Neste trabalho, objetivou-se avaliar as propriedades físicas e microbiológicas de resinas acrílicas a base de polimetilmetacrilato após a incorporação de sal de diacetato de clorexidina (CDA) às mesmas. Para tal, foram confeccionados corpos de prova (CDPs) com as resinas VIPI COR e Duralay, sem e com incorporação de 0,5%; 1,0% e 2,0% de CDA, totalizando 8 grupos. A cromatografia líquida foi utilizada para mensurar a liberação de CDA pelas resinas acrílicas, e ainda, mensurar sua lixiviação de monômeros residuais.Para isso, os CDPs foram armazenados individualmente em placas para cultura celular de 24 poços contendo 1 ml de água destilada estéril em cada poço. Após tempo de armazenagem de 2 horas, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias, a 37oC, a solução foi retirada e a liberação de clorexidina ou monômeros residuais foi avaliada utilizando-se HPLC associado a espectrometria ultravioleta. A atividade antifúngica para C. albicans foi avaliada utilizando teste de difusão em ágar, no qual os CDPs foram colocados em placas de BHI previamente inoculadas com C. albicans, com medição do halo de inibição após 48 horas de incubação a 37C. A análise do grau de conversão das resinas se deu através da técnica de espectroscopia de infravermelho transformada de Fourier FTIR utilizando-se uma amostra de resina não polimerizada de cada grupo e realizados 4 scans de absorbância. Para a mensuração da sorção de água por parte das resinas contendo CDA, foram confeccionados 10 corpos de prova para cada grupo, que foram posicionados em suporte dentro de dessecador a 37C para remoção de umidade intrínseca (m1) e depois imersos em 100 ml de água deionizada por 7 dias a 37C, tendo a água trocada diariamente. Após este intervalo, os corpos foram secos para obter a nova massa da resina (m2). As massas obtidas foram incluídas em fórmula matemática para obtenção do grau de sorção. Após obtenção dos resultados, quando comparou-se o halo inibição entre os grupos testados e de mesma marca, apenas as análises entre grupo CDA 2% x grupo CDA 1% e entre CDA 1% x CDA 0,5% não apresentaram diferenças significantes. Quanto a liberação de CDA, a análise de variância demonstrou que dois dos três fatores avaliados (concentração do fármaco e tempo de armazenagem) alteram de maneira significativa a taxa de liberação da clorexidina (p<0,0001), entretanto a marca do material pareceu não influenciar de maneira significativa na liberação do fármaco. Quanto ao grau de conversão, os valores obtidos não foram significantes e apresentou-se menor apenas nos grupos com CDA 2% . Para ambas a sorção de água aumentou conforme a incorporação do sal cresceu e houve aumento significativo nas concentrações de 1.0% e 2.0%. Podemos concluir que a incorporação da clorexidina às resinas a base de PMMA: é capaz de inibir o crescimento de C. albicans; não alterou o grau de conversão das resinas testadas; não altera a liberação de monômeros residuais; e, altera a sorção de água das resinas acrílicas a base de PMMA quando concentrações maiores de CDA são adicionadas. / This work aimed to evaluate physical and microbiological properties of PMMA acrylic resins after incorporating chlorhexidine diacetate salt (CDA) to them . For that, specimens ( CDPs ) were made with resins VIPI COR and Duralay , with and without incorporation of 0.5 % , 1.0 % and 2.0 % of CDA , totaling 8 groups . The liquid chromatography was used to measure the release of CDA by acrylic resins , and also to measure leaching of residual monomers . For that, CDPs were stored individually in cell culture plates to 24 well containing 1 ml of sterile distilled water in each well. Storage time after 2 hours , 7 days, 14 days, 21 days and 28 days at 37 C , the solution was removed and release of residual monomers or chlorhexidine was evaluated by using ultraviolet spectrometry combined with HPLC. The antifungal activity to C. albicans was evaluated using the agar diffusion method , in which the CDPs were placed on BHI plates inoculated with C. albicans with measuring the zone of inhibition after 48 hours incubation at 37 C. The analysis of the resins conversion degree is given by infrared spectroscopy Fourier transform - FTIR using an uncured resin sample in each group and 4 scans performed absorbance . For the measurement of resins containing CDA s water sorption, 10 specimens were prepared for each group , which were placed in support within desiccator 37 C to remove intrinsic ( m1 ) and then immersed moisture in 100 ml deionized water for 7 days at 37 C , and the water was changed daily. After this interval , the specimens were dried to obtain the new resins weight ( m2 ) . The masses obtained were included in the mathematical formula for the degree of sorption. After obtaining results, when compared the inhibition halo between the tested groups and the same brand , only the analyzes between group CDA2 % x CDA 1 % group and from CDA 1 % x CDA0.5 %,showed no significant differences . About the release of CDA , analysis of variance showed that two of the three factors assessed ( drug concentration and storage time ) significantly change the rate of release of chlorhexidine ( p < 0.0001 ) , however the material mark seemed not significantly influence the drug release . About the conversion degree , the values were not significant and were minor only in groups with CDA 2 % . For both water sorption increased with the incorporation of salt grew and there was significant increase in concentrations of 1.0 % and 2.0 % . We conclude that the incorporation of chlorhexidine to the PMMA based resin : is able to inhibit the growth of C. Albicans ; did not alter the degree of conversion of the resins tested , does not alter the release of residual monomers , and changes the water sorption of the base PMMA acrylic resins when CDA concentrations are incorporated.

Resinas macias para reembasamento de próteses são largamente utilizadas após cirurgias para estabilizarem a prótese e condicionarem o tecido, aguardando a completa cicatrização. É importante que o material não seja facilmente colonizado por biofilme oral e se possível, evite a contaminação do sítio cirúrgico. Objetivou-se avaliar o efeito da incorporação de clorexidina às resinas acrílicas macias para o reembasamento de próteses totais, através de análises de liberação, citotoxicidade e efeito inibitório de um biofilme de C. albicans. Foram confeccionados corpos de provas (CDPs) com as resinas Trusoft e Coe-soft, com incorporação de 0%, 0,5%, 1,0% e 2,0% de clorexidina, totalizando 8 grupos. A liberação de clorexidina foi avaliada através da mensuração da mudança na densidade óptica da solução de armazenamento, na qual ficaram imersos os CDPs, por espectrometria UV, a cada 48 horas, durante 40 dias. A citotoxicidade celular foi avaliada em fibroblastos (linhagem L929), que ficaram 24 horas em contato com meio de cultura no qual os CDPs ficaram previamente imersos, pela técnica de absorção de corante vermelho neutro após 24, 48 e 72 horas e semanalmente até o 28 dia. E, por fim, a atividade antifúngica contra a C. albicans (ATCC 10231) foi avaliada de duas maneiras: (1) teste de difusão em ágar, no qual os CDPs foram colocados em placas de BHI previamente inoculadas com C. albicans, com medição do halo de inibição após 48 horas de incubação a 37C; (2) a avaliação da inibição da formação de um biofilme de C. albicans sobre a superfície dos CDPs pela quantificação por metil tetrazólio (MTT) a cada 48 horas, durante 22 dias, com leitura feita em espectrofotômetro de UV. Os dados obtidos foram inseridos no programa SigmaStat (versão 3.1, USA) para realizar as análises estatísticas. As diferenças estatísticas foram determinadas por análises de variâncias do tipo ANOVA e todos os procedimentos para comparações múltiplas pareadas foram feitos utilizando-se o método Holm-Sidak, com nível de significância global igual a 0,05. A clorexidina adicionada às resinas testadas foi capaz de ser liberada para o meio de armazenagem, proporcionalmente à quantidade de clorexidina incorporada, porém com diferentes cinéticas de liberação entre as resinas, visto que a Trusoft libera até 71% do total de clorexidina liberada nas primeiras 48 horas e a Coe-soft, até 44%. Ambas as resinas com incorporação de clorexidina apresentaram efeito citotóxico adicional, se comparadas às resinas sem clorexidina, porém para a Coe-soft não houve diferença estatística dos valores, apenas para a Trusoft (p<0,001). Ocorreu formação de halo de inibição proporcionalmente às concentrações de resinas adicionadas, com maiores halos para a resina Trusoft (p<0,001), e sem formação de halo para as resinas sem clorexidina; a inibição da formação de biofilme, realizada somente com a resina Coe-soft, mostrou total inibição durante 8, 12 e 16 dias, para a incorporação de 0,5%, 1,0% e 2,0% respectivamente, sendo uma diminuição estatisticamente significativa (p<0,001) em relação à resina sem incorporação de clorexidina, que não apresentou inibição do biofilme. / Denture soft lining materials are widely used after dental surgeries, tissue conditioning and stabilization of prostheses, until the complete tissue healing. It is important that this material not became easily colonized by oral biofilm and if possible, avoid contamination of the surgical site. The aim of this study was to evaluate the effect of chlorhexidine incorporation into resin-based soft denture lining material, considering the drug release analysis, cytotoxicity and C. albicans biofilm inhibition. Specimens were done using Trusoft and Coe-soft, incorporating 0%, 0.5%, 1.0% and 2.0% of chlorhexidine, totaling eight groups. The chlorhexidine release was evaluated through the measurement of change in optical density of the storage solution, which the specimens were immersed, by UV spectrometry, after every 48 hours for 40 days. The cellular cytotoxicity was evaluated in fibroblasts (strain L929), which were 24 hours in contact with culture medium, in which the specimens were previously immersed, the technique of neutral red dye uptake was used after 24, 48 and 72 hours and weekly until 28th day. Finally, the antifungal activity against C. albicans (ATCC 10231) was evaluated by two different ways: (1) agar diffusion test, in which the specimens were placed over the top of BHI agar plates previously inoculated with C. albicans, and the measurement of inhibition zone was done after 48h of incubation at 37C, (2) C. albicans biofilm inhibition over the specimens surface, which was mensured after every each 48 hours of biofilm and specimens co-incubation, by methyl tetrazolium (MTT), in UV/vis spectrophotometer, during 22 days. Data were analyzed with the SigmaStat software (version 3.1, USA). Statistical differences were determined by analysis of variance ANOVA and all procedures for multiple paired comparisons were made using the Holm-Sidak method, with overall significance level of 0.05. The chlorhexidine added to both resins, Trusoft and Coe-soft, can be released to the storage medium, with a dose-related effect, however the resins presented different release kinetics, since the Trusof released up to 71% of the total amount of the chlorhexidine released within the first 48 hours and Coe-soft release only up to 44%, considering the citotoxic effect, both chlorhexidine incorporated resins showed some extra cytotoxic effect, if compared to resins without chlorhexidine, but for Coe-soft no statistical difference of values was founded, only for Trusoft (p<0.001); considering the C. albicans inhibition, the agar diffusion test values were dose-related for both resins, however with bigger inhibition zones for Trusoft (p<0.001), and without any inhibition for the resins without clorexidine. For the C. albicans biofilm inhibition test, performed only with Coe-soft resin, it was verified a complete inhibition at 8, 12 and 16 days for the incorporation of 0.5%, 1.0% and 2.0% of clorexidine respectively, a statistically significant decrease (p<0.001) if compared to the resin without incorporation of chlorhexidine, which showed no inhibitory effect over the biofilm formation.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 7083796 bytes, checksum: 2aa6f174655d082d78cc059fc1eef2e0 (MD5) Previous issue date: 2014-03-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Mucormycoses are infections that have high rates of morbidity and mortality. They show high resistance to antifungal agents, and there is a limited therapeutic arsenal currently available, therefore, there is a great need to give priority to testing therapeutic agents for the treatment of mucormycosis. Along this line, the use of essential oils and phytoconstituents has been emphasized as a new therapeutic approach. The objective of this work was to investigate the antifungal activity of the essential oil (EO) of Thymus vulgaris, and its constituents thymol and p-cymene against Rhizopus oryzae and Rhizopus microsporus, through microbiological screening, determination of minimal inhibitory concentration (MICs) and minimal fungicidal concentration (MFCs), effects on mycelial growth and germination of sporangiospores, fungal morphology and interaction with ergosterol. Also was evaluated the preclinical acute toxicity in mice. In microbiological screening the T. vulgaris essential oil showed antifungal potential against resistant strains of R. oryzae.The MIC of EO and thymol varied 128 512 μg/mL, but the MFC of EO and thymol varied 512 1024 μg/mL and 128 1024 μg/mL, respectively. The results also showed that EO and thymol significantly inhibited mycelial development and germination of sporangiospores of both species of Rhizopus. Investigation of the mechanism of antifungal action showed that EO and thymol interact with ergosterol. These data indicate that EO of T. vulgaris and thymol possess strong antifungal activity, which can be related to their interaction with ergosterol, supporting the possible use of these products in the treatment of mucormycosis. In preclinical acute toxicology the doses of 125, 250, 500 and 1000 mg/kg intraperitoneally (i.p.) showed depressive activity on the central nervous system (CNS). In addition to these parameters was observed that the doses of 125 and 250 mg/kg did not change the body and organs weight of the animals, but it was observed change some of the hematological parameters of the mice. The EO showed DL50 of 250 mg/kg for male and 459.6 mg/kg for female; however the thymol showed DL50 of 222.3 mg/kg for male and 1551 mg/kg for female. These data indicate that EO of T. vulgaris and thymol possess strong antifungal activity, which can be related to their interaction with ergosterol. / As mucormicoses são infecções que possuem elevadas taxas de morbidade e mortalidade, limitado arsenal terapêutico, devido a resistência aos antifúngicos. Portanto, existe uma significativa necessidade de priorizar, testar e aplicar melhorias terapêuticas para o tratamento das mucormicoses. É nesse contexto, que os óleos essenciais e fitoconstituintes vem se destacando como uma nova abordagem terapêutica. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade antifúngica in vitro do óleo essencial (OE) de Thymus vulgaris L. e de seus componentes majoritários (timol e p-cimeno) contra Rhizopus oryzae e Rhizopus microsporus, através da triagem microbiológica, da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e fungicida mínima (CFM), avaliação dos efeitos dos fitoconstituintes no crescimento micelial, na germinação dos esporos fúngicos, na morfologia fúngica e interação com ergosterol. Também foi avaliada a toxicidade pré-clínica aguda em camundongos. Na triagem microbiológica o óleo essencial de T. vulgaris apresentou um dos melhores perfis antifúngicos contra cepas resistentes de R. oryzae. A CIM dos produtos variou entre 128-512 μg/mL, já as CFMs do óleo essencial e timol variaram entre 512-1024 μg/mL e 128-1024 μg/mL, respectivamente. Os resultados também mostraram que tanto o OE como o timol inibiram significativamente o desenvolvimento micelial e a germinação de esporos de ambas as espécies de Rhizopus. Em seguida foi mostrado que os produtos testados alteram a morfologia de R. oryzae e R. microsporus. Na investigação do mecanismo de ação antifúngica foi evidenciado que o OE e o timol interagem com o ergosterol, esterol presente na membrana dos fungos. No ensaio toxicológico pré-clínica agudo, as doses de 125, 250, 500 e 1000 mg/kg via intraperitoneal (i.p.) apresentaram atividade depressora do sistema nervoso central (SNC). Adicionalmente a estes parâmetros foi evidenciado que o OE e o timol nas doses de 125 e 250 mg/kg não promoveram alterações significativas na evolução ponderal e peso dos órgãos dos camundongos. Entretanto, ambas as doses das drogas-teste alteram alguns parâmetros hematológicos dos camundongos. Após 72 h de observação o OE apresentou DL50 estimada em 250 mg/kg para camundongos machos e 459,6 mg/kg para as fêmeas. Já o timol apresentou DL50 estimada em 222,3 mg/kg para os machos e 1551 mg/kg para as fêmeas. Estes dados indicam que o óleo essencial de T. vulgaris e timol, apresentam forte atividade antifúngica, que pode estar relacionada com a interação com ergosterol e consequentemente lise de membrana.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ArquivoTotal.pdf: 5988858 bytes, checksum: 14b6ada57a04027cb68c7a9acf14e510 (MD5) Previous issue date: 2012-12-10 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Heterocyclic compounds like mesoionics are flat and nonaromatic betaínes stabilized by electron delocalization. Some of their properties enable these compounds to be used in crystal liquid field, nonlinear optics and development of new drugs since betaínes possess a broad spectrum of biological activities such as antibacterial, antitumor, antifungal, antimalarial, anticonvulsant, etc. The aim of this work was the synthesis and characterization of the following mesoionic compounds 1,3-thiazolium-5- thiolate class in free base form (MI-H1.1, MI-H1.2, MI-H1.3) and derivates as S-methylated and S-ethylated salts (MI-H2.1, MI-H2.2, MIH2.3, MI-H2.4, MI-H2.5 e MI-H2.6) and of the mesoionic compounds 1,3-diazolio-5-thiolate class in free base form (MI-H4.1, MI-H4.2, MIH4.3 e MI-H4.4) and derivates as S-ethylated salts (MI-H5.1, MI-H5.2 e MI-H5.3). These compounds were properly characterized by spectroscopic techniques such as IR, 1H and 13C NMR. The compounds MI-H1.1, MIH1.2, M1-H2.2, MI-H2.5, MI-H3.2 e MI-H3.4 tested to antifungal activity and the results showed the four of the present activity to inhibit five of six Candidum species with MIC in the range of 64 μg/mL. / Entre os compostos da classe heterocíclica, os mesoiônicos são betaínas heterocíclicas planas e não aromáticas estabilizadas por deslocalização de elétrons. Apresentam propriedades que podem ser aplicadas na área de cristais líquidos, óptica não-linear e principalmente na área de desenvolvimentos de novos fármacos, uma vez que esses compostos possuem um amplo espectro de atividades biológicas tais como: antibacteriana, antitumoral, antifúngica, antimalárica, analgésica, antiinflamatória, anticonvulsivante, etc. Neste trabalho relatamos a síntese e caracterização dos compostos mesoiônicos da classe 1,3-tiazólio-5-tiolato (MI-H1.1, MI-H1.2, MI-H1.3) na forma de base livre e seus derivados na forma de sais S-metilados e S-etilados (MI-H2.1, MI-H2.2, MI-H2.3, MIH2.4, MI-H2.5 e MI-H2.6) e dos compostos mesoiônicos da classe 1,3- diazolio-5-tiolato (MI-H4.1, MI-H4.2, MI-H4.3 e MI-H4.4) na forma de base livre e seus derivados na forma de sais S-etilados (MI-H5.1, MI-H5.2 e MI-H5.3). Todos os compostos foram devidamente caracterizados por técnicas espectroscópicas de IV, RMN de 1H e 13C. Dos dezesseis compostos, apenas os compostos MI-H1.1, MI-H1.2, M1-H2.2, MI-H2.5, MI-H3.2 e MI-H3.4 foram avaliados na atividade antifúngicas e 4 deles apresentaram ótima atividade inibindo cinco das seis espécies de Candida com CIM na faixa de 64 μg/mL. Palavras-chave: Compostos Mesoiônicos, Atividade Antifúngica, 1,3-tiazólio- 5-tiolato, 1,3-diazólio-5-tiolato Entre os compostos da classe heterocíclica, os mesoiônicos sãobetaínas heterocíclicas planas e não aromáticas estabilizadas pordeslocalização de elétrons. Apresentam propriedades que podem seraplicadas na área de cristais líquidos, óptica não-linear e principalmente naárea de desenvolvimentos de novos fármacos, uma vez que essescompostos possuem um amplo espectro de atividades biológicas tais como:antibacteriana, antitumoral, antifúngica, antimalárica, analgésica,antiinflamatória, anticonvulsivante, etc. Neste trabalho relatamos a síntesee caracterização dos compostos mesoiônicos da classe 1,3-tiazólio-5-tiolato(MI-H1.1, MI-H1.2, MI-H1.3) na forma de base livre e seus derivados naforma de sais S-metilados e S-etilados (MI-H2.1, MI-H2.2, MI-H2.3, MIH2.4,MI-H2.5 e MI-H2.6) e dos compostos mesoiônicos da classe 1,3-diazolio-5-tiolato (MI-H4.1, MI-H4.2, MI-H4.3 e MI-H4.4) na forma debase livre e seus derivados na forma de sais S-etilados (MI-H5.1, MI-H5.2e MI-H5.3). Todos os compostos foram devidamente caracterizados portécnicas espectroscópicas de IV, RMN de 1H e 13C. Dos dezesseis compostos,apenas os compostos MI-H1.1, MI-H1.2, M1-H2.2, MI-H2.5, MI-H3.2 eMI-H3.4 foram avaliados na atividade antifúngicas e 4 deles apresentaramótima atividade inibindo cinco das seis espécies de Candida com CIM nafaixa de 64 μg/mL.

Infusos e decoctos preparados com as partes aéreas de Solidago chilensis são utilizados na medicina popular para tratar distúrbios gástricos, úlceras intestinais, inflamações, reumatismo, além de outros empregos tais como diurético e analgésico. Diversos estudos têm sustentado conhecimento popular, como por exemplo, a atividade anti-inflamatória e gastroprotetora das partes aéreas de Solidago chilensis. Em modelos in vitro, in vivo e estudo clínico realizados com extratos obtidos com diversos solventes, foi observada tanto a resposta aguda quanto a crônica à inflamação. O mesmo ocorre para a ação gastroprotetora evidenciada para extratos aquosos em modelos in vivo. Com ampla e abundante ocorrência, essa espécie nativa do Brasil integra a Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse do SUS (Renisus), inserindo-se na Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC). No entanto, não há relatos na literatura sobre a avaliação química e obtenção de produtos tecnológicos padronizados e ativos, o que constitui uma importante limitação para a produção de medicamento fitoterápico. Neste sentido, este trabalho objetivou, primeiramente, avaliar parâmetros de controle de qualidade e estabelecer critérios químicos que permitam identificar e caracterizar a espécie bem como compará-la a outras do gênero, que possuem amplo uso terapêutico na Europa. Análises comparativas destas amostras foram realizadas por CCD, CLAE e teor de flavonoides totais. Análises por CCD e CLAE dos extratos metanólicos demonstraram diferenças químicas interespécie e constância química qualitativa da S. chilensis em diversos locais e anos de coleta. A determinação quantitativa de flavonoides totais envolveu a otimização das condições de hidrólise ácida (concentração de HCl e do tempo de reação) e validação de método analítico por CLAE. O teor de flavonóides totais, assim obtido, foi 154% maior do que o observado por ensaio colorimétrico com cloreto de alumínio a 425 nm. Análises por CLAE-DAD e CLAE-EM/EM também foram realizadas e revelaram a presença de rutina, quercetrina e dos ácidos 3,4-O-dicafeoilquinico e 4,5-O-dicafeoilquinico. Além desses ensaios, ainda como parte da caracterização da droga vegetal, foi avaliado o teor e composição do óleo volátil presente nas folhas e inflorescências. Esses produtos demonstraram potente ação antifúngica frente a leveduras emergentes e multirresistentes, sem evidências de citotoxicidade. Em relação à obtenção do extrato seco por aspersão (PSA) a partir do extrato etanol:éter (1:1), o processo mostrou-se viável, com alto rendimento e para a sua qualificação química foram, empregadas duas técnica cromatográficas. Por CLAE foi determinada a presença dos mesmos componentes descritos para a droga. Adicionalmente, foi realizada a padronização química quantitativa da droga vegetal pela determinação dos flavonoides totais na qual foi evidenciando o teor de 82,73 mg/g expressos em quercetina. A quantificação da solidagenona foi realizada por HPTLC-densitometria e o teor médio encontrado foi de 8 mg/g. A avaliação da atividade gastroprotetora do PSA e do marcador solidagenona utilizou-se os modelos de lesão gástrica induzida por etanol e indometacina em camundongos. Nesses modelos, o PSA apresentou um índice de gastroproteção, nas doses de 50, 125 e 250 mg/kg respectivamente, de 85 ± 15%, 77 ± 3%; 83 ± 9%; 64 ± 16 % quando utilizado etanol como agente lesivo e de 63 ± 23% e 79 ± 12% quando utilizado a indometacina. A solidagenona testada na dose de 30 mg/kg, apresentou índices os índices de gastroproteção próximos aos dos padrões positivos ranitidina e carbenoloxona em doses de 100 e 200 mg/kg respectivamente. O PSA, produto intermediário com ação gastroprotetora, foi caracterizado como um pó fino com baixa densidade e baixa fluidez, tornando necessários processos de granulação por via seca para possibilitar a sua incorporação em forma farmacêutica sólida. Foram obtidos compridos de 700 mg e estes foram caracterizados em relação aos ensaios de resistência mecânica e uniformidade de conteúdo. Os resultados obtidos neste trabalho representam as primeiras contribuições para o estabelecimento de parâmetros e métodos para a caracterização que auxiliem no controle de qualidade da droga vegetal de S. chilensis. A viabilidade de produção, qualificação química e verificação de ação farmacológica do extrato seco obtido e o estudo da viabilidade tecnológica de obtenção de comprimidos contribuem enormemente para o desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos a partir de S. chilensis. Este trabalho pode ser considerado inovador por tratar-se da associação de uma matriz complexa, rica em constituintes terpênicos e flavonoides cuja caracterização química quali e quantitativa foi estabelecida e demonstrada a viabilidade de inserção desta matriz em forma farmacêutica sólida. / Infusions and decoctions prepared with aerial parts of Solidago chilensis are used in folk medicine to treat gastric disorders, intestinal ulcers, inflammatory conditions, rheumatism, and as a diuretic and analgesic agent. The anti-inflammatory and gastroprotective activities attributed to the aerial parts have been observed in pharmacological studies, thus supporting the popular use for this species. Studies have demonstrated the inhibition of the chronic and acute inflammatory responses by extracts obtained with different solvents, through in vitro and in vivo models and also by a clinical trial. The same occurs to the gastroprotective action, evidenced for aqueous extracts in vivo. This species, native to Brazil and widespread throughout our country, is inserted in the RENISUS, which is part of the National Politics of Integrative and Complementary Practices. However, there are no reports in the literature concerning the chemical profile and the obtention of standardized technological products and their active principle, which may be an important limitation to the production of a phytomedicine. Following this line, the current work aims to add knowledge to the utilization for the species and also adds scientific evidences to the possibility of Solidago chilensis to follow into a phytotherapic productive chain. The objectives of this work are the evaluation of quality control parameters and the establishment of chemical conditions which may enable the identification and characterization of this species, as well as its comparison with other species belonging to the same genus, that share a wide therapeutic use in Europe. Comparative analyses for these samples were made by TLC, HPLC and also by the flavonoid total content profile. The analyses of methanolic extracts made by TLC and HPLC evidenced interspecies chemical differences and the qualitative uniformity for Solidago chilensis, observed in different places and years of collection. The quantitative total flavonoid determination involved the optimization of acid hydrolysis conditions (HCl concentration and time of reaction) and the validation of an analytic method by HPLC. The total flavonoid content thus obtained was 154% higher than the observed by the colorimetric assay using aluminum chloride, at 425 nm. Analyses by HPLC-PDA and HPLC-MS-MS were also conducted and revealed the presence of rutin, quercetrin, 3,4-O-cafeoyl quinic and 4,5-O-dicafeoyl quinic acids. Moreover, the vegetal drug characterization involved also the content and composition of volatile oil present in leaves and inflorescences. These products showed a potent antifungal action towards emerging and multiresistant yeast strains, without cytotoxicity evidences. The obtention of the spray-dried ethanol: ether (1:1) extracts demonstrated to be viable, with high yield, and their chemical standardization was achieved using two techniques. By HPLC, the presence of the same compounds described for the vegetal drug was determined. The quantitative content of total flavonoids was 82.73 mg/g, expressed as quercetin. Solidagenone content was assessed by HPTLC-densitometry, and was determined to be 8.0 mg/g. The gastroprotective activities of solidagenone and the Solidago chilensis spray-dried extract (SDE) were assayed using the ethanol and indomethacin-induced ulcer models. The index of ulceration induced by ethanol was reduced in the presence of SDE at the doses of 50, 125 and 250 mg/kg (85 ± 15 %, 77 ± 3 %; 83 ± 9 %; 64 ± 16 %, respectively); 64 ± 16 %, 63 ± 23 % e 79 ± 12 % in the presence of indomethacin. Solidagenone presented at the dose of 30 mg/kg an index of gastroprotection close to the reference standards ranitidine and carbenoxolone (100 and 200 mg/kg, respectively). SDE, the intermediary product with gastroprotective action, was characterized as a fine powder with a low density and a low flowability, making necessary the development of dry granulation processes to achieve its incorporation into solid dosages. This way, 700 mg tablets were obtained and characterized using the parameters mechanical resistance and uniformity of content. The results obtained in this work represent the first contributions to establish methods and parameters to the characterization and for the quality control of the vegetal drug Solidago chilensis. The viability of production, chemical standardization, assessment of the biological activity for the SPE and the technological feasibility to obtain tablets contribute to the development of new pharmaceutical products from Solidago chilensis. Considering that this complex plant matrix, enriched in terpenic and flavonoid constituents, has its qualitative and quantitative characterization already established, and that its insertion into a solid dosage has a viability of production, this can be considered innovator.

O gênero Hypericum (Guttiferae = Clusiaceae) compreende 494 espécies acomodadas em 36 seções taxonômicas. Os representantes americanos pertencem, sobretudo, às seções Brathys e Trigynobrathys, as duas maiores com 87 e 52 espécies, respectivamente. Popularmente, estas plantas são utilizadas como antissépticos, diuréticos, digestivos e agentes de cicatrização. Quimicamente, apresentam tendência em acumular floroglucinóis diméricos, além de benzofenonas, benzopiranos, flavonoides e ácidos fenólicos, metabólitos cuja atividade antidepressiva, antinociceptiva, antimicrobiana, antiproliferativa e antioxidante são descritas. Considerando o potencial terapêutico, este trabalho objetivou a determinação dos principais compostos fenólicos presente nas flores de espécies Hypericum nativas do Sul do Brasil (H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. connatum, H. linoides, H. myrianthum, H. polyanthemum e H. salvadorense) e dos Páramos peruanos (H. andinum e H. laricifolium); a extração e análise dos compostos fenólicos de H. carinatum obtidos com CO2 supercrítico e a investigação da atividade antifúngica e antiquimiotática dos extratos lipofílicos de H. caprifoliatum, H. carinatum, H. linoides, H. myrianthum e H. polyanthemum. Para os experimentos, foram coletadas (2008 - 2010) as partes aéreas das plantas em floração. Todas as coletas foram autorizadas pelos órgãos de proteção ambiental. Os métodos extrativos incluem maceração estática, ultrassom e CO2 supercrítico (temperatura = 40, 50 ou 60ºC; pressão = 90, 120, 150 ou 200 bar). As análises por CLAE foram realizadas em coluna de fase reversa (C18), sistemas isocráticos compostos por acetonitrila, água e ácido trifluroacético e detecção ultravioleta (220, 270 ou 254 nm); Os picos foram identificados pela comparação dos tempos de retenção/co-injeção com padrões e quantificados pela curva de calibração dos compostos. Os ensaios antifúngico e antiquimiotático foram realizados pelo método de microdiluição em caldo e inibição da migração de neutrófilos, respectivamente. O floroglucinol dimérico uliginosina B (0,008 – 0,188%) e o flavonoide hiperosídeo (0,057 – 5,987%) foram os principais metabólitos detectados nas flores das espécies investigadas. Hypericum caprifoliatum e H. andinum apresentaram o maior rendimento destes compostos, respectivamente. Sete espécies apresentaram japonicina A em concentrações de 0,003 a 0,087% (H. myrianthum). O rendimento de hiperbrasilol B variou de 0,006% em H. laricifolium a 0,011% em H. caprifoliatum. Os benzopiranos (HP1 = 0,200%, HP2 = 0,225% e HP3 = 0,327%) e as benzofenonas (carifenona A = 0,309% e carifenona B = 0,062%) ocorreram exclusivamente em H. polyanthemum e H. carinatum. As máximas quantidades de ácido clorogênico, isoquercitrina, quercitrina e guaijaverina foram observadas, respectivamente, em H. campestre (1,458%), H. andinum (1,161%), H. carinatum (0,231%) e H. laricifolium (0,404%). Tais resultados fornecem suporte adicional para o significado quimiotaxonômico dos derivados diméricos de floroglucinol. Temperatura (40°C = 3,04%, 50°C = 2,21% e 60°C = 1,05%) e pressão (90 bar = 0,95%, 150 bar = 0,97% e 200 bar = 1,89%) afetaram de modo distinto o rendimento do extrato supercrítico de H. carinatum. Apesar do menor rendimento em comparação ao extrato n-hexano (6,09%), a extração com CO2 supercrítico provou ser mais seletiva que a maceração. Nas condições ideais (40°C, 90 bar e 180 minutos), a máxima recuperação de uliginosina B, carifenona A e carifenona B foi, respectivamente, 162,83, 376,33 e 48,79%. O modelo matemático empregado para simular o processo de extração foi apropriadamente correlacionado aos dados experimentais. Considerando as atividades biológicas, todas as espécies investigadas apresentaram um amplo espectro de ação antifúngica, assim como reduziram a migração dos neutrófilos. Os extratos de H. carinatum, H. linoides e H. myrianthum apresentaram os mais baixos valores de concentração inibitória mínima contra Cryptococcus neoformans (CIM £ 15,6 μg/mL), Rhodotorula mucilaginosa (CIM £ 62,5 μg/mL), Candida glabrata e C. tropicalis (CIM = 1,9-250 μg/mL). Para estas plantas, o efeito antiquimiotático variou entre 60 - 100% nas concentrações de 0,31 a 10 μg/mL. Os extratos mais ativos apresentaram elevada concentração de uliginosina B, japonicina A e hiperbrasilol B. Assim, as espécies de Hypericum nativas do sul do Brasil apresentam potencial como fonte de novos antifúngicos e anti-inflamatórios. / The genus Hypericum (Guttiferae = Clusiaceae) comprises 494 species placed in 36 taxonomic sections. The representatives of Central and South America belong primarily to sections Brathys and Trigynobrathys, the two largest sections with 87 and 52 species, respectively. In traditional medicine, these plants are used as antiseptic, diuretic, digestive and as healing agents. Such species have a strong tendency to accumulate dimeric phloroglucinol, besides benzophenones, benzopyrans, flavonoids and phenolic acids, metabolites whose antidepressant, antinociceptive, antimicrobial, antiproliferative and antioxidant activities are described. In view of the therapeutic potential, this work aimed to determine the main phenolic compounds present in flowers of Hypericum species native to southern Brazil (H. campestre, H. caprifoliatum, H. carinatum, H. connatum, H. linoides, H. myrianthum, H. polyanthemum and H. salvadorense) and to Peruvian Páramos (H. andinum and H. laricifolium); the supercritical CO2 extraction and analysis of the phenolic compounds of H. carinatum; the antifungal and antichemotactic activities of the lipophilic extracts from H. caprifoliatum, H. carinatum, H. linoides, H. myrianthum and H. polyanthemum. For the experiments, aerial parts in blossom were harvested (2008 - 2010). All collections were authorized by competent agencies of environmental protection. The extraction methods employed were static maceration, ultrasonic bath or supercritical CO2 (temperature = 40, 50 or 60ºC; pressure = 90, 120, 150 or 200 bar). HPLC analyses were carried out in reverse phase column (C18), isocratic system composed of acetonitrile, water and trifluoroacetic acid, and ultraviolet detection (220, 270 or 254 nm). Peaks were identified by comparison of retention times / co-injection with standards and quantified by calibration curve of the compounds. Antifungal and antichemotactic tests were performed using the broth microdilution assay and neutrophils migration inhibition method. The dimeric phloroglucinol uliginosin B (0.008 - 0.188%) and the flavonoid hyperoside (0.057 - 5.987%) were the main metabolite detected in flowers of the investigated species. Hypericum caprifoliatum and H. andinum displayed higher yields of these compounds, respectively. Japonicin A was found in seven species studied at concentrations that varied from 0.003 to 0.087% (H. myrianthum). The yield of hyperbrasilol B ranged from 0.006% in H. laricifolium to 0.011% in H. caprifoliatum. The benzopyrans (HP1 = 0.200%, HP2 = 0.225% and HP3 = 0.327%) and benzophenones (cariphenone A = 0.309% and cariphenone B = 0.062%) occurred exclusively in H. polyanthemum and H. carinatum. Maximum amounts of chlorogenic acid, isoquercitrin, quercitrin and guaijaverin were observed, respectively, in H. campestre (1.458%), H. andinum (1.161%), H. carinatum (0.231%) and H. laricifolium (0.404%). Such results provide a further support for the chemotaxonomic significance of the dimeric phloroglucinols. Temperature (40°C = 3.04%, 50°C = 2.21% and 60°C = 1.05%) and pressure (90 bar = 0.95%, 150 bar = 0.97% and 200 bar = 1.89%) critical did affect differently the yield of supercritical extract of H. carinatum. Despite lower yield in comparison to n-hexane extract (6.09%), supercritical CO2 extraction proved to be more selective than maceration. In optimal conditions (40°C, 90 bar and 180 minutes), the maximum amount of uliginosin B, cariphenone A and cariphenone B was, respectively, 162.83, 376.33 and 48.79%. Lastly, the mathematical model used in the process of supercritical extraction was properly correlated to the experimental data. Regarding the biological activities, all investigated species exhibited a broad spectrum of antifungal action as well as reduced neutrophils migration. Hypericum carinatum, H. linoides and H. myrianthum extracts presented the lowest value of minimum inhibitory concentration against Cryptococcus neoformans (MIC ≤ 15.6 μg/mL), Rhodotorula mucilaginosa (MIC ≤ 62.5 μg/mL), Candida glabrata and C. tropicalis (MIC range = 1.9 - 250 μg/mL). For these plants, the antichemotactic effect varied from 60-100% at concentrations of 0.31 to 10 μg/mL. The most active extracts were that presented high amounts of uliginosin B, japonicin A and hyperbrasilol B. Thus, the Hypericum species native to Southern Brazil show potential as source of new anti-infectives and anti-inflammatory drugs.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O resÃduo (torta) obtido apÃs a extraÃÃo de Ãleo das sementes de pinhÃo-manso (Jatropha curcas) para a produÃÃo de biodiesel à tÃxico. Apesar dos entraves relacionados à sua utilizaÃÃo na alimentaÃÃo animal, existem evidÃncias de que esse resÃduo tem grande potencial de utilizaÃÃo biotecnolÃgica graÃas ao arsenal de molÃculas que o constitui. Assim, o presente trabalho teve como foco a purificaÃÃo e caracterizaÃÃo de um inibidor de tripsina da torta de pinhÃo-manso, vislumbrando um maior aproveitamento desse resÃduo. A anÃlise da composiÃÃo centesimal revelou ser a torta de pinhÃo-manso composta principalmente por proteÃnas (37,21%), fibras (34,26%) e lipÃdios (19,16%). O extrato bruto obtido a partir da torta sob condiÃÃo alcalina (tampÃo borato de sÃdio 100 mM, pH 10,0) mostrou a presenÃa de lectina (319,76 UH/gF), inibidor de papaÃna (1.287,38 UI/gF), protease (2,69 UA/gF) e, principalmente, de inibidor de tripsina (1.649,7 UI/gF). O inibidor de tripsina, denominado JcTI, foi purificado do extrato bruto por fracionamento com Ãcido tricloroacÃtico (2,5%) seguido de cromatografias de afinidade (tripsina-sepharose-4B) e de exclusÃo molecular (sephacryl S-200). JcTI à uma glicoproteÃna (6,4% de carboidratos) com massa molecular na faixa de 20-21 kDa, pI de 6,6, sequÃncia NH2-terminal (VRDICKKEAERQDLSSCENYITQRRGY) exibindo similaridade em torno de 60% com albuminas vegetais e altamente estÃvel ao calor, salinidade e pH. JcTI (500 Âg/mL) retardou o crescimento de vÃrios fungos fitopatogÃnicos de importÃncia agrÃcola, incluindo Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum e Fusarium solani. Esse inibidor tambÃm mostrou atividade antibacteriana frente a bactÃrias patogÃnicas ao homem, tais como Bacillus subtilis, Salmonella choleraesuis e Staphylococcus aureus, com concentraÃÃo inibitÃria mÃnima inferior a 5 Âg/mL. Os resultados obtidos demonstram o potencial do JcTI para aplicaÃÃo biotecnolÃgica como uma nova proteÃna de defesa contra fungos fitopatogÃnicos e bactÃrias patogÃnicas ao homem. / The residue (cake) obtained after the extraction of oil from jatropha (Jatropha curcas) seeds for biodiesel production is toxic. Despite of the obstacles related to its use in the animal feed, there are evidences that this residue has great potential for biotechnology applications due to its arsenal of molecules. Thus, the present study aimed to purify and characterize a trypsin inhibitor from jatropha cake, in order to make a better use of this residue. The centesimal composition analysis showed to be the jatropha cake mainly composed of proteins (37.21%), fiber (34.26%) and lipids (19.16%). The crude extract obtained from the jatropha cake under alkaline condition (100 mM sodium borate buffer, pH 10.0) showed the presence of lectin (319.76 HU/gF), papain inhibitor (1,287.38 IU/gF), protease (2.69 AU/gF) and, especially, trypsin inhibitor (1,649.7 IU/gF). The trypsin inhibitor, named JcTI, was purified by fractionation of the crude extract with trichloroacetic acid (2.5%) followed by affinity chromatography (trypsin-sepharose-4B) and molecular exclusion (sephacryl S-200). JcTI is a glycoprotein (6.4% carbohydrates) with molecular mass in the range of 20-21 kDa, pI of 6.6, NH2-terminal sequence (VRDICKKEAERQDLSSCENYITQRRGY) showing identity around 60% with plant albumins and highly stable to heat, pH and salinity. JcTI (500 Âg/mL) slowed the growth of important phytopthogenic fungi, including Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum and Fusarium solani. This inhibitor also presented antibacterial activity against human pathogenic bacteria such as Bacillus subtilis, Salmonella choleraesuis and Staphylococcus aureus, with minimum inhibitory concentration less than 5 Âg/mL. The results demonstrate the potential of JcTI for biotechnological application as a new defense protein against phytopthogenic fungi and human pathogenic bacteria.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos. No presente trabalho, novas propriedades estruturais da Mo-CBP3 sÃo descritas, revelando correlaÃÃo entre sua estabilidade estrutural e atividade antifÃngica. Em adiÃÃo, para melhor compreensÃo dos mecanismos pelos quais essa proteÃna exerce aÃÃo antifÃngica, sua habilidade de induzir a produÃÃo endÃgena de espÃcies reativas de oxigÃnio e de causar alteraÃÃes morfolÃgicas e ultraestruturais foi analisada, usando Fusarium solani como modelo. F. solani à uma espÃcie de fÃcil manuseio e desenvolvimento rÃpido, ideal para ensaios in vitro, e de relevÃncia, por se tratar de um fungo que ataca culturas economicamente importantes. Com foco na utilizaÃÃo segura da Mo-CBP3 como agente quÃmico contra fungos, seus efeitos citotÃxicos sobre cÃlulas eucariÃticas tambÃm foram investigados. Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina de 18,0 kDa, de acordo com PAGE-SDS. Todavia, anÃlise por espectrometria de massas revelou que essa proteÃna consiste de mÃltiplas isoformas com massas moleculares variando entre 12,2 e 12,3 kDa. Mo-CBP3 à composta por duas cadeias polipeptÃdicas de 5,0 e 9,0 kDa, denominadas de cadeia A e cadeia B, respectivamente. A cadeia B contÃm a sequÃncia NH2-terminal representada por CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, enquanto que a cadeia A tem o resÃduo NH2-terminal bloqueado. cDNA codificador da cadeia B foi obtido com iniciadores sintetizados a partir de sua sequÃncia NH2-terminal. AnÃlises in silico das sequÃncias de nucleotÃdeos e de aminoÃcidos deduzida confirmaram a presenÃa de isoformas e massa molecular da Mo-CBP3 e identificaram sÃtios potenciais de O-glicosilaÃÃo e fosforilaÃÃo. AlÃm disso, similaridades entre Mo-CBP3 e outras proteÃnas de M. oleifera, bem como com albuminas 2S, foram detectadas. A estrutura secundaria da Mo-CBP3 à composta por 30,3% &#945;-hÃlices, 16,3% folhas &#946;, 22,3% voltas e 30,4% estruturas ao acaso. Na espectroscopia de fluorescÃncia, excitaÃÃes de uma soluÃÃo da Mo-CBP3 a 280 nm e 295 nm produziram emissÃo mÃxima a 303 e 309 nm, respectivamente. A estrutura da Mo-CBP3 à altamente estÃvel, se apresentando indiferente Ãs mudanÃas de temperatura e pH. Mo-CBP3 (0,05-0,1 mg/mL) se mostrou capaz de inibir a germinaÃÃo de conÃdios de vÃrios fungos fitopatogÃnicos, incluindo F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae e C. gloeosporioides. Similarmente, Mo-CBP3 (0,05 mg/mL) foi capaz de inibir o crescimento micelial de F. solani e apresentou tanto efeito fungistÃtico como fungicida, dependendo da concentraÃÃo usada. LigaÃÃo da Mo-CBP3 à superfÃcie de cÃlulas fÃngicas ocorre, pelo menos em parte, via interaÃÃo eletrostÃtica, jà que NaCl 0,15 M aboliu seu efeito inibitÃrio. Mo-CBP3 induziu a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio e causou perda de assimetria e deformaÃÃes em cÃlulas de F. solani. DesorganizaÃÃo do sistema de endomembranas, condensaÃÃo do citosol e aumento de vacuolizaÃÃo tambÃm foram observados. Mo-CBP3 nÃo mostrou atividade hemolÃtica e nem foi capaz de alterar a viabilidade das cÃlulas MCF-7 e Caco-2, sugerindo que essa proteÃna nÃo à tÃxica para cÃlulas humanas. Com base na alta estabilidade e no amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos em baixas concentraÃÃes e, tambÃm, na ausÃncia de citotoxicidade para cÃlulas humanas testadas, Mo-CBP3 tem grande potencial para desenvolvimento de novas drogas antifÃngicas ou na produÃÃo de plantas transgÃnicas mais resistentes a fungos. / Mo-CBP3 is a chitin-binding protein purified from Moringa oleifera seeds that displays broad inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In this work, we report new structural features of Mo-CBP3 that reveal a correlation between its structural stability and antifungal activity. In addition, to gain better insights into the mechanisms by which this protein acts as an antifungal agent, its ability to induce the endogenous production of reactive oxygen species and to trigger morphologic and ultrastructural alterations were analysed using Fusarium solani as a model. F. solani is an easy-to-handle and fast-developing species, making it ideal for in vitro assays, and it holds relevance as a phytopathogenic fungus that attacks economically important crop plants. To fully explore the biosafety of Mo-CBP3 as a chemical agent against fungi, its cytotoxic effects on eukaryotic cells were also investigated. Mo-CBP3 is a chitin-binding protein of 18.0 kDa, according to SDS-PAGE. However, by mass spectrometry analysis, it was observed that this protein consists of multiple isoforms with molecular masses ranging between 12.2 and 12.3 kDa. Mo-CBP3 is composed by two polypeptide chains of 5.0 and 9.0 kDa, named A and B chain, respectively. The B chain contains the following NH2-terminal sequence CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ while the A chain has a blocked NH2-terminal residue. cDNA encoding the B chain was obtained with primers of its NH2-terminal sequence. In silico analyses of nucleotide and deduced amino acid sequences confirmed the presence of isoforms and molecular mass of Mo-CBP3 and identified potential sites of O-glicosylation and phosphorilation. Moreover, similarities between Mo-CBP3 and other M. oleifera proteins as well as 2S albumins were detected. The secondary structure of Mo-CBP3 showed 30.3% &#945;-helices, 16.3% &#946;-sheets, 22.3% turns and 30.4% unordered forms. In the fluorescence spectroscopy, excitation of Mo-CBP3 solution at 280 nm and 295 nm gave emission maxima at 303 and 309 nm, respectively. The Mo-CBP3 structure is highly stable and retains its antifungal activity regardless of temperature and pH. Mo-CBP3 (0.05-0.1 mg/mL) was able to inhibit the conidia germination of several phytopathogenic fungi, including F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae and C. gloeosporioides. Similarly, Mo-CBP3 was inhibitory to the mycelial mass development of F. solani at 0.05 mg/mL and has both fungistatic and fungicidal effects, depending on the concentration used. Binding of Mo-CBP3 to the fungal cell surface is achieved, at least in part, via electrostatic interactions, as 150 mM NaCl abolished its inhibitory effect. Mo-CBP3 induced the production of reactive oxygen species and caused in F. solani cells a marked loss of asymmetry, deformations and deep wrinkles in comparison to control cells. Disorganisation of the endomembrane system and condensation and shrinkage of cytosol with increased vacuolation and the loss of normal structure and content were also observed. Mo-CBP3 did not show haemolytic activity and it was not capable to alter de viability of both MCF-7 and Caco-2 cells, suggesting that this protein is not toxic for human cells. Based on its high stability and broad-spectrum efficacy against important phytopathogenic fungi at low inhibitory concentrations and absence of cytotoxicity to human cells, Mo-CBP3 has great potential in the development of new antifungal drugs or in transgenic crops with enhanced resistance to fungi.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-02-13T13:18:57Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE colação de grau.pdf: 1971286 bytes, checksum: 680d0e24d2f0efbe0313ab8752f1cc93 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-13T13:18:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE colação de grau.pdf: 1971286 bytes, checksum: 680d0e24d2f0efbe0313ab8752f1cc93 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / CNPq / A criptococose é uma infecção fúngica predominantemente oportunista cujos principais agentes etiológicos são Cryptococcus neoformans e C. gattii. O tratamento de escolha para a micose é a anfotericina B associada ou não a 5-fluorocitosina seguido de terapia de manutenção com fluconazol. Contudo, falhas no tratamento associadas à toxicidade e ao aparecimento de resistência aos fármacos têm sido relatadas, o que torna essencial a descoberta de novas alternativas terapêuticas, como a ciclopirox olamina (CPO). Neste contexto, o objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar a ação in vitro e in vivo da CPO livre e encapsulada em lipossomas frente a amostras de Cryptococcus neoformans para futura aplicação no tratamento da criptococose sistêmica. Foram obtidas 30 amostras de Cryptococcus neoformans provenientes de pacientes imunocomprometidos. A preparação dos lipossomas convencionais e furtivos de CPO foi realizada pelo método da hidratação do filme lipídico e a caracterização foi realizada avaliando os seguintes parâmetros: tamanho de partícula, Índice de Polidispersão (PDI) e taxa de encapsulação (EE%). Para otimização dos constituintes lipídicos, foi realizado um planejamento fatorial fracionado a 24-1 a partir da melhor formulação obtida nos estudos de pré-formulação. A cinética de liberação in vitro foi conduzida para avaliar e comparar estatisticamente o perfil de liberação dos sistemas convencional e furtivo. Adicionalmente, testes de susceptibilidade antifúngica foram realizados de acordo com Clinical and Laboratotry Standards Institute (CLSI). Para caracterização molecular dos isolados, PCR fingerprinting foi conduzida utilizando os primers M13 e URA5. O estudo in vivo foi conduzido com camundongos imunossuprimidos, infectados com Cryptococcus neoformans (106 cels/mL) e tratados com CPO lipossomal (Lipo-CPO) (0.5 mg/Kg). As concentrações de CPO utilizadas na forma livre e encapsuladas em lipossomas convencionais e furtivos variaram de 0,30 a 625 µg/mL. Os resultados do planejamento fatorial mostraram que o ponto central apresentou características proeminentes com redução do tamanho de partícula em 17,1%; melhora do PDI em 15,34% e da quantidade de fármaco encapsulado (25%). A cinética do lipossoma furtivo apresentou uma velocidade de liberação mais controlada quando comparada ao lipossoma convencional. Com relação ao teste de susceptibilidade, todos os inóculos foram susceptíveis a CPO livre, com atividade fungistática entre 0,30 e 0,61 g/mL e fungicida entre 1,22 e 4,88 g/mL. Não houve diferença relacionada à atividade antifúngica entre as formulações lipossomais convencionais e furtivas. A atividade fungistática dos lipossomas foi observada em concentrações variando de 1,22 e 2,44 g/mL. A faixa das concentrações fungicidas foi de 1,22 a 9,76 g/mL. O padrão de bandas do URA5 revelou que todos os isolados apresentam genótipo VNI, característico de C. neoformans. Lipo-CPO apresentou eficácia antifúngica comparada à anfotericina B após 14 dias de infecção, reduzindo a carga fúngica em aproximadamente 8% no baço, 41% no fígado, 63% no pulmão e 89% no cérebro. O exame histológico evidenciou infiltrado celular no fígado dos grupos tratados com Lipo-CPO e anfotericina B, porém com menor intensidade quando comparado ao grupo controle. O estudo sugere que a CPO encapsulada em lipossomas apresenta significativa ação antimicótica frente às amostras sistêmicas de C. neoformans, reforçando seu potencial na terapêutica da criptococose. / Cryptococcosis is an opportunistic fungal infection whose the main ethiological agents are Cryptococcus neoformans and C. gattii. The treatment of choice for this mycosis is amphotericin B combined or not with 5-fluorocytosine, followed by maintenance therapy with fluconazole. However treatment failures associated with toxicity and drug resistance has been reported, which makes it essential to the discovery of new therapies, such as ciclopirox olamine (CPO). The purpose of this study was to characterize and evaluate the in vitro and in vivo antifungal activity of ciclopirox olamine in its free form and encapsulated in liposomes against thirty Cryptococcus neoformans isolates obtained from immunocompromised patients for future application in systemic cryptococcosis treatment. Preparation of conventional and stealth liposomes was performed to define particle size, polydispersity index (PDI), CPO amount of encapsulated and efficiency of encapsulation (EE%). For optimization of liposomal lipid constituents, a 24-1 fractional factorial design was carried out from the prominent formulation obtained in pre-characterization studies. In vitro release kinetics was conducted to evaluate and compare statistically the release profile of conventional and stealth liposomes. Antifungal susceptibility testing was conducted in accordance with the reference method. Regarding molecular characterization, PCR fingerprinting was carried out by using MT3 and URA5 primers. Concentrations of CPO used in free form and encapsulated into stealth and conventional liposomes ranged from 625 to 0.3 g.mL-1. Despite of the central point of the factorial design have increased the total lipids amount in 35.52%, it showed prominent characteristics when compared with the L4 formulation with improvement of the mean size in 17.1%, PDI in 15.34% and CPO amount in 25%. The minimum concentrations of stearylamine to obtain the stable formulation for one month was 5.88 mM. . Kinetics of stealth liposomes showed a release profile more controlled as compared to conventional liposomes. All inoculations were susceptible to CPO in its free form, presenting fungistatic activity between 0.3 and 0.61 g.mL-1 and fungicidal activity between 1.22 and 4.88 g.mL-1. There was no difference with respect to antimycotic activity between conventional and stealth liposomal formulations. Fungistatic activity of liposomes was observed at concentrations ranging from 1.22 and 2.44 g.mL-1. Fungicidal concentration range was 1.22-9.76 g.mL-1. The URA5 profile analized demonstrated all isolates are VNI genotype (C. neoformans). The treatment with Lipo-CPO showed a reduction of 8% of the C. neoformans population in spleen, 40.8% in liver, 63% in lungs and 89% in brain after 14 days of infection. Histological examination revealed cell infiltrate either Lipo-CPO or Amphotericin B treated groups, but less intense when compared to control group. The results suggest that Ciclopirox olamine loaded-liposomes have significant antimycotic activity against Cryptoccocus spp, reinforcing its potential for in vivo studies and its application in cryptococcosis treatment.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dentre as espécies florestais nativas da Amazônia utilizadas por populações tradicionais na terapêutica de diversos problemas de saúde estão a Geissospermum argenteum Woodson, uma Apocynaceae, e a Minquartia guianensis Aubl., da família Olacaceae. Entre os problemas de saúde está a malária, que no Brasil e no mundo ainda é um grave problema de saúde pública. Outro agravo à saúde de importância são infecções microbianas, pois os micro-organismos têm desenvolvido resistência aos agentes antimicrobianos. Neste trabalho, foram coletadas amostras de cascas, folhas e galhos de G. argenteum e M. guianensis, em área de floresta, na Vila Apiaú, município de Mucajaí RR. As amostras foram submetidas à extração metanólica a quente e extração aquosa, Amostra de extrato metanólico de cascas de G. argenteum foi submetida a particionamento líquido-líquido, resultando nas frações hexânica, clorofórmica, acetato de etila e metanol/água. A fração clorofórmica foi selecionada para cromatografia em coluna com sistema gradiente de solventes, obtendo-se 38 frações, as quais foram analisadas através de CCD e destas a fração Cr10 foi selecionada para cromatografia preparativa, a partir da qual foi obtida a fração F6, que analisada em CCD mostrou-se positiva para alcalóides. Os extratos metanólicos e aquosos de ambas as espécies, e frações primárias provenientes de extratos G. argenteum foram testados em ensaios in vitro para atividade antimalárica frente à cepa cloroquino-resistente, K1, de Plasmodium falciparum, nas concentrações de 50 e 5 &#956;g/mL. Posteriormente, amostras ativas foram avaliadas em 7 diluições para estabelecer a relação dose-resposta e valores de concentração inibitória mediana (CI50). Amostras provenientes das duas espécies também foram testadas contra as cepas bacterianas, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans e Escherichia coli, e contra a levedura Candida albicans. A atividade antimicrobiana foi avaliada através de difusão em ágar e a concentração inibitória mínima (CIM) por microdiluição em placas. Para as frações acetato de etila, clorofórmica, hexânica e hidroalcoólica obtida de cascas de G. argenteum e a fração Cr10 foi realizada a bioautografia para S. aureus. Na atividade antimalárica o extrato metanólico de casca foi ativo, com CI50 de 4,6 &#956;g/mL e a fração clorofórmica obtida de casca de G. argenteum também foi ativa com CI50 de 2,0 &#956;g/mL. Os extratos de M. guianensis foram considerados inativos para a atividade antimalárica. Na atividade antimicrobiana, através de difusão em ágar, extratos de G. argenteum foram parcialmente ativos contra S. aureus, S. mutans e inativos contra E. coli e C. albicans. A CIM para S. aureus foi de 0,63 mg/mL para a fração metanol/água, para S. mutans, CIM de 0,63 mg/mL e C. albicans com CIM de 0,63 mg/mL. Para cepa de E. coli os extratos foram inativos. Extratos de M. guianensis mostraram-se ativos frente à S. aureus e C. albicans através de difusão em ágar e apresentaram a CIM superior a 1mg/ml para S. aureus, S. mutans e C. albicans. Os extratos de M. guianensis foram inativos contra E. coli. Na autobiografia para S. aureus as frações testadas apresentaram atividade. / Among the natives species from the Amazon Forest used by traditional populations in the treatment of various health problems, including, malaria, wich in Brazil and in the world remains a serious public health problem, are Geissospermum argenteum Woodson, an Apocynaceae, and Minquartia guianensis Aubl, Olacaceae family. Another important health problem is the microbial infections, because the microorganisms have developed resistence to antimicrobial agents. In this work, samples were collected from bark, leaves and twigs of G.argenteum and M. guianensis in a forestall area in Apiaú village, city of Mucajaí RR. The samples were extracted by hot methanol and water extraction, resulting in methanol and aqueous extracts. Sample of methanol extract of bark of G.argenteum was submitted to liquid-liquid partitioning, resulting in fractions hexane, chloroform, ethyl acetate and methanol/water. The chloroform fraction was selected for fractionation using chromatography colunn and solvent gradient system, resulting in 38 fractions, which were analyzed by TLC and the fraction Cr10 was selected for preparative chromatography, from which the fraction F6 was obtained, analyzed in CCD was positive for alkaloids. The methanol and aqueous extracts of both species and fractions of extracts from primary G.argenteum were tested in vitro assays for antimalarial activity against the chlroquine-resistant K1 Plasmodium falciparum at concentrations of 50 and 5 mg/mL. Subsequently, active samples were evaluated in 7 diluitions to establish the dose-response and median inhibitory concentration values (IC50). Samples from two species were also tested against bacterial strains, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans and Escherichia coli, and against the yeast Candida albicans. Antimicrobial activity was evaluated by agar diffusion and minimum inhibitory concentration (MIC) by microdilution plates. For fractions of ethyl acetate, chloroform, hexane and water-alcohol obtained from barks of G.argenteum, fraction Cr10 and bioautography was performed fo S. aureus. Antimalarial activity in the methanol extract of bark was active, with IC50 of 4,6 mg/mL and chloroform fraction obtained from bark of G.argenteum was also active with IC50 of 2,0 mg/mL. The extracts of M. guianensis were considered inactive for antimalarial activity. In antimicrobial activity by agar diffusion, extracts of G.argenteum were partially active against S. aureus, S. mutans and inactive against E. coli and C. albicans. The MIC for S. aureus was 0,63 mg/mL per fraction methanol/water, S. mutans, MIC of 0,63 mg/mL and C. albicans with an MIC of 0,63 mg/mL. For the strain of E.coli there was no activity. Extracts of M. guianensis were active against the S. aureus and C. albicans by agar diffusion and presented more than 1 mg/mL MIC for S aureus, S.mutans and C. albicans. The extracts of M. guianensis were inactive against E. coli.