Anyphaenidae apresenta 56 gêneros e 525 espécies e compreende aranhas com pequeno a médio porte, que habitam diversos ambientes. Anyphaenidae foi dividida em Amauroboidinae e Anyphaeninae sendo esta última caracterizada pelas quelíceras com mais de quatro dentículos na retromargem, espiráculo traqueal aproximadamente no meio do ventre ou entre o meio do ventre e o sulco epigástrico. Atualmente Anyphaeninae compreende 33 gêneros e 346 espécies na região Neotropical, dentro as quais se destaca o grupo Aysha, sendo o mais diversificado com 10 gêneros. Estes gêneros são caracterizados por possuir como característica diagnóstica importante, o processo embólico no palpo dos machos. O gênero Tafana Simon é diagnosticado por apresentar distinta projeção na base do êmbolo e processo tegular ventral distal próximo a apófise média no palpo dos machos e margem anterior esclerotizada e septo atrial no epígino das fêmeas. O presente trabalho teve por objetivo revisar e analisar filogeneticamente o gênero Tafana e ver as relações de parentesco com as espécies do grupo Aysha. As análises cladística foram realizadas a partir de uma matriz com 21 terminais e 71 caracteres provenientes de estudo morfológico comparado. Utilizamos como critério de optimilidade a parcimônia. A obtenção de inferências filogenéticas resultou em duas árvores mais parcimoniosas, apresentando 147 passos (IC= 53; IR=62). De acordo com a árvore de consenso o gênero Tafana é monofilético apresentando alça mediana do ducto espermático na região distal do tégulo, projeção na base do êmbolo laminar ou cônica e borda lateral sinuosa. Sendo assim o gênero Tafana pertence ao grupo Aysha, por apresentar processo embólico no palpo dos machos. Além disso o gênero Tafana Simon foi revisado e redescrito machos e fêmeas de Tafana quelchii, T. silhavyi e T. straminea. Descrevemos onze espécies novas. Nove espécies mantem sua distribuição para o norte da América do Sul, no Equador, Venezuela, Colômbia, Peru e Bolívia, e duas espécies, Tafana sp. nov. 6 e Tafana sp. nov. 7 com distribuição para o norte da Argentina / Anyphaenidae includes 56 genera and 525 species and comprises small to medium sized spiders that inhabit different environments. Anyphaenidae is divided into Amauroboidinae and Anyphaeninae, the latter characterized by chelicerae with more than four denticles in the retromargin, tracheal spiracle approximately in the middle of the abdomen or near the epigastric furrow. Currently Anyphaeninae comprises 33 genera and 346 species in the Neotropical region, in which the Aysha group stands out as the most diverse with 10 genera. These genera are characterized by having an important diagnostic characteristic, the embolic process in the male palpi. The genus Tafana Simon is recognized by a distinct projection at the base of the embolus, a distal ventral tegular process near the median apophysis in the male palpi and an anterior sclerotized margin and atrial septum in female epigina. The present work had as objective to review and analyze phylogenetically the genus Tafana and to see the relations of kinship with the species of the Aysha group. The cladistic analyzes were performed from a matrix with 21 terminals and 71 characters from a comparative morphological study. We use parsimony as the criterion of optimality. Obtaining phylogenetic inferences resulted in two most parsimonious trees, with 147 steps (CI = 53; RI = 62). According to the consensus tree, the genus Tafana is monophyletic presenting a median loop of the spermatic duct in the distal region of the tegulum, projection at the base of the embolus laminar or conical and the sinuous lateral border. Thus, the genus Tafana belongs to the Aysha group, because it presents an embolic process in the male palpi. In addition the genus Tafana Simon was reviewed and redescribed males and females of Tafana quelchii, T. silhavyi and T. straminea. We describe eleven new species. Nine species maintain their distribution to the north of South America, in Ecuador, Venezuela, Colombia, Peru and Bolivia, and two species, Tafana sp. nov. 6 and Tafana sp. nov. 7 with distribution to the north of Argentina

This essay considers the relationship between the creative and philosophical writings of Graça Aranha, in part as response to the critical tendency to exclude the majority of his works when analyzing his oeuvre. Aranha’s major work of philosophy, The Aesthetic of Life, proclaims that aesthetic experience is the “basis of perfection”: the solution the alienation initiated by the duality of consciousness. Yet, the aestheticism of his philosophical treatise is ruthlessly tested through the dramatic embodiment found in his three works of fiction: Canaan (novel), Malazarte (play), The Marvelous Journey (novel). Aranha’s interest in philosophical dialectic is manifested most effectively in the drama of ideas which runs through his fiction. Consequently, Aranha’s works should be evaluated and explicated with attention to the ways in which they comment on each other. In particular, the fictional works suggest a negative aspect to Aranha’s aesthetic concept of the marvelous. The three creative works employ and anticipate ideas found in Psychoanalytic theory, Marxist theory, and Existentialism in order to illustrate that the marvelous experience is a kind of death of the subject. Additionally, this essay contributes to the critical dialogue over Aranha’s place in or outside of Brazilian modernism. The representation of Brazilian dance and ritual found in the two novels are explored as a noteworthy modernist approach to the questions of cultural and aesthetic decadence that influenced the modernist period in both Europe and Brazil. / text

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação de Biologia Molecular, 2007. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-09-25T18:40:25Z No. of bitstreams: 1 Tese Final.pdf: 6188529 bytes, checksum: 6aa4e95b65ce34ead01801608bfbf982 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:19:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese Final.pdf: 6188529 bytes, checksum: 6aa4e95b65ce34ead01801608bfbf982 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:19:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Final.pdf: 6188529 bytes, checksum: 6aa4e95b65ce34ead01801608bfbf982 (MD5) Previous issue date: 2007-07 / As aranhas produzem até seis tipos diferentes de seda, cada um para uma função biológica específica. As sedas de aranhas também são conhecidas por suas exclusivas propriedades mecânicas. A possibilidade de produzir novos materiais com propriedades semelhantes motivou a pesquisa sobre essas proteínas da seda (espidroínas). Neste trabalho foram identificados diferentes espidroínas produzidas pelas glândulas sericígenas das aranhas Nephilengys cruentata, produtora de teias em orbital, e Avicularia juruensis, da família das caranguejeiras, aranhas rudimentares possuídoras de apenas uma ou duas glândulas produtoras de seda; ambas encontradas na fauna brasileira. As seqüências das espidroínas de N. cruentata mostraram uma considerável semelhança com outras espidroínas anteriormente descritas, com alto teor de alanina e glicina devido à presença dos motivos altamente repetitivo (poli-Ala, (GlyGlyX)n, (GlyProGlyGlyX)n). Estudos mecânicos e estruturais da fibra ampolada principal, uma das produzidas pela aranha N. cruentata, também foram conduzidos no intuito de esclarecer as correlações entre estrutura e função desta espidroína. Nos últimos anos, a maioria das pesquisas sobre as proteínas de seda de aranhas se concentrou nas aranhas de fiação orbicular e em suas intrigantes teias. Outras aranhas de construção não orbicular, tais como a "primitiva" Mygalomorphae, foram em grande parte negligenciadas, assim criando uma nítida lacuna de conhecimento na evolução da seda de aranhas. Neste estudo, foram identificadas duas espidroínas produzidas pela glândula globular da aranha migalomorfa Avicularia juruensis, uma aranha nativa da Amazônia brasileira. A análise das seqüências e da filogenia usando 77 C-terminais a partir de 35 espécies de aranhas classificaram, de modo evidente, uma das espidroínas da Avicularia dentro da classe da ampolada maior (MaSp2), contribuindo para o melhor entendimento de vários aspectos evolutivos das sedas de aranhas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Spiders are able to produce up to six different kinds of silk, each one for a specific biological function. Spiders’ silks are also known for their unique mechanical properties. The possibility to produce new materials with similar properties led to an advance in the studies about the silks’ proteins (spidroins). In this work were identified spidroins produced by the silk glands from the Brazilian spiders Nephilengys cruentata, an orb-weaver spider, and Avicularia juruensis, from the tarantula family which has only one or two silk glands. N. cruentata spidroins sequence showed great similarity to other spidroins previously described, with high content of alanine and glycine amino acids due to the presence of highly repetitive motifs (poly-Ala, (GlyGlyX)n, (GlyProGlyGlyX)n). In order to establish a comparison between the amino acid sequence motifs found in the major ampullate silk from N. cruentata and its mechanical properties, structural and mechanical analyses were also done. Most research on spider silk proteins in recent years has concentrated on orb weaving spiders and their intriguing webs. Other non-web building spiders, such as the “primitive” Mygalomorphae have been largely neglected, creating a clear knowledge gap in spider silk evolution. In this study we have identified two spidroins produced by the globular gland of the mygalomorph spider Avicularia juruensis, a native spider from the Brazilian Amazon. Sequence and phylogenetic analysis using 77 C-termini from 35 spider species clearly place one of the Avicularia spidroins within the major ampullate (MaSp2) clade, contributing for the better understanding of several evolutionary aspects of the spider silks.

Orientador: Marielle Cristina Schneider / Banca: Patricia Pasquali Parise Maltempi / Banca: Katia Cristina Machado Pellegrino / Banca: Douglas de Araujo / Banca: Liano Cenofante / Resumo: Na ordem Araneae existem 45.741 espécies de aranhas descritas taxonomicamente, as quais estão distribuídas em duas subordens, Mesothelae e Opisthothelae, 114 famílias e 3.965 gêneros. Considerando o número de espécies de aranhas descritas taxonomicamente, as informações citogenéticas são muito escassas, pois menos de 2% dos representantes foram caracterizados até o momento. Dentre as 114 famílias de aranhas, 45 não possuem sequer uma espécie examinada citogeneticamente. Nas aranhas, o número diploide varia de 2n♂=7 a 2n♂=128, com sistema cromossômico sexual simples, como X0 e XY, ou múltiplo, como o X1X20, X1-X130, X1X2Y e X1-X7Y, e cromossomos com morfologia meta/submetacêntrica ou subtelo/telocêntrica. Em relação a regiões cromossômicas específicas, como as regiões organizadoras de nucléolo (RONs), somente cerca de 50 espécies de aranhas foram caracterizadas, principalmente através de impregnação pelo íon prata. Nas Mygalomorphae e Araneomorphae, as RONs estão localizadas predominantemente sobre a região terminal de um a três pares autossômicos. Porém, em algumas espécies foram observadas RONs sobre o cromossomo sexual X. Considerando as particularidades cromossômicas encontradas em Araneae e a escassez de informações citogenéticas, especialmente de regiões específicas como as RONs, este trabalho tem como objetivo estabelecer os mecanismos de evolução cromossômica em espécies de aranhas pertencentes a diferentes famílias de Mygalomorphae e Araneomorphae, levando-se em conta as características cariotípicas básicas e o padrão de distribuição das RONs. As análises cromossômicas foram realizadas através de coloração convencional, impregnação pelo nitrato de prata (Ag-RON) para identificar as RONs ativas e hibridização in situ fluorescente (FISH) para localizar os genes de rDNA 18S. As 17 espécies examinadas neste trabalho pertencem a três famílias de Haplogynae, cinco de... / Abstract: The order Araneae possesses 45,741 taxonomically described species, which are distributed in two suborders, Mesothelae and Opisthothelae, 114 families and 3,965 genera. The cytogenetic data in this order are scarce, considering that less than 2% of the species were studied up to now. Among the 114 families of Araneae, in 45 there are no species cytogenetically examined. In the spiders, the diploid number ranged from 2n♂=7 to 2n♂=128, with sex chromosome system of the simple (X0 and XY) or multiple (X1X20, X1-X130, X1X2Y e X1-X7Y) types, and chromosomes with meta/submetacentric or subtelo/telocentric morphology. In relation to specific chromosome sites, such as the nucleolar organizer regions (NOR), only 30 species were investigated mainly through silver impregnation. In Mygalomorphae and Araneomorphae, the NORs were predominantly located in the terminal region from one to three autosomal pairs. However, in some species, the NORs occurred in the X sex chromosome. Considering the cytogenetic particularities observed in Araneae and the scarcity of information of specific chromosome regions, the purpose of this work was to establish the mechanism of chromosome evolution in Mygalomorphae and Araneomorphae spiders with the focus of the rDNA genes. The chromosome analyses were accomplished with standard staining, silver nitrate impregnation (Ag-NOR) to identify the active NORs and fluorescent in situ hybridization (FISH) to locate the 18S rDNA genes. The 17 species examined here belong to three families of Haplogynae, five of Entelegynae and three of Mygalomorphae. Mitotic metaphase cells exhibited 2n♂=16+X1X2Y in Sicarius cariri and Sicarius ornatus and 2n♂=18+XY in Sicarius tropicus, with Ag-NORs on the terminal region of pair 1. In S. ornatus and S. tropicus, the FISH technique showed similar results to Ag-NOR, but in S. cariri, the ribosomal cistrons were located in the terminal region of the X1 sex chromosome. The description of a ... / Doutor

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:30:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-11-18. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:32:58Z : No. of bitstreams: 1 000857570_20181118.pdf: 1213871 bytes, checksum: 1217b26e49381e1c08a0877fcc38cb08 (MD5) Bitstreams deleted on 2018-11-21T11:45:01Z: 000857570_20181118.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-11-21T11:45:57Z : No. of bitstreams: 1 000857570.pdf: 3162544 bytes, checksum: 933a175ada75ae354b262fe8ecddcd7a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Na ordem Araneae existem 45.741 espécies de aranhas descritas taxonomicamente, as quais estão distribuídas em duas subordens, Mesothelae e Opisthothelae, 114 famílias e 3.965 gêneros. Considerando o número de espécies de aranhas descritas taxonomicamente, as informações citogenéticas são muito escassas, pois menos de 2% dos representantes foram caracterizados até o momento. Dentre as 114 famílias de aranhas, 45 não possuem sequer uma espécie examinada citogeneticamente. Nas aranhas, o número diploide varia de 2n♂=7 a 2n♂=128, com sistema cromossômico sexual simples, como X0 e XY, ou múltiplo, como o X1X20, X1-X130, X1X2Y e X1-X7Y, e cromossomos com morfologia meta/submetacêntrica ou subtelo/telocêntrica. Em relação a regiões cromossômicas específicas, como as regiões organizadoras de nucléolo (RONs), somente cerca de 50 espécies de aranhas foram caracterizadas, principalmente através de impregnação pelo íon prata. Nas Mygalomorphae e Araneomorphae, as RONs estão localizadas predominantemente sobre a região terminal de um a três pares autossômicos. Porém, em algumas espécies foram observadas RONs sobre o cromossomo sexual X. Considerando as particularidades cromossômicas encontradas em Araneae e a escassez de informações citogenéticas, especialmente de regiões específicas como as RONs, este trabalho tem como objetivo estabelecer os mecanismos de evolução cromossômica em espécies de aranhas pertencentes a diferentes famílias de Mygalomorphae e Araneomorphae, levando-se em conta as características cariotípicas básicas e o padrão de distribuição das RONs. As análises cromossômicas foram realizadas através de coloração convencional, impregnação pelo nitrato de prata (Ag-RON) para identificar as RONs ativas e hibridização in situ fluorescente (FISH) para localizar os genes de rDNA 18S. As 17 espécies examinadas neste trabalho pertencem a três famílias de Haplogynae, cinco de... / The order Araneae possesses 45,741 taxonomically described species, which are distributed in two suborders, Mesothelae and Opisthothelae, 114 families and 3,965 genera. The cytogenetic data in this order are scarce, considering that less than 2% of the species were studied up to now. Among the 114 families of Araneae, in 45 there are no species cytogenetically examined. In the spiders, the diploid number ranged from 2n♂=7 to 2n♂=128, with sex chromosome system of the simple (X0 and XY) or multiple (X1X20, X1-X130, X1X2Y e X1-X7Y) types, and chromosomes with meta/submetacentric or subtelo/telocentric morphology. In relation to specific chromosome sites, such as the nucleolar organizer regions (NOR), only 30 species were investigated mainly through silver impregnation. In Mygalomorphae and Araneomorphae, the NORs were predominantly located in the terminal region from one to three autosomal pairs. However, in some species, the NORs occurred in the X sex chromosome. Considering the cytogenetic particularities observed in Araneae and the scarcity of information of specific chromosome regions, the purpose of this work was to establish the mechanism of chromosome evolution in Mygalomorphae and Araneomorphae spiders with the focus of the rDNA genes. The chromosome analyses were accomplished with standard staining, silver nitrate impregnation (Ag-NOR) to identify the active NORs and fluorescent in situ hybridization (FISH) to locate the 18S rDNA genes. The 17 species examined here belong to three families of Haplogynae, five of Entelegynae and three of Mygalomorphae. Mitotic metaphase cells exhibited 2n♂=16+X1X2Y in Sicarius cariri and Sicarius ornatus and 2n♂=18+XY in Sicarius tropicus, with Ag-NORs on the terminal region of pair 1. In S. ornatus and S. tropicus, the FISH technique showed similar results to Ag-NOR, but in S. cariri, the ribosomal cistrons were located in the terminal region of the X1 sex chromosome. The description of a ... / FAPESP: 11/19873-9

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-06T21:13:13Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-13T19:33:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-13T19:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoCDNA.PDF: 1649529 bytes, checksum: 00aae23f984e9db472f5a8b04b6c2e83 (MD5) Previous issue date: 2006 / O veneno de cobras, escorpiões, aranhas e outros animais venenosos é uma fonte rica em toxinas. Uma característica importante de algumas toxinas é o fato de serem espécie específicas. Neste trabalho, nós realizamos a clonagem da seqüência codificante para a toxina LTx2 da aranha Lasiodora sp. no vetor de expressão pET11a. Esta toxina foi previamente identificada, através da varredura de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno desta aranha. A análise de similaridade, feita com o programa de alinhamento local BLAST, mostrou que esta toxina apresenta similaridade com as toxinas huwetoxina-II e huwetoxina-VII da aranha Selenocosmia huwena, bem como com as toxinas LTx1 e LTx3 da Lasiodora sp. Após a clonagem no vetor de expressão, nós sequenciamos o produto da clonagem pelo método de Sanger e verificamos que o mesmo foi inserido no frame correto. A indução da expressão da toxina recombinante foi feita usando IPTG na concentração de 0,6 mM, por 3-4 horas. Através de ensaios imunoquímicos, nós constatamos que neste sistema a proteína recombinante é expressa sobretudo na forma de corpos de inclusão. Definimos então, uma estratégia para obter a toxina solúvel renaturada. Utilizando uma solução contendo uréia na concentração de 6 M realizamos a desnaturação dos corpos de inclusão, e procedemos a renaturação da proteína recombinante através de diálise em um tampão de renaturação. A amostra foi então submetida a uma cromatografia líquida de alta pressão em coluna de fase reversa. Através de eletroforese e Western Blotting, nós observamos que a estratégia de purificação foi eficiente. Realizamos então um ensaio antimicrobiano, onde observamos que a toxina recombinante, na concentração de 400 mg/mL. inibiu o crescimento dos microrganismos Escherichia coli, Salmonella Agona e Staphylococcus epidermidis. A expressão e recuperação da proteína recombinante em maior quantidade permitirá a realização de testes em outros organismos e a realização de ensaios eletrofisiológicos. ____________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The venom from snakes, scorpions, spiders and other venomous animals is a very rich source of potent toxins. An interesting feature of some toxins is their remarkable species specificity. In the present work we cloned a sequence which codifies for the toxin LTx2 from the venom of the spider Lasiodora sp, in the expression vector pET11a. This toxin was previously identified in the screening of the cDNA library of the total venom. This toxin, when submitted to the local alignment tool, BLAST, shown similarity with the toxins huwetoxina-II and huwetoxina-VII, from the venom of the spider Selenocosmia huwena, as well as with the toxins LTx1 and LTx3 from Lasiodora sp. venom. After cloning in expression vector we verified if the fragment was inserted in the correct frame using the Sanger DNA sequencing method. The expression of the target protein was made by adding 0,6 mM IPTG to the media followed by a 3 to 4 hours incubation. With the assistance of immunochemical assays, we were able to detect that the target protein was been expressed in the form of inclusion bodies. Then we defined a strategy to recover the soluble refolded protein. Using a solution containing 6 M urea we proceed the solubilization of the inclusion bodies. The refolding of the soluble protein was made by the dialysis method in refolding buffer. The sample was, then, submitted to high pressure liquid chromatography, in a reversed phase column, to purify the protein. The purifying process was efficient, as shown by the Western Blotting and electrophoresis results. After that, we made an anti microbial assay, where we could see that the target protein, in the concentration of 400 mg/mL, inhibited the growth of the organisms used in the test. The expression and recovery of larger amounts of the target protein will allow tests with this toxin in other organisms and electrophysiological experiments.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-15T20:31:46Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-20T14:11:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-20T14:11:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_ClonagemExpressãoSequência.PDF: 5671313 bytes, checksum: 6449585170e71dbb4b26ba69ffcac214 (MD5) Previous issue date: 2010 / Peptídeos neurotóxicos encontrados em venenos animais têm despertado um grande interesse de pesquisadores. A possibilidade de utilizá-los como ferramentas moleculares para estudos em canais iônicos, além do uso como bioinseticidas e/ou como biofármacos, tem impulsionado as pesquisas nessa área. Experimentos com o veneno bruto da aranha caranguejeira Lasiodora sp mostraram que o mesmo atua em canais iônicos de pequenos vertebrados e de invertebrados. Recentemente, construímos uma biblioteca de cDNA a partir dos mRNAs presentes na glândula de veneno dessa aranha. A varredura desta biblioteca, usando a técnica de ELISA, e o sequenciamento de DNA, permitiram a identificação de cinco toxinas presentes no veneno, nomeadas LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 e LTx5. Experimentos realizados com a toxina recombinante LTx2, em células musculares BC3H1, mostraram que esse peptídeo bloqueia canais de cálcio tipo-L e inibe a recarga de Ca2+ dos estoques intracelulares. A estrutura primária do peptídeo LTx2 é muito similar a dos peptídeos LTx1 e LTx3, portanto, espera-se que essas toxinas possuam mescanismos de ação semelhantes. Por outro lado, a sequência de aminoácidos da LTx4 e da LTx5 são bem diferentes, tanto quando comparadas com a LTx1, LTx2 e LTx3, quanto entre si, o que leva a acreditar que elas possam atuar em diferentes canais e/ou ter diferentes mecanismos de ação. Neste trabalho, a sequência codificante para o peptídeo maduro LTx4 foi subclonada no vetor de expressão pET21b (Novagen). A estratégia foi inserir o gene de interesse sob o controle do promotor T7 e obter um produto expresso em fusão com uma cauda de seis histidinas. A confirmação da clonagem foi realizada através de PCR, digestão do DNA plasmidial com endonucleases de restrição e, finalmente, seqüenciamento dos DNAs extraídos dos clones positivos. A indução da expressão do peptídeo LTx4 foi realizada com a adição de 1mM de IPTG ao meio de cultura. Nos ensaios de imunodetecção utilizamos o anticorpo monclonal anti His-Tag. O peptídeo recombinante foi identificado tanto em experimentos de Western Blot como em experimentos de Dot Blot. O peptídeo recombinante foi expresso exclusivamente na forma de corpos de inclusão e em maiores quantidades após três a quatro horas de indução. O perfil protéico foi analisado em géis de poliacrilamida (Tricina-SDS). Experimentos de purificação do peptídeo encontramse em andamento. ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Peptide neurotoxins found in animal venoms have attracted great interest of researchers. The possibility of using them as tools for molecular studies of ion channels in addition to use as biopesticides and/or as biopharmaceuticals has boosted research in this area. Experiments with the venom of the spider Lasiodora sp showed that it acts on ion channels of small vertebrates and invertebrates. Recently, we constructed a cDNA library from mRNAs present in the venom gland of this spider. The screen of this library, using ELISA and DNA sequencing, allowed the identification of five toxins in the venom, named LTx1, LTx2, LTx3, LTx4 and LTx5. Experiments conducted with recombinant toxin LTx2 in muscle cells BC3H1 showed that this peptide blocks L-type calcium channels and inhibits Ca+2 recharge from intracellular stores. The primary structure of the peptide LTx2 is very similar to the peptides LTx1 and LTx3, and consequently it is expected that these toxins have similar action mechanisms. On the other hand, the amino acids sequences of LTx4 and LTx5 are quite different, both when compared with LTx1, LTx2 LTx3 and as between themselves, which leads to believe that they can act on different channels and/or have different action mechanisms. In this work, the coding sequence for the mature peptide LTx4 was subcloned at the expression vector pET21b (Novagen). The strategy used was to insert the gene of interest under the control of T7 promoter and obtain the expression product in fusion with a six histidine tag. The cloning confirmation was performed by PCR, plasmid DNA digestion with restriction enzymes, and finally, sequencing of DNAs extracted from the positive clones. The induction of LTx4 peptide expression was performed by addition of 1mM IPTG to the culture medium. At the immunodetection assay, we used monoclonal antibody anti His-tag. The recombinant peptide was identified by both Western Blot and Dot Blot experiments. The recombinant peptide was expressed exclusively as inclusion bodies and in larger amounts after three to four hours of induction. The protein profile was analyzed on polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS). Peptide purification experiments are in course.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. / Submitted by Robson Amaral (robsonamaral@bce.unb.br) on 2018-05-09T18:32:58Z No. of bitstreams: 1 2018_AlessaBembomGarcia.pdf: 4531073 bytes, checksum: 3c1b54ef2ea2220db65b1e930489911a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-06-07T11:37:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_AlessaBembomGarcia.pdf: 4531073 bytes, checksum: 3c1b54ef2ea2220db65b1e930489911a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T11:37:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_AlessaBembomGarcia.pdf: 4531073 bytes, checksum: 3c1b54ef2ea2220db65b1e930489911a (MD5) Previous issue date: 2018-06-07 / Aranhas possuem uma complexa variedade de componentes em sua peçonha. Dentre esses componentes, os peptídeos neurotóxicos destacam-se por sua capacidade de paralisar a presa por meio da interação com canais iônicos dependentes de voltagem e com receptores glutamatérgicos presentes no sistema nervoso central (SNC) e no sistema nervoso periférico (SNP). Estudos prévios no laboratório de Toxinologia da Universidade de Brasília (UnB) verificaram que a peçonha da aranha caranguejeira Acanthuscurria paulensis apresenta cerca de 100 compostos, distribuídos entre intervalos de massa de 635-21.895 Da, sendo a fração com maior abundância, de massa monoisotópica [M+H]+ = 5457,79 Da, denominada Ap1a. Foi evidenciando que o peptídeo Ap1a apresenta 48 resíduos de aminoácidos e três pontes dissulfeto. O objetivo do presente trabalho é descrever o(s) alvo(s) molecular(es) do peptídeo Ap1a, isolado da aranha A. paulensis, através de ensaios eletrofisiológicos em canais de Na+ e K+ , bem como analisar seu efeito em ensaios de ligação de [3,4 3 H]- L- Glutamato. Foram realizadas 48 cromatografias da peçonha bruta de A. paulensis para obtenção da fração de interesse, denominada Ap1a, a qual eluiu, aproximadamente, aos 41% de acetonitrila. Para purificação da fração de interesse realizou- se uma recromatografia com gradiente de acetonitrila otimizado. O peptídeo Ap1a, 1 μM, apresentou efeitos em todos os canais de sódio de mamíferos testados: hNav 1.1, hNav 1.3 e hNav 1.7, sendo que, ao se avaliar a ativação dos canais testados, o canal hNav 1.1 foi o que mais deslocou o potencial de ativação para voltagens mais hiperpolarizadas (ΔV1/2 = - 6,58 mV ± 0,72) quando em presença da Ap1a. Contudo, ao se analisar as alterações na amplitude da corrente iônica, o canal hNav 1.7 apresentou maior efeito (32,43% ± 4,93). O peptídeo Ap1a à 1 μM não apresentou efeito nos canais de sódio tanto de barata (Blattella germanica) quanto de ácaro (Varroa destructor). Além disso, nenhum bloqueio ou modulação nos canais potássio de inseto do tipo Shaker, Shab, Shal, Shaw e hKv 10.1 foi evidenciado. Ensaios de ligação de [3,4 3 H]- L- Glutamato foram realizados em triplicata na presença de concentrações crescentes do peptídeo Ap1a (0,01 a 1000 μM), todavia em nenhuma das concentrações utilizadas foi observado alguma diferença estatística significativa na ligação de [3,4 3 H]-L-glutamato. Com base nisso, o presente estudo contribuiu para a ampliação do conhecimento específico do peptídeo Ap1a, isolado da peçonha da A. paulenis, uma das inúmeras aranhas caranguejeiras endêmicas do Brasil, através da realização de uma ampla investigação eletrofisiológica em diversos canais iônicos dependentes de voltagem, bem como em receptores ionotrôpicos de glutamato. / Spiders have venom composed by several compounds of different chemical classes, among them potentially neurotoxic peptides, which are essencial in the prey paralysis process acting in voltage-dependent ion channels and in glutamatergic receptors present in the central nervous system (CNS) and peripheral nervous system (PNS). Previous studies in the laboratório de Toxinologia da Universidade de Brasília (UnB) found that the venom of the tarantula Acanthuscurria paulensis presents about 100 compounds, distributed between mass intervals of 635-21,895 Da, being the fraction with greater abundance, of monoisotopic mass [ M + H] + = 5457.79 Da, designated Ap1a. It was also found that the Ap1a has 48 amino acid residues and three disulfide bonds. The aim of the present work is to describe the molecular target (s) of the Ap1a, isolated from the A. paulensis tarantula, through electrophysiological recordings on Na + and K + channels, as well as to analyze its effect in binding assays of [3,4 3 H] -L-glutamate. Ap1a was purified through chromatography of the crude venom followed by rechromatography. Ap1a, 1 μM, showed effects on all the mammalian sodium channels tested: hNav 1.1, hNav 1.3 and hNav 1.7, and, when evaluating the activation of the channels tested, hNav 1.1 was the one that displaced the most activation potential for more hyperpolarized voltages (ΔV1 / 2 = -6.58 mV ± 0.72) when in the presence of Ap1a. However, when analyzing the changes in the amplitude of the ionic current, hNav 1.7 had a greater effect (32.43% ± 4.93). Ap1a, 1 μM, also showed no effect on the sodium channels of both cockroach (Blattella germanica) and mite (Varroa destructor). In addition, no blockage or modulation in the Shaker, Shab, Shal and Shaw potassium channels was found. [3,4 3 H] -L-Glutamate binding assays were performed in triplicate in the presence of increasing concentrations of Ap1a (0.01 to 1000 μM), however at any of these concentrations used was no significant statistical difference in binding of [3,4 3 H] -L-glutamate. Based on this, the present study contributed to increase the specific knowledge of Ap1a, isolated from A. paulenis venom, one of the numerous endemic tarantula in Brazil, through a broad electrophysiological investigation in several voltage dependent ion channels, as well as in ionotropic glutamate receptors.

Resumo: O presente trabalho teve como objetivo, estudar, a morfologia das glândulas produtoras de veneno da aranha L intermedia, bem como esclarecer questões relacionadas ao perfil e funções dos oligossacarídeos conjugados às glicoproteínas deste veneno. A aranha marrom, do gênero Loxosceles, tornou-se de grande importância médica, devido aos acidentes de envenenamento (loxoscelismo) que vem ocorrendo em diferentes partes do mundo. As atividades biológicas do veneno da aranha marrom normalmente incluem lesões dermonecróticas no local da picada, acompanhadas por efeitos hemolíticos e hemorrágicos e também pelo quadro clínico de insuficiência renal aguda (IRA). Pelo uso de microscopia óptica, microscopia eletrônica de transmissão e de varredura, demonstrou-se que a organização das glândulas produtoras de veneno de Loxosceles intermedia seguem a arquitetura geral das glândulas de veneno de outras aranhas. A microscopia eletrônica de varredura mostrou que as glândulas de veneno são estruturas pares, situadas no cefalotórax e que descarregam seus produtos de secreção diretamente em um par de tubos ligados a cada quelícera. Usando-se microscopia óptica e microscopia eletrônica de transmissão, observou-se que as glândulas apresentam camadas de fibras de músculos estriados, em contato com uma membrana basal que separa a região muscular da camada epitelial. As células epiteliais possuem um citoplasma rico em retículo endoplasmático rugoso, mitocôndrias, complexo de Golgi e vesículas secretoras contendo o veneno, uma mistura complexa de proteínas. Com as técnicas de lectina-blotting, cromatografia de afinidade lectínica e tratamentos com glicosidases, detectou-se no veneno estruturas do tipo alta-manose N-ligadas, proteínas com resíduos de fucose N-Iigados e proteínas com resíduos de N-acetilgalactosamina O-ligados, mas ausência de glicosaminoglicanos ou estruturas complexas contendo galactose ou ácido siálico terminais. Com veneno deglicosilado enzimática ou quimicamente, demonstrou-se que a agregação plaquetária (atividade trombocitopênica), como também os efeitos fibronectinolítico e fibrinogenolítico (hemorrágicos), são açúcar-independentes quando comparados com os efeitos do veneno glicosilado. Uma análise através de zimograma copolimerizado em géis de gelatina, mostrou que a loxolisina B, uma metaloprotease gelatinolítica de 32-35 kDa, é uma glicoproteína do tipo alta-manose e que após uma N-deglicosilação enzimática teve seu peso molecular reduzido em aproximadamente 2 kDa e seu efeito gelatinolítico residual em 28%, quando comparado com a molécula glicosilada. Nesta condição apontou também uma atividade gelatinolítica dependente da glicosilação pós-traducional. O tratamento químico ou enzimático do veneno de L. intermedia (deglicosilação), reduziu significativamente seu efeito dermonecrótico quando testado experimentalmente em coelhos. Este dado sugere fortemente que resíduos de oligossacarídeos exercem um importante papel nos efeitos lesivos do veneno da aranha marrom e abre a possibilidade de se postular uma terapia tópica das lesões cutâneas, baseada em carboidratos.

Resumo: As fosfolipases são uma família de enzimas encontradas em várias fontes biológicas incluindo os organismos procarióticos e eucarióticos. As aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas popularmente como aranhas marrons, são eficazes em produzir em seus venenos uma grande proporção de fosfolipases-D. No veneno destas aranhas, estas enzimas estão relacionadas à dermonecrose, desregulação da resposta inflamatória, hemólise, nefrotoxicidade e agregação plaquetária. As fosfolipases-D catalizam a hidrólise de diferentes fosfolipídios gerando ácido fosfatídico, ou ácido lisofosfatídico, ou ceramida-1-fosfato, importantes mediadores nos eventos de sinalizações celulares. Alterações no padrão de expressão, atividade destas moléculas ou receptores para seus produtos tem sido relacionados com o desenvolvimento de muitos tumores. Desta forma, neste trabalho foi observado o efeito de uma fosfolipase-D exógena recombinante da glândula de veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia (LiRecDT1) sobre as células das linhagens de melanoma murino B16-F10 e B16-F1. Por meio de experimentos de imunoblotting em duas dimensões com anticorpo contra a fosfolipase-D recombinante LiRecDT1 foi observada reatividade imunológica cruzada para pelo menos 25 spots no veneno bruto de L. intermedia, indicando alto nível de expressão para diferentes isoformas de fosfolipase-D. Experimentos de cinética de degradação de lipídios mostraram que esta toxina degrada de maneira tempo dependente tanto esfingomileina, gerando ceramida-1-fosfato e colina, quanto lisofosfatidilcolina, gerando ácido lisofosfatídico e colina e mostram menor atividade contra fosfatidilcolina. Através de experimentos de imunofluorescência com anticorpos contra LiRecDT1 e usando a toxina recombinante de fusão LiRecDT1-GFP foi observado a ligação direta de LiRecDT1 na membrana de células B16-F10. Também foi observado que a toxina recombinante LiRecDT1 tem acesso e degrada fosfolipídios das membranas das células B16-F10, observado em experimentos com extratos de membranas obtidos com detergente ou Ghosts de membrana pela geração de colina. Usando o Fluo-4 AM, um fluoróforo permeante sensível ao cálcio, foi possível observar que o tratamento das células B16-F10 e B16-F1 com a toxina LiRecDT1 induziu um aumento da concentração de cálcio no citoplasma. Em células B16-F10 também foram avaliadas a viabilidade e a morfologia após o tratamento com a fosfolipase-D recombinante e os resultados mostraram que não houve alterações sugerindo que a entrada de cálcio não foi decorrente a danos causados à membrana das células. Baseado no que é conhecido sobre a atividade de fosfolipases-D endógenas como indutores da proliferação celular e no fato de que LiRecDT1 se liga a superfície de células B16-F10 hidrolisando fosfolipídios e gerando lipídios bioativos, foi utilizada a toxina LiRecDT1 como uma fonte exógena de fosfolipase-D em células B16-F10. O tratamento destas células com a fosfolipase-D recombinante de aranha marrom foi efetivo no aumento da sua proliferação e de maneira tempo e concentração dependentes, especialmente na presença de esfingomielina sintética no meio. Estes resultados sugerem que a fosfolipase-D de aranha marrom pode ser usada como uma ferramenta bioativa para protocolos experimentais em biologia celular.