Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le virus de l'hépatite A et les norovirus humains sont les principaux agents viraux causant des maladies d'origine alimentaire mondialement. Contrairement aux bactéries, une contamination des aliments par ces virus n'est pas facilement détectable et ceux-ci y sont présents en très faible quantité. Malheureusement, une faible concentration de ces virus sur les aliments suffit à provoquer une infection. Afin d'effectuer une détection sensible et éviter des éclosions, il est primordial d'effectuer une concentration de ces virus. L'objectif de ce projet était donc de développer deux méthodes de concentration, l'une possédant une affinité spécifique basée sur les anticorps spécifiques et l'autre possédant une affinité à large spectre utilisant l'apolipoprotéine H. La méthode basée sur les anticorps a été élaborer à partir d'autres méthodes similaires présenté dans la littérature. La méthode basée sur l'apolipoprotéine H, pour sa part, est méthode élaborer et optimiser durant ce projet de recherche. La caractérisation de l'affinité de l'apolipoprotéine H et son utilisation dans une méthode de concentration virale étant très peu détaillé par la communauté scientifique. Étant donné que les résultats obtenus pour la méthode de concentration basée sur les anticorps spécifiques étaient insatisfaisants. En effet, la sensibilité de la méthode ainsi que ça répétabilité était faible. Les efforts ont été dirigés vers la méthode de concentration basée sur l'apolipoprotéine H qui présentait des résultats prometteurs. À ce jour, aucune étude n'a démontré une affinité entre le virus de l'hépatite A et l'apolipoprotéine H et l'applicabilité de cette méthode à concentrer ces virus dans les aliments. Dans ce projet de recherche, la méthode basée sur l'apolipoprotéine H a été testée sur des fraises et des framboises fraîches et congelées contaminés expérimentalement par le virus de l'hépatite A et le norovirus humain GII.4 et comparée à la méthode référence ISO 15216 : 1. / Hepatitis A virus and human noroviruses are the major viral agents causing foodborne illness worldwide. Unlike bacteria, food contamination by these viruses is not easily detectable and they are present in very small quantities. Unfortunately, a low concentration of these viruses on food is enough to cause infection. In order to carry out a sensitive detection and avoid outbreaks, it is essential to carry out a concentration of these viruses. The objective of this project was therefore to develop two concentration methods, one with specific affinity based on specific antibodies and the other with broad-spectrum affinity using apolipoprotein H. The antibody-based method has been developed from other similar methods presented in the literature. The method based on apolipoprotein H, for that part, is a method developed and optimized during this research project. The characterization of the affinity of apolipoprotein H and its use in a method of viral concentration being very little detailed by the scientific community. Since the results obtained for the concentration method based on specific antibodies were unsatisfactory. Indeed, the sensitivity of the method as well as its repeatability was low. Efforts were directed towards the concentration method based on apolipoprotein H which showed promising results. To date, no study has demonstrated an affinity between the hepatitis A virus and apolipoprotein H and the applicability of this method to concentrate these viruses in food. In this research project, the method based on apolipoprotein H was tested on fresh and frozen strawberries and raspberries experimentally contaminated with the hepatitis A virus and the human norovirus GII.4 and compared with the ISO reference method. 15216: 1.

Le projet de recherche qui constitue ce mémoire de maîtrise avait pour but d’investiguer les mécanismes physiologiques responsables de l’effet divergent de deux statines [inhibiteurs de la 3-hydroxy-3-méthylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) réductase] largement utilisées en clinique, la simvastatine et l’atorvastatine, sur les concentrations de cholestérol associées aux lipoprotéines de haute densité (HDL-C). Pour ce faire, nous avons comparé l’impact de ces deux médicaments hypocholestérolémiants sur la cinétique de l’apolipoprotéine A-I, la protéine majeure des lipoprotéines de haute densité, chez 7 sujets hypercholestérolémiques avec des concentrations relativement faibles de cholestérol HDL. Tous les sujets étaient soumis à chacun des deux traitements à l’étude, soit simvastatine 80 mg/jour et atorvastatine 40 mg/jour, selon un devis expérimental randomisé, en chassé-croisé et à double insu. Chaque phase de traitement durait 8 semaines. Des analyses de cinétique étaient réalisées à la fin de chacune des phases de traitement. Celles-ci ont démontré qu’un traitement de 8 semaines sous simvastatine 80 mg/jour était associé à une concentration d’apolipoprotéine A-I en circulation significativement plus élevée de 8% que sous traitement à l’atorvastatine 40 mg/jour. La concentration supérieure d’apolipoprotéine A-I sous traitement à la simvastatine était attribuable à un taux de production de d’apolipoprotéine A-I significativement plus élevé (15%) comparativement au traitement à l’atorvastatine. / The purpose of the following study was to investigate the physiological mechanisms underlying the diverging impact of two statins (HMG-CoA reductase inhibitors) widely used in clinic, simvastatin and atorvastatin, on high density lipoprotein cholesterol (HDL-C). To do so, we compared the impact of the two lipid-lowering agents on apoA-I kinetics, the protein moiety of HDL, in 7 hypercholesterolemic men with low HDL levels. All subjects were assigned two both treatments, simvastatin 80 mg/day and atorvastatin 40mg/day, in a randomized, cross-over, double-blind fashion. Each treatment phase last 8 weeks and kinetic studies were performed at the end of each treatment phase. Our analysis has demonstrated that simvastatin 80 mg/day was associated with a significant 8% greater apoA-I concentration in circulation compared to atorvastatin 40 mg/day. The higher apoA-I conentration observed with simvastatin 80 mg/day was explained by a significant 15% greater aspoA-I production rate with simvastatin 80 mg/day compared to atorvastatin 40 mg/day.

Les maladies cardiovasculaires (MCV) représentent une des principales causes de décès dans le monde. La diminution des concentrations de cholestérol contenues dans les LDL (LDL) représente actuellement la méthode de prévention privilégiée dans la prévention des MCV. Toutefois, d’autres biomarqueurs, telles que la concentration d’apolipoprotéine (apo) B-100 et la taille des LDL, pourraient être utilisés et seraient possiblement supérieurs dans l’évaluation du risque. Ainsi, puisque la mesure du cholestérol LDL (LDL-C), habituellement utilisée en clinique, ne permet pas nécessairement de d’obtenir autant d’informations que ces deux derniers marqueurs, il importe d’en déterminer les facteurs métaboliques responsables, et ce, dans le but d’établir une stratégie de prévention efficace. Ce mémoire présente les résultats d’une étude d’observation dont l’objectif était de comparer les origines métaboliques de ces deux marqueurs athérogènes. Les résultats suggèrent que les phénotypes de la taille et du nombre de particules LDL naissent d’origines métaboliques distinctes. / Cardiovascular diseases (CVD) represent one of the leading mortality causes in the world. Reduction of the concentration of cholesterol in low-density-lipoprotein (LDL) is currently the privileged CVD prevention method. However, others markers such as apolipoprotein (apo) B-100 and LDL size might be more accurate in CVD risk prediction because they reflect additional features of cardiometabolic risk that are not provided by the traditional LDL-C measures in clinic. It is therefore of great interest to better understand the metabolic factors responsible for increased LDL particle number and decreased LDL particle size, in the optics of establishing an efficient prevention strategy. This thesis presents the results of an observational study, which has the objective of comparing the metabolic origins of high levels of apo-B100 and of small LDL particle size. Results suggest that both features are the result of distinct metabolic pathways.

Le virus de l’hépatite A et les norovirus humains sont les principaux agents viraux causant des maladies d’origine alimentaire mondialement. Contrairement aux bactéries, une contamination des aliments par ces virus n’est pas facilement détectable et ceux-ci y sont présents en très faible quantité. Malheureusement, une faible concentration de ces virus sur les aliments suffit à provoquer une infection. Afin d’effectuer une détection sensible et éviter des éclosions, il est primordial d’effectuer une concentration de ces virus. L’objectif de ce projet était donc de développer deux méthodes de concentration, l’une possédant une affinité spécifique basée sur les anticorps spécifiques et l’autre possédant une affinité à large spectre utilisant l’apolipoprotéine H. La méthode basée sur les anticorps a été élaborer à partir d’autres méthodes similaires présenté dans la littérature. La méthode basée sur l’apolipoprotéine H, pour sa part, est méthode élaborer et optimiser durant ce projet de recherche. La caractérisation de l’affinité de l’apolipoprotéine H et son utilisation dans une méthode de concentration virale étant très peu détaillé par la communauté scientifique. Étant donné que les résultats obtenus pour la méthode de concentration basée sur les anticorps spécifiques étaient insatisfaisants. En effet, la sensibilité de la méthode ainsi que ça répétabilité était faible. Les efforts ont été dirigés vers la méthode de concentration basée sur l’apolipoprotéine H qui présentait des résultats prometteurs. À ce jour, aucune étude n’a démontré une affinité entre le virus de l’hépatite A et l’apolipoprotéine H et l’applicabilité de cette méthode à concentrer ces virus dans les aliments. Dans ce projet de recherche, la méthode basée sur l’apolipoprotéine H a été testée sur des fraises et des framboises fraîches et congelées contaminés expérimentalement par le virus de l’hépatite A et le norovirus humain GII.4 et comparée à la méthode référence ISO 15216 : 1. / Hepatitis A virus and human noroviruses are the major viral agents causing foodborne illness worldwide. Unlike bacteria, food contamination by these viruses is not easily detectable and they are present in very small quantities. Unfortunately, a low concentration of these viruses on food is enough to cause infection. In order to carry out a sensitive detection and avoid outbreaks, it is essential to carry out a concentration of these viruses. The objective of this project was therefore to develop two concentration methods, one with specific affinity based on specific antibodies and the other with broad-spectrum affinity using apolipoprotein H.The antibody-based method has been developed from other similar methods presented in the literature. The method based on apolipoprotein H, for that part, is a method developed and optimized during this research project. The characterization of the affinity of apolipoproteinH and its use in a method of viral concentration being very little detailed by the scientific community. Since the results obtained for the concentration method based on specific antibodies were unsatisfactory. Indeed, the sensitivity of the method as well as its repeatability was low. Efforts were directed towards the concentration method based on apolipoprotein H which showed promising results. To date, no study has demonstrated an affinity between the hepatitis A virus and apolipoprotein H and the applicability of this method to concentrate these viruses in food. In this research project, the method based on apolipoprotein H wastested on fresh and frozen strawberries and raspberries experimentally contaminated with the hepatitis A virus and the human norovirus GII.4 and compared with the ISO reference method. 15216: 1.

Le virus de l’hépatite C (HCV) infecte les hépatocytes. Il est remarquable par le fait q’ilperturbe fortement le metabolisme lipidique de l’hôte, conduisant à des dysfonctions majeures telles qu’une stéatose ou une résistance à l’insuline. In vivo, les virions sériques présentent une densité faible et variable reflétant leur association aux lipoprotéines de faible et de tres faible densité (LDL et VLDL). Ainsi, l'existence de lipo-viro-particules (LVP), contenant à la fois les constituants viraux et les apolipoprotéines B (apoB) et E (apoE) a été suggerée. Ces LVP joueraient un rôle important dans la persistance virale. Cependant, cette association entre HCV et apoB n'a pas été retrouvée in vitro avec les modeles cellulaires disponibles.Mes travaux de thèse se sont donc concentrés sur la mise en place d'un nouveau modèle deculture cellulaire capable de produire a la fois des VLDL et des particules virales HCV, permettantainsi d’étudier l’interaction entre les deux voies de synthèse. Dans un premier temps, lacaracterisation de la production de lipoproteines par differentes lignees d'hepatocytes a permis demontrer l'existence d'un défaut de secretion de VLDL en cellules Huh7.5, classiquement utiliséespour étudier HCV in vitro, alors que les cellules HepG2 et HepaRG sont capables de produire des VLDL physiologiques. Dans un second temps, des cellules HepG2 repliquant HCV de manière persistante ont été utilisées pour caractériser les particules virales produites. Etonnamment, a l'instar des cellules Huh7.5 et malgré leur capacité a produire des VLDL, les cellules HepG2 ne secreteraient pas de LVP mais des particules virales positives pour apoE et négatives pour apoB. / Hepatitis C virus (HCV) mainly infects hepatocytes. It is unique in its ability to impair host lipidmetabolism, leading to major liver dysfunctions as, for instance, hepatic steatosis or insulinresistance. In vivo, serum virions have a low and variable density, reflecting their association withlow- and very-low-density lipoproteins (LDL and VLDL). Hence, the existence of lipo-viro-particles(LVP), containing both viral components as well as apolipoprotein B (apoB) and E (apoE), has beensuggested. These LVPs could play an important role in viral persistence. However, this associationbetween HCV and apoB has not been observed in vitro, using the currently available cell culturemodels.Therefore, during my PhD, I have worked at setting up a new cell culture model, which wascapable of producing both VLDL and HCV particles, and therefore would enable the study of theinterplay between both synthesis pathways. First of all, we characterized lipoprotein production indifferent hepatocyte cell lines and confirmed that Huh7.5 cells, usually used to study HCV in vitro,were deficient for VLDL secretion, whereas two other cell lines, HepG2 and HepaRG, were able toproduce quasi-physiological VLDLs. Therefore, in a second time, we used HepG2 cells to replicate aHCV strain containing a selection gene and to characterize viral particle production. Surprisingly,VLDL-producing HepG2 cells were also unable to secrete LVPs, but rather secreted apoE-positive andapoB-negative viral particles, which were similar to ones Huh7.5 cells produced. This suggests thatthe ability to produce LVPs does not correlate with the ability to produce VLDL.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les patients atteints de la maladie de Tangier présentent des niveaux très bas de lipoprotéines de haute densité (HDL), un facteur de risque pour le développement des maladies cardiovasculaires. In vivo, les HDL ont un effet protecteur important contre l’athérosclérose puisqu’elles effectuèrent le transport à rebours du cholestérol des tissus périphériques vers le foie. Or, la maladie de Tangier est causée par des mutations dans le gène du transporteur « ATP-binding cassette A1 » (ABCA1). Le modèle actuel stipule que ce transporteur assure la lipidation de l’apolipoprotéine A-I (apoA-I), la composante protéique majeure des HDL, pour former des particules HDL naissantes discoïdales. Un défaut dans la lipidation de l’apoA-I par l’ABCA1 abolit la biogénèse des HDL. Nous avons voulu étudier les sites d’interaction de l’ABCA1 avec son ligand (l’apoA-I), les voies de biogénèse impliquées, et l’implication des pré-β-HDL dans l’efflux du cholestérol par la voie de l’ABCA1. D’abord, nous avons utilisé un système de culture cellulaire (fibroblastes humaines et BHK-ABCA1-inductible) afin de déterminer les sites de liaison cellulaires de l’apoA-I, leurs localisations et l’implication de l’ABCA1. Nous avons trouvé que la majorité de l’apoA-I n’est pas associée à l’ABCA1 et, deux tiers de cet apoA-I, était à la membrane plasmique. Ensuite, Une étude plus détaillée examinait les voies de lipidation de l’apoA-I, soit au niveau de la membrane plasmique (MP), soit aux compartiments intracellulaires (CICs). Nous avons montré que la lipidation de l’apoA-I a lieu aux deux niveaux (MP et CICs) selon deux voies différentes cinétiquement. Finalement, nous avons montré que les pré-β-HDL effluent aussi (efficacement que l’apoA-I) le cholestérol par la voie de l’ABCA1. Ces observations réunies démontrent que 1) la majorité de l’apoA-I s’est trouvé non-associée à l’ABCA1; 2) deux tiers de l’apoA-I s’associent a la membrane plasmique; 3) la lipidation de l’apoA-I se fait en partie à la membrane plasmique et, par la voie de retro-endocytose du complexe apoA-I/ABCA1. / Patients affected with Tangier disease show abnormal low levels of high density lipoproteins (HDL), a risk factor for the development of cardiovascular diseases. In vivo, HDL has an important protective effect against atherosclerosis since they accomplish the reverse cholesterol transport from peripheral tissues towards the liver. However, Tangier disease is caused by mutations in the gene of the transporter “ATP-binding cassette A1” (ABCA1). The current model believe that ABCA1 promotes the lipidation of apolipoprotein AI (apoA-I), the major protein component of HDLs, to form nascent discoid HDL particles. A defect in the lipidation of apoA-I by ABCA1 abolishes the biogenesis of HDL. We wanted to study interaction sites of ABCA1 with its ligand (the apoA-I), the implicated biogenesis’s pathways, and the implication of pre-β-HDLs in the cholesterol efflux by the ABCA1 pathway. Initially, we used a cell culture system (human skin fibroblasts and BHK-ABCA1) in order to determine the cellular sites of apoA-I binding and their localizations and the implication of ABCA1. We found that the majority of apoA-I was not associated with ABCA1 and, 2 thirds of this apoA-I bound to the plasma membrane. Then, a more detailed study examined the lipidation pathways of apoA-I either at plasma membrane (PM) level, or in the intracellular compartments (ICCs). We showed that the lipidation apoA-I occurs at the two levels (PM and ICCs) with two kinetically different pathways. Finally, we showed that the pre-β-HDLs efflux (as efficiently as apoA-I) the cholesterol via the ABCA1 pathway. Taken together, these observations show that 1) the majority of apoA-I was found non-associated with ABCA1; 2) two thirds of apoA-I bind the plasma membrane; 3) the lipidation of the apoA-I occurs, in part at the plasma membrane and, in the other, by the retro-endocytosis pathway of the apoA-I/ABCA1complexe.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative d’évolution toujours fatale. Dans les formes sporadiques (SLAS), l’étiologie demeure inconnue et l’hypothèse d’une participation génétique dans le cadre d’un modèle de maladie complexe est envisagée. Notre travail porte sur deux gènes de susceptibilité dans la SLAS : le gène de l’Apolipoprotéine E (APOE) et le gène impliqué dans l’hémochromatose familiale de type 1 (HFE). Notre première étude confirme sur une population de 1482 patients atteints de SLA sporadique le lien entre allèle ε4 et la forme bulbaire de la maladie mais uniquement chez les hommes. Nous proposons une explication physiopathologique faisant intervenir le récepteur aux androgènes, particulièrement exprimé au niveau des motoneurones bulbaires. Notre deuxième étude sur 244 patients et 302 contrôles ne retrouve pas l’association entre le polymorphisme H63D et le risque de SLA sporadique notée dans d’autres populations. En revanche, l’allèle Y du polymorphisme C282Y semble exercer un effet protecteur vis-à-vis de la SLA. Ces données sont discutées dans le contexte de l’hypothèse physiopathologique du stress oxydant. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease. The cause of sporadic cases (SALS) remains unknown but a genetic participation in a model of complex disease is suspected. Our work concerns two susceptibility genes for SALS: Apolipoprotein E gene (APOE) and the gene involved in familial hemochromatosis (HFE). Our first study including 1482 patients with SALS confirms a link between ε4 allele and bulbar-onset of the disease, only in men. We suggest a pathophysiological explanation with a role for the androgen receptor which is particularly abundant in motor neurons of the brainstem. Our second study about 244 patients and 302 controls did not find any association between the H63D polymorphism and SLAS, which has previously been showed. However, the Y allele of the C282Y polymorphism seems to exert a protective effect against SALS. We discuss these data within the pathophysiological hypothesis of oxidative stress in ALS.

L’infection par le virus de l’hépatite C (HCV) est une cause majeure de maladies hépatites sévères et constitue un problème majeur de santé public. Le HCV est associé aux lipopoprotéines formant une lipoviroparticule (LVP) qui est la forme infectieuse du virus. L’apolipoprotéine E (apoE), associée aux lipoprotéines, est impliquée dans les étapes précoces et tardives de l’infection. Elle interagit avec de récepteurs impliqués dans le métabolisme lipidique tels les héparanes sulfates protéoglycanes (HSPG). Durant ma thèse, j’ai démontré que les acides aminés chargés positivement du domaine de liaison aux HSPG d’apoE sont impliqués dans l’entrée du HCV dans l’hépatocyte. J’ai également démontré que la production et/ou l’infectiosité des particules virales est corrélée au taux d’expression d’apoE dans les cellules sans avoir d’impact sur la traduction ou la réplication virales. Enfin, j’ai identifié syndecan-4, un membre de la famille des HSPG, comme l’HSPG principal impliqué dans l’entrée du HCV dans les lignées Huh7.5.1. L’ensemble de ces résultats démontre qu’HCV utilise l’interaction apoE-SDC4 pour établir une infection virale efficace. / Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of liver disease worldwide and represents a major health problem. HCV associates with host lipoproteins forming host/viral hybrid complexes termed lipoviral particles. Apolipoprotein E (apoE) is a lipoprotein component that interacts with heparan sulfate proteoglycans (HSPG) to mediate hepatic lipoprotein uptake, and may likewise mediate HCV entry. I sought to define the functional regions of apoE with an aim to identify critical apoE binding partners involved in HCV infection. I demonstrated a direct correlation of apoE expression and HCV infectivity, whereas no correlation exists with viral protein translation or replication. Mutating the HSPG binding domain (HSPG-BD) of apoE revealed key residues that are critical for mediating HCV infection. Finally, I identified Syndecan-4 (SDC4), an HSPG family member, as the principal HSPG mediating HCV entry. Our data demonstrate that HCV uses apoE-SDC4 interactions to enter hepatocytes and establish efficient viral infection.