Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le cholestérol, molécule complexe, est depuis longtemps associé aux maladies cardiovasculaires. Bien qu'il ait des effets bénéfiques lorsqu'il est, par exemple, précurseur de sels biliaires, de la vitamine D et d'autres stéroïdes, s'il est en excès dans le sang, il peut être à l'origine de la formation de plaques athéromateuses. Le transport du cholestérol dans la circulation est assuré par les lipoprotéines qui sont évacuées de la circulation par des récepteurs spécifiques au niveau du foie. Le récepteur de lipoprotéines de faible densité (LDL) mène à la captation et à la dégradation complète de la particule, tandis que le récepteur « scavenger » de classe B type J (SR-BI) est capable de retirer de façon sélective les esters de cholestérol des LDL et des lipoprotéines de haute densité (HDL). Les lipoprotéines sont reconnues par ces récepteurs grâce aux apolipoprotéines (apo) présentes à la surface de la particule. Des études antérieures ont démontré que l'apoC-I peut inhiber la captation de lipoprotéines riches en triglycérides et moduler l'activité d'enzymes impliquées dans le métabolisme du cholestérol. L'objectif de la présente étude est d'examiner si les différents taux de sécrétion d'apoC-I par les cellules hépatiques induisent un changement au niveau du métabolisme des LDL et des HDL. Des essais de captation des HDL et des LDL par des cellules d'hépatome humain HepG2 ont été réalisés en présence de concentrations croissantes d'apoC-I purifiées. Ces essais ont démontré une diminution dose dépendante de la captation sélective des esters de cholestérol des LDL et des HDL (95 % et 98% d'inhibition respectivement, en présence de 5 µg/ml d'apoC-I), sans provoquer de changement dans l'association protéique et la dégradation de ces lipoprotéines. Pour caractériser l'impact des différents taux de sécrétion d'apoC-I endogène, des transformants stables de cellules HepG2 ont été obtenus exprimant 290 % et 380 % du niveau d'apoC-I secrétée par les cellules HepG2. D'autre part, l'expression de cette apolipoprotéine a été inhibée de 55 % de son niveau d'expression par les cellules HepG2 en utilisant la stratégie des siRNA (short interfering RNA). Les essais d'association et de dégradation des HDL et des LDL par ces différents types de cellules ont démontré qu'une diminution de l'expression de l'apoC-I induit une augmentation de la captation sélective des esters de cholestérol des HDL de 29 % par l'apport à celle des cellules contrôles. Les associations protéique et lipidique des LDL ont été aussi plus élevées pour les cellules sous-exprimant l'apoC-I (23 % et 15 % d'augmentation respectivement). Contrairement aux résultats obtenus avec les cellules sous-exprimant l'apoC-I, le métabolisme des lipoprotéines n'a pas été modifié dans les cellules sur-exprimant l'apoC-I. Les analyses de clairances plasmatiques des LDL et des HDL injectées à des souris, réalisées en présence d'apoC-I purifiée, visant à élucider l'impact de cette apolipoprotéine dans le métabolisme des lipoprotéines in vivo, n'ont pas donné les résultats escomptés. D'autre part, les essais de liaison de l'apoC-I marquée à l'iode-125 aux cellules HepG2 ont révélé que celle apolipoprotéine se lie de façon spécifique à la membrane plasmique de ces cellules. De plus, les résultats d'incubation des LDL et des HDL en présence de cette apoC-I marquée ont démontré que celle-ci s'associe également aux lipoprotéines. Enfin, la définition du rôle de l'apoC-I dans le métabolisme des HDL et des LDL pourrait mener à une intervention d'ordre thérapeutique visant à diminuer le taux de synthèse de cette apolipoprotéine, et ainsi diminuer le taux de cholestérol sanguin et en conséquence l'incidence de maladies cardiovasculaires. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : LDL, HDL, Apolipoprotéines, Cholestérol, Captation sélective.

Depuis la découverte de l'apolipoprotéine D (ApoD) en 1973 par McConathy et Alaupovic et malgré de grandes avancées, la fonction et les mécanismes de régulation de cette protéine demeurent toujours inconnus. Quoi qu'il en soit, toutes les études faites jusqu'à présent semblent montrer qu'elle serait une protéine importante et bénéfique tant en situation normale que pathologique. Son expression génique est détectée chez presque tous les mammifères de même que chez les plantes, les insectes et certaines espèces d'oiseaux. Chez l'humain, elle est exprimée dans plusieurs tissus et hautement exprimée dans les glandes surrénales, la rate, les poumons, le cerveau, le placenta, et les reins. Par contre, chez le rat et la souris, l'expression est limitée au système nerveux central (SNC), ce qui en fait un bon modèle d'étude de la régulation génique d'ApoD. En effet, l'APOD est induite dans plusieurs cas de neuropathologies chez l'humain tel que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson, la sclérose en plaques, la schizophrénie ainsi que dans certains cancers. L'ApoD est également induite dans plusieurs modèles de neurodégénérescence chez la souris et sa surexpression confère une neuroprotection. En corrélation avec ces faits, il est suggéré que l'APOD soit une protéine de stress pouvant être considérée comme marqueur de pathologies d'ordre neurologique d'où l'importance d'une étude plus approfondie. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis d'éclaircir un tant soit peu les mécanismes régulant l'expression génique d'APOD lors de divers stress cellulaires. Effectivement, ces travaux présentent la purification et la caractérisation des facteurs nucléaires Parp-1, HnRNP-U, CBF-A, BUB-3, Kif4, APEX-1 et Ifi204 liant les éléments régulateurs SRE, EBS et GRE du promoteur d'APOD lors de l'arrêt de croissance par déprivation de sérum. L'activité enzymatique des protéines Parp-1, APEX-1 et ERK1/2 semble être importante dans l'induction de l'expression génique d'APOD. Sachant que l'expression d'APOD et la prolifération cellulaire sont inversement corrélées dans plusieurs types de cellules, ces résultats permettent d'éclaircir les mécanismes impliqués. Dans un même ordre d'idée, les résultats présentés dans cette thèse montrent l'identification de plusieurs centaines de protéines liant le promoteur d'APOD, dans la région -816 à +64, provenant de cortex de souris saines ou infectées par un coronavirus humain causant une neurodégénérescence. Parmi ces protéines, l'ApoE et la protéine non-structurale Ns2 du coronavirus lient le promoteur d'APOD. Ces résultats suggèrent aussi que les isoformes E3 et E4 d'APOE humaines soient des répresseurs tandis que Ns2 activerait le promoteur in vivo. De plus, il est mis en évidence une corrélation inverse entre l'expression d'ApoD et d'ApoE notamment au niveau du cortex de souris. Considérant que l'allèle E4 est un facteur génétique important dans le développement de la maladie d'Alzheimer et que les coronavirus sont associés à des désordres neurologiques tels que la sclérose en plaques, ces résultats ouvrent une porte permettant d'investiguer plus en profondeur, et vers une nouvelle direction, les mécanismes impliqués non seulement dans la régulation du gène d'APOD mais aussi dans les maladies neurodégénératives. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Apolipoprotéine D, arrêt de croissance, inflammation, facteur de transcription, coronavirus OC43, spectrométrie de masse

Les interactions protéine-ligand interviennent dans de nombreux processus biochimiques et permettent notamment à certaines protéines sanguines d’assurer leur rôle de transport. Parmi ces protéines figurent notamment l’albumine, protéine la plus abondante du plasma, ou l’apolipoprotéine A1 (ApoA1), majoritaire au sein des lipoprotéines de haute densité (HDL). Dans un contexte diabétique, la glycation des protéines induit des modifications structurales affectant ainsi leur potentiel d’interaction.Le premier objectif de ce travail de thèse visait à déterminer l’impact de la glycation de l’albumine sur sa liaison au liraglutide, un médicament de plus en plus utilisé dans le traitement du diabète de type 2. Ensuite, la seconde partie de ce travail a consisté en la production d’une ApoA1 humaine recombinante fonctionnelle afin d’étudier ses propriétés d’interaction, sous forme libre ou associée aux phospholipides. La technique RMN (résonance magnétique nucléaire) a été utilisée sur les protéines préalablement marquées au fluor (pour le liraglutide) ou aux isotopes stables 13C/15N (pour l’ApoA1). La titration microcalorimétrique isotherme (ITC), méthode complémentaire à la RMN a été appliquée pour l’étude des interactions avec l’avantage de ne nécessiter aucun marquage. Différentes stratégies de clonage ont été explorées pour la surexpression de l’ApoA1 en bactérie Clearcoli.Les résultats obtenus démontrent une altération de l’affinité de l’albumine pour le liraglutide in vitro et in vivo, dépendante du degré de glycation. Ces résultats, enrichis d’une analyse lipidomique et peptidique, permettent d’expliquer les observations cliniques concernant la baisse de l’efficacité de médicaments liant l’albumine chez les patients ayant un diabète mal contrôlé. Concernant l’ApoA1, le choix de l’étiquette de fusion reste à optimiser, mais sa surexpression de manière soluble et abondante a été obtenue pour l’ApoA1 marquée et non marquée. / Protein-ligand interactions are involved in many biochemical processes. They are notably implicated in the role of transporter proteins in blood. Albumin, the most abundant plasma protein, and apolipoprotein A1 (ApoA1), which is the main component of high-density lipoprotein (HDL) belong to this class of proteins. In the context of diabetes, proteins are altered by glycation which leads to structural modifications and potentially affect their interactions.The first objective of this work was to determine the impact of albumin glycation on its binding to liraglutide, a drug increasingly used in the treatment of type 2 diabetes. Then, the second part of this work involved the production of recombinant functional human ApoA1 in order to study its interaction properties, in its lipid-free form or associated with phospholipids. The NMR (nuclear magnetic resonance) technique has been used on proteins previously labeled with fluorine (for liraglutide) or stable 13C/15N isotopes (for ApoA1). In addition, isothermal titration microcalorimetry (ITC), has been applied to the study of interactions with the advantage of not requiring any labeling. Various cloning strategies have been explored for the overexpression of ApoA1 in Clearcoli bacteria.The results demonstrate an alteration of the affinity of albumin for liraglutide in vitro and in vivo, depending on the degree of glycation. These results, supported by a lipidomic and peptide analysis, explain clinical observations concerning the decrease of efficacy of albumin-binding drugs in patients with poorly controlled diabetes. Regarding ApoA1, the choice of the fusion tag remains to be optimized, but both labeled and unlabeled ApoA1 were successfully overexpressed at high yields in a soluble form.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Apolipoprotein E (apoE) is crucial for lipid transport and cholesterol homeostasis within the plasma and central nervous system. Binding to lipoprotein particles activates apoE allowing it to interact with cell surface receptors such as the low density lipoprotein receptor (LDLr). This mediates the clearance of apoE containing lipoproteins through an endocytosis pathway and therefore reduces plasma cholesterol level, explaining the strong anti-atherogenic effect of apoE. Nevertheless, the active conformation of apoE, critical for the receptor interaction, remains elusive. Since high resolution structure-determination methods (i.e. NMR and X-ray crystallography) are not yet applicable to large protein/lipid complexes, we are actually in need of biophysical techniques to solve the structure-activity relationship of lipidated apoE. The aim of this work was to elucidate the lipidated structure of apoE. Therefore, we reconstituted apoE/lipid particles mimicking a subspecies of high density lipoproteins (HDL) found in the plasma, starting from recombinant apoE and synthetic lipids (POPC). After optimization, a homogeneous population of reconstituted apoE/POPC lipoproteins was obtained. A thorough characterization by different biochemical methods (native PAGE, electron microscopy, FTIR…) showed that these lipoprotein particles bear 2 apoE molecules at their surface and display a discoidal shape with a diameter of 105Å. Further structural information was gathered by using a combination of lysine-directed cross-linking and mass spectrometry. We then developed a two-step modeling procedure using all the structural knowledge acquired at this point enriched with literature data to build 3D atomic resolution structural models of the apoE4/POPC complexes. First, monomeric apoE models were produced in the absence of lipids using a distance calculation program. These initial models, where apoE is folded into a helical hairpin, should reflect the conformation adopted by the protein on a disc-shaped lipoprotein. Secondly, two modeled monomeric conformations were dimerized, associated with a lipid disc, solvated and finally subjected to a molecular dynamics (MD) simulation. Our MD trajectories show an elongation of a helix in the N-terminal domain that redefines the position of Arg172, a key residue for LDLr binding, in regards to the well-defined receptor binding region (residues 136-150) of apoE. The observed elongation explains why the lipidation of apoE is an essential requirement in the activation mechanism and offers an ideal framework for the recognition of two specific LDLr ligand binding repeats needed for full binding to the LDLr. Based on an important structural change observed in our different models, we can also propose an activation mechanism relying on a regulation of the accessibility of the ligand binding region by the protein itself. Thus, the two new presented models provide important structural information at the atomic level and new insights into the mechanisms involved in apoE receptor recognition. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’entrée du virus de l’hépatite C (VHC) dans les hépatocytes est un événement multi-étapes complexe, impliquant un certain nombre de facteurs cellulaires. Elle est initiée par la fixation des particules virales sur des structures d’héparanes sulfates (HS) présentes à la surface de l’hépatocyte. Cette étape initiale reste cependant peu comprise. En effet, en raison de l’interaction de la particule virale du VHC avec des lipoprotéines, la contribution exacte des différents composants du virion à cette interaction reste controversée. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le rôle potentiel de protéines d'enveloppe du VHC et de l'apolipoprotéine E dans l'étape de liaison aux HS. Nous avons d’abord montré que la délétion de la région hypervariable 1 (HVR1), une région précédemment proposée pour participer à l’interaction avec les HS, n'avait aucun effet sur la liaison du virion aux HS, indiquant que cette région n'est pas impliquée dans cette interaction. Nous avons également utilisé des anticorps monoclonaux neutralisants reconnaissant différentes régions des glycoprotéines d'enveloppe du VHC dans un test de compétition utilisant des billes d’agarose couplées à l’héparine, un homologue structural des HS, pour précipiter le virus. Bien que les glycoprotéines d’enveloppe du VHC dissociées de la particule virale interagissaient avec l'héparine, aucun de ces anticorps n’était capable d'interférer avec l'interaction entre la particule virale et l’héparine, suggérant fortement que les glycoprotéines d'enveloppe du VHC présente à la surface des virions ne sont pas accessibles pour interagir avec les HS. En revanche, nos résultats d’études cinétiques, d’interaction avec l’héparine ainsi que les expériences d'inhibition avec des anticorps anti-apolipoprotéine E indiquent que cette apolipoprotéine joue un rôle majeur dans l'interaction initiale entre le VHC et les HS. Enfin, la caractérisation des déterminants structuraux des HS nécessaires à l'infection par le VHC, à l’aide d’ARN interférents ciblant des enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse des HS et par compétition avec des héparines modifiées, indique que la N-sulfatation et la 6-O-sulfatation sont nécessaires pour l’initiation de l'infection par le VHC. Par contre la 2-O-sulfatation n’est pas indispensable pour l’étape d’entrée cellulaire du VHC. Enfin, nous avons également montré que la taille minimale des oligosaccharides d’HS requise pour l'infection par le VHC est un decasaccharide. En conclusion, l’ensemble de ces données indique que le VHC détourne l'apolipoprotéine E pour initier son interaction avec des structures d’HS spécifiques. / Hepatitis C virus (HCV) entry into hepatocytes is a complex multistep process involving a series of cellular factors. HCV entry is initiated by the binding of viral particles to cell surface heparan sulfate (HS) structures. However, due to the lipoprotein-like structure of HCV, the exact contribution of virion components to this interaction remains controversial. Here, we investigated the relative contribution of HCV envelope proteins and apolipoprotein E in the HS-binding step. Deletion of hypervariable region 1, a region previously proposed to be involved in HS-binding, did not alter HCV virion binding to HS, indicating that this region is not involved in this interaction. Neutralizing monoclonal antibodies recognizing different regions of HCV envelope glycoproteins were also used in a pull-down assay with beads coated with heparin, a close HS structural homologue. Although isolated HCV envelope glycoproteins could interact with heparin, none of these antibodies was able to interfere with virion-heparin interaction, strongly suggesting that, at the virion surface HCV envelope glycoproteins are not accessible for HS binding. In contrast, results from kinetic studies, heparin pull-down and inhibition experiments with anti-apolipoprotein E antibodies indicate that this apolipoprotein plays a major role in HCV-HS interaction. Finally, characterization of HS structural determinants required for HCV infection by silencing enzymes involved in the HS biosynthesis pathway and by competition with modified heparin indicated that N- and 6-O-sulfation but not 2-O-sulfation are required for HCV infection, and that the minimum HS oligosaccharide length required for HCV infection is a decasaccharide. Together, these data indicate that HCV hijacks apolipoprotein E to initiate its interaction with specific HS structures.

Le syndrome métabolique est un regroupement de facteurs de nsque de maladie cardiovasculaire (MCV) étroitement liés à l'obésité. L 'hypertriglycéridémie, la présence en circulation de lipoprotéines de faible densité (LDL) de diamètre réduit et une condition proinflammatoire représentent trois de ces facteurs. L' apoliprotéine (apo) C-III, présente sous 3 isoformes en circulation, inhibe la lipase lipoprotéique. et serait impliquée dans le développement de l 'hypertriglycéridémie. Les LDL petites et denses seraient métabolisées moins rapidement et seraient ' ainsi plus susceptibles de participer au processus athérosclérotique. Les concentrations plasmatiques élevées de protéine C-réactive (CRP) sont utilisées en clinique dans l'évaluation de la condition inflammatoire et dans l'estimation du profil de risque de MCV. La compréhension du métabolisme intravasculair-e de l'apoC-III, des différentes classes de LDL et de la CRP en rapport avec le syndrome métabolique est incomplète. Utilisant des techniques de traçage in vivo, les mécanismes physiologiques (taux de production et de catabolisme) responsables des variations de concentrations plasmatiques des différents isoformes de l'apoC-III, de la CRP et des LDL petites et denses furent étudiés. Les études sur le métabolisme intravasculaire de l' apoC-III ont démontré que le taux de production de l'ensemble des isoformes de l' apoC-III était positivement associé aux concentrations plasmatiques de triglycérides et que le taux de production de l'isoforme doublement sialylée était fortement associé à la proportion de petites LDL en circulation. L'étude de la cinétique intravasculaire de différentes sousclasses de LDL a révélé que les LDL de moindres densités, malgré ' leur métabolisme intravasculaire rapide, sont les principaux précurseurs des LDL de plus hautes densités. Finalement, l'étude de la CRP révéla que les concentrations plasmatiques de ce marqueur inflammatoire sont déterminées principalement par son taux de production, et que ce dernier serait positivement associé au tour de taille et aux concentrations plasmatiques d'apoB-lOOet de triglycérides, et négativement associé aux concentrations plasmatiques de lipoprotéines de haute densité et d'adiponectine. Dans l'ensemble, ces études in vivo auront permis de mieux situer le rôle métabolique des isoformes de l'apoC-III, des LDL et de la CRP dans le développement du syndrome métabolique et appellent à la réalisation d'études dans divers contextes métaboliques afin de valider les conclusions ici présentées.

Agrégation de l'enseignement supérieur, Orientation sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished