Les sphingolipides (SLs) sont des composants essentiels de la membrane plasmique et des molécules bioactives impliquées dans la régulation de l'apoptose et de la motilité cellulaire induite par les récepteurs de mort (DR). Les altérations du métabolisme sphingolipidique sont fréquentes dans le cancer, incluant le mélanome et le cancer du sein, et semblent contribuer à la progression tumorale. Dans les cellules non cancéreuses, le céramide synthétisé de novo est principalement converti en sphingomyéline (SM) et, dans une moindre mesure, en glucosylcéramide (GlcCer). Notre étude indique que les SM synthases (SMS1 et SMS2) sont peu exprimées dans les biopsies de mélanome humain et une faible expression de SMS1 est associée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de mélanome métastatique. En conséquence, les cellules de mélanome humain ont une faible activité SMS et un contenu plus élevé de GlcCer que de SM. De plus, la restauration de l'homéostasie SM-GlcCer dans les lignées cellulaires de mélanome humain, en exprimant la SMS1 ou en inhibant la GCS, lève la résistance aux ligands pro-apoptotiques des DRs comme CD95L ou TRAIL. Une littérature récente indique que le CD95L pro-apoptotique transmembranaire peut être clivé en un ligand pro-migratoire soluble, le cl-CD95L. La signalisation de motilité des cellules cancéreuses induite par le cl-CD95L reste mal définie. Nous avons identifié la voie de la sphingosine-1-phosphate (S1P) comme une voie sphingolipidique régulée par cl-CD95L. Ainsi, dans les cellules de cancer du sein triple négatif (TNBC), le cl-CD95L induit une augmentation du taux de S1P associée à une augmentation de l'activité de la sphingosine kinase 1 (SK1) et à une diminution de l'activité de la sphingosine-1- phosphate lyase (SPL). L'ensemble de nos résultats souligne le rôle potentiel des SLs dans la régulation des voies de signalisation apoptotique et non-apoptotique activées par les DRs. La reprogrammation du métabolisme des SL pourrait sensibiliser les cellules cancéreuses à CD95L ou TRAIL et/ou inhiber la migration des cellules cancéreuses induite par cl-CD95L. Ces observations expérimentales pourraient permettre le développement de nouvelles approches pour le traitement du mélanome ou du cancer du sein. / Sphingolipids (SLs) are essential plasma membrane components and bioactive molecules implicated in the regulation of death receptor (DR)-mediated apoptosis and cell motility. SL metabolism alterations are frequent in cancer, including melanoma and breast cancer, and likely to contribute to cancer progression. In non-cancer cells, de novo synthesized ceramide is mainly converted to sphingomyelin (SM) and, to a lesser extent, glucosylceramide (GlcCer). Herein, we provide evidence that both SM synthases 1 (SMS1) and 2 (SMS2) were expressed at low levels in human melanoma biopsies and low SMS1 expression was associated with a worse prognosis for metastatic melanoma patients. Accordingly, human melanoma cell lines exhibited low SMS activity and expressed higher content of GlcCer than SM. Importantly, restoring the SM-GlcCer homeostasis in human melanoma cell lines, either by expressing SMS1 or by inhibiting GCS, overcame melanoma resistance to pro-apoptotic DR ligands such as CD95L or TRAIL. A growing body of evidence indicates that the transmembrane pro-apoptotic CD95L can be cleaved to release a pro-migratory soluble ligand, cl-CD95L. The motility signaling pathway elicited in cancer cells by cl-CD95L remains poorly defined. Here, we identified the S1P pathway as a SL pathway regulated by cl-CD95L. In Triple negative breast cancer (TNBC) cells, cl-CD95L induced an augmentation of S1P level associated with increased sphingosine kinase 1 (SK1) activity and decreased sphingosine-1-phosphate lyase (SPL) activity. Collectively, our results underscore the putative role of SLs in the regulation of DR-mediated apoptotic and nonapoptotic signaling pathways. Reprogramming SL metabolism in cancer can sensitize cancer cells to pro-apoptotic CD95L or TRAIL and/or impair cancer cell migration in response to the pro-migratory cl-CD95L. These findings could enable the development of new approaches for the treatment of melanoma and breast cancer.

O arbovírus Oropouche (OROV), da família Peribunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, é importante causador de doença febril nas Américas Central e do Sul. Como outros Orthobunyavirus, OROV é envelopado, com genoma compreendido por três segmentos de RNA de fita simples de polaridade negativa, nomeados de acordo com o seu tamanho, como S (small), M (médio) e L (large). O segmento S codifica a proteína estrutural do nucleocapsideo N e, em uma fase de leitura alternativa, a proteína não estrutural NSs. Apesar da patogênese de OROV ser pouco conhecida, dados obtidos com modelos experimentais murinos indicam que a apoptose desempenha um papel central na morte de células infectadas. Portanto, embora não seja essencial à replicação de OROV, NSs pode desempenhar papeis importantes para a patogênese. Nosso grupo demonstrou previamente que OROV induz apoptose em células HeLa pela via intrínseca, e esse efeito requer a síntese de proteínas virais. No presente estudo objetivamos investigar o papel da proteína NSs de OROV na apoptose induzida em células HeLa. Nós encontramos que a superexpressão da proteína NSs de OROV induz apoptose em diferentes linhagens de células humanas (Glioblastoma, Huh7 e HCE) 24 horas após transfecção. NSs induz apoptose pela via intrínseca, com liberação de citocromo c da mitocôndria, ativação de caspases 9 e 3, e fragmentação de cromatina. Curiosamente, a proteína NSs também induz apoptose pela via extrínseca, confirmada pela detecção de caspase 8 ativada. Um clone infeccioso do OROV sem a proteína NSs (OROVdelNSs) também não induz apoptose em células HeLa até 36 horas pós-infecção, confirmando a importância da proteína NSs para a indução de morte celular por apoptose. A predição da estrutura da proteína NSs revelou a presença de uma sequência de treze aminoácidos na região C-terminal da proteína, que tem similaridade como receptor de TNF. Ensaio de PCR array indicou que a proteína NSs de OROV causa aumento na quantidade de transcritos de TNF em células HeLa. / The arbovirus Oropouche (OROV), of the family Peribunyaviridae, genus Orthobunyavirus, is an important cause of febrile disease in Central and South America. Like other Orthobunyaviruses, OROV is enveloped, with a genome comprised of three segments of single-stranded RNA of negative polarity, named according to their sizes as S (small), M (medium) and L (large). The S segment encodes the structural nucleocapsid N protein and, on an alternative reading frame, the NSs nonstructural protein. Although the pathogenesis of OROV is poorly understood, data obtained from murine experimental models indicate that apoptosis plays a central role in killing infected cells. Therefore, while not essential for the replication of OROV, NSs may play important roles in the pathogenesis. Our group has previously demonstrated that OROV induces apoptosis in HeLa cells via the intrinsic pathway, and this effect requires the synthesis of viral proteins. The present study aimed to investigate the role of OROV protein NSs in apoptosis induced in HeLa cells. We found that overexpression of the NSs protein induces apoptosis in different human cell lines (glioblastoma neuroblastoma and human corneal epithelium) 24 hours after transfection. NSs induces apoptosis by the intrinsic pathway, with release of cytochrome c from mitochondria, activation of caspases 9 and 3, and chromatin fragmentation. Interestingly, the NSs protein also induces activation of caspase 8, an element of the extrinsic pathway of apoptosis. An OROV infectious clone lacking the NSs protein (OROVdelNSs) does not induce apoptosis in HeLa cells up to 36 hours postinfection, confirming the importance of the NSs protein for the induction of cell death by apoptosis. The prediction of the structure of the NSs protein revealed the presence of a sequence of thirteen amino acids in the C-terminal region of the protein, which has similarity as a TNF receptor, and this could shed light into a possible mechanism of apoptosis to be validated by experiments silencing target genes in Hela cells.

Les nanotubes de carbone (NTC) sont difficilement détectables dans les matrices biologiques. Ceci rend l'étude de leur toxicité et de leur biodistribution plus difficile. Lors de ce travail, nous avons étudié, dans un premier temps, l'effet de l'albumine sérique de veau (BSA) sur la dispersion des NTC puis dans un second temps, la toxicité, la biodistribution ainsi que la clairance d'un NTC multi-feuillet (MWCNT) chez le rat en utilisant le nickel, une impureté métallique présente dans le nanotube étudié. Après une unique instillation intratrachéale de 100 μg de MWCNT, nos résultats ne montrent ni inflammation, ni lésions pulmonaires, ni modifications des paramètres physiologiques pulmonaires. De plus, l'absence de passage de la barrière alvéolo-capillaire et la mise en place d'un long mécanisme de clairance ont été observées dans le poumon. Afin de mieux comprendre ce mécanisme et à l'aide de la microscopie electronique et de la spectroscopie infrarouge, nous avons montré que les MWCNT sont chimiquement modifiés et sont clivés dans le poumon. Ces résultats, ainsi que l'étude de la phagocytose des MWCNT et de l'apoptose des macrophages alvéolaires, ont permis d'émettre l'hypothèse d'un mécanisme de clairance selon laquelle l'élimination des MWCNT dans le poumon serait liée à la phagocytose, l'apoptose, la dégradation de MWCNT par les macrophages alvéolaires puis la phagocytose de cellules apoptotiques.

Le but de cette thèse est de développer une stratégie pro-apoptotique à partir des paramètres pouvant moduler l'apoptose photoinduite par le Foscan® dans des modèles précliniques d'adénocarcinome humain. La PDT avec le Foscan® a été appliquée in vitro sur lignées cellulaires où une apoptose modérée a été obtenue via l'implication indirecte de la voie mitochondriale. La modulation de l'apoptose photoinduite par l'oxygénation a été démontrée sur sphéroïde, modèle de micro-tumeur non vascularisée. Une irradiance faible, garantissant le maintien de l'oxygénation du sphéroïde, favorise l'activation de la caspase-3 photoinduite par le Foscan®. Le deuxième paramètre favorisant l'apoptose photoinduite est l'accroissement du temps d'incubation du photosensibilisateur avec les cellules MCF-7, ce qui modifie sa localisation subcellulaire. Après 3h d'incubation, le Foscan® est essentiellement localisé dans le réticulum endoplasmique (RE) et l'appareil de Golgi. Après irradiation, le stress oxydant du RE évalué par l'induction de la protéine chaperone GRP78 suivie de la réponse apoptotique mitochondriale et de l'activation des caspases a été observée. Après 24h d'incubation avec le Foscan®, la localisation dans le RE est renforcée ainsi que l'expression photoinduite de GRP78 corrélée avec une augmentation de l'activation de la caspase-7 indépendamment de la réponse mitochondriale. Après PDT in vivo, l'estimation par immunohistochimie sur coupe tissulaire de l'activation de la caspase-7 et de la caspase-3 montre une activation prédominante de la caspase-3 ce qui suggère une apoptose majoritairement dépendante de la caspase-3 dans les tumeurs d'adénocarcinome colique HT29 traitées par Foscan®-PDT.

Le mésothéliome pleural est un cancer de la plèvre provoqué principalement par linhalation de fibres damiante. Nous avons émis lhypothèse que la dérégulation de lexpression génique est un paramètre important du développement de cette maladie. Or, les histones désacétylases (HDACs) peuvent jouer le rôle de répresseur transcriptionnel en modifiant la conformation de la chromatine. Dans ce contexte, nous avons étudié lactivité anticancéreuse du valproate, un inhibiteur dHDAC, en combinaison avec différents types de traitements utilisés en chimiothérapie. Nous avons démontré leffet synergique entre la chimiothérapie et le valproate dans des lignées cellulaires et dans des biopsies isolées à partir de patients. Nous avons étudié les processus impliqués dans lapoptose et révélé limplication des caspases, des espèces oxygéno-réactives et le rôle important de la protéine Bid. Nous avons ensuite réalisé une étude transcriptomique par microdamiers dans le but de mieux caractériser les mécanismes impliqués. Enfin, nous avons démontré lefficacité du valproate dans un modèle préclinique murin. Ces recherches ont permis la mise en place dun essai clinique de deuxième ligne sur des patients réfractaires à une première chimiothérapie.

Les méthodes classiques de traitement contre le cancer, telle que la chimiothérapie (CT), sont utilisées dans le but d'enrayer la tumeur. L'Adriamycine (ADR ou doxorubicine), un agent anticancéreux, agirait entre autres en s'intercalant entre les bases d'ADN, en inhibant la topoisomérase II et en causant la production de stress oxydatif. Plusieurs effets secondaires indésirables seraient reliés à l'utilisation de ADR comme par exemple la cardiotoxicité à des doses cumulatives de 500 mg/m². Une autre limite importante du traitement de CT est la résistance pléiotropique aux médicaments (MDR), qui peut être causée entre autres par la surexpression de protéines de résistance aux médicaments tel que la MRP, Les protéines MRP, comme la MRP l, expulseraient ADR hors des cellules tumorales ce qui diminuerait son efficacité et nécessiterait l'élévation de la dose optimale de traitement, causant ainsi une augmentation de la toxicité aux tissus sains. L'hyperthermie (HT) qui consiste à élever artificiellement la température tumorale (40 à 45°C), permettrait de contourner ce phénomène MDR et ciblerait les cellules tumorales sans affecter les cellules saines. HT sensibiliserait les cellules résistantes et non résistantes aux agents anticancéreux, en augmentant la perméabilité membranaire, l'accumulation intracellulaire des agents de CT, et en inhibant la réparation de l'ADN. CT et HT mèneraient à la mort des cellules cancéreuses par activation de l'apoptose. Cependant, les mécanismes apoptotiques spécifiquement impliqués dans la mort des cellules cancéreuses lors de traitement par ADR et/ou HT ne sont pas entièrement connus et ont tenté d'être éclaircis dans le cadre de ce projet tant chez les cellules d'adénocarcinomes cervicaux non résistants (HeLa) que résistants (HeLa MRP+). Dans cette étude, la voie du récepteur de mort Fas a été la voie apoptotique d'intérêt. C'est pourquoi l'implication des différentes protéines apoptotiques de cette voie ont été étudiées comme le récepteur Fas ainsi que son ligand (FasL), la protéine adaptatrice de domaine de mort associée à Fas (FADD), les caspases 8 et 3. De plus, la recherche des causes d'activation de la voie du récepteur Fas a mené à l'investigation des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Lors de la présente étude, une augmentation de l'expression membranaire de FasL, de FADD ainsi que de l'activité de la caspase 8 ont été observées suite au traitement par ADR (après 1, 2 et 8 h respectivement). Les résultats obtenus montrent une activation précoce de la voie des récepteurs de mort après 1 à 2 h, contrairement à celle de la voie mitochondriale qui serait plus tardive après 18 h. La phase d'exécution de l'apoptose se produit après 18 h d'exposition. La quantification des ROS chez les HeLa exposées à ADR a montré que l'anion superoxyde (O2°-) serait le ROS principalement produit. Cette production pourrait activer la voie des récepteurs de mort puisqu'elle serait la cause de l'augmentation de l'expression de FasL. En effet, l'ajout d'un antioxydant (Mn TBAP) mène à l'inhibition de la production d'O2°-, de l'expression de FasL et diminue l'activité de la caspase 8. Les résultats démontrent également que l'utilisation de HT favoriserait l'apoptose des cellules HeLa et HeLa MRP+ exposées à ADR, via un mécanisme apoptotique induit par l'augmentation de la production d'O2°-. Les résultats obtenus ont permis de mieux comprendre les mécanismes apoptotiques impliqués par l'exposition à l'ADR et/ou HT. La compréhension de ces mécanismes est critique dans le développement de nouvelles stratégies, visant à augmenter l'efficacité des traitements contre le cancer. De plus, cette étude démontre également que HT peut augmenter l'efficacité du traitement par l' ADR en sensibilisant les cellules cancéreuses résistantes et non résistantes. Ce qui fait de HT, un traitement adjuvant prometteur qui permettrait de contrer le phénotype MDR et d'augmenter l'efficacité du traitement de CT, tout en diminuant les doses optimales, la toxicité aux tissus sains et les effets secondaires indésirables qui compromettre sérieusement la qualité de vie du patient. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Chimiothérapie, Adriamycine, Résistance pléiotropique aux médicaments, MRP1, Hyperthermie, Apoptose.

Les maladies pulmonaires graves touchent plus de 3 millions de Canadiens, indépendamment de leur âge ou de leur sexe. Parmi ces maladies, nous retrouvons l'asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), le cancer du poumon et la fibrose kystique. Ces dernières peuvent être déclenchées par la présence chronique d'un stress oxydatif et par conséquent, elles font partie des pathologies associées à une exposition à l'acroléine. On retrouve l'acroléine dans notre alimentation et dans les produits de combustion organique. L'acroléine, un aldéhyde alpha,beta-insaturé très réactif, est également une des substances toxiques qui résulte de la peroxydation des lipides endogènes, lors d'un stress oxydatif. Notre laboratoire a évalué les mécanismes toxiques de l'acroléine induits in vitro, en utilisant la lignée cellulaire A549. Le choix de ce modèle cellulaire pour l'étude provient du fait qu'elles sont des cellules humaines, d'origine pulmonaire, soit le premier organe ciblé par une exposition à l'acroléine. Cette étude vise donc à comprendre les mécanismes impliqués dans l'induction de la mort cellulaire par apoptose: 1) la voie des récepteurs de mort, 2) la voie du « cross-talk » et 3) la voie mitochondriale induites par l'acroléine. L'exposition des cellules A549 à des doses d'acroléine de 0 à 50 µM a activé la voie des récepteurs de mort. L'acroléine a causé une augmentation d'expression du ligand FasL (FasL) et a induit la translocation de la protéine associée au domaine de mort de Fas (FADD) et du récepteur de protéine (RlP) à la membrane cytoplasmique, en plus de l'activation des caspases initiatrices 2 et 8. Par ailleurs, cette exposition a causé une augmentation du domaine interagissant par BH3 tronqué (tBid) à la mitochondrie. Il semble que l'acroléine peut déclencher la voie du « cross-talk » par l'activation des caspases-2 et -8, qui clivent la protéine Bid en tBid. Pour ce qui est de la voie mitochondriale, l'acroléine a causé une hyperpolarisation de la membrane mitochondriale et une surproduction d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Notre étude a aussi démontré que l'acroléine a induit l'activation de p53, la translocation de la protéine X associée à Bcl-2 (Bax) à la mitochondrie, le relâchement du cytochrome c dans le cytosol, l'activation de la caspase initiatrice 9 et la translocation du facteur inducteur d'apoptose (AlF) au noyau. De plus, l'inhibition des ROS générées par l'acroléine grâce à l'antioxydant PEG-catalase, a empêché l'augmentation de l'expression totale du FasL, l'hyperpolarisation de la membrane mitochondriale ainsi que l'activation des caspases -3 et -8. Par conséquent, les ROS sont préalablement requises pour que l'acroléine induise l'apoptose par la voie des récepteurs de mort et par la voie mitochondriale, chez les cellules A549. En conclusion, l'acroléine peut induire les trois voies apoptotiques étudiées chez ces cellules. L'acroléine provoque l'exécution de l'apoptose via l'activation des caspases effectrices -3, -6 et -7, l'externalisation de la phosphatidylsérine, la condensation de la chromatine et le clivage de la polyADP-ribose polymérase (PARP). Par contre, l'acroléine induit aussi certains mécanismes de survie cellulaire comme l'augmentation de la phosphorylation d'AKT, de Bad et de l'expression des clAP 1/2. Même si les protéines antiapoptotiques sont activées, l'acroléine peut encore induire la mort cellulaire par apoptose chez les cellules A549. Ces recherches sont pertinentes dans plusieurs contextes de toxicité à l'acroléine tels que l'action pharmacologique et/ou les effets secondaires de la cyclophosphamide, un agent anticancéreux où l'acroléine est l'un de ses métabolites, la régulation de la prolifération cellulaire et de la croissance tumorale par les polyamines, la maladie d'Alzheimer, ainsi que la toxicité causée par les expositions environnementales à de faibles doses d'acroléine. Cependant, il est important de poursuivre les recherches pour améliorer nos connaissances sur les mécanismes de toxicité de cet aldéhyde, considérant l'étendue de l'exposition des humains à l'acroléine. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Acroléine, Apoptose, Caspase, Mitochondrie, Récepteurs de mort.

De nombreuses pathologies du système nerveux sont associées à une augmentation de l'apolipoprotéineD (apoD), une lipocaline également exprimée au cours du développement normal et du vieillissement. Un gène homologue de l'apoD chez la drosophile a un rôle protecteur dans les situations de stress et son absence réduit la résistance au stress oxydatif et accélère la neurodégénerescence. Notre équipe a été la première à démontrer le rôle protecteur de l'apoD chez les vertèbrés (souris) face à l'encéphalite induite par le cornavirus humain OC43 et aussi face au stress oxydatif induit par le paraquat. Afin de démontrer davantage l'effet bénéfique de l'apoD dans les situations pathologiques du système nerveux central, on a induit la neurodégénerescence en injectant l'acide kaïnique chez des souris transgéniques qui surexpriment l'apoD et des souris témoins non-transgéniques. L'acide kaïnique (analogue du glutamate) est un acide aminé excitateur dont l'activation des récepteurs dans le cerveau cause la dépolarisation des neurones et finalement la mort neuronale par apoptose (mimant la maladie d'Alzheimer). Ainsi ce modèle nous permettra de mesurer l'effet protecteur de l'apoD contre l'apoptose. Suite à l'injection intrapéritonéale, nous avons observé que l'acide kaïnique provoque des crises épileptiques chez les deux groupes de souris peu après l'injection; une légère différence concernant le taux et la gravité des convulsions entre les transgéniques et les non-transgéniques a été détectée. Cependant nous avons démontré par des analyses de type Northern, des immunobuvardages et par RT-PCR semi-quantitatif que l'acide kaïnique induit la surexpression de l'apoD endogène et provoque l'activation des cellules gliales (GFAP) dans l'hippocampe et le cervelet des souris au troisième jour après l'injection. Par contre, on a remarqué la présence de la cyclooxygénase-2 (inflammation) seulement dans l'hippocampe et le cortex de certaines souris (les souris ayant des très fortes convulsions) et son absence totale dans le cervelet. Nous avons aussi montré par la méthode TUNEL que l'acide kaïnique induit l'apoptose dans le cortex, le cervelet et surtout dans l'hippocampe, la zone la plus endommagée dans la maladie d'Alzheimer. Chez les souris transgéniques surexprimant l'apoD, dans les mêmes conditions, il y a moins d'apoptose comparativement aux souris de type sauvage, donc l'apoD pourrait jouer un rôle en modulant l'apoptose ainsi que protéger les neurones en prévenant l'apoptose. Les résultats obtenus au cours de différentes étapes de ce projet, tout d'abord mettent au point un modèle animal de neurodégénérescence associé à une surexpression de l'apoD et ensuite révèlent un autre aspect mal connu de rôle protecteur de l'apoD dans la régulation d'apoptose induite par l'acide kaïnique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Apolipoprotéine D, Neurodégénérescence, Acide kaïnique, Transgénique, TUNEL, Alzheimer, Apoptose.

L'exploitation des terres à des fins agricoles entraîne la présence de nombreux contaminants dans les milieux naturels, ce qui peut nuire à la faune qu'on y retrouve. Nous avons émis l'hypothèse que la présence de contaminants agricoles aurait un impact sur le métabolisme osseux du ouaouaron (Rana catesbeiana), puisque des difformités au niveau des pattes avaient auparavant été observées chez certains individus. Les grenouilles ont été capturées à l'été 2008 en six sites situés aux abords de la rivière Yamaska et choisis selon un gradient d'activité agricole. Elles ont par la suite été disséquées et leurs fémurs et phalanges ont été analysés à l'aide d'une technique d'imagerie numérique, grâce à l'appareil Skyscan 1172. Les phalanges des individus ont été analysées en histologie afin d'estimer leur âge par squelettochronologie. Une analyse sérique des principaux marqueurs du métabolisme osseux a aussi été effectuée. Nos résultats ont démontré que l'activité de la phosphatase alcaline augmentait en fonction du gradient d'exploitation agricole, supposant une atteinte hépatique. Aussi, les ouaouarons provenant du site de plus forte activité agricole présentaient un volume osseux réduit au niveau de la portion trabéculaire de la phalange, ainsi que de la portion corticale du fémur. De plus, les grenouilles capturées à ce site étaient significativement plus jeunes. Nous avons aussi voulu vérifier l'impact de certains pesticides au niveau cellulaire, en utilisant la lignée ostéoblastique murine MC3T3-E1 et la lignée ostéoblastique humaine MG-63. Il s'est avéré que l'atrazine et le métolachlore n'étaient pas cytotoxiques pour les cellules aux concentrations utilisées. Par contre, l'endosulfan, un pesticide organochloré, a été démontré cytotoxique, sa CL50 ayant été mesurée à 42,4µM. Nous avons par la suite tenté de documenter son mécanisme de toxicité par des mesures au cytofluoromètre. Nous avons pu démontrer par un marquage aux sondes PI et Annexine V que l'endosulfan induisait l'apoptose et la nécrose. De plus, le potentiel mitochondrial subit une dépolarisation forte et rapide après traitement à l'endosulfan, ce qui a été mesuré grâce à la sonde JC-1. Bien que l'apoptose soit induite par l'endosulfan et que le potentiel mitochondrial chute, nous n'avons pas été en mesure de mettre en évidence la production de ROS par marquage à la sonde H2DCFDA. Par contre, l'ajout de trois antioxydants différents, soit la vitamine C, la vitamine E et la N-acétyl-cystéine au milieu de culture a significativement réduit la mortalité, ce qui laisse présumer que la production de ROS serait à la base du mécanisme de toxicité de ce pesticide, mais que le marquage au H2DCFDA n' aurait pu le révéler. Le métabolisme osseux est souvent ignoré lors d'études toxicologiques. Ce projet ayant permis de révéler l'impact de contaminants agricoles sur le métabolisme osseux du ouaouaron ainsi que sur des cellules ostéoblastiques indique que cet aspect ne devrait pas être négligé lors de futures études. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : ostéoblaste, apoptose, endosulfan, ouaouaron, pesticides.

Une faible exposition à des stress tels qu'un choc thermique, du stress oxydatif ou des radiations peut induire une réponse adaptative qui permet aux cellules et aux organismes qu'elles constituent de continuer à fonctionner normalement lorsqu'ils sont confrontés à un stimulus négatif. Ces réponses adaptatives impliquent de nombreux changements dans l'expression de gènes et de protéines, dont l'induction de défenses cellulaires (antioxydants, protéines de choc thermique (heat shock proteins (Hsps)), etc.) qui permettront à la cellule de survivre. Si une réponse adaptative ne parvient pas à contrer les effets de l'exposition au stress, les cellules sont éliminés via des processus de mort cellulaire comme l'apoptose ou la nécrose. Une exposition préalable à des températures modérées, de l'ordre de 40°C, induit une réponse adaptative (la thermotolérance) qui permet aux cellules de résister à une agression toxique ultérieure. La thermotolérance induite par des températures modérées de l'ordre de 39-40°C (ce qui correspond physiologiquement à un état fiévreux) a été peu étudiée et est mal comprise. Les deux objectifs principaux de cette étude sont : (i) d'évaluer si l'induction d'un système de défense par une température modérée et non-létale (40°C) peut permettre de protéger la cellule contre l'activation de la cascade apoptotique par le stress oxydatif, et (ii) de comprendre les mécanismes moléculaires détaillés de l'apoptose induite par le stress oxydatif. L'apoptose est évaluée au niveau des voies de signalisation médiées par les mitochondries, des récepteurs de mort et le réticulum endoplasmique (RE) dans des cellules HeLa. L'objectif premier est de déterminer si un choc thermique modéré peut induire un mécanisme de défense cellulaire autre que les Hsps. En effet, une thermotolérance modérée (40°C, 3h) induit une augmentation du taux de plusieurs antioxydants et protéines de stress du RE. L'expression protéique et l'activité enzymatique de la manganèse superoxyde dismutase (MnSOD) et de la catalase sont augmentées dans les cellules thermotolérantes, comparées aux contrôles (37°C). Les niveaux intracellulaires de glutathion et de y-glutamylcysteine synthétase, l'enzyme qui synthétise le glutathion, sont aussi augmentés. Ceci peut être expliqué par l'augmentation de la production de dérivés réactifs de l'oxygène (reactive oxygen species, ROS) dans les cellules thermotolérantes. De plus, l'expression des protéines de stress du RE, PERK, p-PERK, eIF2α et p-eIF2α, est accrue dans ces cellules. Cela démontre que la thermotolérance modérée accroit les effets pro-survie de la voie PERK/eIF2α de réponse aux mauvais repliements de protéines (unfolded protein response, UPR). Le second objectif a pour but de déterminer les mécanismes de l'apoptose induite par le stress oxydatif. Lorsqu'elles sont exposées à du peroxyde d'hydrogène (H2O2), les cellules entrent en apoptose via les voies des mitochondries, des récepteurs de mort et du RE. L'activation de la cascade mitochondriale de l'apoptose implique la translocation de Bax à la mitochondrie, la dépolarisation de la membrane mitochondriale, la libération du cytochrome c, l'activation des caspases -9 et -3 et la condensation de la chromatine du noyau. De plus, H2O2 cause l'activation de p53 et l'induction de sa protéine cible PUMA, ainsi que l'apoptose caspase-indépendante impliquant le facteur d'induction de l'apoptose (AIF). Ces évènements sont tous inhibés dans les cellules thermotolérantes, ce qui suggère qu'une exposition préalable à des températures modérées et physiologiques peut protéger les cellules contre l'apoptose mitochondriale déclenchée par le stress oxydatif, qu'elle soit caspase-dépendante ou -indépendante. De plus, H2O2 active la voie d'apoptose du Fas récepteur de mort par l'induction du ligand FasL, le recrutement de la protéine FADD à la membrane plasmique et l'activation des caspases -8 et -2. Ceci mène au clivage de Bid et à la voie mitochondriale de l'apoptose. Tous ces évènements sont diminués dans les cellules thermotolérantes, ce qui démontre une fois de plus le rôle anti-apoptotique de cette réponse adaptative. L'induction de FasL, l'activation des caspases -8 et -2 et l'apoptose sont inhibées par pifithrin-α, un inhibiteur de p53, ce qui suggère que p53 agit en amont dans l'activation de la voie des death receptors par H2O2. Une exposition courte (15 min) des cellules au H2O2 donne lieu à l'activation de l'UPR, comme le confirment l'augmentation de l'expression de p-PERK, p-eIF2α, p-IRE1α et du clivage de ATF6. Une exposition plus longue (1-3 h) au H2O2 induit l'apoptose liée au RE, durant laquelle l'expression de CHOP ainsi que l'activité enzymatique de la calpaïne et des caspase -7, -4, -12 et -3 augmentent. Tous ces évènements pro-apoptotiques sont diminués dans les cellules thermotolérantes. Il a été montré que le calcium, la calpaïne et la caspase -7 agissent en amont de l'activation de l'apoptose liée au RE par H2O2. De plus, la réponse adaptative (UPR) prédomine lors d'expositions courtes au H2O2 (stress léger) tandis que lors d'expositions plus longues (stress sévère), c'est l'apoptose liée au RE qui est la plus fréquente. En conclusion, cette étude permet d'ajouter aux connaissances sur l'effet anti-apoptotique et protecteur de la réponse adaptative induite par un stress modéré, tel une fièvre, sur le stress oxydatif. Cette étude améliore également notre compréhension de l'activation de la cascade apoptotique par le pro-oxydant H2O2, cascade qui a d'importantes répercussions sur la santé humaine si l'on considère le rôle des ROS dans les pathologies majeures que sont le cancer, le diabète, les maladies cardiovasculaires ou encore les maladies neurodégénératives. ______________________________________________________________________________