Resumo: As aranhas do gênero loxoceles são espalhadas mundialmente e suas picadas podem se manifestar em indivíduos de duas formas, primeiro como quadro cutâneo ou dermonecrótico e segundo como quadro sistêmico, sendo consideradas como problema de saúde pública. Independente da espécie da aranha, o veneno pode causar dermonecrose, hemólise, disfunção renal e resposta inflamatória sistêmica. De acordo com estudos, um importante componente do veneno responsável por hemólise e dermonecrose é a Fosfolipase D. Os objetivos deste trabalho foram avaliar os efeitos diretos e sistêmicos da toxina recombinante Fosfolipase D (PLD) em músculos papilares, anéis de aorta e corações isolados perfundidos. Avaliamos em músculo cardíaco e liso de ratos Wistar parâmetros de contratilidade como geração de força e pressão, velocidade máxima de contração e de relaxamento. Nossos estudos demonstraram que em corações isolados de animais pré-tratados, a administração intraperitoneal de fosfolipase D reduziu o valor máximo de pressão intraventricular, a velocidade máxima de relaxamento (-dP/dt). Não foram observados efeitos diretos da toxina em parâmetros de contratilidade de músculos papilares isolados e anéis de aorta. Esses dados sugerem que o efeito da Fosfolipase D é decorrente de sua ação sistêmica.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Sanches Veiga / Coorientador : Prof. Dr. Olga Meiri Chaim / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 25/02/2016 / Inclui referências : f. 33-34;53-61 / Área de concentração :Biologia Celular e Molecular / Resumo: Loxoscelismo é a denominação do quadro clínico provocado em pacientes picados por aranhas do gênero Loxosceles, caracterizado principalmente por causar lesão dermonecrótica com intensa resposta inflamatória no local da picada, e raramente ocorrem manifestações sistêmicas, como distúrbios renais e hematológicos. O veneno loxoscélico é um líquido cristalino e incolor composto essencialmente por proteínas e peptídeos entre 5 a 40kDa, contendo cerca de 30?g de proteínas. Sabe-se que as toxinas da família das fosfolipases-D são capazes de desencadear a maioria dos efeitos biológicos causados pelo envenenamento, tornando-se necessário o aprofundamento da ação completa desta toxina. Algumas isoformas de fosfolipases-D de veneno de aranha-marrom já foram identificadas e biologicamente caracterizadas. Após análise do transcriptoma da glândula produtora de veneno de Loxosceles intermedia, algumas prováveis novas isoformas desta toxina foram identificadas e, entre elas, uma se destacou por sua presença em proporção relevante. O objetivo deste trabalho foi a clonagem, expressão heteróloga e purificação desta nova isoforma de toxina dermonecrótica, de modo a permitir sua avaliação biológica por testes in vitro e in vivo. A partir de técnicas de biologia molecular, foi possível obter a sequência nucleotídica e, por sua vez, aminoacídica completas da LiRecDT7, relatando que esta possui uma substituição conservativa no resíduo de aminoácido Asp233'Glu233. Houve pouco rendimento na expressão da toxina recombinante na forma solúvel e o processo de purificação por cromatografia mostrou-se pouco eficiente. Os testes de atividade esfingomielinásica sugerem que esta toxina como enzima está ativa. Os resultados obtidos até o presente demonstram que esta toxina é uma nova isoforma de fosfolipase-D presente no veneno de L. intermedia. Ainda assim, o processo de expressão e purificação devem ser otimizados, para avaliá-la biologicamente, contribuindo para a compreensão da composição do veneno dessa espécie, além de ser mais uma alternativa de ferramenta com potencial de aplicação biotecnológica. Palavras-chave: aranha, Loxosceles intermedia, veneno, fosfolipase-D / Abstract: Loxoscelism is the name of the clinical picture provoked in patients bitten by Loxosceles spiders. It is mainly characterized by dermonecrotic lesions with an intense inflammatory response at the site of the bite, and rarely systemic manifestations such as renal and hematological disorders. The venom produced by Loxosceles spiders is a crystalline, colorless liquid consisting mainly of proteins and peptides between 5 and 40kDa. It is known that the phospholipase-D family of toxins present in this venom is capable of causing most of the biological effects observed in accidents with the spiders. Some isoforms of phospholipases-D have been identified in the Loxosceles venom and biologically characterized. Transcriptome analysis of the venom gland of Loxosceles intermedia revealed some potential novel isoforms of this toxin and among them, one stood out for its presence in significant proportion. The aim of this work was the cloning, heterologous expression and purification of this new isoform of dermonecrotic toxin, named LiRecDT7, to allow their biological evaluation by in vitro and in vivo analysis. Using molecular biology techniques, it was possible to obtain the nucleotide sequence and, in turn, the complete amino acid sequence of LiRecDT7. Further analysis showed a conservative substitution at amino acid residue Glu233'Asp233. The expression of recombinant toxin in soluble form resulted in a low yield and the process of purification by chromatography proved to be inefficient. Nevertheless, preliminary assays that tested the sphingomyelinasic activity of LiRecDT7 suggest that this toxin is active as an enzyme. The results show that LiRecDT7 is a new isoform of phospholipase-D present in the venom of L. intermedia. Still, the expression and purification process must be optimized to allow further assessments. Thus, the results will help to expand the knowledge concerning the composition of the venom of this species, besides being an alternative tool with potential biotechnological applications. Key-words: spider, Loxosceles intermedia, venom, phospholipase-D

Resumo: O conteúdo total do veneno das aranhas do gênero Loxosceles permanece ainda desconhecido, entretanto, muitos estudos têm mostrado que se constitui uma mistura complexa de compostos biologicamente ativos. Por meio de análises eletroforéticas, observa-se a predominância de moléculas de baixa massa molecular (3-45 kDa), enquanto moléculas de alta massa molecular são menos abundantes. Os venenos de aranhas estão funcionalmente relacionados à defesa contra predadores e também à paralisia e captura de presas, especialmente insetos. As aranhas desenvolveram um arsenal de moléculas inseticidas, resultando em uma biblioteca combinatória de peptídeos que tem sido aprimorada durante sua evolução. Comumente, tais peptídeos consistem em moléculas de cadeia única com massa molecular variando de 3 a 10 kDa, ricos em resíduos de cisteína, os quais estabelecem pontes dissulfeto intramoleculares características. Essas pontes se organizam em um motivo estrutural característico denominado "nó de cistina inibidor" ou ICK (Inhibitor Cystine Knot) e, por isso, os peptídeos que o contém são denominados notinas ("knottins"). Recentemente, análises do transcriptoma da glândula de veneno de L. intermedia (GREMSKI et al., 2010) revelaram ESTs com similaridade a notinas previamente descritas como LiTx (De CASTRO et al., 2004). Sequências relacionadas à LiTx3 foram as mais abundantes no transcriptoma de L. intermedia, representando aproximadamente 13,9% de todas as ESTs obtidas e compreendendo 32% dos mRNAs codificantes de toxinas. Devido a alta proporção de sequências codificantes para peptídeos semelhantes a LiTx3, o presente estudo teve como objetivo a clonagem e expressão de um peptídeo dessa família. Primers foram desenhados para a realização das técnicas de 3' e 5' RACE, o qual teve como resultado a obtenção da sequência nucleotídica completa do cDNA correspondente ao peptídeo em estudo. A sequência do propeptídeo associado ao peptídeo maduro foi amplificada e modificada por PCR com primers contendo sítios de restrição para as enzimas XhoI e BamHI e inseridos no vetor de expressão pET-14b. A construção foi transformada em cepa de E. coli AD494(DE3). Um teste de expressão foi realizado para determinar as condições ótimas de expressão do peptídeo. Verificou-se que a indução com 0,5mM de IPTG, por 3 horas e meia, a 30oC era a melhor condição de expressão. A partir desse resultado, uma expressão em larga escala foi realizada, obtendo-se o peptídeo recombinante na fração solúvel, após cromatografia de afinidade em resina de Ni2+-NTA. A diversidade de peptídeos presentes no veneno de L. intermedia representa uma fonte importante de possíveis novas ferramentas moleculares com aplicação farmacológica e/ou biotecnológica.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Ecologia, Programa de Pós-Graduação em Ecologia, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-21T12:59:38Z No. of bitstreams: 1 2014_ViniciusSouzaMoraes.pdf: 2342611 bytes, checksum: c471cb76f0b15c1ec894738940a88733 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-21T14:17:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ViniciusSouzaMoraes.pdf: 2342611 bytes, checksum: c471cb76f0b15c1ec894738940a88733 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-21T14:17:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ViniciusSouzaMoraes.pdf: 2342611 bytes, checksum: c471cb76f0b15c1ec894738940a88733 (MD5) / Perceber e entender os fatores que determinam e regulam a diversidade das espécies é uma das questões centrais em ecologia. Padrões e processos são pouco documentados para o efeito bottom-up, para o qual podemos citar duas hipóteses principais acerca dos fatores que estariam regulando a diversidade de espécies: hipótese da diversidade taxonômica e hipótese da heterogeneidade estrutural. A primeira hipótese é abordada em diversos estudos com diferentes grupos taxonômicos e ambientes, como a resposta de invertebrados a estrutura da vegetação, sendo que entre os grupos de organismos mais sujeitos aos efeitos da arquitetura do hábitat estão os artrópodes. A vegetação é um elemento que proporciona complexidade estrutural ao hábitat. Plantas abrigam diferentes composição de guildas de aranhas e estas diferenças podem ser em decorrência às variáveis relacionadas com a arquitetura destes hábitats, pois as estratégias de caça adotadas por diferentes guildas de aranhas tem uma forte relação com a estrutura da vegetação. Neste trabalho avaliamos a relação entre os aspectos da estrutura dos ramos arbóreos, densidade foliar do ramo, área foliar, distância nodal com a composição da assembleia de aranhas, levando em consideração sua classificação em guildas. Também foi feita uma comparação dessas medidas entre o cerrado sensu stricto e a mata de galeria, assim como a comparação dos resultados das correlações entre as variáveis de arquitetura e composição das assembleias para estas fitofisionomias. O objetivo foi perceber a relação da arquitetura de ramos arbóreos com a assembleia de aranhas. O trabalho foi realizado na Fazenda Água Limpa (DF) e no Parque Estadual da Serra de Caldas Novas (GO), utilizando o guarda-chuva-entomológico como técnica de coleta. Foram amostrados 182 pontos, sendo 84 em mata de galeria e 98 em cerrado sensu stricto. Foram coletadas 1512 aranhas, das quais 10,52% eram adultas. As famílias mais abundantes foram Anyphaenidae e Salticidae (aranhas caçadoras corredoras), seguidas por Theridiidae (guilda das construtoras de teias irregulares), a qual pertence Thwaitesia affinis, a espécie mais abundante. Nenhuma espécie foi comum a duas fitofisionomias. As duas fitofisionomias são similares na abundância total de aranhas, mas diferem nas abundâncias das guildas. Matas de galeria apresentam maior abundância de aranhas construtoras de teias, enquanto que no cerrado sensu stricto são mais abundantes aranhas que caçam ativamente forrageando na superfície foliar. As guildas de construtoras de teia se correlacionam com a distância entre os nós das folhas, sugerindo a necessidade de espaço maior para construção das teias. A correlação entre as aranhas caçadoras corredoras e o índice de densidade foliar indica que ramos mais densos abrigam maior abundância dessas aranhas que necessitam de superfície foliar para forragear. A abundância de aranhas caçadoras cursoriais pode depender diretamente da densidade foliar, principalmente no cerrado sensu stricto. Este estudo corroborou a hipótese de que a heterogeneidade arquitetural da vegetação pode influenciar significativamente a estruturação da assembleia de aranhas, podendo exercer um efeito bottom-up sobre a assembleia de aranhas. / Perceive and understand the factors that determine and regulate the diversity of species is one of the central questions in ecology. Standards and processes are poorly documented for the bottom-up effect, for which we can mention two main hypotheses about the factors that would be regulating species diversity: (1) hypothesis of taxonomic diversity and (2) hypothesis of structural heterogeneity. The hypothesis of structural heterogeneity has been gaining attention in many studies with different taxonomic groups and environments, such as the invertebrate response to vegetation structure, and between groups of organisms more susceptible to the effects of habitat architecture are arthropods. The vegetation is an element that provides the habitat structural complexity, because can represent a whole plant habitat, and small variations in its architecture can have consequences in the community structure and foraging efficiency, for example, Spiders. Plants harboring different composition of spider guilds and these differences may be due to the variables related to the architecture of these habitats, because the hunting strategies adopted by different guilds of spiders has a strong relationship with the vegetation structure. Since the importance of vegetation structure in the composition of the assembly of spiders, especially as the hunting strategies adopted by these, this study evaluated the relationship between aspects of the structure of arboreal branches, leaf density branch, leaf area, nodal distance with composition of the board of spiders, taking into account their classification into guilds. There was also a comparison of these architectural measures between points collected in the cerrado sensu stricto and gallery forest, as well as comparing the results of correlations between variables architecture and composition of meetings for each of the two forest types. The objective was to understand the relationship of tree branches architecture with the assembly of spiders. The study was conducted at Fazenda Água Limpa and the Parque Estadual da Serra de Caldas Novas. The vegetation types sampled outside the gallery forest and the cerrado sensu stricto and the collection technique was the umbrella-entomological with a square meter. In total, we sampled 182 points in 84 gallery forest and 98 in cerrado sensu stricto. Spiders were collected in 1512 in total, of which the most abundant families were Anyphaenidae, Salticidae and Theridiidae, the first two belonging to the guild runners hunting spiders (CO) and the third the guild of builders irregular webs (IT). Of this total, 10.52% were adults and individuals were identified in kind, Thwaitesia affinis being the most abundant species. No species was common to two forest types. The results of the Analyzes Redundancy showed correlations between the web construction of guilds and the distance between the nodes of the leaves, suggesting that cobwebs need more space for building them, and correlation between hunting spiders runners and the density index leaf, indicating that more dense branches harbor greater abundance of these spiders in need of leaf surface to forage. A regression shows that plenty of cursorias hunting spiders can depend directly leaf density, especially in the cerrado sensu stricto. We also found that there was a significant difference between the composition of guilds and between the values of the architectural variables between the two forest types. This study supported the hypothesis that the architectural heterogeneity of vegetation can significantly influence the structure of the assembly of spiders. Correlations were found between architecture variables and guilds, and the guild of spiders hunting runners seems to be dependent of the leaf density of branches. However, to the guilds of the study spiders webs of construction must be done with an analysis on a larger scale and with more architectural variables of vegetation so that we can find the strongest correlation of these guilds. To the union of hunting spiders by ambush should also be evaluated other factors so that we can find a correlation. Anyway, this work shows that the architecture of vegetation can have a bottom-up effect on the assembly of spiders.

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Resumo: No Paraná, ocorrem apenas quatro espécies de aranhas do gênero Loxosceles: L. gaucho, L. laeta, L. hirsuta e L. intermedia, sendo essa ultima espécie a mais abundante em Curitiba-PR e região metropolitana. Essas aranhas também são conhecidas como aranhas-marrons devido a sua coloração que varia de marrom claro a marrom escuro. Atualmente, acidentes com aranha-marrom é um problema de saúde publica devido aos inúmeros casos de envenenamento. O veneno dessas aranhas já foi caracterizado e diversas toxinas foram estudadas. Contudo, a hemolinfa de Loxosceles nunca foi pesquisada e de forma geral a hemolinfa de artrópodes é pouco investigada. Hemolinfa de diferentes animais tem sido alvo de estudos que envolvem diversas aplicações biotecnológicas, tais inibição de proteases e aplicação dos peptídeos antimicrobianos nas áreas médicas. Portanto, esse trabalho teve como objetivo determinar as características bioquímicas e biológicas da hemolinfa da aranha-marrom L. intermedia. A hemolinfa de L. intermedia apresentou um perfil proteico com amplo espectro de proteínas. O componente proteico mais representativo foi identificado na região de 66 kDa. Alguns autores mostraram que essa região refere-se às subunidades de hemocianina, que é a proteína mais abundante na hemolinfa dos artrópodes. Além disso, o perfil proteico apresentou outras duas bandas bem características da hemolinfa de outros artrópodes em 116 e 97 kDa. O perfil em gel 2D revelou que as proteínas totais da hemolinfa de L. intermedia estão distribuídas principalmente na faixa de pH ácido e neutro. A análise lipídica da hemolinfa foi realizada através de HPTLC e foram identificados fosfolipídios como fosfatidilcolina, fosfatidil-inositol e fostatidiletanolamina. Os esteróis identificados nesse trabalho foram colesterol, ergosterol e triacilglicerol; e não foram identificados glicolipídios. O perfil de glicosilação proteica foi avaliado através de Lectin Blot e as proteínas totais da hemolinfa de L. intermedia apresentaram resíduos de alta manose e N-acetilglucosamina. Não foram identificados resíduos de ácido siálico, corroborando com dados de glicosilação de toxinas do veneno dessa mesma aranha. Através de microscopia de luz foram identificados pró-hemócitos, que são células precursoras dos outros tipos celulares. Também foi constatada a presença de plasmatócitos e granulócitos, que são células envolvidas na imunidade inata, realizando fagocitose, nodulação, encapsulação e melanização. Esse trabalho foi o primeiro a estudar a hemolinfa da aranha-marrom caracterizando o perfil proteico, lipídico e de glicosilação de seus componentes. Além disso, a fração celular também foi investigada e diferentes hemócitos identificados. Dessa forma esse estudo inicia uma nova linha de pesquisa no estudo de Loxosceles, ampliando o conhecimento e as fontes naturais de moléculas bioativas com potenciais biotecnológicos.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-10-10T15:24:29Z No. of bitstreams: 1 2012_PaulaElizabethFariasOliveira.pdf: 18875208 bytes, checksum: 7cd69548c1b2b88c1b00e78a57e23e31 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-15T10:56:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_PaulaElizabethFariasOliveira.pdf: 18875208 bytes, checksum: 7cd69548c1b2b88c1b00e78a57e23e31 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-15T10:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_PaulaElizabethFariasOliveira.pdf: 18875208 bytes, checksum: 7cd69548c1b2b88c1b00e78a57e23e31 (MD5) / Sedas de aranhas são caracterizadas pela diversidade química, estrutural e funcional, variando de sedas muito elásticas (flageliforme) a fibras extremamente resistentes (linha de segurança). Para melhor entender a relação entre o comportamento elastomérico da seda flageliforme e sua estrutura molecular, foi expressa uma proteína recombinante em bactéria baseada na sequência nativa da flageliforme (Flag) da aranha Nephilengys cruentata e, a partir dessa proteína, foi polimerizada uma fibra sintética. Estudos de espectroscopia Raman das fibras sintéticas mostraram que a proteína Flag recombinante possui uma mistura de várias estruturas secundárias, dominada por estruturas helicoidais e β-turn. Análises de dispersão de raios X de grandes ângulos (WAXS) mostrou a presença de dois anéis difusos de diferentes intensidades que são consistentes com a presença de estruturas helicoidais. Análise de microscopia de força atômica (MFA) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostrou que a superfície dessa fibra sintética é amorfa o que sugere que processo de extrusão e a sequência primária da proteína interfere nas propriedades físicas da fibra. Uma proteína recombinante baseada na sequência da proteína MaSp1, presente na seda linha de segurança da aranha, Parawixia bistriata também foi expressa em bactéria e fibras recombinantes foram formadas. Após a extrusão essas fibras foram processadas. Testes mecânicos mostraram que as fibras processadas possuem melhores propriedades mecânicas. Estudos de espectroscopia Raman e WAXS dessas fibras revelaram que o processamento promove a formação de folhas-β, o que indica que esse processo é muito importante na formação correta das estruturas secundárias, o que leva a formação de fibras de melhor qualidade. A análise do tipo MFA mostrou que a fibra não processada é caracterizada pela presença de estruturas nanoglobulares, enquanto a fibra processada apresenta uma aparência lisa e uniforme. O presente estudo avaliou fibras Flag e MaSp1 sintéticas descrevendo suas conformações, propriedades mecânicas, orientação das proteínas e detalhes das superficies das fibras, além de sua organização molecular interna. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Spider silk are characterized by diversity in their chemistry, structure and functions, ranging from very extensible silk (flagelliform) and remarkably strong fiber (dragline). In order to better understand the relationship between the elastomeric behavior of flagelliform silk and its molecular structure, we expressed a recombinant silk protein based on the native flagelliform protein (Flag) from Nephilengys cruentata and spun it into fibers. Raman spectroscopy studies of the synthetic fibers showed that the Flag-like protein accommodated a mixture of several secondary structures, dominated by helical and β-turn structures. Wide Angle X-ray Scattering (WAXS) data shows the presence of two diffuse rings of different intensities that are consistent with the presence of helical structures. Atomic Force Microscopy (AFM) and Scanning Electron Microscopy (SEM) analyses showed that the surface of the synthetic fiber was amorphous suggesting that the physical properties of Flag-like spider silk depend on the spinning process and on the primary sequence of the Flag-like protein. We also expressed a recombinant protein based on Parawixia bistriata Major Ampullate Spidroin 1 (MaSp1) from dragline and spun into fibers. As spun fibers were post spin stretched. Mechanical test results showed that postspin stretched fibers had better overall mechanical properties. Raman spectroscopy and WAXS studies of those fibers revealed that the postspin treatment promoted the formation of β-sheet, indicating that this process is key to help the proteins in the fiber form correct secondary structures, leading to better quality fibers. Atomic Force Microscopy (AFM) analyses showed that the surface of these as spun fibres is characterized by the presence of nanoglobular structures, while the topographical landscape of postspin stretched fibers is uniform and smooth. The present study was able to evaluate synthetic Flag-like and MaSp1-like fibers describing the conformation, mechanical properties, orientation of the proteins and unique details of the synthetic spider fibers surface structure and internal molecular organization.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-11-14T11:55:11Z No. of bitstreams: 1 2012_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 5439112 bytes, checksum: 09bc9fa597576b8a38b218e890515d36 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-11-14T12:18:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 5439112 bytes, checksum: 09bc9fa597576b8a38b218e890515d36 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-14T12:18:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 5439112 bytes, checksum: 09bc9fa597576b8a38b218e890515d36 (MD5) / Aranhas produzem em sua peçonha uma complexa mistura de moléculas, as quais, devido a seus potenciais neurotoxicos, tem despertado o interesse para a prospecção de novos fármacos e pesticidas. No entanto, poucos estudos são realizados com a peçonha de aranhas caranguejeiras, em especial de espécies encontradas no Brasil. O presente estudo teve como objetivo a caracterização da peçonha bruta da aranha caranguejeira Acanthoscurrio poulensis em busca de peptídeos neuroativos, sendo este o primeiro estudo completo realizado com essa peçonha. A peçonha de A. paulensis apresentou um total de 58 frames cromatograficas e 97 massas moleculares distintas, variando de m/z 601,4 a 21.932,3. A dose letal media em camundongos foi de 25,45 ± 2,42 µg/g. Nos ensaios em coração de rã (coração in situ e fatias isoladas de ventrículo), a peçonha bruta e a "fração de baixa massa molecular" (FBMM) promoveram efeitos semelhantes ao do estímulo vagal, os quais foram bloqueados na presença de atropina, um antagonista muscarinico. A fração protéica (FP) da pegonha não apresentou atividade similar nessas preparações. Um peptídeo denominado Ap1a, eluído aos 41% de acetonitrila no fracionamento da peçonha bruta, foi isolado e caracterizado. A seqüência precursora da Apia apresentou um peptídeo sinal e pro-peptídeo contendo 23 e 27 resíduos de aminoácidos, respectivamente, e 48 resíduos de aminoácidos, com seis cisteínas, referentes ao peptídeo maduro. Esse peptídeo, com massa molecular monoisotopica ([M+H]+) de 5.457,79, apresentou de 60 a 84% de identidade com toxinas da família da HWTX-II. Diferentemente do padrão estrutural proposto para essas toxinas, a Ap1a apresentou um arranjo das pontes dissulfeto típico do motivo ICK. A Ap1a induziu um efeito paralítico dependente da dose em lagartas Spodoptero frugiperda, com DE50 de 13,01 ± 4,21 µg/g. No circuito da Fibra Gigante de Drosophilo melonogoster, a Ap1a causou a redução de freqüência e amplitude nas respostas das vias GF-TTM e GF-DLM, indicando uma ação na junção neuromuscular de Drosophilo, a qual e mediada por receptores glutamatergicos. A Apia foi também letal a camundongos (30 mg/animal via intracranial), causando hipermotilidade com movimentos circulares e saltos e crises tônicas generalizadas com status epiiepticus e morte entre 25 e 35 min, sendo esses efeitos semelhantes aos reportados com a administração via i.c.v. de NMDA, um agonista glutamatergico. A Ap1a (1 µM) não alterou a resposta induzida por acetilcolina na preparação com células de rabdomiossarcoma, e seus efeitos foram mínimos nos canais hNav1.2, hNav1.4, hNav1.5 e hNav1.6. Dessa forma, o presente estudo proporcionou a caracterização química e biológica de uma nova molécula neuroativa da peçonha da aranha A. paulensis, com possível ação na neurotransmissao glutamatergica, e também a caracterização da peçonha bruta, mostrando uma grande variedade de compostos que podem ser futuramente estudados visando a melhor compreensão de canais iônicos ou receptores celulares e o desenvolvimento de novos fármacos e pesticidas. / Spiders produce in their venoms a complex mixture of molecules which, due to their neurotoxic potential, have raised interest in prospecting new drugs and pesticides. Nevertheless, few studies are carried out with tarantula venoms, especially with species found in Brazil. The present study aimed to characterize the crude venom from Aconthoscurria paulensis tarantula venom in search of neuroactive peptides, being this the first complete study performed with this venom. The venom of A. paulensis presented a total of 58 chromatographic fractions and 97 different molecular masses ranging from m/z 601.4 to 21,932.3. The median lethal dose in mice was 25.45 ± 2.42 |ig/g. On the frog heart assays [in situ and isolated ventricle slices), the crude venom and the "low molecular mass fraction" (LMMF) promoted effects similar to vagal stimulation, which were blocked in the presence of atropine, a muscarinic antagonist. The proteic fraction did not show similar effects on frog heart tissue. A peptide named Apia, eluted with 41% acetonitrile in the crude venom fractionation was isolated and characterized. The Apia showed 48 amino acid residues, with six cysteines, and a precursor sequence showing a signal peptide and pro¬peptide containing 23 and 27 residues, respectively. This peptide, with a monoisotopic molecular mass ([M+H]+) of 5457.79, presented 60 to 84% identity with toxins from the HWTX-II family. Unlike the structural pattern proposed for these toxins, Apia presented an arrangement of disulfide bonds typical of the ICK motif. The Apia induced a dose-dependent paralytic effect in Spodoptera frugiperda caterpillars, with and ED50 of 13.01 ± 4.21 ng/g. In the Drosophilo melonogaster Giant Fiber circuit, Apia has reduced both the amplitude and frequency of responses from GF-TTM and GF-DLM pathways, indicating an action at the Drosophilo neuromuscular junction, which is mediated by glutamatergic receptors. The Apia was also lethal to mice (30 |_ig/animal by intracranial route), causing hypermotility with circular and jump movements and generalized tonic seizures with status epilepticus and death between 25 and 35 min. These effects were similar to those reported with the administration by i.e.v. route of NMDA, a glutamatergic agonist. The Apia (1 yiM) did not alter the response induced by acetylcholine on the rhabdomyosarcoma cells preparation, and it presented minimal effects on hNavl.2, hNavl.4, hNavl.5 and hNavl.6 channels. Thus, this study provided chemical and biological characterization of a new neuroactive molecule from A. paulensis spider venom, with possible action on glutamatergic neurotransmission, and also the crude venom characterization, showing a wide variety of compounds that can be further studied in order to better understanding ion channels or cell receptors and to the design of new drugs and pesticides.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2007. / Submitted by samara castro (sammy_roberta7@hotmail.com) on 2009-11-28T18:13:59Z No. of bitstreams: 1 2007_FelipeMalheirosGawryszewski.pdf: 4809127 bytes, checksum: 9f7f0d3cbbc67d31690690b66bb65252 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2009-11-30T12:25:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_FelipeMalheirosGawryszewski.pdf: 4809127 bytes, checksum: 9f7f0d3cbbc67d31690690b66bb65252 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-30T12:25:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_FelipeMalheirosGawryszewski.pdf: 4809127 bytes, checksum: 9f7f0d3cbbc67d31690690b66bb65252 (MD5) Previous issue date: 2007 / Entre as hipóteses mais discutidas para explicar padrões conspícuos no corpo das aranhas ou decorações em suas teias estão a atração de presas e a proteção da teia. Gasteracantha cancriformis é uma espécie de aranha de teia orbicular, comum no cerrado, que apresenta polimorfismo de cor. Suas cores, bem como o stabilimentum em forma de tufos de seda que são aderidos a sua teia, as tornam aparente na vegetação para os seres humanos. Dessa forma, os objetivos desta dissertação foram: (1) identificar e descrever os morfos de G. cancriformis; (2) analisar o espectro de reflectância desses morfos e dos tufos das teias; (3) testar a hipótese da atração de presas para as cores de G. cancriformis; (4) testar a hipótese da atração de presas para os tufos das teias e (5) testar a hipótese da proteção da teia para os tufos das teias. Foram identificados pelo menos oito fenótipos. Os mais comuns foram o amarelo com espinhos pretos, seguido pelo branco com espinhos pretos e o preto e branco com espinhos pretos. Contrariamente à hipótese da atração de presas, o número de presas presentes na teia, o número de buracos na teia causado por presas e os restos de presas presentes na teia não foram diferentes entre os morfos, nem diferentes em indivíduos que tiveram a coloração manipulada com tinta preta ou amarela. Em laboratório, Drosophila melanogaster não mostrou nenhuma preferência pelos morfos ou por indivíduos pintados. A hipótese da atração de presas também não foi corroborada para os tufos nas teias, pois o número de presas capturadas pelas teias, o número de buracos na teia e o tipo de presas capturadas não diferiram entre teias com tufos pintados de preto e teias com o intervalo entre os tufos pintado de preto, muito embora tenha sido encontrada uma correlação positiva entre número de tufos e número de restos de presa na teia. Em laboratório, D. melanogaster não mostrou nenhuma preferência por fios de seda com ou sem tufos. A hipótese da proteção da teia também não foi corroborada, pois a taxa de destruição das teias foi a mesma independentemente da manipulação experimental. Outras hipóteses são propostas para explicar os padrões de cores e tufos em G. cancriformis. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Prey attraction and web protection are among the most discussed hypotheses to explain conspicuous patterns in spiders’ body and their webs. Gasteracantha cancriformis is an orb weaver spider, common in cerrado, which body shows colour polymorphism. Its colours, together with its silk tufts (stabilimentum) added in webs, make this species conspicuous to human eyes. Hence, the purposes of this dissertation were: (1) identify and describe G. cancriformis colour morphs; (2) analyze the reflectance spectrum of colour morphs and tufts; (3) test the prey attraction hypothesis for the colour morphs; (4) test the prey attraction hypothesis for web tufts; and (5) test the web protection hypothesis for web tufts. At least eight different colour morphs were identified. The most common were: yellow with black spines, white with black spines, and black and white with black spines. Contrary to the prey attraction hypothesis, the number of prey captured by webs, number of holes caused by preys and number of remains of captured preys did not differ between colour morphs and individuals that had been painted black or yellow. In laboratory, Drosophila melanogaster did not show any preference for colour morphs or painted individuals. The prey attraction hypothesis was not confirmed for web tufts. Number of prey captured by webs, number of web holes and type of prey captured did not differ between webs with painted tufts and sham-manipulated webs, Nonetheless it had been found a positive correlation between number of tufts and number of remains of captured prey. In laboratory, D. melanogaster did not show any preference for tufted silk lines or non-tufted silk lines. The web protection hypothesis was not corroborated as well. Rate of web destruction was the same regardless experimental manipulation. Other hypotheses to explain colour pattern and tufts in G. cancriformis are proposed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-05T17:31:42Z No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-03-06T00:48:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-06T00:48:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CarlaSimoneVizzotto.pdf: 3539881 bytes, checksum: b07d43eaf6ed86b3ae63ef89eab91b2f (MD5) Previous issue date: 2009 / A peçonha de aranhas constitui-se como um conjunto diverso de moléculas bioativas, usado para subjugar a presa e eventualmente para defesa. Essas moléculas atuam de formas variadas em muitos sistemas biológicos e despertam interesse pelo seu potencial para a prospecção de produtos naturais. Pouco se sabe sobre as peçonhas de aranhas caranguejeiras do Brasil. Este estudo apresenta a caracterização de componentes da peçonha de Lasiodora sp. bem como sua atividade biológica. Foram detectados 191 componentes na peçonha de Lasiodora sp. com predominância de componentes com massa molecular menor que 1000 Da e entre 4000 e 8500 Da. A atividade cardiotóxica foi atribuída aos componentes de baixo peso molecular da peçonha. Quatro peptídeos tiveram sua estrutura primária parcialmente elucidada. A análise de similaridade desses peptídeos isolados e caracterizados sugeriu a atividade em canais iônicos, que não foi detectada nos ensaios eletrofisiológicos. A peçonha bruta de Lasiodora sp. inibiu de maneira significativa o crescimento das bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus. A atividade antibacteriana foi identificada em oito frações cromatográficas e em um grupo de frações com baixa massa molecular (JL1), sendo que não foi possível a determinação de MIC. Este estudo contribui para a compreensão da diversidade e complexidade da peçonha da aranha Lasiodora sp., bem como preenche lacunas até então não esclarecidas para essa espécie. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The spider venom is a diverse set of bioactive molecules, used to subdue the prey and possibly for defense. These molecules act in various forms in many biological systems and arouse interest in its potential for the exploration of natural products. Little is known about the Tarantula venoms from Brazil. This study presents the characterization of components from the venom of Lasiodora sp. and its biological activity. We identified 191 molecular mass components in the Lasiodora sp. venom, with prevalence of components smaller than 1000 Da and between 4000 and 8500 Da. The cardiotoxic activity was attributed to low molecular weight components. Four peptides had their primary structure partially elucidated. The analysis of similarity of these isolated and characterized peptides suggest activity on ion channels, which was not detected in the electrophysiological testing. The Lasiodora sp. crude venom significantly inhibited the bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus growth. The antibacterial activity was identified in eight chromatographic fractions, and in a group of low molecular weight fractions (JL1), which was not possible to determine MIC. This study contributes to understanding the diversity and complexity of the venom of the spider Lasiodora sp. and then fills gaps unclear for this species.