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O arbovírus Oropouche (OROV), da família Peribunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, é importante causador de doença febril nas Américas Central e do Sul. Como outros Orthobunyavirus, OROV é envelopado, com genoma compreendido por três segmentos de RNA de fita simples de polaridade negativa, nomeados de acordo com o seu tamanho, como S (small), M (médio) e L (large). O segmento S codifica a proteína estrutural do nucleocapsideo N e, em uma fase de leitura alternativa, a proteína não estrutural NSs. Apesar da patogênese de OROV ser pouco conhecida, dados obtidos com modelos experimentais murinos indicam que a apoptose desempenha um papel central na morte de células infectadas. Portanto, embora não seja essencial à replicação de OROV, NSs pode desempenhar papeis importantes para a patogênese. Nosso grupo demonstrou previamente que OROV induz apoptose em células HeLa pela via intrínseca, e esse efeito requer a síntese de proteínas virais. No presente estudo objetivamos investigar o papel da proteína NSs de OROV na apoptose induzida em células HeLa. Nós encontramos que a superexpressão da proteína NSs de OROV induz apoptose em diferentes linhagens de células humanas (Glioblastoma, Huh7 e HCE) 24 horas após transfecção. NSs induz apoptose pela via intrínseca, com liberação de citocromo c da mitocôndria, ativação de caspases 9 e 3, e fragmentação de cromatina. Curiosamente, a proteína NSs também induz apoptose pela via extrínseca, confirmada pela detecção de caspase 8 ativada. Um clone infeccioso do OROV sem a proteína NSs (OROVdelNSs) também não induz apoptose em células HeLa até 36 horas pós-infecção, confirmando a importância da proteína NSs para a indução de morte celular por apoptose. A predição da estrutura da proteína NSs revelou a presença de uma sequência de treze aminoácidos na região C-terminal da proteína, que tem similaridade como receptor de TNF. Ensaio de PCR array indicou que a proteína NSs de OROV causa aumento na quantidade de transcritos de TNF em células HeLa. / The arbovirus Oropouche (OROV), of the family Peribunyaviridae, genus Orthobunyavirus, is an important cause of febrile disease in Central and South America. Like other Orthobunyaviruses, OROV is enveloped, with a genome comprised of three segments of single-stranded RNA of negative polarity, named according to their sizes as S (small), M (medium) and L (large). The S segment encodes the structural nucleocapsid N protein and, on an alternative reading frame, the NSs nonstructural protein. Although the pathogenesis of OROV is poorly understood, data obtained from murine experimental models indicate that apoptosis plays a central role in killing infected cells. Therefore, while not essential for the replication of OROV, NSs may play important roles in the pathogenesis. Our group has previously demonstrated that OROV induces apoptosis in HeLa cells via the intrinsic pathway, and this effect requires the synthesis of viral proteins. The present study aimed to investigate the role of OROV protein NSs in apoptosis induced in HeLa cells. We found that overexpression of the NSs protein induces apoptosis in different human cell lines (glioblastoma neuroblastoma and human corneal epithelium) 24 hours after transfection. NSs induces apoptosis by the intrinsic pathway, with release of cytochrome c from mitochondria, activation of caspases 9 and 3, and chromatin fragmentation. Interestingly, the NSs protein also induces activation of caspase 8, an element of the extrinsic pathway of apoptosis. An OROV infectious clone lacking the NSs protein (OROVdelNSs) does not induce apoptosis in HeLa cells up to 36 hours postinfection, confirming the importance of the NSs protein for the induction of cell death by apoptosis. The prediction of the structure of the NSs protein revealed the presence of a sequence of thirteen amino acids in the C-terminal region of the protein, which has similarity as a TNF receptor, and this could shed light into a possible mechanism of apoptosis to be validated by experiments silencing target genes in Hela cells.

O vírus Oropouche pertence à família Bunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, sorogrupo Simbu, e é segunda causa mais freqüente de arbovirose febril no Brasil. Estima-se que mais de meio milhão de casos de febre do Oropouche tenham ocorrido no Brasil nos últimos 30 anos, havendo também ocorrências no Panamá, Peru, Suriname e Trinidad. Epidemias de febre do Oropouche têm sido registradas quase que exclusivamente na Amazônia. Porém, com o aquecimento global do planeta, desmatamentos e conseqüente redistribuição de insetos vetores e animais reservatórios, há risco de disseminação de vírus Oropouche para outras regiões do Brasil e da América do Sul. A patogenia da infecção por Oropouche não é bem entendida. Modelo em roedores, usando inoculação intracerebral, tem sido descrito, mas não com uso da via subcutânea, que mais se assemelha à rota natural da infecção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer e caracterizar um modelo experimental de infecção com Oropouche, usando inoculação subcutânea em hamster, a fim de contribuir para o entendimento da patogenia do mesmo. Oropouche da linhagem BeAn19991, passado em cérebro de camundongo recém-nascido, foi inoculado (106,25 TCID50/100?L) por via subcutânea na coxa de hamsters sírios com 2-3 semanas de idade. Em torno de 3 dias alguns animais desenvolveram doença com sinais clínicos brandos caracterizados por: eriçamento dos pêlos e agressividade, outros com características mais graves: perda de peso, tremores sugestivos de calafrios, letargia e paralisia. Os animais foram sacrificados 1, 3, 5, 8 e 11 dias pós-inoculação ou quando eram encontrados em estado agônico. Baço, cérebro, coração, fígado, músculo e sangue foram colhidos para titulação viral, histologia e imunohistoquímica. Infiltrado inflamatório estava presente no cérebro, principalmente em torno dos vasos, meninges e discretamente no coração. O vírus Oropouche foi detectado no tecido cerebral (107,23 TCID50/g), no fígado (106,67TCID50/g) e no sangue (106 TCID50/g). Antígeno de Oropouche foi encontrado, difusamente no fígado, associado com hepatócitos e em neurônios de diversos locais do cérebro. Este modelo reproduz uma infecção sistêmica por Oropouche e pode tornar-se útil no estudo da patogênese, bem como para testar drogas antivirais e possíveis candidatos à vacina. / Oropouche virus belongs to the family Bunyaviridae, genus Orthobunyavirus, serogroup Simbu and is the second most frequent arboviral febrile illness in Brazil. There are estimates of more than half million cases of Oropouche fever in Brazil in the past 30 years, with cases registered in Panama, Peru, Suriname and Trinidad. Oropouche fever has been registered almost exclusively in the Amazon, but with the global warming, deforestation and the consequent redistribution of vectors and reservoir animals, the risk of Oropouche virus dissemination to others areas of Brazil and South America increases. However, the pathogenesis of Oropouche infection is not well understood. Rodent models using intracerebral inoculation have been described, but no attempts to use a route that more closely resembles the natural route of infection have been published. This study was conducted to establish and characterize an experimental model of infection with Oropouche, using subcutaneous inoculation of hamsters, in order to contribute to the understanding of Oropouche pathogenesis. We have established an experimental model through subcutaneous inoculation of hamsters in order to study pathogenesis. Suckling mouse brain passaged Oropouche strain BeAn19991 was inoculated (106,25 TCID50/100?L) subcutaneously in the thigh of syrian hamsters 2-3 weeks old. Around day 3 animals developed disease characterized by lethargy, paralysis, chill-like shaking and ruffled fur. Animals were sacrificed on days 1, 3, 5, 8 and 11 post-inoculation or whenever found to be agonic. Brain, heart, liver, spleen, muscle and blood were harvested for virus titration, histology and Oropouche immunohistochemistry. Inflammatory infiltrate was present in the brain, mostly as perivascular cuffs, meninges and some in the heart. Oropouche titers were 107,23 TCID50/g of tissue in brain 106,67 TCID50/g in liver, and 106 TCID50/g in blood. Oropouche antigen was detected diffusely distributed in the liver in association with hepatocytes, and in neurons in several regions of the brain. This model reproduces systemic Oropouche infection and may become useful in pathogenesis studies, as well as to test antiviral drugs and possible vaccine candidates.

O arbovírus Oropouche (OROV), da família Peribunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, é importante causador de doença febril nas Américas Central e do Sul. Como outros Orthobunyavirus, OROV é envelopado, com genoma compreendido por três segmentos de RNA de fita simples de polaridade negativa, nomeados de acordo com o seu tamanho, como S (small), M (médio) e L (large). O segmento S codifica a proteína estrutural do nucleocapsideo N e, em uma fase de leitura alternativa, a proteína não estrutural NSs. Apesar da patogênese de OROV ser pouco conhecida, dados obtidos com modelos experimentais murinos indicam que a apoptose desempenha um papel central na morte de células infectadas. Portanto, embora não seja essencial à replicação de OROV, NSs pode desempenhar papeis importantes para a patogênese. Nosso grupo demonstrou previamente que OROV induz apoptose em células HeLa pela via intrínseca, e esse efeito requer a síntese de proteínas virais. No presente estudo objetivamos investigar o papel da proteína NSs de OROV na apoptose induzida em células HeLa. Nós encontramos que a superexpressão da proteína NSs de OROV induz apoptose em diferentes linhagens de células humanas (Glioblastoma, Huh7 e HCE) 24 horas após transfecção. NSs induz apoptose pela via intrínseca, com liberação de citocromo c da mitocôndria, ativação de caspases 9 e 3, e fragmentação de cromatina. Curiosamente, a proteína NSs também induz apoptose pela via extrínseca, confirmada pela detecção de caspase 8 ativada. Um clone infeccioso do OROV sem a proteína NSs (OROVdelNSs) também não induz apoptose em células HeLa até 36 horas pós-infecção, confirmando a importância da proteína NSs para a indução de morte celular por apoptose. A predição da estrutura da proteína NSs revelou a presença de uma sequência de treze aminoácidos na região C-terminal da proteína, que tem similaridade como receptor de TNF. Ensaio de PCR array indicou que a proteína NSs de OROV causa aumento na quantidade de transcritos de TNF em células HeLa. / The arbovirus Oropouche (OROV), of the family Peribunyaviridae, genus Orthobunyavirus, is an important cause of febrile disease in Central and South America. Like other Orthobunyaviruses, OROV is enveloped, with a genome comprised of three segments of single-stranded RNA of negative polarity, named according to their sizes as S (small), M (medium) and L (large). The S segment encodes the structural nucleocapsid N protein and, on an alternative reading frame, the NSs nonstructural protein. Although the pathogenesis of OROV is poorly understood, data obtained from murine experimental models indicate that apoptosis plays a central role in killing infected cells. Therefore, while not essential for the replication of OROV, NSs may play important roles in the pathogenesis. Our group has previously demonstrated that OROV induces apoptosis in HeLa cells via the intrinsic pathway, and this effect requires the synthesis of viral proteins. The present study aimed to investigate the role of OROV protein NSs in apoptosis induced in HeLa cells. We found that overexpression of the NSs protein induces apoptosis in different human cell lines (glioblastoma neuroblastoma and human corneal epithelium) 24 hours after transfection. NSs induces apoptosis by the intrinsic pathway, with release of cytochrome c from mitochondria, activation of caspases 9 and 3, and chromatin fragmentation. Interestingly, the NSs protein also induces activation of caspase 8, an element of the extrinsic pathway of apoptosis. An OROV infectious clone lacking the NSs protein (OROVdelNSs) does not induce apoptosis in HeLa cells up to 36 hours postinfection, confirming the importance of the NSs protein for the induction of cell death by apoptosis. The prediction of the structure of the NSs protein revealed the presence of a sequence of thirteen amino acids in the C-terminal region of the protein, which has similarity as a TNF receptor, and this could shed light into a possible mechanism of apoptosis to be validated by experiments silencing target genes in Hela cells.

O vírus Oropouche pertence à família Bunyaviridae, gênero Orthobunyavirus, sorogrupo Simbu, e é segunda causa mais freqüente de arbovirose febril no Brasil. Estima-se que mais de meio milhão de casos de febre do Oropouche tenham ocorrido no Brasil nos últimos 30 anos, havendo também ocorrências no Panamá, Peru, Suriname e Trinidad. Epidemias de febre do Oropouche têm sido registradas quase que exclusivamente na Amazônia. Porém, com o aquecimento global do planeta, desmatamentos e conseqüente redistribuição de insetos vetores e animais reservatórios, há risco de disseminação de vírus Oropouche para outras regiões do Brasil e da América do Sul. A patogenia da infecção por Oropouche não é bem entendida. Modelo em roedores, usando inoculação intracerebral, tem sido descrito, mas não com uso da via subcutânea, que mais se assemelha à rota natural da infecção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer e caracterizar um modelo experimental de infecção com Oropouche, usando inoculação subcutânea em hamster, a fim de contribuir para o entendimento da patogenia do mesmo. Oropouche da linhagem BeAn19991, passado em cérebro de camundongo recém-nascido, foi inoculado (106,25 TCID50/100?L) por via subcutânea na coxa de hamsters sírios com 2-3 semanas de idade. Em torno de 3 dias alguns animais desenvolveram doença com sinais clínicos brandos caracterizados por: eriçamento dos pêlos e agressividade, outros com características mais graves: perda de peso, tremores sugestivos de calafrios, letargia e paralisia. Os animais foram sacrificados 1, 3, 5, 8 e 11 dias pós-inoculação ou quando eram encontrados em estado agônico. Baço, cérebro, coração, fígado, músculo e sangue foram colhidos para titulação viral, histologia e imunohistoquímica. Infiltrado inflamatório estava presente no cérebro, principalmente em torno dos vasos, meninges e discretamente no coração. O vírus Oropouche foi detectado no tecido cerebral (107,23 TCID50/g), no fígado (106,67TCID50/g) e no sangue (106 TCID50/g). Antígeno de Oropouche foi encontrado, difusamente no fígado, associado com hepatócitos e em neurônios de diversos locais do cérebro. Este modelo reproduz uma infecção sistêmica por Oropouche e pode tornar-se útil no estudo da patogênese, bem como para testar drogas antivirais e possíveis candidatos à vacina. / Oropouche virus belongs to the family Bunyaviridae, genus Orthobunyavirus, serogroup Simbu and is the second most frequent arboviral febrile illness in Brazil. There are estimates of more than half million cases of Oropouche fever in Brazil in the past 30 years, with cases registered in Panama, Peru, Suriname and Trinidad. Oropouche fever has been registered almost exclusively in the Amazon, but with the global warming, deforestation and the consequent redistribution of vectors and reservoir animals, the risk of Oropouche virus dissemination to others areas of Brazil and South America increases. However, the pathogenesis of Oropouche infection is not well understood. Rodent models using intracerebral inoculation have been described, but no attempts to use a route that more closely resembles the natural route of infection have been published. This study was conducted to establish and characterize an experimental model of infection with Oropouche, using subcutaneous inoculation of hamsters, in order to contribute to the understanding of Oropouche pathogenesis. We have established an experimental model through subcutaneous inoculation of hamsters in order to study pathogenesis. Suckling mouse brain passaged Oropouche strain BeAn19991 was inoculated (106,25 TCID50/100?L) subcutaneously in the thigh of syrian hamsters 2-3 weeks old. Around day 3 animals developed disease characterized by lethargy, paralysis, chill-like shaking and ruffled fur. Animals were sacrificed on days 1, 3, 5, 8 and 11 post-inoculation or whenever found to be agonic. Brain, heart, liver, spleen, muscle and blood were harvested for virus titration, histology and Oropouche immunohistochemistry. Inflammatory infiltrate was present in the brain, mostly as perivascular cuffs, meninges and some in the heart. Oropouche titers were 107,23 TCID50/g of tissue in brain 106,67 TCID50/g in liver, and 106 TCID50/g in blood. Oropouche antigen was detected diffusely distributed in the liver in association with hepatocytes, and in neurons in several regions of the brain. This model reproduces systemic Oropouche infection and may become useful in pathogenesis studies, as well as to test antiviral drugs and possible vaccine candidates.

Submitted by Gizele Lima (gizele.lima@inpa.gov.br) on 2016-09-01T13:41:33Z No. of bitstreams: 2 dissertacao_Luis_versao_final.pdf: 15102445 bytes, checksum: 19cf08353dc3d5342446786c90e35595 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T13:41:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertacao_Luis_versao_final.pdf: 15102445 bytes, checksum: 19cf08353dc3d5342446786c90e35595 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-05-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Ceratopogonidae family possesses four hematophagics genus: Forcipomyia, Leptoconops, Austroconops and Culicoides. The Culicoides are insects with 3mm in length, the female are vectors of helminths, protozoan and virus. The main arboviruses transmitted are Oropouche virus, endemic of amazon basin and Bluetongue Virus, which affects both wildlife and domestic livestocks. The convenience collections were done on Alvorada do Oeste, Buritis, Cacoal, Costa Marques, Espigão do Oeste, Guajará-Mirim, Pimenta Bueno, São Francisco Guaporé and Porto Velho municipalities, in Rondônia state through HP light traps between 18:00 and 06:00. Systematic collections were made in Porto Velho municipality on forest and pasture environments. Were collected 2,196 Culicoides (1,515 females and 681 males) distributed throughout 43 species and 27 morfotypes. The species most frequent were Culicoides insignis (n=1,594; 72.59%), C. foxi (n=76; 3.46%), C. hildebrandoi (n=53; 2.41%), C. leopoldoi (n=44; 2%), C. ocumarensis (n=34; 1.55%), C. pusillus (n=29; 1.32%) and C. glabrior (n=28; 1.28%). There were 37 news records of species in Rondônia and three for Brazil. The municipalities with greatest richness were Porto Velho (56), Cacoal (26) e Costa Marques (14). The municipalities with lowest richness were Espigão do Oeste (4), Buritis (3) and Alvorada do Oeste (2). Species with greatest distribution were C. foxi and C. leopoldoi. In Porto Velho were collected 1,773 individuals (1,179 female and 594 males), collected 228 individuals and 51 species in forest, and collected 1,545 individuals and 19 species in pasture. The most abundant species were C. insignis (n=1,472; 83%), C. foxi (n=45; 2.5%), C. glabrior (n=25; 1.4%) and C. ocumarensis (n=23; 1.3%). The forest presented most richness (41 species) and pasture presented greatest abundance (1,545 individuals). In Pasture the most abundant species were C. insignis (1,457-94.30%), C. foxi (34-2.20%) and C. ocumarensis (14-0.90%), and Forest the most abundant species were C. glabrior (25-10.96%), C. insignis (15-6.57%) e C. tetrathyris (15-6.57%). Diversity of species and eveness on Forest environment were greatest than Pasture environment. There was significant statistical difference (p=0.02) on species composition per environment. Diagnoses of some individuals of Rondônia were made. The findings of species of Culicoides on Rondônia now contribute to the total of 46 species, representing 36.8% of amazon species. The species C. darlingtonae, C. contubernalis e C. rodriguezi contribute for ampliation of geographic distribution this species and increase of amazon species fauna. The wide distribution of C. foxi and C. leopoldoi suggest that this species are ecletics for ecotypes and blood meal sources (chicken, livestock and human). The high abundance of C. insignis indicates that feeding behavior on mammals can be one of the factors contributing to the high number of individuals on light traps when placed near blood meal sources. Low number of individuals of C. paraensis on rural areas suggests that this specie is little attracted to light traps due to its diurnal or anthropophilic and urban habit that this species has. In Porto Velho, greatest abundance of C. insignis on Pasture can is related to the wet and muddy substrate with decaying organic matter, which favors the development of immature. The greatest diversity in forest can be explained by water bodies, wetlands, undergrowth, fruit peels present in this breeding sites, which makes it conducive to the proliferation and maintenance of Culicoides species. The diagnosis of the main morphotypes shows differences and similarities in relation to species already described, indicating possible new species for the state of Rondônia. / A família Ceratopogonidae possui quatro gêneros hematófagos: Forcipomyia, Leptoconops, Austroconops e Culicoides. Os Culicoides são insetos com até 3 mm de tamanho, as fêmeas são vetores de helmintos, protozoários e vírus. As principais arboviroses transmitidas são Oropouche, endêmica da bacia amazônica e Vírus da Língua Azul, que acomete bovinos silvestres e domésticos. As coletas de conveniência foram realizadas nos municípios de Alvorada do Oeste, Buritis, Cacoal, Costa Marques, Espigão do Oeste, Guajará-Mirim, Pimenta Bueno e São Francisco Guaporé, no estado de Rondônia, por meio de armadilhas luminosas HP entre 18:00 e 06:00. As coletas sistemáticas foram feitas no município de Porto Velho nos ambientes de floresta e pasto. Foram capturados 2.196 indivíduos, (1.515 fêmeas e 681 machos), distribuídos em 43 espécies e 27 morfótipos. As espécies mais frequentes foram Culicoides insignis (n=1.594; 72,59%), C. foxi (n=76; 3,46%), C. hildebrandoi (n=53; 2,41%), C. leopoldoi (n=44; 2%), C. ocumarensis (n=34; 1,55%), C. pusillus (n=29; 1,32%) e C. glabrior (n=28; 1,28%). Houve 37 novos registros de espécies em Rondônia e três novos registros para o Brasil. Os municípios com maior riqueza foram Porto Velho (56), Cacoal (26) e Costa Marques (14). Os municípios com menor de número de espécies foram Espigão do Oeste (4), Buritis (3) e Alvorada do Oeste (2). As espécies com maior distribuição foram C. foxi e C. leopoldoi. No município de Porto Velho foram capturados 1.773 indivíduos (1.179 fêmeas e 594 machos), sendo coletados 228 espécimens e 51 espécies em floresta, e 1.545 indivíduos e 19 espécies em pasto. As espécies mais abundantes foram C. insignis (1.472; 83%), C. foxi (45; 2,5%), C. glabrior (25; 1,4%) e C. ocumarensis (23; 1,3%). Floresta apresentou maior riqueza (41) e o pasto apresentou maior abundância (n=1.545). No pasto as espécies mais abundantes foram C. insignis (1.457-94,30%), C. foxi (34-2,20%) e C. ocumarensis (14-0,90%), e em floresta as mais abundantes foram C. glabrior (25-10,96%), C. insignis (15-6,57%) e C. tetrathyris (15-6,57%). A diversidade de espécies e a homogeneidade foram maiores em área de floresta do que o ambiente pasto. Houve diferença estatística significativa (p=0,02) na composição de espécies por ambiente. Foram realizadas diagnoses de alguns morfótipos de Rondônia. O achado de espécies de Culicoides em Rondônia contribui agora para o total de 46 espécies, representando 36,8% das espécies amazônicas. As espécies C. darlingtonae, C. contubernalis e C. rodriguezi contribuem para a ampliação da distribuição geográfica dessas espécies e o incremento da fauna de espécies amazônicas. A ampla distribuição de C. foxi e C. leopoldoi sugere que essas espécies são ecléticas às opções de ecótopos e fontes de repasto (galinhas, gados e humanos). A alta abundância de C. insignis indica que o comportamento alimentar sobre os mamíferos pode ser um dos fatores que contribui para o elevado número de indivíduos em armadilhas luminosas, quando colocadas próximas a fontes de repasto. O baixo número de C. paraensis na zona rural sugere que essa espécie é pouco atraída às armadilhas luminosas devido a seu hábito diurno ou ao hábito antropofílico e urbano que essa espécie apresenta. Em Porto Velho, a maior abundância de C. insignis em pasto pode está relacionado ao substrato úmido e enlameado com matéria orgânica em decomposição, que favorece o desenvolvimento de imaturos. A maior diversidade em floresta pode ser explicada pelos corpos d’água, brejos, serrapilheira, cascas de frutas presentes neste ecótopo, que torna propício à proliferação e manutenção de espécies de Culicoides. A diagnose dos principais morfótipos mostra diferenças e semelhanças em relação às espécies já descritas, indicando possíveis espécies novas para o estado de Rondônia.

Submitted by Inácio de Oliveira Lima Neto (inacio.neto@inpa.gov.br) on 2018-07-13T18:47:44Z No. of bitstreams: 2 dissertacao_Luis_versao_final.pdf: 15102445 bytes, checksum: 19cf08353dc3d5342446786c90e35595 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-13T18:47:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertacao_Luis_versao_final.pdf: 15102445 bytes, checksum: 19cf08353dc3d5342446786c90e35595 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-05-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The Ceratopogonidae family possesses four hematophagics genus: Forcipomyia, Leptoconops, Austroconops and Culicoides. The Culicoides are insects with 3mm in length, the female are vectors of helminths, protozoan and virus. The main arboviruses transmitted are Oropouche virus, endemic of amazon basin and Bluetongue Virus, which affects both wildlife and domestic livestocks. The convenience collections were done on Alvorada do Oeste, Buritis, Cacoal, Costa Marques, Espigão do Oeste, Guajará-Mirim, Pimenta Bueno, São Francisco Guaporé and Porto Velho municipalities, in Rondônia state through HP light traps between 18:00 and 06:00. Systematic collections were made in Porto Velho municipality on forest and pasture environments. Were collected 2,196 Culicoides (1,515 females and 681 males) distributed throughout 43 species and 27 morfotypes. The species most frequent were Culicoides insignis (n=1,594; 72.59%), C. foxi (n=76; 3.46%), C. hildebrandoi (n=53; 2.41%), C. leopoldoi (n=44; 2%), C. ocumarensis (n=34; 1.55%), C. pusillus (n=29; 1.32%) and C. glabrior (n=28; 1.28%). There were 37 news records of species in Rondônia and three for Brazil. The municipalities with greatest richness were Porto Velho (56), Cacoal (26) e Costa Marques (14). The municipalities with lowest richness were Espigão do Oeste (4), Buritis (3) and Alvorada do Oeste (2). Species with greatest distribution were C. foxi and C. leopoldoi. In Porto Velho were collected 1,773 individuals (1,179 female and 594 males), collected 228 individuals and 51 species in forest, and collected 1,545 individuals and 19 species in pasture. The most abundant species were C. insignis (n=1,472; 83%), C. foxi (n=45; 2.5%), C. glabrior (n=25; 1.4%) and C. ocumarensis (n=23; 1.3%). The forest presented most richness (41 species) and pasture presented greatest abundance (1,545 individuals). In Pasture the most abundant species were C. insignis (1,457-94.30%), C. foxi (34-2.20%) and C. ocumarensis (14-0.90%), and Forest the most abundant species were C. Glabrior (25-10.96%), C. insignis (15-6.57%) e C. tetrathyris (15-6.57%). Diversity of species and eveness on Forest environment were greatest than Pasture environment. There was significant statistical difference (p=0.02) on species composition per environment. Diagnoses of some individuals of Rondônia were made. The findings of species of Culicoides on Rondônia now contribute to the total of 46 species, representing 36.8% of amazon species. The species C. Darlingtonae, C. contubernalis e C. rodriguezi contribute for ampliation of geographic distribution this species and increase of amazon species fauna. The wide distribution of C. foxi and C. leopoldoi suggest that this species are ecletics for ecotypes and blood meal sources (chicken, livestock and human). The high abundance of C. insignis indicates that feeding behavior on mammals can be one of the factors contributing to the high number of individuals on light traps when placed near blood meal sources. Low number of individuals of C. paraensis on rural areas suggests that this specie is little attracted to light traps due to its diurnal or anthropophilic and urban habit that this species has. In Porto Velho, greatest abundance of C. insignis on Pasture can is related to the wet and muddy substrate with decaying organic matter, which favors the development of immature. The greatest diversity in forest can be explained by water bodies, wetlands, undergrowth, fruit peels present in this breeding sites, which makes it conducive to the proliferation and maintenance of Culicoides species. The diagnosis of the main morphotypes shows differences and similarities in relation to species already described, indicating possible new species for the state of Rondônia. / A família Ceratopogonidae possui quatro gêneros hematófagos: Forcipomyia, Leptoconops, Austroconops e Culicoides. Os Culicoides são insetos com até 3 mm de tamanho, as fêmeas são vetores de helmintos, protozoários e vírus. As principais arboviroses transmitidas são Oropouche, endêmica da bacia amazônica e Vírus da Língua Azul, que acomete bovinos silvestres e domésticos. As coletas de conveniência foram realizadas nos municípios de Alvorada do Oeste, Buritis, Cacoal, Costa Marques, Espigão do Oeste, Guajará-Mirim, Pimenta Bueno e São Francisco Guaporé, no estado de Rondônia, por meio de armadilhas luminosas HP entre 18:00 e 06:00. As coletas sistemáticas foram feitas no município de Porto Velho nos ambientes de floresta e pasto. Foram capturados 2.196 indivíduos, (1.515 fêmeas e 681 machos), distribuídos em 43 espécies e 27 morfótipos. As espécies mais frequentes foram Culicoides insignis (n=1.594; 72,59%), C. foxi (n=76; 3,46%), C. hildebrandoi (n=53; 2,41%), C. leopoldoi (n=44; 2%), C. ocumarensis (n=34; 1,55%), C. pusillus (n=29; 1,32%) e C. glabrior (n=28; 1,28%). Houve 37 novos registros de espécies em Rondônia e três novos registros para o Brasil. Os municípios com maior riqueza foram Porto Velho (56), Cacoal (26) e Costa Marques (14). Os municípios com menor de número de espécies foram Espigão do Oeste (4), Buritis (3) e Alvorada do Oeste (2). As espécies com maior distribuição foram C. foxi e C. leopoldoi. No município de Porto Velho foram capturados 1.773 indivíduos (1.179 fêmeas e 594 machos), sendo coletados 228 espécimens e 51 espécies em floresta, e 1.545 indivíduos e 19 espécies em pasto. As espécies mais abundantes foram C. Insignis (1.472; 83%), C. foxi (45; 2,5%), C. glabrior (25; 1,4%) e C. ocumarensis (23; 1,3%). Floresta apresentou maior riqueza (41) e o pasto apresentou maior abundância (n=1.545). No pasto as espécies mais abundantes foram C. insignis (1.457-94,30%), C. foxi (34-2,20%) e C. ocumarensis (14-0,90%), e em floresta as mais abundantes foram C. glabrior (25-10,96%), C. Insignis (15 6,57%) e C. tetrathyris (15-6,57%). A diversidade de espécies e a homogeneidade foram maiores em área de floresta do que o ambiente pasto. Houve diferença estatística significativa (p=0,02) na composição de espécies por ambiente. Foram realizadas diagnoses de alguns morfótipos de Rondônia. O achado de espécies de Culicoides em Rondônia contribui agora para o total de 46 espécies, representando 36,8% das espécies amazônicas. As espécies C. darlingtonae, C. contubernalis e C. rodriguezi contribuem para a ampliação da distribuição geográfica dessas espécies e o incremento da fauna de espécies amazônicas. A ampla distribuição de C. foxi e C. leopoldoi sugere que essas espécies são ecléticas às opções de ecótopos e fontes de repasto (galinhas, gados e humanos). A alta abundância de C. Insignis indica que o comportamento alimentar sobre os mamíferos pode ser um dos fatores que contribui para o elevado número de indivíduos em armadilhas luminosas, quando colocadas próximas a fontes de repasto. O baixo número de C. paraensis na zona rural sugere que essa espécie é pouco atraída às armadilhas luminosas devido a seu hábito diurno ou ao hábito antropofílico e urbano que essa espécie apresenta. Em Porto Velho, a maior abundância de C. insignis em pasto pode está relacionado ao substrato úmido e enlameado com matéria orgânica em decomposição, que favorece o desenvolvimento de imaturos. A maior diversidade em floresta pode ser explicada pelos corpos d’água, brejos, serrapilheira, cascas de frutas presentes neste ecótopo, que torna propício à proliferação e manutenção de espécies de Culicoides. A diagnose dos principais morfótipos mostra diferenças e semelhanças em relação às espécies já descritas, indicando possíveis espécies novas para o estado de Rondônia.

Objective: To evaluate the frequency of infection caused by the Oropouche virus (OROV) in 496 patients with acute febrile disease (AFI), whose samples were obtained for the analysis of endemic arboviruses in a previous investigation carried out in 2016. Results: OROV was detected in 26.4% (131/496) of serum samples from patients with AFI. Co-infections with Dengue virus (7.3%), Zika virus (1.8%) and Chikungunya (0.2%) were observed. The most common clinical symptoms reported among the patients with OROV infections were headache 85.5% (112/131), myalgia 80.9% (106/131), arthralgia 72.5% (95/131) and loss of appetite 67.9% (89/131). Headache and myalgia were predominant in all age groups. Both OROV infections and co-infections were more frequent in May, June and July corresponding to the dry season of the region. / Revisión por pares

O vírus Oropouche (OROV) é um arbovírus que ocorre na região amazônica causando surtos de doenças febris agudas e que, ocasionalmente, podem ser associados a meningoencefalite. Aproximadamente 500.000 casos de Oropouche teriam ocorrido no Brasil. Entretanto, não existe vacina contra o OROV. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo animal de infecção por OROV para estudar a patogênese da doença e um modelo para testar candidatas vacinais. Protótipo vacinal utilizando a proteína recombinante do nucleocapsídeo (N) de OROV (NrOROV), que é o principal antígeno viral, foi usado como potencial candidato para vacina. Neste estudo utilizou-se um modelo animal em camundongos Balb/c de 12 semanas de idade, inoculados intracerebralmente com 8x105 PFU de OROV, capaz de induzir 100% de letalidade após o terceiro dia da infecção. Altos títulos virais foram encontrados no cérebro e na medula espinhal dos animais. Surpreendentemente, 12 e 24 horas pós-infecção foi possível detectar vírus no fígado e baço (3 Log10 PFU/g) dos camundongos. Com este modelo foram testados os candidatos vacinais. Grupos de camundongos foram imunizados 3 vezes com OROV, OROV e FCA, NrOROV, NrOROV e FCA, NrOROV, Poli I:C e Montanide ISA 720. Após 3 imunizações, os animais foram desafiados com 10 LD50 de OROV e observados por 20 dias. Os animais imunizados com NrOROV e adjuvantes, não foram capazes de produzir anticorpos neutralizantes e adquirir imunidade protetora contra OROV enquanto que os imunizados com OROV apresentaram altos níveis de anticorpos neutralizantes e completa proteção in vivo. Ainda, os anticorpos produzidos pelos animais imunizados permitiram estudar o ciclo de replicação celular do OROV utilizando imunofluorescência. / Oropouche (OROV) is an arbovirus that occurs in the South American, Amazon region, producing outbreaks of acute febrile illness occasionally associated to meningoencephalitis. Approximately 500,000 cases of Oropouche have been reported in Brazil in the last 60 years. However, there is no available vaccine for OROV. We show here the development of an animal model of OROV suitable for studies on pathogenesis and vaccine testing. A vaccine prototype based on recombinant OROV nucleocapsid protein (NrOROV), an important viral antigen, was evaluated in the animal model. Initialy, we observed that all 12-week-old Balb/c mice inoculated intracerebrally with 8x105 PFU died after the third day of infection. Surprisingly, OROV genome was detectable in the liver as early as 12 hours post infection (pi) and in the spleen at 24 hours pi at 3 log10 PFU/g. Besides, high viral titers were found in brain and spinal cord. To test the NrOROV as a vaccine candidate, animals divided in 5 groups were immunized subcutaneously 3 times, two weeks apart with either OROV, OROV and Freud complete Adjuvant (FCA), NrOROV, NrOROV and FCA, NrOROV and Poly I:C and Montanide ISA 720. The experiment also included a group of naïve animals. After the third immunization, the animals were challenged with 10LD50 by intracerebral route and followed for 20 days. The animals immunized with NrOROV and adjuvants developed specific antibodies that were not able to neutralize the virus or confer protective immunity against OROV. Nevertheless, mice immunized with OROV showed high levels of neutralizing and protective antibodies. Despite the discouraging results with NrOROV as a vaccine, the mouse model is suitable to study pathogenesis, and to test other vaccines for OROV.

O vírus Oropouche (OROV) é um arbovírus que ocorre na região amazônica causando surtos de doenças febris agudas e que, ocasionalmente, podem ser associados a meningoencefalite. Aproximadamente 500.000 casos de Oropouche teriam ocorrido no Brasil. Entretanto, não existe vacina contra o OROV. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo animal de infecção por OROV para estudar a patogênese da doença e um modelo para testar candidatas vacinais. Protótipo vacinal utilizando a proteína recombinante do nucleocapsídeo (N) de OROV (NrOROV), que é o principal antígeno viral, foi usado como potencial candidato para vacina. Neste estudo utilizou-se um modelo animal em camundongos Balb/c de 12 semanas de idade, inoculados intracerebralmente com 8x105 PFU de OROV, capaz de induzir 100% de letalidade após o terceiro dia da infecção. Altos títulos virais foram encontrados no cérebro e na medula espinhal dos animais. Surpreendentemente, 12 e 24 horas pós-infecção foi possível detectar vírus no fígado e baço (3 Log10 PFU/g) dos camundongos. Com este modelo foram testados os candidatos vacinais. Grupos de camundongos foram imunizados 3 vezes com OROV, OROV e FCA, NrOROV, NrOROV e FCA, NrOROV, Poli I:C e Montanide ISA 720. Após 3 imunizações, os animais foram desafiados com 10 LD50 de OROV e observados por 20 dias. Os animais imunizados com NrOROV e adjuvantes, não foram capazes de produzir anticorpos neutralizantes e adquirir imunidade protetora contra OROV enquanto que os imunizados com OROV apresentaram altos níveis de anticorpos neutralizantes e completa proteção in vivo. Ainda, os anticorpos produzidos pelos animais imunizados permitiram estudar o ciclo de replicação celular do OROV utilizando imunofluorescência. / Oropouche (OROV) is an arbovirus that occurs in the South American, Amazon region, producing outbreaks of acute febrile illness occasionally associated to meningoencephalitis. Approximately 500,000 cases of Oropouche have been reported in Brazil in the last 60 years. However, there is no available vaccine for OROV. We show here the development of an animal model of OROV suitable for studies on pathogenesis and vaccine testing. A vaccine prototype based on recombinant OROV nucleocapsid protein (NrOROV), an important viral antigen, was evaluated in the animal model. Initialy, we observed that all 12-week-old Balb/c mice inoculated intracerebrally with 8x105 PFU died after the third day of infection. Surprisingly, OROV genome was detectable in the liver as early as 12 hours post infection (pi) and in the spleen at 24 hours pi at 3 log10 PFU/g. Besides, high viral titers were found in brain and spinal cord. To test the NrOROV as a vaccine candidate, animals divided in 5 groups were immunized subcutaneously 3 times, two weeks apart with either OROV, OROV and Freud complete Adjuvant (FCA), NrOROV, NrOROV and FCA, NrOROV and Poly I:C and Montanide ISA 720. The experiment also included a group of naïve animals. After the third immunization, the animals were challenged with 10LD50 by intracerebral route and followed for 20 days. The animals immunized with NrOROV and adjuvants developed specific antibodies that were not able to neutralize the virus or confer protective immunity against OROV. Nevertheless, mice immunized with OROV showed high levels of neutralizing and protective antibodies. Despite the discouraging results with NrOROV as a vaccine, the mouse model is suitable to study pathogenesis, and to test other vaccines for OROV.