O objetivo do presente trabalho foi estudar a ação de diversos antifúngicos isolados e associados a anfotericina B contra amostras sequenciais ou não recuperadas de pacientes com cromoblastomicose e submetidas ou não a tratamento. A partir de 18 pacientes foram isoladas 39 cepas, submetidas a testes de diluição em ágar contendo anfotericina B, cetoconazol, itraconazol, terbinafina, 5-fluorocitosina, fluconazol ou griseofulvina. Com base nas CIMs e nas concentrações séricas desses antifúngicos verificou-se que as amostras foram, de modo geral, sensíveis ao cetoconazol, a terbinafina e ao itraconazol. Somente 13 amostras foram sensíveis a anfotericina, 7 a 5-FC, 2 ao fluconazol e nenhuma à griseofulvina.Com relação as CFMs, 2 cepas foram sensíveis a AnB, 11 ao itraconazol, 20 ao cetoconazol e 3 a 5-FC. Seis não responderam a terbinafina e 38 ao fluconazol. As combinações de antifúngicos resultaram em interações principalmente aditivas ou indiferentes. O estudo de isolados seqüenciais evidenciou um ponto de corte para sensibilidade desses agentes ao itraconazol, correspondente a ClMs ≤0,06µg/ml desse azol. / The aim of the present work was to study the action of several antifungals isolated and combined with amphotericin B against sequential or non-sequential samples in patients infected with chromoblastomycosis and treated or not treated. Thirty nine strains from 18 patients were isolated and submitted to agar dilution testing containing amphotericin B, cetoconazole, itraconazole, terbinafine, 5-flucytosin, fluconazole or griseofulvin. Based on the CIMs and on the serum levels of these antifungals, the isolates were susceptible to ketoconazole, terbinafine and itraconazole. Only 13 of the isolates were susceptible to amphotericin; seven to 5-FC, two to fluconazole and none to a griseofulvin. Regarding the CFMs two strains were susceptible to AnB, 11 for itraconazole, 20 for ketoconazole and three for 5-FC. Six didn\'t respond to terbinafine and 38 for fluconazole. The combination of antifungals resulted in mainly additive or indifferent interaction. The study of the sequential isolated sample showed a breaking point for the susceptibility of these agents to itraconazole, corresponding CIMs ≤0,06µg/ml of this azole.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Candida dubliniensis fue descrita por primera vez en el año 1995, como una levadura estrechamente relacionada con Candida albicans. Coloniza normalmente la cavidad oral, tracto respiratorio alto y otros lugares anatómicos. Debido a que la mayoría de las infecciones ocurre en individuos con inmunosupresión se la describe como un patógeno oportunista. A diez años de su descubrimiento varios aspectos de su biología son poco claros, como los mecanismos de resistencia que puede adquirir. Se caracteriza por su capacidad para adquirir resistencia tanto in vivo como in vitro cuando es sometida a tratamientos con antifúngicos. Varios estudios han postulado que esta habilidad podría estar relacionada a un proceso de microevolución El objetivo de este trabajo fue determinar la ocurrencia de microevolución in vitro en la levadura C. dubliniensis expuesta a fluconazol (FCZ) y analizar su relación con la aparición de cepas menos susceptibles a este antifúngico. Para ello, se estudió el comportamiento de una cepa de C. dubliniensis, cuyo valor de Concentración Mínima Inhibitoria (CIM) fue 0,5 μg/mL a fluconazol. La cepa fue sometida a un cultivo seriado con concentraciones crecientes de FCZ desde 0,5 a 128 g/mL, tomándose muestra a distintos intervalos de tiempo. Las colonias obtenidas fueron caracterizadas molecularmente por Amplificación Aleatoria del ADN Polimórfico, RAPD (“Randomly Amplified Polymorfic DNA”) y en cada caso se determinó su susceptibilidad a fluconazol mediante microdilución en caldo. C. dubliniensis dio origen a cepas menos susceptibles a fluconazol, cuando fue expuesta al antifúngico. Las cepas menos sensibles presentaron una CIM de 32 g/mL, valor superior al encontrado entre las cepas derivadas del grupo control (CIM=0,125 g/mL). Además, el grupo de cepas menos susceptibles experimentó mayor microevolución, lo que determinó una alta diversidad genética, expresada en la aparición de un número mayor de genotipos (11 genotipos diferentes) respecto al grupo control (6 genotipos), con valores de diversidad genotípica G de 5,00 y 3,76, respectivamente. Estos resultados sugieren una relación entre la adquisición de resistencia y la microevolución en cepas de Candida dubliniensis cultivadas in vitro. Sin embargo, esto debe ser evaluado más extensamente analizando un mayor número de cepas.

A procura por novos agentes com ação antifúngica está se intensificando nos últimos anos. A incidência de infecções fúngicas causadas por espécies do gênero Candida sp tem aumentado consideravelmente, principalmente em pacientes imunocomprometidos, nos quais podem apresentar gravidade. Por esse motivo, há uma intensa busca por novas substâncias com atividade antifúngica concomitante com pesquisa de novos alvos farmacológicos. A proteína H+-ATPase presente na membrana plasmática dos fungos é um novo alvo promissor, já que é exclusiva de células fúngicas. O Ebselen, mostrou ser um bom inibidor de H+-ATPase, sendo utilizado em alguns estudos como padrão de inibição dessa enzima. O eugenol, presente nos óleos essenciais de várias espécies vegetais é conhecido por apresentar diversas propriedades biológicas, incluindo ação antifúngica, a qual também parece estar relacionada à inibição desta ATPase microbiana. Soma-se a isso, o fato das 1,2-benzisoxazolin-3-onas, serem uma classe pouco explorada quanto ao seu perfil de ação biológica. Nesse contexto, foram planejados e sintetizados por hibridização molecular seis derivados benzisoxazolinônicos do eugenol e substâncias correlatas. Destes, quatro são inéditos, sendo que nenhum deles foi explorado quanto ao potencial antifúngico. Os produtos planejados foram sintetizados por meio de procedimentos sintéticos clássicos, tendo em comum as etapas finais de formação de intermediários do tipo ácido hidroxâmico seguido de ciclização às benzisoxazolinonas via reação de Mitsunobu. Os produtos finais foram caracterizados pelos métodos espectrométricos usuais. Na sequência, os produtos finais, bem como intermediários de síntese, foram avaliados quanto à sua atividade antifúngica in vitro frente a espécies de Candida spp. por meio de testes de microdiluição. Adicionalmente, os produtos mais promissores tiveram avaliados seus perfis de citotoxidade para determinação do índice de seletividade. Os testes revelaram que todos os compostos sintetizados apresentam atividade antifúngica superior à do eugenol. As N-fenilbenzisoxazolinonas (18, 19 e 20) foram as mais promissoras, apresentando, em alguns casos, valores de IC50 comparáveis ou até igual ao do fármaco fluconazol contra as espécies C. krusei e C. glabrata. O composto 19 apresentou um IC50 de 142 M frente a C. krusei, valor esse bem próximo ao alcançado pelo fluconazol (104 µM), sendo também o único híbrido planejado que se mostrou fungicida. O produto de hibridização 18, alvo do planejamento desse trabalho, foi o mais ativo contra C. glabrata com um CI50 de 53 µM. Ele obteve um índice seletividade bom (IS 3,4) e sua potência foi igual à do fluconazol (CI50 52 µM). Essa classe de heterociclos é ainda pouco explorada e mostrou ter atividade antifúngica, sendo passível de alterações estruturais para otimização dessa atividade biológica. / The incidence of fungal infections caused by Candida spp. has increased considerably, especially in immunocompromised patients, who may present gravity. The most widely used antifungal agents in the treatment of these infections are amphotericin B and azole. However, resistence to drugs and severe side effects limit the success of therapeutics. For these reasons, there is an intensive search for new substances with antifungal activity, mainly those acting in new molecular targets. Ebselen, a seleno-organic compound is a good inhibitor of H+-ATPase, an essential and unique yeast enzime. On the other hand, eugenol is a natural product present in the essential oils of several plant species, especially in clove, is and it known for its various biological properties, including antifungal action, which also seems to be related to inhibition of this microbial ATPase. Likewise, of benzisoxazolinones, are heterocycles chemically similar to ebselen, but relatively little explored as bioactive compounds. In this context, we describe here the design and synthesis of benzisoxazolinones derived from eugenol (our related substances) and ebselen, planned according to molecular hybridization strategy. They were synthesized by classical synthetic procedures and the final step consisted cyclization in hydroxamic acids into benzisoxazolinone via Mitsunobu reaction. The final products were obtained with yields ranging from 5 to 70% and were characterized by standard spectroscopic methods. Next, the final products, and synthetic intermediates were evaluated for their in vitro antifungal activity against Candida spp. by microdilution tests. In addition, the most promising products were evaluated for their cytotoxicity profiles for determining the selectivity indexes. Tests have shown that all synthesized compounds have antifungal activity higher than eugenol. The N-phenylbenzisoxazolinones (18, 19 and 20) were the most promising ones showing in some instances IC50 values comparable oe equal to those of fluconazole against C. krusei and C. glabrata. Compound 19 showed an IC50 of 142 µM against C. krusei, very close to that achieved by fluconazole (104 µM) and was the only hybrid with fungicidal activity. Product 18, eugenol-ebselen hybrid, was the most active one against C. glabrata with an IC50 of 53 µM, good selectivity index (3.4) and potency equal to that of fluconazole (IC50 52 µM). These results highlight these derivatives as good compounds for structural optimization and further studies, as investigations on its molecular mechanism of antifungal action. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Onicomicose é uma infecção crônica das unhas provocadas por fungos. É a doença mais comum das unhas em todo o mundo e constitui cerca de metade de todas as alterações ungueais em indivíduos imunocompetentes e imunossuprimidos. Nos últimos anos, vários estudos tem demonstrado aumento na prevalência de onicomicose. Esse aumento pode ser atribuído a diversos fatores, incluindo o aumento da expectativa de vida, e propagação do vírus da imunodeficiência humana (HIV). Nesse sentido, o número de pacientes renais crônicos vem aumentando em todo mundo. No entanto, a literatura relata poucos estudos sobre a prevalência e as características das onicomicoses nestes pacientes. Diante disso, nossos objetivos foram determinar a prevalência, etiologia e perfil de suscetibilidade das onicomicoses provenientes de pododáctilos de pacientes dialíticos (DL), receptores de transplante renal (RTR) e pacientes grupo controle. Foram examinados 510 pacientes, sendo 336 provenientes da Unidade de Transplante Renal (149 DL e 187 RTR), e 174 pacientes do Ambulatório de Clínica Geral, sem histórico de doença associada à imunossupressão (Grupo controle). Os isolados foram identificados por testes fenotípicos e moleculares. O perfil de suscetibilidade foi realizado pelo método de microdiluição em caldo frente aos fármacos fluconazol, itraconazol, voriconazol e terbinafina. A prevalência de onicomicose foi de 23,4% nos pacientes DL e 23,0% nos RTR, significativamente maior que no grupo controle (13,2%). Nos pacientes DL, onicomicose foi associada com diabetes, mas não com o tempo de diálise e sexo. Nos pacientes RTR, onicomicose foi mais prevalente em homens, mas não houve associação com duração do transplante, diabetes e protocolo de tratamento imunossupressor. Trichophyton rubrum foi a agente mais prevalente (45,9%), seguido por T. mentagrophytes (24,5%) e Candida parapsilosis (18%). Todos antifúngicos foram eficazes frente aos isolados de dermatófitos, sendo terbinafina o mais eficiente. Os isolados de C. parapsilosis foram todos sensíveis aos quatro antifúngicos de acordo com os atuais \"end-points\". Nossos achados permitiram concluir que pacientes renais (DL e RTR) tem risco aumentado de desenvolver onicomicose. Nossos dados também revelaram que a etiologia e a suscetibilidade das espécies isoladas são comparáveis aos encontrados em outros grupos de pacientes não renais descritos na literatura. / Onychomycosis is a chronic fungal infection of the nail. It is the most common disorder of nails worldwide and constitutes about 50% of all nail changes of the immunosuppressed and healthy patients. In recent years, several reports have shown increased prevalence of onychomycosis. This increase can be attributed to several factors, including increased life expectancy, and to the human immunodeficiency virus (HIV) epidemics. In this regard, the number of chronic renal patients is also increasing worldwide. However, the literature reports few studies on onychomycosis in these patients. Therefore, our objectives were to determine the prevalence, etiology and susceptibility profile of onychomycosis of the toenail of patients undergoing hemodialysis treatment (HD), kidney transplant recipients (KTR) and control patients. Were examined 510 patients, 336 attending the Renal Transplantation Unit (187 KTR e 149 HD) and 174 patients attending an internal medicine outpatient service with diseases other than renal disease (control group). The isolates were identified by phenotypic and molecular tests. Antifungal susceptibility tests were performed using a broth microdilution method against the antifungal drugs voriconazole, itraconazole, fluconazole and terbinafine. The prevalence of onychomycosis in HD patients (23.4%) and KTR (23.0%) was significantly higher than control group (13.2%). In HD patients, onychomycosis was associated with diabetes but not duration of dialysis and gender. In KTR, onychomycosis was more prevalent in males, but not associated with duration of transplantation, diabetes or immunosuppressive protocols. Trichophyton rubrum was the most prevalent species (45.9%) followed by T. mentagrophytes (24.5%) and Candida parapsilosis (18%). While all antifungals were efficient against the dermatophyte isolates, terbinafine was the most effective. All C. parapsilosis isolates were sensitive to the antifungals according to the current end-points. In conclusion, this study shows that HD patients and KTR are at high risk of contracting onychomycosis. Our data also show that the etiology and susceptibility of the species are comparable with those found in other groups of non-renal patients described in the literature.

Os membros do complexo de espécies Fusarium graminearum (CEFG) estão entre os mais importantes fungos micotoxigênico que infectam tecidos florais e interferem no desenvolvimento dos grãos de cereais resultando na redução da produtividade e qualidade dos grãos. Sais imidazólicos (SI) são compostos orgânicos constituídos por um grande cátion orgânico em conjunto com um ânion e alquilo substituintes. Os cátions e ânions constituintes modificam as propriedades químicas e físicas resultando no surgimento de características interessantes destes compostos, que incluem natureza anfifílica e baixa toxicidade para as células humanas. Recentemente, SI foram testados contra fungos e bactérias patogênicas para o homem com resultados promissores. O objetivo deste estudo foi investigar a atividade antifúngica de SI contra o CEFG que afetam grãos de trigo. A sensibilidade de F. graminearum, F. asiaticum e F. meridionale foi avaliada frente a três SI, que variaram quanto aos ânions substituintes (C16MImCl, C16MImMeS e C16MImNTf2), e um fungicida comercial (tebuconazol). A avaliação foi realizada com base na germinação dos esporos e na inibição efetiva de 50% do micélio. A concentração inibitória mínima (CIM) variou de 1,56 a 6,25 μg/mL, e o CIM mais frequente foi determinado em 3,12 μg/mL. Apenas um SI, cloreto de 1-n-hexadecil-3-metilimidazolio - C16MImCl, foi capaz de reduzir 50% do crescimento micelial in vitro (CE50) para todos os isolados, a uma concentração de 0,321 g/L. As curvas de tempo de morte indicaram que o SI C16MImCl apresenta efeito fungicida significativo na concentração de 12,48 μg/mL, com a ação iniciada desde a primeira hora de incubação, que foi mantida durante o desenvolvimento do ensaio. O SI C16MImCl foi pulverizado sobre as espigas de trigo durante a floração suprimindo com sucesso os sintomas e controlando F. graminearum nas espigas e grãos quando aplicado de forma preventiva (antes da inoculação fúngica) e na dose mais elevada (2 g/L), não diferindo do fungicida usual tebuconazol. Os dados sugerem o uso potencial do SI C16MImCl para o controle do fungo micotoxigênico F. graminearum em doenças que afetam o trigo especialmente quando aplicados antes da infecção fúngica. / Members of the Fusarium graminearum species complex (FGSC) are among the most important mycotoxigenic fungi that infect floral tissues and developing kernels of cereal crops, and lead to reduced grain yield and quality. Imidazolium salts (IMSs), are organic compounds composed entirely of a large organic cation together with an anion and alkyl substituents. The cation and/or anion constituents modifiy the chemical and physical properties which may result in the emergence of interesting properties of these compounds that include an amphiphilic nature, low toxicity to human cells . Recently, IMSs have been tested against fungi and bacteria that are pathogenic to humans with promising results. The aim of this study was to investigate the antifungal activity of imidazolium salts (IMS) against FGSC which affects wheat grains. The sensitivity of F. graminearum, F. asiaticum and F. meridionale isolates to three IMS, which vary in substituent anions (C16MImCl, C16MImMeS and C16MImNTf2), and one commercial fungicide (tebuconazole) was evaluated based on spore germination and mycelial growth inhibition. The minimum inhibitory concentration (MIC) ranged from 1.56 to 6.25 μg/mL, with 3.12 μg/mL as the most frequent MIC. Only one IMS, 1-n-Hexadecyl-3-methylimidazolium chloride (C16MImCl), was able to reduce 50% of the in vitro mycelial growth (EC50) for all isolates at a concentration of 0.321g/L. The time-kill curves indicated a significant fungicidal effect at the concentration of four times the MIC (12,48 μg/mL), starting since one hour after incubation, which was maintained during the course of the experiment. The IMS C16MImCl sprayed onto the wheat spikes during flowering succesfully supressed symptoms and control of the disease in the spikes and kernels when applied preventatively (before fungal inoculation) at the highest dosage (2 g/L), not differing from tebuconazole. The data suggests the potential of using an IMS for controlling mycotoxigenic Fusarium and the resulting disease affecting wheat, especially when applied prior to fungal infection.

As taxas de mortalidade causadas por Candida não-albicans (CNA) aumentaram nas últimas décadas e a resistência aos fármacos é um desafio para tratamento dessas infecções, representando um problema de saúde pública. O uso indiscriminado de antifúngicos, principalmente fluconazol (FLZ) resulta no surgimento de cepas resistentes aos medicamentos entre populações anteriormente suscetíveis. Dessa forma mostra-se importante a realização de testes de aquisição de resistência in vitro na prospecção de um novo medicamento. Própolis é uma mistura resinosa complexa feita pelas abelhas e sua atividade antifúngica já foi intensamente investigada, entretanto, sua capacidade de indução de resistência em fungos ainda não havia sido avaliada. O objetivo principal desse estudo foi averiguar a capacidade de C. parapsilosis e C. glabrata desenvolverem resistência fenotípica à fração enriquecida em benzofenonas da própolis vermelha brasileira e comparar ao FLZ, bem como investigar possível sinergismo quando esta fração é associada com FLZ e anidulafungina (AND). Para analisar o desenvolvimento de resistência, isolados suscetíveis foram cultivados em concentrações crescentes de FLZ e a fração de própolis. O aumento da concentração inibitória mínima (CIM) do FLZ foi evidenciado para todos isolados e a maioria desenvolveu resistência, enquanto que nenhum isolado tornou-se menos suscetível à própolis após a exposição O sinergismo foi investigado pelo método checkerboard. Própolis e FLZ demonstraram sinergia para a maioria dos isolados com resistência induzida ao FLZ, e própolis e AND apresentaram aditividade ou indiferença para a maioria dos isolados. Em conclusão, a própolis demonstrou ser um produto não indutor de resistência, uma vez que não provocou o desenvolvimento de resistência in vitro, ao contrário do FLZ. Além disso, própolis mostrou importante efeito sinérgico com FLZ, apontando uma possível estratégia terapêutica para o tratamento de infecções relacionadas a Candida spp. resistentes ao FLZ. / Mortality rates caused by non-albicans Candida (CNA) have increased in recent decades and drug resistance is a challenge to treat these infections, representing a public health problem. The indiscriminate use of antifungals, especially fluconazole (FLZ), results in the emergence of drug-resistant strains among previously susceptible populations. Thus it is important to develop tests of acquisition of resistance in vitro in prospecting of a new drug. Propolis is a complex resinous mixture made by bees and its antifungal activity has been intensively investigated, however, its ability to induce resistance in fungi has not yet been evaluated. The main aim of this study was to evaluate the ability of C. parapsilosis and C. glabrata develop phenotypic resistance to benzophenones enriched fraction of the Brazilian red propolis and compare to the FLZ, as well as investigate possible synergy when this fraction is associated with FLZ and anidulafungin (AND). To analyze the development of resistance, isolates susceptible to these antifungals were cultured in increasing concentrations of FLZ and propolis. The increase in FLZ Minimum inhibitory concentration (MIC) for all isolates was evident and the majority has developed resistance, whereas none isolated has become less susceptible to propolis after exposure. Synergism was investigated by checkerboard method. Propolis and FLZ demonstrated synergy for most isolates with induced resistance to the FLZ, and propolis and AND showed additivity or indifference to the majority of the isolates. In conclusion, propolis has demonstrated to be a product does not inductor resistance, since it has not caused the development of resistance in vitro, unlike the FLZ. In addition, propolis showed an important synergistic effect with FLZ, indicating a possible therapeutic strategy for the treatment of infections related to FLZ-resistant Candida spp.

O presente trabalho teve como objetivo realizar a extração de lignanas e outros compostos fenólicos do farelo de linhaça desengordurado e avaliar a atividade antifúngica dessas frações frente a fungos leveduriformes do gênero Candida. Obteve-se o extrato bruto através de maceração com solução hidroalcólica. O extrato bruto foi hidrolisado em condições básicas e ácidas, objetivando-se o isolamento de heterosídeos e agliconas, respecitvamete. A lignana secoisolariciresinol diglicosídeo foi quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência. O flavonoide herbacetin diglicosídeo e a lignana anidrosecoisolariciresinol foram identificados por espectrometria de massas. A avaliação da atividade antifúngica foi realizada in vitro e foi observado que tanto o extrato bruto como o extrato obtido por hidrólise alcalina inibiram o desenvolvimento de Candida krusei CK 02 e Candida parapsilosis RL 20 na concentração de 500 μg/mL. O extrato obtido por hidrólise ácida, na mesma concentração, apresentou atividade inibitória frente a Candida krusei CK 02, Candida parapsilosis RL 20 e Candida tropicallis ATCC 750. A investigação das condições de hidrólise ácida, a melhor caracterização de seus componentes e a avaliação da ação antifúngica dos extratos frente a outros gêneros de fungos constituem perspectivas para trabalhos futuros. / The aim of the present work was carry out the extraction of lignans and other phenolic compounds from defatted flaxseed meal and evaluate the antifungal activity of these fractions against yeast fungi of Candida genus. The crude extract was obtained by maceration with a hydroalcoholic solution. The crude extract was hydrolyzed in basic and acidic conditions, aiming the isolation of glycosides and aglycones, respectively. Secoisolariciresinol diglucoside was quantified by highperformance liquid chromatography. The flavonoid herbacetin diglucoside and the lignan anhydrosecoisolariciresinol were identified by mass spectrometry. The avaliation of antifungal activity was performed in vitro and it was observed that both the crude extract and the extract obtained by alkaline hydrolysis inhibited the development of Candida krusei CK 02 and Candida parapsilosis RL 20 at a concentration of 500 ug/mL. The extract obtained by acid hydrolysis, in the same concentration, showed inhibitory activity against Candida krusei CK 02, Candida parapsilosis RL 20 and Candida tropicallis ATCC 750. The investigation of acid hydrolysis conditions, a better characterization of its components and the avaliation of antifungal activity against other fungi genera represents good potencial for future work.

Fungos filamentosos com capacidade de produzir micotoxinas podem estar presentes em alimentos, desde o cultivo até o produto após industrialização. Devido a isso, estratégias para controlar o crescimento fúngico devem ser investigadas, a fim de evitar o desenvolvimento desses microrganismos, bem como a produção de suas toxinas nos alimentos. Neste trabalho, duas abordagens para o controle de fungos toxigênicos foram avaliadas. A primeira estratégia foi a utilização de bactérias provenientes de diferentes ambientes aquáticos, sendo que 10 linhagens de Bacillus spp. e a linhagem Pseudomonas sp. 4B foram testadas quanto à influência sobre os parâmetros de crescimento (taxas de crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos) de fungos toxigênicos (Aspergillus e Penicillium) e formação de micotoxinas. Todas as bactérias foram capazes de inibir o crescimento dos fungos em meio de cultura, apresentando halos de inibição variando de 1,0 até 15,7 mm. Bacillus sp. P11 apresentou resultados mais expressivos em relação às demais linhagens do gênero Bacillus com maiores valores de redução na maioria dos parâmetros de crescimento. Além disso, Bacillus sp. P11 e Pseudomonas sp. 4B apresentaram efeito sobre as taxas de crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos, com níveis de redução acima de 43,3, 32,1 e 84,1% respectivamente. Mesmo assim, as demais linhagens também apresentaram resultados satisfatórios sobre esses parâmetros. Estas bactérias também reduziram a síntese de aflatoxina B1 e ocratoxina A em mais de 94 e 63%, respectivamente, quando cultivadas simultaneamente com os fungos produtores de cada micotoxina. Adicionalmente, a capacidade de Bacillus sp. P11 em produzir os lipopeptídeos iturina A (167,9 mg/mL de extrato butanólico) e surfactina (361,9 mg/mL de extrato butanólico) foi confirmada. Estes compostos podem ter contribuído para a atividade antifúngica desta bactéria. A segunda estratégia investigada neste estudo para controlar o desenvolvimento de fungos toxigênicos foi o emprego de nanofibras de poli-ɛ-caprolactona (PCL) incorporadas com cetoconazol e natamicina como material antimicrobiano. Nesta abordagem, as nanofibras foram produzidas pela técnica de eletrofiação e posteriormente caracterizadas e avaliadas quanto ao seu potencial antifúngico. Nanofibras funcionalizadas com cetoconazol ou natamicina apresentaram atividade antifúngica contra os isolados toxigênicos uma vez que zonas de inibição variando de 6 a 44 mm foram observadas. Além disso, as análises de microscopia eletrônica e espectroscopia demonstraram que a incorporação dos antifúngicos não altera de forma expressiva as principais características das nanofibras. Também foi possível verificar a capacidade de liberação controlada dos antifúngicos durante 72 h de contato das nanofibras com diferentes soluções simulantes. Valores próximos a 80 e 45 μg/mL de cetoconazol e natamicina, respectivamente, foram observados em solução de Tween 20 (5%). Portanto, o processo de eletrofiação foi capaz de agregar propriedades antifúngicas às nanofibras de PCL. Os resultados demonstraram que as bactérias e os nanomateriais investigados neste estudo são promissores para o controle de fungos toxigênicos e produção de micotoxinas. / Filamentous fungi that have the potential to produce mycotoxins may be present in food, from cultivation to after industrialization. Therefore, several strategies to control fungal growth must be investigated in order to avoid the development of these microorganisms and the production of their toxins in food. In this work, two approaches to toxigenic fungi control were evaluated. The first one was the use of bacteria from different aquatic environments as biocontrol agents in which 10 Bacillus spp. strains and the Pseudomonas sp. 4B strain were tested in relation to the effect on growth parameters (mycelial growth, sporulation and spore germination rates) of toxigenic fungi (Aspergillus and Penicillium) and mycotoxin formation. All bacteria were able to inhibit the fungal growth in culture medium with inhibition zones ranging from 1.0 to 15.7 mm. It was also observed that Bacillus sp. P11 had better results compared to other Bacillus strains with larger reduction values in most of growth parameters. Furthermore, Bacillus sp. P11 and Pseudomonas sp. 4B exhibited effect on mycelial growth, sporulation and spore germination rates with reduction values above of 43.3, 32.1 and 84.1%, respectively. Even so, the other strains also showed satisfactory results on these parameters. Finally, these bacteria reduced the synthesis of aflatoxin B1 and ochratoxin A at levels above 94 and 63%, respectively, when co-cultivated with each mycotoxin producing fungi. Additionally, the ability of Bacillus sp. P11 to produce lipopeptides such as iturin A (167.9 mg/ml of butanolic extract) and surfactin (361.9 mg/ml of butanolic extract) was confirmed. These compounds may have contributed to antifungal activity of this bacterium. The second investigation of this work in order to control the growth of toxigenic fungi was the use of poly-ε-caprolactone nanofibers incorporated with ketoconazole and natamycin as antimicrobial material. In this approach, nanofibers were produced by the electrospinning technique and subsequently characterized and evaluated for their antifungal potential. Both nanofibers functionalized with ketoconazole and natamycin showed antifungal activity against toxigenic isolates since inhibitory zones ranging from 6 to 44 mm were observed. In addition, scanning electron microscopy and infrared spectroscopy analysis showed that the antifungals incorporation does not change the characteristics of nanofibers. It was also possible to verify the ability of controlled drug release during 72 h of nanofibers contact with different simulants solutions. Values near 80 and 45 μg/ml of ketoconazole and natamycin, respectively, were observed in the solution containing 5% Tween 20. Therefore, the electrospinning process was able to provide antifungal properties to the nanofibers. The results showed that bacteria and nanomaterials investigated in this study are promising for developing control strategies of toxigenic fungi and mycotoxin production.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-22T14:32:37Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Gabriela de Souza da Silva.pdf: 747981 bytes, checksum: c098f507cfc2f2c6e90b43f8f1a81fec (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-22T14:32:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Gabriela de Souza da Silva.pdf: 747981 bytes, checksum: c098f507cfc2f2c6e90b43f8f1a81fec (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-22T14:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Gabriela de Souza da Silva.pdf: 747981 bytes, checksum: c098f507cfc2f2c6e90b43f8f1a81fec (MD5) Previous issue date: 2016-04-27 / O fluconazol é um fármaco antifúngico de amplo espectro muito utilizado pela população. Contudo, são poucos os registros na literatura que imputem a segurança do uso do fluconazol e tampouco a dose mínima capaz de induzir lesões no material genético do paciente. Embora a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) exija testes de genotoxicidade para admissão de novos medicamentos, os que têm seu registro expedido antes do ano de 2006 não trazem essa obrigatoriedade, incluindo-se aqui o fluconazol. Portanto, é de extrema importância estudos sobre a avaliação genotoxicológica de fármacos, principalmente os que são tão conhecidos e utilizados como o fluconazol. O presente estudo investigou os efeitos genotóxicos da cápsula e do princípio ativo do fluconazol através do teste cometa e do teste de proliferação celular e também os efeitos citotóxicos da cápsula e do princípio ativo do fluconazol através do teste de viabilidade celular. As concentrações testadas da cápsula e do princípio ativo do fluconazol foram 6, 12, 30, 60 e 120 μg/mL. Todos os ensaios foram realizados em triplicatas e o peróxido foi utilizado como controle positivo e tampão PBS 7,4 como controle negativo. Todas as concentrações testadas da cápsula do Fluconazol (6, 12, 30, 60 e 120 μg/mL) demonstraram ser capazes de interferir negativamente no processo de proliferação celular, diminuindo o número de células proliferadas em todas as concentrações testadas, quando comparadas ao controle negativo. Já no caso do princípio ativo do Fluconazol, apenas as três últimas concentrações (30, 60 e 120 μg/mL) interferiram negativamente no processo de proliferação celular. Na avaliação do índice de dano ao DNA (teste cometa), foi observado dano à estrutura de DNA nas concentrações 60 e 120 μg/mL da cápsula do Fluconazol. Já as concentrações testadas com o princípio ativo do Fluconazol não foi observado dano à estrutura de DNA. Foi verificado que a cápsula do Fluconazol possui atividade citotóxica sobre leucócitos humanos nas duas maiores concentrações testadas (60 e 120 μg/mL) de forma concentração dependente. Porém, o princípio ativo do Fluconazol não demonstrou ser citotóxico nas concentrações testadas (6 12, 30, 60 e 120 μg/mL). / Fluconazole is a broad-spectrum antifungal drug widely used by the population. However, there are few reports in the literature that imput the safety of the use of fluconazole and either the minimum dose capable of inducing lesions in the genetic material of the patient. Although the National Health Surveillance Agency (ANVISA) requires genotoxicity tests for admission of new medicines, which have their registration issued before 2006 do not bring this obligation, including here fluconazole. Therefore, it is extremely important genotoxicológica studies on the evaluation of drugs, especially such that are known and used as fluconazole. This study investigated the genotoxic effects of the capsule and the active principle of fluconazole by the comet test and the cell proliferation test and also the cytotoxic effects of the capsule and the active principle of fluconazole by cell viability test. The tested concentrations of the capsule and the active principle of fluconazole were 6, 12, 30, 60, and 120 mg/mL. All assays were performed in triplicate and peroxide was used as a positive control and PBS buffer as negative control 7.4. All tested concentrations of fluconazole capsule (6, 12, 30, 60 and 120 μg/mL) were capable of induce a negative interference in the cellular proliferation process, reducing the number of proliferating cells at all concentrations tested when compared to the negative control. In the case of the active ingredient, the fluconazole, only the last three concentrations (30, 60, and 120 μg/mL) were able to decrease the cellular proliferation process. In the assessment of DNA damage index (comet assay), there was observed damage of fluconazole capsule on the DNA structure at concentrations 60 and 120 μg/mL. On the other hand, the concentrations tested with the active ingredient of Fluconazole was not observed damage to the DNA structure. Fluconazole has been found that the capsule has a cytotoxic activity on human leukocytes at the two highest concentrations tested (60 and 120 μg/mL) as a concentration-dependent manner. However, the active ingredient of Fluconazole not induced any cytotoxic effect at the concentrations tested (6, 12, 30, 60, and 120 μg/mL).

Ilex paraguariensis é uma importante planta nativa da América do Sul, popularmente conhecida como mate, cujas folhas são tradicionalmente consumidas na forma de infusão. Muitos benefícios à saúde são mencionados para a utilização de seus constituintes, entre eles as saponinas. Várias propriedades farmacológicas são atribuídas as saponinas. No mate, o maior teor delas ocorre nos frutos imaturos. Os fungos promovem sérias micoses invasivas em indivíduos com a saúde comprometida. Sendo assim, este trabalho objetiva avaliar o potencial antimicótico do extrato aquoso e de uma fração purificada de saponinas, ambos obtidos de frutos verdes do mate, frente aos principais fungos causadores de micoses. Visa também o estudo da associação entre a fração de saponinas e o fluconazol. Inicialmente foram avaliadas quanto à susceptibilidade 16 espécies, entre fungos leveduriformes e filamentosos. Nove Candida spp. foram selecionadas para os estudos de CIM, de associação por Checkerboard e pela metodologia de superfície de resposta, e por fim para pesquisa do mecanismo de ação. As espécies de Candida foram mais sensíveis a associação da fração de saponinas com fluconazol, que aos mesmos isoladamente. A associação foi capaz de reverter à resistência ao fluconazol em alguns isolados. Os testes de mecanismo de ação revelaram variações entre os isolados, não sendo possível afirmar apenas um mecanismo geral de ação da combinação. Ensaios microscópicos revelaram um predomínio do brotamento e a presença de um material viscoso em torno das leveduras, enquanto que o ergosterol exógeno revelou a possibilidade de interação com as saponinas, interferindo na atividade antifúngica. / Ilex paraguariensis is an important native plant from South America, generally known as Yerba Mate, which is traditionally consumed as an infusion made from the leaves. Many health benefits have been mentioned for the use of its constituents, including the saponins. Several pharmacological properties are atributed to the saponins, where it´s highest content can be found in mate green fruits. The fungi promote serious invasive mycoses in individuals with compromised health. Thus, this study aims to evaluate the antifungal potential of the crude extract and the purified saponins fraction, both obtained from unripe mate fruits, in the treatment of mycoses causing fungi. It also aims evaluate the antifungal association of saponins fraction and fluconazole. At first were evaluated the susceptibilities of 16 species, including yeasts and filamentous fungi. Nine Candida spp. were selected for the studies of minimal inhibitory concentration, association assay, checkerboard, response surface methodology, and finally to investigate the antifungal action mechanism. Candida species were more susceptible to the fraction of saponins more fluconazole, than the neat substances. Their association was able to reverse fluconazole resistance in some isolates. The mechanism of action assays revealed variations between the isolates, then, it was not possible to explain a general mechanism of action for this antifungal activity. Microscopic studies demonstrated a predominance of buds and a viscous liquid around the cells. Furthermore, exogenous ergosterol showed the possibility of interaction with saponins, interfering antifungal activity.