A incidÃncia de infecÃÃes oportunistas causadas por fungos, com destaque para as leveduras do gÃnero Candida vem aumentando substancialmente. Estudos relatam que tem sido observado um notÃvel crescimento de infecÃÃes por espÃcies nÃo albicans (Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis e Candida krusei). Isolados clÃnicos resistentes aos azÃlicos, em especial ao fluconazol, sÃo cada vez mais relatados. As naftoquinonas sÃo uma importante classe de molÃculas biologicamente ativas, apresentando atividades antibacteriana, antifÃngica, antiviral, anti-inflamatÃria, antipirÃtica, anticancerÃgena e tripanocida e tem sido amplamente testadas em vÃrios estudos farmacolÃgicos. Nos Ãltimos anos intensificou-se o interesse nestas substÃncias, nÃo sà devido à sua importÃncia em processos bioquÃmicos vitais, como tambÃm ao destaque cada vez maior que apresentam em variados estudos farmacolÃgicos. O presente trabalho buscou avaliar e comparar o efeito antifÃngico de naftoquinonas frente a cepas de Candida tropicalis resistentes e sensÃveis ao fluconazol, utilizando diferentes tÃcnicas tais como mÃtodos de microdiluiÃÃo em caldo, procedimentos de citometria de fluxo e ensaio do Cometa. Utilizamos sete cepas de Candida tropicalis resistentes ao fluconazol para esse estudo, as quais foram isoladas de sangue e faziam parte da colecÃÃo de leveduras do LaboratÃrio de BioprospecÃÃo Experimental em leveduras (LABEL), afiliado com a Faculdade de FarmÃcia da Universidade Federal do Cearà . Foi utilizado trÃs compostos de naftoquinonas frente à 07 cepas de Candida tropicalis e foram submetidas aos testes de Sensibilidade in vitro , onde apresentaram uma potente atividade antifÃngica. AtravÃs da Citometria de Fluxo, foi possÃvel avaliar alteraÃÃes morfolÃgicas e de integridade da membrana significativas desses compostos frentes Ãs cepas, alÃm de disfunÃÃo mitocondrial e produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio. AtravÃs do ensaio do Cometa foi possÃvel encontrar danos significativos ao DNA. Em sÃntese, os resultados sugerem que estes compostos podem ser usados como agentes antifÃngicos para o tratamento de candidemias / The incidence of opportunistic infections caused by fungi, with emphasis on Candida species has increased substantially. Studies report that there has been a notable increase of infections by non-albicans species (Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida krusei). Clinical isolates resistant to azoles, particularly fluconazole, are increasingly reported. The naphthoquinones are an important class of active molecules biologically presenting antibacterial, antifungal, antiviral, antiinflammatory, antipyretic, anti-cancer and trypanocidal and has been tested extensively in several pharmacological studies. In recent years intensified the interest in in this substances, not only due to your importance in vital biochemical processes as well as the increasing emphasis that they show in various pharmacological studies. This study aimed to evaluate and compare the effect of antifungal naphthoquinones against strains of Candida tropicalis resistant and susceptible to fluconazole, using different techniques such as broth microdilution methods, procedures Flow Cytometry procedures and Comet assay. We use seven strains of Candida tropicalis resistant to fluconazole for this study, which were isolated from blood and were part of the collection of yeasts Experimental Laboratory Bioprospecting in yeast (LABEL), affiliated with the Faculty of Pharmacy, Federal University of CearÃ. We used three compounds of naphthoquinones against the seven strains of Candida tropicalis and were subjected to in vitro sensitivity tests, which showed an antifungal activity potent. Through Flow Cytometry, it was possible to assess morphological changes and membrane integrity of these compounds fronts to significant strains in addition to mitochondrial dysfunction and production of reactive oxygen species. Through the Comet assay was possible to find significant damage to DNA. In summary, the results suggest that these compounds may be used as antifungal agents for the treatment of candidemia

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Um relevante nÃmero de espÃcies vegetais à descrito como plantas produtoras de um fluido leitoso comumente denominado de lÃtex. Nestas espÃcies, o lÃtex à sintetizado e armazenado sob pressÃo em um sistema de canais formados por cÃlulas altamente especializadas denominadas de laticÃferas, em cujos citoplasmas estÃo presentes todas as estruturas eucariontes em meio à Ãgua, borracha e inÃmeras molÃculas, muitas das quais especÃficas deste conteÃdo. Muitos estudos tÃm sugerido que molÃculas produzidas nestes fluidos participam da defesa vegetal. Neste trabalho, o lÃtex de 5 espÃcies foi coletado e processado em laboratÃrio para obtenÃÃo de suas fraÃÃes protÃicas e estas foram avaliadas quanto a atividade sobre fungos fitopatogÃnicos atravÃs de ensaios de inibiÃÃo da germinaÃÃo de esporos e crescimento de hifas. ProteÃnas do lÃtex de C. procera (PLCp), Cryptostegia grandiflora (PLCg) e Carica candamarcensis (P1 G10) apresentaram atividade antifÃngica enquanto que Plumeria rubra (PLPr) e Euphorbia tirucalli (PLEt) nÃo apresentaram atividade sobre qualquer dos fungos avaliados (Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger). A atividade inibitÃria das fraÃÃes protÃicas se correlacionou diretamente com a presenÃa de atividade proteolÃtica do tipo cisteÃnica presente nas amostras de PLCp, PLCg e P1G10. A atividade antifÃngica foi aumentada na presenÃa de DTT, um ativador destas proteases e foi diminuÃda ou eliminada quanto Ãs amostras foram prÃ-tratadas com iodoacetamida (IAA), um inibidor especÃfico de proteases cisteÃnicas. AlÃm disso, a atividade antifÃngica foi observada quando papaÃna, uma protease cisteÃnica purificada do lÃtex de Carica papaya foi avaliada, mas tripsina e quimotripsina, duas proteases serÃnicas nÃo apresentaram atividade. AtravÃs de cromatografia em coluna de Mono-S Sepharose acoplada ao sistema de FPLC, uma protease cisteÃnica foi isolada de PLCg. A proteÃna purificada (Cg24-I) apresentou massa molecular de 24,118 KDa. A Cg24-I apresentou atividade proteolÃtica mÃxima em pH 8,0 e foi inibida por IAA e E-64, utilizando azocaseÃna e BANA como substratos, respectivamente. Cg24-I inibiu a germinaÃÃo de F. solani e foi capaz de alterar a permeabilidade das membranas dos esporos na concentraÃÃo de 90 ng/ml. Esse conjunto de resultados sugere que proteinases cisteÃnicas de fluidos laticÃferos participam da defesa das plantas contra fungos fitopatogÃnicos e que o provÃvel mecanismo de aÃÃo destas proteÃnas seja a alteraÃÃo da permeabilidade da membrana plasmÃtica destes microrganismos. A descriÃÃo de atividade antifÃngica de proteases cisteÃnicas oriundas de fluidos laticÃferos nÃo à ainda descrita em detalhes na literatura, sendo este um trabalho com carÃter original. / Canal systems containing secretions, such as latex, are widely disseminated in the plant kingdom. These fluids are chemically complex and exhibit intense metabolism. Despite their origin, latex is the cytoplasm of specialized cells growing intrusively into organized tissues and organs, forming an interconnected network allowing latex exudation immediately after tissue damage. Insecticidal effects of latex proteins have been described, however minor studies were devoted to investigate antifungal activities in latex. In this study proteins extracted from latex of Calotropis procera (Ait.) R.Br (PLCp), Plumeria rubra L.(PLPr), Carica candamarcensis Hook F.(P1 G10), Cryptostegia grandiflora (PLCg), and Euphorbia tirucalli L. (PLEt) were tested for antifungal activity against six phytopathogens (Fusarium solani, F. oxysporium, Aspergilus niger, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. and Colletrotricum gloerosporioides). PLCp, PLCg and P1G10 exhibited antifungal activity and PLPr and PLEt were not efetive. Inhibitory activity of the protein fractions correlated with the cysteine-type proteolytic activity found in these fractions. The endogenous proteolytic activity and inhibitory activity on fungal growth were both increased when samples were first activated with DTT, a cysteine proteinase activator. Conversely, pre-treatment of samples with iodoacetamide, an inhibitor of these proteases rendered all samples deficient of both, proteolytic and antifungal activities. Antifungal of activity of cysteine proteinases of latex origin was also confirmed when papain, obtained from latex of Caryca papaya was tested while purified trypsin and chemotrysin, two serine-type proteases were not antifungal. A cysteine proteinase was thus, purified form PLCg by ion exchange chromatography on a Mono-S Sepharose matrix monitored by a FPLC system. The protein, named Cg24-I exhibited molecular mass of 26.118 KDa determined by MALDI spectrometry; maximum of proteolysis at pH 8.0 and inhibited by iodoacetamide and E-64 when assayed with azocazein or BANA as substrates. Cg24-I inhibited germination of F. solani and altered membrane permeability of spores at a minimum concentration of 90 ng/ml. Results present here suggest that cysteine proteinases of laticifer fluids are proteins with antifungal activity capable of damaging spore structure and inhibiting hyphae growth. Reports of antifungal activity of latex proteases are still scarce in literature and this work appears as an important contribution to this field. Furthermore, this work gives important evidence for the multiple defensive role of latex in plants.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera Lam. à uma planta originÃria do Noroeste da Ãndia, bem adaptada Ãs regiÃes tropicais. De suas sementes foi isolada uma nova proteÃna ligante à quitina, a Mo-CBP3, com propriedades coagulantes e atividade antifÃngica contra o fitopatÃgeno Fusarium solani. As proteÃnas foram extraÃdas da farinha delipidada de sementes com o tampÃo Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M. O teor mÃdio de proteÃna da farinha correspondeu a 216,44 mgP/gF. O extrato total foi fracionado em albuminas e globulinas por diÃlise contra Ãgua seguida de centrifugaÃÃo. As albuminas foram concentradas com sulfato de amÃnio a 90% de saturaÃÃo. A F0-90% foi submetida à cromatografia de afinidade em coluna de quitina, previamente equilibrada com o tampÃo de extraÃÃo. Foram obtidos um pico nÃo retido e dois picos retidos, correspondentes Ãs proteÃnas ligantes à quitina (CBP). O primeiro destes foi eluÃdo com soluÃÃo de N-acetil-D-glucosamina 0,1 M (PNAG), e o segundo, com Ãcido acÃtico 0,05 M, pH 3,0 (PAC). PNAG foi aplicado em coluna de troca catiÃnica, Resource S, acoplada a um sistema de FPLC, equilibrada com tampÃo acetato de sÃdio 0,05 M, pH 5,2. Dos picos obtidos, o terceiro correspondeu à proteÃna Mo-CBP3 - eluÃda com 0,5 M de NaCl no tampÃo de equilÃbrio. O teor protÃico mÃdio calculado para a proteÃna purificada Mo-CBP3 foi de 1,17 mgP/gF, representando um rendimento final de 0,54% das proteÃnas do extrato total. A massa molecular aparente por SDS-PAGE foi de 18,0 kDa sem o agente redutor e, de 9,0 kDa, na presenÃa deste. O resultado sugere que Mo-CBP3 seja uma proteÃna dimÃrica formada de subunidades idÃnticas, unidas por pontes dissulfeto. A massa molecular de Mo-CBP3, por cromatografia de exclusÃo molecular, foi de 14,34 kDa, e o pI de 10,8. Trata-se de uma glicoproteÃna com 2,5% de carboidratos, que nÃo apresenta atividade hemaglutinante ou quitinÃsica. Sua seqÃÃncia NH2-Terminal obtida foi CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, com 22 aminoÃcidos, confirmando sua caracterÃstica bÃsica. Mo-CBP3 mostrou-se tÃo eficiente quanto o AlK(SO4)2 na capacidade de coagular matÃria em suspensÃo na Ãgua. Mo-CBP3 foi fungicida para esporos de Fusarium solani a 0,1 mg/mL. O aquecimento da proteÃna a 98 ÂC, por 1 h, e a prÃ-incubaÃÃo com o aÃÃcar N-acetil-D-glucosamina, nÃo reverteram sua aÃÃo. Mo-CBP3 mostrou-se capaz de retardar o crescimento micelial do fungo ainda na menor dose testada, 0,05 mg/mL. Mo-CBP3 à inativa contra o oomiceto Pythium oligandrum, que apresenta celulose no lugar da quitina na parede celular. A proteÃna foi, ainda, capaz de inibir cerca de 80% da acidificaÃÃo do meio, por esporos de F. solani, induzida por glicose, o que sugere a influÃncia de Mo-CBP3 sobre as bombas de prÃtons (H+ATPases) presentes na membrana celular dos esporos deste fungo. / Moringa oleifera Lam. is native from Northwest India, well adapted to tropical regions. From its seeds it was isolated a new chitin binding protein, Mo-CBP3, which has coagulant properties and antifungal activity against the phytopathogen Fusarium solani. Proteins were extracted from defatted seeds flour by 0.05 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 0.15 M NaCl. The average protein content of the flour was 216.44 mgP/gF. The crude extract was fractionated in albumins and globulins by dialysis and centrifugation. Albumins were concentrated by 90% ammonium sulfate saturation. This fraction was applied into a chitin column, previously equilibrated with the same buffer. An unadsorbed and two adsorbed peaks were obtained. The first adsorbed peak was eluted with 0.1 M N-acetyl-D-glucosamine (PNAG), and the second one, with 0.05 M acetic acid, pH 3.0 (PAC). PNAG was applied into a cation exchange column, Resource S, equilibrated with 0.05 M sodium acetate buffer, pH 5.2. The third peak corresponded to Mo-CBP3 â eluted with 0.5 M NaCl in equilibrium buffer. The protein content of Mo- CBP3 was 1.17 mgP/gF. It represents a final yield of 0.54% of crude extract proteins. Apparent molecular mass by SDS-PAGE was 18.0 kDa in the absence of β-ME, and 9.0 kDa, in its presence. Results suggest that Mo-CBP3 is a dimeric protein, made of identical subunits, linked by disulfide bonds. By molecular exclusion chromatography, calculated molecular mass was 14.34 kDa, pI 10.8. Mo-CBP3 is a glycoprotein with 2.5% of carbohydrates, which has not hemagglutinating or chitinase activities. Its NH2- terminal sequence was CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, with 22 amino acids, conffirming its basic character. Mo-CBP3 was as efficient as AlK(SO4)2 in the capacity of coagulating suspended material in water. Mo-CBP3 (0.1 mg/mL) was fungicide to Fusarium solani spores. Heat treatment of the protein at 98 ÂC, du ring 1 h, and pre incubation with N-acetyl-D-glucosamine, did not reverse its action. Mo-CBP3 was able to retard the mycelial growth of the fungus even at the lowest tested dose of 0.05 mg/mL. Mo-CBP3 was inactive against the oomycete Pythium oligandrum, which has cellulose in spite of chitin in cell wall. Protein was also able to inhibit about 80% of medium acidification, induced by glucose, by F. solani spores, that suggests the influence of Mo-CBP3 over the proton pumps (H+ATPases) present in cellular membranes of F. solani spores.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O Cajueiro (Anacardium occidentale L.) à uma planta com uma grande importÃncia social e econÃmica no Nordeste do Brasil. O bagaÃo do pedÃnculo do caju à uma das maiores fontes de resÃduos (90-94%) produzidos pela indÃstria cajueira. Neste estudo, foram preparadas cinzas do bagaÃo e submetidas à anÃlise da composiÃÃo e a testes de atividade antifÃngica in vitro contra espÃcies de Fusarium. Esta anÃlise indicou uma cristalinidade em torno de 73%, correspondendo Ãs seguintes fases solÃveis: carbonato Ãcido de potÃssio - KHCO3 (39,54%), sulfato de potÃssio - K2SO4 (24,87%), e estruvita-K - MgKPO4 â 6H2O (8,59%). As fases amorfas (cerca de 27%) foram identificadas como a fraÃÃo insolÃvel de cinzas. A soluÃÃo apresentou alta atividade antifÃngica contra F. oxysporum, F. moniliforme e F. lateritium. Sua aÃÃo foi maior do que o Cercobin (tiofanato metÃlico), indicando uma possÃvel utilizaÃÃo como um agente antifÃngico nÃo tÃxico. / Cashew (Anacardium occidentale L.) is a plant with a highly social and economic importance in Northeast Brazil. Cashew peduncle bagasse is one of the greatest sources of residues (90â94%) produced by the cashew agronomic industry. In this study, we prepared cashew peduncle bagasse ashes and submitted them to compositional analysis and tests for antifungal activity in vitro against Fusarium species. This analysis indicated a crystallinity around 73%, corresponding to the following soluble phases: acid potassium carbonate- KHCO3 (39.54%), potassium sulfate - K2SO4 (24.87%), and struvite-K - MgKPO4Â6H2O (8.59%). The amorphous phases (around 27%) were identified as the insoluble fraction of ashes. The solution showed high antifungal activity against F. oxysporum, F. moniliforme and F. lateritium. This activity of this product was greater than that of Cercobin (thiophanate-methyl), indicating a possible use of this material as a non-toxic antifungal agent.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / MoÂ-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com massa molecular aparente de 18,0 kDa, consistindo de mÃltiplas isoformas heterodimÃricas. Mo-CBP3 à uma proteÃna altamente estÃvel, que possui amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos e mantÃm sua estrutura secundÃria e atividade antifÃngica em extremos de temperaturas e diferentes valores de pH. Dessa forma, a proteÃna Mo-CBP3 se apresenta como uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de plantas transgÃnicas resistentes ao ataque de fungos. Para tanto, Mo-CBP3 foi submetida a testes de biosseguranÃa alimentar, visando garantir sua utilizaÃÃo atravÃs da expressÃo em plantas, minimizando, assim, os riscos para animais nÃo alvo, incluindo o homem. A avaliaÃÃo de biosseguranÃa alimentar da proteÃna seguiu o teste de duas etapas, baseado em pesos de evidÃncia, proposto pelo Instituto Internacional de CiÃncias da Vida (ILSI). A pesquisa evidenciou o longo histÃrico de uso seguro, fundamentado em dados cientÃficos, da espÃcie M. oleifera, fonte da proteÃna Mo-CBP3. AnÃlises in silico mostraram que Mo-CBP3 nÃo possui qualquer identidade com proteÃnas alergÃnicas, tÃxicas e/ou antinutricionais. Adicionalmente, nÃo foram encontrados na proteÃna epÃtopos potencialmente capazes de promover reaÃÃo cruzada e desencadear uma resposta alergÃnica. Identidade com proteÃnas alergÃnicas (> 35%) foi encontrada apenas quando uma janela de 80 aminoÃcidos foi utilizada. SÃtios potenciais de N-glicosilaÃÃo nÃo foram encontrados na proteÃna madura. A proteÃna mostrou resistÃncia ao tratamento tÃrmico e à digestibilidade por fluido gÃstrico simulado, mas foi completamente susceptÃvel à digestÃo em fluido intestinal simulado. Em adiÃÃo, Mo-CBP3 nÃo causou efeitos adversos relevantes em camundongos submetidos a doses elevadas de 5 a 2000 mg/kg, via oral, evidenciando seu carÃter inÃcuo. A partir da avaliaÃÃo de biosseguranÃa alimentar proposta pelo ILSI nÃo à esperado qualquer risco associado ao consumo da proteÃna Mo-CBP3 pelo homem e demais animais monogÃstricos. / Mo-CBP3 is a chitin binding protein purified from Moringa oleifera seeds which has an apparent molecular mass of 18.0 kDa and consists of multiple heterodimeric isoforms. Mo-CBP3 is a highly stable protein that has a broad spectrum of activity against phytopathogenic fungi and maintains its secondary structure and antifungal activity at extreme temperatures and different pH values. Thus, the Mo-CBP3 protein presents itself as a promising tool for the development of transgenic plants resistant to fungi attack. For such purpose, the Mo-CBP3 protein was subjected to food safety tests to ensure the safety of its expression in plants, minimizing the risk to non-target animals, which include human beings. The food safety assessment of the protein followed the two-tiered approach, based on weight of evidences, proposed by International Life Sciences Institute (ILSI). The research evidenced the long history of safe use, supported by scientific literature, of the M. oleifera species, source of Mo-CBP3 protein. In silico analysis did not reveal any identity of Mo-CBP3 with allergenic, toxic and/or antinutritional proteins. Additionally, were not found in the protein potential epitopes able to lead to cross reaction and unleash an allergic response. Identity with allergenic proteins was found only when a window of 80 amino acids was used. Potential sites of N-glycosylation were not found in the mature protein. The protein showed resistance to thermal treatment and digestibility by simulated gastric fluid, but was completely susceptible to digestion in simulated intestinal fluid. In addition, Mo-CBP3 caused no relevant adverse effects to mice subjected to high oral doses from 5 to 2000 mg/kg, showing its innocuous nature. Based on the food safety approach proposed by ILSI is not expected any risk associated to use of Mo-CBP3 protein for humans and other monogastric animals.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O resÃduo (torta) obtido apÃs a extraÃÃo de Ãleo das sementes de pinhÃo-manso (Jatropha curcas) para a produÃÃo de biodiesel à tÃxico. Apesar dos entraves relacionados à sua utilizaÃÃo na alimentaÃÃo animal, existem evidÃncias de que esse resÃduo tem grande potencial de utilizaÃÃo biotecnolÃgica graÃas ao arsenal de molÃculas que o constitui. Assim, o presente trabalho teve como foco a purificaÃÃo e caracterizaÃÃo de um inibidor de tripsina da torta de pinhÃo-manso, vislumbrando um maior aproveitamento desse resÃduo. A anÃlise da composiÃÃo centesimal revelou ser a torta de pinhÃo-manso composta principalmente por proteÃnas (37,21%), fibras (34,26%) e lipÃdios (19,16%). O extrato bruto obtido a partir da torta sob condiÃÃo alcalina (tampÃo borato de sÃdio 100 mM, pH 10,0) mostrou a presenÃa de lectina (319,76 UH/gF), inibidor de papaÃna (1.287,38 UI/gF), protease (2,69 UA/gF) e, principalmente, de inibidor de tripsina (1.649,7 UI/gF). O inibidor de tripsina, denominado JcTI, foi purificado do extrato bruto por fracionamento com Ãcido tricloroacÃtico (2,5%) seguido de cromatografias de afinidade (tripsina-sepharose-4B) e de exclusÃo molecular (sephacryl S-200). JcTI à uma glicoproteÃna (6,4% de carboidratos) com massa molecular na faixa de 20-21 kDa, pI de 6,6, sequÃncia NH2-terminal (VRDICKKEAERQDLSSCENYITQRRGY) exibindo similaridade em torno de 60% com albuminas vegetais e altamente estÃvel ao calor, salinidade e pH. JcTI (500 Âg/mL) retardou o crescimento de vÃrios fungos fitopatogÃnicos de importÃncia agrÃcola, incluindo Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum e Fusarium solani. Esse inibidor tambÃm mostrou atividade antibacteriana frente a bactÃrias patogÃnicas ao homem, tais como Bacillus subtilis, Salmonella choleraesuis e Staphylococcus aureus, com concentraÃÃo inibitÃria mÃnima inferior a 5 Âg/mL. Os resultados obtidos demonstram o potencial do JcTI para aplicaÃÃo biotecnolÃgica como uma nova proteÃna de defesa contra fungos fitopatogÃnicos e bactÃrias patogÃnicas ao homem. / The residue (cake) obtained after the extraction of oil from jatropha (Jatropha curcas) seeds for biodiesel production is toxic. Despite of the obstacles related to its use in the animal feed, there are evidences that this residue has great potential for biotechnology applications due to its arsenal of molecules. Thus, the present study aimed to purify and characterize a trypsin inhibitor from jatropha cake, in order to make a better use of this residue. The centesimal composition analysis showed to be the jatropha cake mainly composed of proteins (37.21%), fiber (34.26%) and lipids (19.16%). The crude extract obtained from the jatropha cake under alkaline condition (100 mM sodium borate buffer, pH 10.0) showed the presence of lectin (319.76 HU/gF), papain inhibitor (1,287.38 IU/gF), protease (2.69 AU/gF) and, especially, trypsin inhibitor (1,649.7 IU/gF). The trypsin inhibitor, named JcTI, was purified by fractionation of the crude extract with trichloroacetic acid (2.5%) followed by affinity chromatography (trypsin-sepharose-4B) and molecular exclusion (sephacryl S-200). JcTI is a glycoprotein (6.4% carbohydrates) with molecular mass in the range of 20-21 kDa, pI of 6.6, NH2-terminal sequence (VRDICKKEAERQDLSSCENYITQRRGY) showing identity around 60% with plant albumins and highly stable to heat, pH and salinity. JcTI (500 Âg/mL) slowed the growth of important phytopthogenic fungi, including Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum and Fusarium solani. This inhibitor also presented antibacterial activity against human pathogenic bacteria such as Bacillus subtilis, Salmonella choleraesuis and Staphylococcus aureus, with minimum inhibitory concentration less than 5 Âg/mL. The results demonstrate the potential of JcTI for biotechnological application as a new defense protein against phytopthogenic fungi and human pathogenic bacteria.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos. No presente trabalho, novas propriedades estruturais da Mo-CBP3 sÃo descritas, revelando correlaÃÃo entre sua estabilidade estrutural e atividade antifÃngica. Em adiÃÃo, para melhor compreensÃo dos mecanismos pelos quais essa proteÃna exerce aÃÃo antifÃngica, sua habilidade de induzir a produÃÃo endÃgena de espÃcies reativas de oxigÃnio e de causar alteraÃÃes morfolÃgicas e ultraestruturais foi analisada, usando Fusarium solani como modelo. F. solani à uma espÃcie de fÃcil manuseio e desenvolvimento rÃpido, ideal para ensaios in vitro, e de relevÃncia, por se tratar de um fungo que ataca culturas economicamente importantes. Com foco na utilizaÃÃo segura da Mo-CBP3 como agente quÃmico contra fungos, seus efeitos citotÃxicos sobre cÃlulas eucariÃticas tambÃm foram investigados. Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina de 18,0 kDa, de acordo com PAGE-SDS. Todavia, anÃlise por espectrometria de massas revelou que essa proteÃna consiste de mÃltiplas isoformas com massas moleculares variando entre 12,2 e 12,3 kDa. Mo-CBP3 à composta por duas cadeias polipeptÃdicas de 5,0 e 9,0 kDa, denominadas de cadeia A e cadeia B, respectivamente. A cadeia B contÃm a sequÃncia NH2-terminal representada por CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, enquanto que a cadeia A tem o resÃduo NH2-terminal bloqueado. cDNA codificador da cadeia B foi obtido com iniciadores sintetizados a partir de sua sequÃncia NH2-terminal. AnÃlises in silico das sequÃncias de nucleotÃdeos e de aminoÃcidos deduzida confirmaram a presenÃa de isoformas e massa molecular da Mo-CBP3 e identificaram sÃtios potenciais de O-glicosilaÃÃo e fosforilaÃÃo. AlÃm disso, similaridades entre Mo-CBP3 e outras proteÃnas de M. oleifera, bem como com albuminas 2S, foram detectadas. A estrutura secundaria da Mo-CBP3 à composta por 30,3% α-hÃlices, 16,3% folhas β, 22,3% voltas e 30,4% estruturas ao acaso. Na espectroscopia de fluorescÃncia, excitaÃÃes de uma soluÃÃo da Mo-CBP3 a 280 nm e 295 nm produziram emissÃo mÃxima a 303 e 309 nm, respectivamente. A estrutura da Mo-CBP3 à altamente estÃvel, se apresentando indiferente Ãs mudanÃas de temperatura e pH. Mo-CBP3 (0,05-0,1 mg/mL) se mostrou capaz de inibir a germinaÃÃo de conÃdios de vÃrios fungos fitopatogÃnicos, incluindo F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae e C. gloeosporioides. Similarmente, Mo-CBP3 (0,05 mg/mL) foi capaz de inibir o crescimento micelial de F. solani e apresentou tanto efeito fungistÃtico como fungicida, dependendo da concentraÃÃo usada. LigaÃÃo da Mo-CBP3 à superfÃcie de cÃlulas fÃngicas ocorre, pelo menos em parte, via interaÃÃo eletrostÃtica, jà que NaCl 0,15 M aboliu seu efeito inibitÃrio. Mo-CBP3 induziu a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio e causou perda de assimetria e deformaÃÃes em cÃlulas de F. solani. DesorganizaÃÃo do sistema de endomembranas, condensaÃÃo do citosol e aumento de vacuolizaÃÃo tambÃm foram observados. Mo-CBP3 nÃo mostrou atividade hemolÃtica e nem foi capaz de alterar a viabilidade das cÃlulas MCF-7 e Caco-2, sugerindo que essa proteÃna nÃo à tÃxica para cÃlulas humanas. Com base na alta estabilidade e no amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos em baixas concentraÃÃes e, tambÃm, na ausÃncia de citotoxicidade para cÃlulas humanas testadas, Mo-CBP3 tem grande potencial para desenvolvimento de novas drogas antifÃngicas ou na produÃÃo de plantas transgÃnicas mais resistentes a fungos. / Mo-CBP3 is a chitin-binding protein purified from Moringa oleifera seeds that displays broad inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In this work, we report new structural features of Mo-CBP3 that reveal a correlation between its structural stability and antifungal activity. In addition, to gain better insights into the mechanisms by which this protein acts as an antifungal agent, its ability to induce the endogenous production of reactive oxygen species and to trigger morphologic and ultrastructural alterations were analysed using Fusarium solani as a model. F. solani is an easy-to-handle and fast-developing species, making it ideal for in vitro assays, and it holds relevance as a phytopathogenic fungus that attacks economically important crop plants. To fully explore the biosafety of Mo-CBP3 as a chemical agent against fungi, its cytotoxic effects on eukaryotic cells were also investigated. Mo-CBP3 is a chitin-binding protein of 18.0 kDa, according to SDS-PAGE. However, by mass spectrometry analysis, it was observed that this protein consists of multiple isoforms with molecular masses ranging between 12.2 and 12.3 kDa. Mo-CBP3 is composed by two polypeptide chains of 5.0 and 9.0 kDa, named A and B chain, respectively. The B chain contains the following NH2-terminal sequence CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ while the A chain has a blocked NH2-terminal residue. cDNA encoding the B chain was obtained with primers of its NH2-terminal sequence. In silico analyses of nucleotide and deduced amino acid sequences confirmed the presence of isoforms and molecular mass of Mo-CBP3 and identified potential sites of O-glicosylation and phosphorilation. Moreover, similarities between Mo-CBP3 and other M. oleifera proteins as well as 2S albumins were detected. The secondary structure of Mo-CBP3 showed 30.3% α-helices, 16.3% β-sheets, 22.3% turns and 30.4% unordered forms. In the fluorescence spectroscopy, excitation of Mo-CBP3 solution at 280 nm and 295 nm gave emission maxima at 303 and 309 nm, respectively. The Mo-CBP3 structure is highly stable and retains its antifungal activity regardless of temperature and pH. Mo-CBP3 (0.05-0.1 mg/mL) was able to inhibit the conidia germination of several phytopathogenic fungi, including F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae and C. gloeosporioides. Similarly, Mo-CBP3 was inhibitory to the mycelial mass development of F. solani at 0.05 mg/mL and has both fungistatic and fungicidal effects, depending on the concentration used. Binding of Mo-CBP3 to the fungal cell surface is achieved, at least in part, via electrostatic interactions, as 150 mM NaCl abolished its inhibitory effect. Mo-CBP3 induced the production of reactive oxygen species and caused in F. solani cells a marked loss of asymmetry, deformations and deep wrinkles in comparison to control cells. Disorganisation of the endomembrane system and condensation and shrinkage of cytosol with increased vacuolation and the loss of normal structure and content were also observed. Mo-CBP3 did not show haemolytic activity and it was not capable to alter de viability of both MCF-7 and Caco-2 cells, suggesting that this protein is not toxic for human cells. Based on its high stability and broad-spectrum efficacy against important phytopathogenic fungi at low inhibitory concentrations and absence of cytotoxicity to human cells, Mo-CBP3 has great potential in the development of new antifungal drugs or in transgenic crops with enhanced resistance to fungi.