order to achieve low limits of detection. As a consequence, many researchers have addressed their efforts towards the development of alternative methods to allow the rapid detection of pathogens. Molecular biology-based methods, specifically polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR are nowadays the most common tools used for pathogen detection. They are highly sensitive and allow the quantification of the target. In addition, microarray platforms of DNA have been developed in order to analyse hundreds of targets simultaneously. However, this technique is costly and reagent-consuming. The introduction of biosensors has brought new alternatives in pathogenic detection. Biosensors are the most used tools in pathogenic detection after PCR, culture methods and ELISA. They provide rapid results after the sample has been taken. However, their real application lies in achieving selectivities and sensitivities comparable to the established methods and at low cost. Since carbon nanotubes (CNTs) were discovered by Iijima, many papers have reported their unique electronic and optical properties which, together with their size, make these nanostructures interesting materials in the development of biosensing platforms. Their very high capacity for charge transfer between heterogeneous phases makes them suitable as components in electrochemical sensors. The electrical conductivity of the CNTs is highly sensitive to changes in their chemical environment and, as a result, they have been successfully applied in the study of molecular recognition processes. An approach for the direct electrical detection of biomolecules integrates CNTs as transducer elements within a field-effect transistor (FET) configuration. The main advantages of this kind of configuration lies in that the conducting channel is usually located on the surface of the substrate and as a result, they are extremely sensitive to any change in the surrounding environment. Moreover, CNTFET devices can operate at room temperature and in ambient conditions. At the beginning of this research (2006) electrochemical CNTFETs based on single walled carbon nanotubes had not been applied to detect bacteria or fungi. Only the interaction between CNTs and bacteria had been explored, but without sensing purposes. Therefore, this thesis reports the first CNTFET devices applied to the detection of pathogenic microorganisms. First, the background and the introduction containing the state of the art are presented covering relevant investigations made in the last years. Next, the main analytical methods are described. These descriptions involve detailed information of all procedures, analytical tools and materials used throughout this research work. In the following chapters, the application of the CNTFETs for the determination of bacteria, yeast and moulds is presented throughout the scientific articles published along the development of the thesis. Briefly, the first device developed was applied to the detection of Salmonella Infantis in a simple matrix (0.85 % saline solution) and it was proven for first time, that this kind of sensor was able to detect, at least, 100 cfu/mL of the bacteria in just one hour with high selectivity. Subsequently, we enlarged the application field to other types of microorganisms: Candida albicans. In this study we improved not only the detection limit of the devices to 50 cfu/mL but also we proved the selectivity of the CNTFETs against possible interference that can be present in real samples like serum proteins. Finally, the devices were applied to the detection of the mould Aspegillus flavus in real samples. In this assay the response time was 30 minutes and a high sensitivity (10 µg of A. flavus / 25 g of rice) was obtained. As the final chapters, general conclusions extracted from the overall work and annexes are reported. It can be stated that nanomaterials displaying extraordinary properties like carbon nanotubes can be combined with biological entities to obtain highly sensitive and selective biosensors able to detect bacteria, yeasts and moulds in a very short time. In future work, other performance parameters such as, long term stability, robustness and reusability must be studied further and contrasted with standard methods before thinking of the commercialization of the devices. / Los microorganismos están presentes en una gran variedad de orígenes, incluyendo alimentos, agua, animales, medio ambiente también como en el propio cuerpo humano. Estos pueden ser beneficiosos o perjudiciales. Los microorganismos perjudiciales reciben el nombre de patógenos y su detección es de gran importancia por razones de salud y seguridad. Es bien conocido que los alimentos contaminados con bacterias pueden producir cierto número de enfermedades. Como consecuencia de esto, miles de euros se invierten cada año en tratamientos médicos para mantener la salud de la población. Existen más de 250 enfermedades transmitidas por alimentos. En las últimas décadas se ha incrementado por ejemplo, la incidencia de brotes de salmonelosis en muchos países, siendo Salmonella Infantis uno de los agentes etiológicos más importantes asociados con la producción de esta enfermedad entérica. Debido a la amplia distribución de los microorganismos, estos pueden llegar también a contaminar alimentos durante su cultivo como durante la fase de almacenamiento. En este sentido, los hongos filamentosos son en gran parte los agentes etiológicos responsables del deterioro de alimentos después de la cosecha produciendo pérdidas en la calidad y devaluación económica. Por otra parte, las infecciones fúngicas invasivas producidas por levaduras han aumentado considerablemente en los últimos años. Candidiasis, es la enfermedad producida por Candida albicans. Esta es una de las infecciones más comunes que afectan pacientes inmunocomprometidos requiriendo tratamientos de elevado coste. Se han propuesto varios métodos hasta la fecha para la detección de microorganismos patógenos. El cultivo es el método de referencia utilizado para la detección y cuantificación de bacterias. Tiene la ventaja de ser altamente selectivo y sensible pero tiene el inconveniente de requerir varios días para obtener un resultado. Para simplificar y automatizar la identificación de bacterias y hongos se han desarrollado kits bioquímicos rápidos. Aunque los resultados obtenidos usando esta clase de kits son comparables a las pruebas bioquímicas tradicionales, también 1 o 2 días son requeridos para la obtención de resultados. El enzimoinmunoensayo ("Enzyme Linked Immunosorbent Assay", ELISA) es un método immunológico de gran sensibilidad que se utiliza ampliamente para detectar y cuantificar microorganismos patógenos, tanto en el sector médico como en el alimentario. Sin embargo, su principal desventaja es que a veces el tiempo de análisis puede aumentar considerablemente, específicamente cuando se realizan etapas de pre-enriquecimiento de la muestra para disminuir el límite de detección. Como consecuencia, muchos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia el desarrollo de métodos más rápidos. Los métodos basados en el uso de la biología molecular, específicamente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR en tiempo real, son hoy en día las herramientas más comúnmente usadas para la detección de patógenos. Estas técnicas son altamente sensibles y permiten la cuantificación del patógeno. Adicionalmente, se han desarrollado chips con plataformas de DNA para analizar cientos de patógenos simultáneamente. Sin embargo, esta técnica es costosa y requiere el uso de muchos reactivos. La introducción de los biosensores ha contribuído a generar nuevas alternativas para la detección de patógenos. Los biosensores son las herramientas más usadas en la detección de patógenos después de la PCR, los métodos convencionales y el ELISA. Tienen la ventaja de proporcionar respuestas rápidas entre la toma de muestra y la obtención de los resultados. No obstante, el reto para su aplicación en muestras reales radica en alcanzar selectividades y sensibilidades comparables a los métodos convencionales ya establecidos y a un costo económico reducido. Desde que Iijima descubrió los nanotubos de carbono (CNTs) se han publicado numerosos trabajos sobre sus excelentes propiedades electrónicas y ópticas, las cuales, en conjunción con su tamaño, hacen de estas nanoestructuras materiales interesantes en el desarrollo de plataformas de biodetección. Los CNTs presentan una gran capacidad de transferencia de carga entre estructuras heterogéneas. Ello les confiere una gran utilidad en la elaboración de sensores de tipo electroquímico. Su conductividad eléctrica varía de forma muy acusada con cambios en su ambiente químico y, como resultado, se han aplicado con éxito en el estudio de procesos de reconocimiento molecular. Una metodología para la detección directa de biomoléculas integra los CNTs como elementos transductores dentro de una configuración de transistor de efecto campo (FET). Las principales ventajas de esta clase de configuraciones radican en que el canal conductor se localiza sobre la superficie del substrato y, como resultado, es altamente sensible a cualquier cambio en el medio ambiente. Además, los CNTFETs pueden operar a temperatura y, humedad ambientales. Al inicio de esta tesis (2006), todavía no se habían aplicado los CNTFETs basados en nanotubos de carbono monocapa a la detección de bacterias y hongos. Sólo se había estudiado la interacción entre los CNTs y bacterias, pero sin el objetivo de detección. Por tanto, esta tesis aporta los primeros CNTFETs aplicados a la detección de microorganismos patógenos. En primer lugar, se presentan los antecedentes y la introducción, donde se realiza una revisión crítica y actualizada de los métodos e investigaciones más relevantes para detectar microorganismos patógenos. Posteriormente, se incluye un capítulo con la información detallada de todos los procedimientos experimentales, herramientas analíticas y materiales utilizados a lo largo del trabajo de investigación. En los siguientes capítulos, se presenta la aplicación de CNTFETs en la determinación de bacterias, mohos y levaduras mediante artículos científicos publicados a lo largo del desarrollo de la tesis. Brevemente, el primer dispositivo desarrollado se aplicó a la detección de Salmonella Infantis en una matriz simple (solución salina 0.85 %) y se comprobó por primera vez que esta clase de sensores eran capaces de detectar al menos 100 ufc/mL de la bacteria en tan solo una hora con alta selectividad. Seguidamente, se amplió el campo de aplicación a otro tipo de microorganismo, Candida albicans. En este estudio, se mejoró no sólo el límite de detección de los dispositivos a 50 ufc/mL sino que también se mejoró la selectividad de los CNTFETs frente a posibles interferentes que pueden estar presentes en muestras reales, tales como proteínas séricas. Finalmente, se aplicaron los dispositivos a la detección del moho Aspergillus flavus en muestras reales. En este ensayo, el tiempo de respuesta fue de 30 minutos y se obtuvo una buena sensiblidad (10 µg de A. flavus / 25 g de arroz). Como parte final de la tesis, se presentan las conclusiones generales extraídas a lo largo del trabajo completo junto con los anexos. Puede concluirse que, gracias a las propiedades únicas de los nanotubos de carbono, dichos nanomateriales pueden combinarse con entidades biológicas (como los anticuerpos) para obtener biosensores altamente sensibles y selectivos capaces de detectar bacterias, levaduras y mohos en un tiempo de análisis muy reducido. Como trabajo futuro, se deberán estudiar otros parámetros de calidad de los dispositivos tales como la estabilidad a lo largo del tiempo, la robustez o su reutilización con el fin de contrastarlos con los métodos estándar antes de poder iniciar la comercialización de este tipo de sensores.

Ingeniero Civil en Química / Ingeniero Civil en Biotecnología / Debido a la gran demanda de proteínas recombinantes y en particular de anticuerpos para el uso terapéutico en humanos, se busca optimizar los cultivos celulares para obtener mayor producción de proteínas y menores costos de producción. Uno de los métodos utilizados en el mejoramiento de los cultivos es la ingeniería celular donde, mediante la inserción o eliminación de un gen, se modifican las vías metabólicas de las células. Las líneas celulares animales tienen la desventaja de que su metabolismo es incapaz de oxidar la glucosa completamente a CO2 y H2O. La mayor parte de la glucosa, es oxidada a piruvato y finalmente a lactato, el que tiene un impacto negativo en el crecimiento celular y en la producción de proteínas. El trabajo consistió en caracterizar los clones CHO MDHII y CHO PYC generados a partir de una línea celular CHO productora de IgG, que sobreexpresan los genes MDHII y PYC2 las cuales han mostrado mejorar la eficiencia del metabolismo en otras líneas celulares, produciendo menos lactato y aumentando el flujo de carbonos desde la glicólisis hacia el ciclo del TCA. Para ello fue necesario hacer una selección previa de clones, de tal forma de escoger a los que presentaran mayor productividad específica de IgG y mayor eficiencia metabólica, caracterizada por valores bajos de producción de lactato por glucosa consumida (ΔL/ΔG). Luego se procedió a realizar las curvas de crecimiento para los clones y las células CHO wild-type que se utilizó como control. Para la caracterización del metabolismo, se midió la glucosa consumida, la producción de lactato, IgG y amonio, y se calcularon las tasas de consumo y producción de los metabolitos. La caracterización de la expresión transcripcional se realizó mediante un PCR en tiempo real, para el que fue previamente necesario extraer el RNA de las muestras, seguida de la síntesis de cDNA. Los resultados mostraron una menor producción de biomasa y anticuerpo IgG en los clones en comparación al control CHO wild-type, debido a un aumento inesperado en la producción de este último. Por otro lado, sí fue posible demostrar una mayor eficiencia metabólica de los clones debido a la disminución en la producción de lactato, en el caso del clon CHO MDHII y a una menor diferencia entre las tasas de producción de lactato y consumo de glucosa, en el clon CHO PYC. Al comparar las eficiencias de ambos clones, las células CHO MDHII mostraron una mayor eficiencia metabólica lo que se debería a un mayor flujo de carbonos desde la glicólisis al ciclo del TCA. Se cree que el clon CHO PYC no mostró una mayor eficiencia metabólica debido a que se generaría una acumulación de malato que no podría ser procesada por la enzima MDHII en el ciclo del TCA. Los cálculos de productividad específica de IgG demostraron que la producción de proteína recombinante estaría asociada al crecimiento celular y se cree que el consumo de glutamina cumpliría un rol importante en la producción de biomasa e IgG debido a que se obtuvieron mayores concentraciones de amonio en las células con mayor densidad y producción de proteína. El análisis de la expresión transcripcional no permitió detectar diferencias en la amplificación de los genes MDHII y PYC2, principalmente debido a la variación en los resultados obtenidos y a que no fue posible amplificar un producto específico para el gen PYC2. Del trabajo se puede concluir que el clon CHO MDHII presentó una mayor eficiencia metabólica debido a la menor producción de lactato y exhibió mayor producción de biomasa e IgG que el clon CHO PYC. Para comprender mejor el comportamiento de estos clones, se debe llevar a cabo un estudio de los flujos en las vías metabólicas y buscar métodos de cultivo que optimicen el crecimiento celular y la producción de proteína, para obtener el máximo beneficio de los clones. Por otro lado, es importante que en el proceso de la selección de clones, la productividad de proteína recombinante de los clones se compare con una muestra control, de tal manera de verificar que estos presentan una mejora. Además se deben seleccionar los clones que presenten una mayor densidad celular y menor producción de lactato, ya que se ha visto que estas características mejoran la productividad.

Diferentes factores genéticos y ambientales influyen en el desarrollo de la enfermedad celíaca (EC). La evidencia clínica muestra que la lactancia materna prolongada se ha asociado a una incidencia decreciente de EC en niños. Partiendo de la hipótesis de que péptidos del gluten y/o anticuerpos anti-gliadina (AAG) presentes en leche materna (LM) podrían ayudar a prevenir o modular el desarrollo de la EC, nos planteamos estudiar la presencia de AAG y péptidos de gliadina en LM en un grupo de madres con diagnóstico de EC que siguen una dieta sin gluten (DSG) y en un grupo de madres no celiacas con dieta normal (DN), y comparar los niveles de anticuerpos y péptidos de gliadina de ambos grupos de madres, con el fin último de poder establecer una posible relación con el desarrollo de EC en su descendencia. El objetivo secundario fue analizar la respuesta inmune precoz en niños que recibieron LM y con diagnóstico de EC, profundizando en la serología, histología, así como la aparición de depósitos de intestinales de anticuerpos anti-transglutaminasa tisular (anti-TG2). Tras desarrollar un método para detectar AAG en LM, encontramos AAG presentes tanto en la LM de madres EC tras una DSG, como en madres que siguen una DN, por lo que la dieta no sería un factor clave que influya en la presencia de AAG en LM. Se encontró una marcada tendencia hacia una disminución gradual en el contenido de IgA total en la LM de madres con EC a lo largo de los meses, mientras que permanecía estable en las madres no EC. Esta disminución de las concentraciones de IgA en la LM podría reducir la protección de la mucosa del lactante, contribuyendo a la disbiosis y la respuesta proinflamatoria, ambos factores podrían eventualmente favorecer la pérdida de tolerancia al gluten. En cuanto a la detección de péptidos de gluten en LM, la alta variabilidad en los resultados obtenidos en los análisis, indica de presencia de interferentes en las muestras de LM que estarían alterando la cuantificación de los mismos, siendo necesario investigaciones adicionales para conocer o identificar los componentes que están interfiriendo en el análisis. Por último, confirmamos que los depósitos intestinales de anti-TG2 son un evento precoz en el desarrollo de la respuesta inmunológica responsable de la EC, pudiendo preceder a la aparición de anticuerpos anti-TG2, incluso en lactantes pequeños. / Different genetic and environmental factors influence the development of celiac disease (CD). Clinical evidence shows that prolonged breastfeeding has been associated with a decreasing incidence of CD in children. Based on the hypothesis that gluten peptides and / or anti-gliadin antibodies (AGA) present in breast milk (BM) could help prevent or modulate the development of CD, our aim is to study the presence of AGA and gliadin peptides in BM from a group of CD mothers who follow a gluten-free diet (GFD) and from a group of non-coeliac mothers on a normal diet (ND), and to compare the levels of antibodies and gliadin peptides from both groups of mothers, with the ultimate goal of establishing a potential relationship with the development of CD in their offspring. The secondary objective is to analyse the early immune response in children who received BM and with a diagnosis of CD, deepening into the serology, histology, as well as the appearance of intestinal deposits of anti-tissue transglutaminase (anti-TG2) antibodies. After developing a method to detect AGA in BM, we found AGA present both in BM of CD mothers on a longstanding GFD, and in mothers who follow a ND, so that gluten exclusion would not be a key factor that influences the presence of AGA in BM. A marked tendency towards a gradual decrease in the total IgA content in the BM of CD mothers was found over the months, while it remained stable in non-CD mothers. This decrease in IgA concentrations in the BM could reduce the protection at the intestinal mucosal level by contributing to dysbiosis and to a proinflammatory response; both factors could eventually favour losing tolerance to gluten. Regarding the detection of gluten peptides in BM, the high variability in the results obtained in the analyses, indicates the presence of interferences in BM samples that would be altering the quantification of the same, reason why more research is needed on this topic, studying the components that are interfering in the analysis. Finally, we confirmed that intestinal anti-TG2 deposits are an early event in the CD development preceding serum anti-TG2 antibodies detection, even in very young infants. / Diferents factors genètics i ambientals influeixen en el desenvolupament de la malaltia celíaca (MC). L'evidència clínica mostra que la lactància materna prolongada s'ha associat a una incidència decreixent de MC en xiquets. Partint de la hipòtesi que pèptids del gluten i/o anticossos anti-gliadina (AAG) presents en llet materna (LM) podrien ajudar a previndre o modular el desenvolupament de la MC, ens plantegem estudiar la presència d'AAG i pèptids de gliadina en LM en un grup de mares amb diagnòstic de MC que segueixen una dieta sense gluten (DSG) i en un grup de mares no celíaques amb dieta normal (DN), i comparar els nivells d'anticossos i pèptids de gliadina d'ambdós grups de mares, amb el fi últim de poder establir una possible relació amb el desenvolupament de MC en la seua descendència. L'objectiu secundari va ser analitzar la resposta immune precoç en xiquets que van rebre LM i amb diagnòstic de MC, aprofundint en la serologia, histologia, així com l'aparició de depòsits d'intestinals d'anticossos anti-transglutaminasa tissular (anti-TG2). Després de desenvolupar un mètode per a detectar AAG en LM, trobem AAG presents tant en la LM de mares MC després d'una DSG, com en mares que segueixen una DN, per la qual cosa la dieta no seria un factor clau que influeix en la presència d'AAG en LM. Es va trobar una marcada tendència cap a una disminució gradual en el contingut d'IgA total en la LM de mares amb MC al llarg dels mesos, mentre que romania estable en les mares no MC. Esta disminució de les concentracions d'IgA en la LM podria reduir la protecció de la mucosa del lactant, contribuint a la disbiosis i la resposta proinflamatòria, ambdós factors podrien eventualment afavorir la pèrdua de tolerància al gluten. En quant a la detecció de pèptids de gluten en LM, l'alta variabilitat en els resultats obtinguts en les anàlisis, indica de presència d'interferents en les mostres de LM que estarien alterant la quantificació dels mateixos, per la qual cosa es necessita més investigació sobre este tema, estudiant els components que estan interferint en l'anàlisi. Finalment, confirmem que els depòsits intestinals d'anti-TG2 són un esdeveniment precoç en el desenvolupament de la resposta immunològica responsable de la MC, podent precedir a l'aparició d'anticossos anti-TG2, inclús en lactants xicotets. / Roca Llorens, M. (2018). ESTUDIO DE MEDIADORES HUMORALES INMUNOLÓGICOS Y FACTORES DIETÉTICOS DE RIESGO EN LA ENFERMEDAD CELIACA [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/110083 / TESIS

Caracteriza el consumo de anticuerpos monoclonales en la Unidad de Mezclas Oncológicas (UMO) del Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen (HNGAI), de enero a diciembre del 2018; para lo cual se realizó un estudio descriptivo, transversal y retrospectivo. Se trabajó con reportes de registros emitidos por el sistema de gestión hospitalaria (SGH). Se determinó que el mayor consumo fue para la especialidad de oncología con 73,05%, También se determinó que el consumo anual de anticuerpos monoclonales fue mayor para rituximab 10mg/mL x 50mL (500mg) con 1214 ampollas, rituximab de10mg/mL x 10mL (100mg) con 716 ampollas, trastuzumab, nivolumab y cetuximab con 645, 298 y 240 ampollas, respectivamente. Con respecto al mayor gasto fue para trastuzumab con S/.3 124 134 soles, seguido de rituximab 500mg, nivolumab, rituximab 100mg, cetuximab con S/. 2 913 287, S/. 1 674 107, S/.375 211, S/.241 920 soles, respectivamente. El remanente total de anticuerpos monoclonales fue de 312 ampolla de los cuales, el que genero mayor remanente fue el rituximab de 100mg con 152 ampollas, en comparación con el trastuzumab, rituximab con 113, 47 ampollas respectivamente por otro lado el ahorro total del remanente fue de 726 278 soles de los cuales fue para trastuzumab S/.531688 soles, seguido de rituximab de 500mg con S/.114 763 soles y finalmente el rituximab de 100mg con S/.79 827soles. Se concluye que el consumo de ampollas de anticuerpos monoclonales utilizadas en la UMO fue de 3113 ampollas, siendo su costo valorizado en S/.8 328 659 soles correspondientes al período de enero a diciembre 2018. / Trabajo académico