Doctora en Bioquímica / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / La macroautofagia (autofagia) es una vía de reciclaje caracterizada por la formación de vesículas de doble membrana denominadas autofagosomas que secuestran estructuras citoplasmáticas marcadas para su degradación. La formación del autofagosoma requiere la actividad de proteínas relacionadas con la autofagia (Atg) que median algunas de las cuatro etapas principales de la autofagia: iniciación, nucleación, expansión y cierre. La proteína MAP1LC3B (referida sólo como LC3) es una de las Atg más importantes ya que ayuda a elongar la membrana y reclutar al cargo. Su forma lipidada (LC3-II) se encuentra en ambas superficies del autofagosoma (externa e interna) donde se degrada con su cargo cuando el autofagosoma se fusiona con el lisosoma. La autofagia se regula principalmente por modificaciones post-traduccionales y modificaciones lipídicas de las proteínas Atg. Además, en algunos escenarios, la inducción de la autofagia se acompaña de aumentos en los niveles de mRNA de ciertos genes asociados a la autofagia, como LC3, ATG5 o ATG12. Sin embargo, prácticamente se desconocen los mecanismos que controlan la traducción de las proteínas Atg. Estudios recientes con la cochaperona Bag3 han mostrado controlar la degradación selectiva de proteínas mal plegadas a través de autofagia, incluyendo huntingtina con expansiones de poli-Q y SOD1 mutante. El mecanismo involucra la asociación de Bag3 a dineína y microtúbulos para el transporte de proteínas mal plegadas a los agresomas, facilitando su eliminación por la autofagia. Además del papel en el plegamiento y degradación de proteínas, recientemente se ha descrito que la chaperona Hsp70 regula la traducción de proteínas. Los últimos trabajos muestran que Bag3 es una proteína que induce la lipidación LC3 pero no hay antecedentes sobre el mecanismo utilizado. En esta tesis se estudió cómo Bag3 controla la autofagia en células HeLa. Para este fin Bag3 se silenció con un siRNA ó shRNA, o se expresó con plasmidios. Los niveles de mRNA, proteínas y estado de fosforilación de varias proteínas Atg, particularmente de LC3I y LC3II, mTOR y AMPK. Además, se determinó si Bag3 es necesaria para la inducción de la autofagia en condiciones de estrés como la privación de nutrientes e inhibición del proteasoma. Los resultados mostraron que Bag3 mantiene los niveles basales de la proteína LC3 en células HeLa, controlando la traducción de su mRNA. El efecto de Bag3 es aparentemente específico para LC3 dado que otras proteínas Atg no fueron afectadas. De hecho, la conversión de LC3I a LC3II por inductores autofagia, como la privación de nutrientes y la inhibición del proteosoma, no se observó afectada. Se concluye que Bag3 regula niveles proteicos totales de LC3, manteniendo su traducción / Macroautophagy (autophagy) is a recycling pathway characterized by the formation of double-membrane vesicles called autophagosomes, which sequester cytoplasmic structures targeted for destruction. Autophagosome formation requires the activity of autophagy-related proteins (Atg), which are shown to participate in the four major steps: initiation, nucleation, expansion and closure. MAP1LC3B (referred only as LC3) is most important Atg protein, aiding to elongate the membrane and recruit the cargo. The lipidated form of LC3 (LC3-II) lies on both surfaces of autophagosome (external and internal) where it degrades with its cargo when the autophagosome fuses with the lysosome. Autophagy is mainly regulated by post-translational modifications and lipid modifications of Atg proteins. Moreover, in some scenarios, the induction of autophagy is accompanied by an increase in the mRNA levels of certain genes associated to autophagy, such as LC3, ATG5 or ATG12. However, less work has done on the study of mechanisms controlling translation of the Atg proteins. In recent studies, Bag3 has shown to control the selective degradation of misfolded proteins by autophagy, including polyQ-expanded huntingtin and mutant SOD1. The mechanism involves Bag3 association to dynein and microtubules to transport misfolded proteins to the aggresomes and facilitates their clearance by autophagy. Besides the role in folding and degradation of proteins, recently has shown a role of the Hsp70 chaperone in the regulation of the translation of proteins. The last reports show that Bag3 is a protein that induces LC3 lipidation but little is known about the mechanisms used. In the present work, we study how Bag3 controls the autophagy pathway in HeLa cells. Bag3 was knockdown with siRNA or shRNA, or expressed with plasmids. mRNA levels, protein levels and phosphorylation status of several Atg, particularly of LC3I and LC3II, mTOR and AMPK were evaluated. In addition, it was determined whether Bag3 is required for the induction of autophagy in stress conditions such as nutrient deprivation and inhibition of the proteasome. Our results showed that Bag3 maintains the basal protein levels of LC3 in HeLa cells, controlling the translation of its mRNA. This effect was apparently specific for LC3 because the levels of other Atg proteins remained unchanged. The LC3I conversion to LC3II did not alter by autophagy inductors such as nutrient deprivation or proteasome inhibition. We concluded that Bag3 maintains the basal protein levels of LC3, controlling the translation of its mRNA / Conicyt Fondecyt Fondap Proyecto Anillo ACT 1111

A autofagia é um processo dinâmico de degradação de componentes celulares e está reconhecidamente envolvida em processos fisiológicos e patológicos. Por isso, uma melhor compreensão do processo autofágico é necessária para permitir sua manipulação em intervenções terapêuticas. Vários métodos têm sido desenvolvidos e amplamente utilizados para a determinação de diversos aspectos do processo autofágico, porém a falta de ensaios quantitativos rápidos pode prejudicar o desenvolvimento de terapias tendo a autofagia como alvo. O marcador laranja de acridina (AO) é um fluoróforo metacromático que fluoresce vermelho em organelas vesiculares ácidas (AVOs) e verde no restante da célula, sendo assim, a marcação com AO um método rápido e barato para detecção deste tipo de organelas, que aumentam durante a indução de autofagia. Entretanto, a especificidade da marcação com AO para quantificação de autofagia tem sido questionada. Desse modo, desenvolvemos uma nova abordagem para sua análise, considerando a razão de fluorescências verde e vermelha obtida a partir de citometria de fluxo. Com essa abordagem para análise de dados de marcação com AO foi possível detectar o aumento de autofagia induzido por rapamicina, e também o bloqueio pelo inibidor de acidificação lisossomal bafilomicina A1 bem como pelo silenciamento de genes da maquinaria molecular central que controlam a autofagia em diferentes etapas. Em comparação com a forma mais comum de analisar dados de AO, que considera somente a fluorescência vermelha, os resultados obtidos com a forma de análise proposta nesse trabalho tiveram uma melhor correlação com outros métodos bem estabelecidos para quantificação de autofagia, como conversão de LC3-I/II, degradação de SQSTM1/p62 e ensaio de formação de pontos de GFP-LC3. Essa nova maneira de analisar dados da marcação com AO pode permitir que este método fácil seja utilizado como uma abordagem inicial e objetiva para a avaliação de um passo tardio do processo autofágico em células individuais, complementando a utilização de outros métodos. / Autophagy is a dynamic process of degradation of cellular components that is involved in developmental processes and various diseases. Therefore, a better understanding of autophagy is needed to allow its manipulation for therapeutic purposes. Several methods have been developed and extensively employed in determining various aspects of the autophagic process, but the lack of rapid and quantitative autophagy assays has impaired the development of autophagy-targeting therapies. Acridine orange (AO) is a cell permeable metachromatic fluorophore that fluoresces red in Acidic Vesicular Organelles (AVOs) and green in the remaining of the cell. Therefore, AO staining is a fast and cheap method to assess AVO mass in a cell, which increases upon autophagy induction. Since the specificity of AO staining for measuring autophagy has been questioned, we developed a ratiometric analysis of autophagy, considering the red-to-green fluorescence ratio to quantify data obtained from AO flow cytometry. This method measured with accuracy the increase in autophagy induced by rapamycin, which was blocked by the lysosome acidification inhibitor bafilomycin A1 as well as stable knockdown of genes that regulate different steps in the autophagy pathway. In comparison to the most-commonly used threshold, that considers only the absolute red fluorescence, the results obtained with our proposed threshold setting had higher correlation with well-established specific methods for autophagy quantification, such as LC3-I to LC3-II conversion, SQSTM1 degradation and GFP-LC3 puncta formation assay. This new way of AO data analysis will allow this simple assay to be used as an initial and objective method for evaluating the late step of the autophagic process in individual cells, complementing other methods.

A autofagia é um processo dinâmico de degradação de componentes celulares e está reconhecidamente envolvida em processos fisiológicos e patológicos. Por isso, uma melhor compreensão do processo autofágico é necessária para permitir sua manipulação em intervenções terapêuticas. Vários métodos têm sido desenvolvidos e amplamente utilizados para a determinação de diversos aspectos do processo autofágico, porém a falta de ensaios quantitativos rápidos pode prejudicar o desenvolvimento de terapias tendo a autofagia como alvo. O marcador laranja de acridina (AO) é um fluoróforo metacromático que fluoresce vermelho em organelas vesiculares ácidas (AVOs) e verde no restante da célula, sendo assim, a marcação com AO um método rápido e barato para detecção deste tipo de organelas, que aumentam durante a indução de autofagia. Entretanto, a especificidade da marcação com AO para quantificação de autofagia tem sido questionada. Desse modo, desenvolvemos uma nova abordagem para sua análise, considerando a razão de fluorescências verde e vermelha obtida a partir de citometria de fluxo. Com essa abordagem para análise de dados de marcação com AO foi possível detectar o aumento de autofagia induzido por rapamicina, e também o bloqueio pelo inibidor de acidificação lisossomal bafilomicina A1 bem como pelo silenciamento de genes da maquinaria molecular central que controlam a autofagia em diferentes etapas. Em comparação com a forma mais comum de analisar dados de AO, que considera somente a fluorescência vermelha, os resultados obtidos com a forma de análise proposta nesse trabalho tiveram uma melhor correlação com outros métodos bem estabelecidos para quantificação de autofagia, como conversão de LC3-I/II, degradação de SQSTM1/p62 e ensaio de formação de pontos de GFP-LC3. Essa nova maneira de analisar dados da marcação com AO pode permitir que este método fácil seja utilizado como uma abordagem inicial e objetiva para a avaliação de um passo tardio do processo autofágico em células individuais, complementando a utilização de outros métodos. / Autophagy is a dynamic process of degradation of cellular components that is involved in developmental processes and various diseases. Therefore, a better understanding of autophagy is needed to allow its manipulation for therapeutic purposes. Several methods have been developed and extensively employed in determining various aspects of the autophagic process, but the lack of rapid and quantitative autophagy assays has impaired the development of autophagy-targeting therapies. Acridine orange (AO) is a cell permeable metachromatic fluorophore that fluoresces red in Acidic Vesicular Organelles (AVOs) and green in the remaining of the cell. Therefore, AO staining is a fast and cheap method to assess AVO mass in a cell, which increases upon autophagy induction. Since the specificity of AO staining for measuring autophagy has been questioned, we developed a ratiometric analysis of autophagy, considering the red-to-green fluorescence ratio to quantify data obtained from AO flow cytometry. This method measured with accuracy the increase in autophagy induced by rapamycin, which was blocked by the lysosome acidification inhibitor bafilomycin A1 as well as stable knockdown of genes that regulate different steps in the autophagy pathway. In comparison to the most-commonly used threshold, that considers only the absolute red fluorescence, the results obtained with our proposed threshold setting had higher correlation with well-established specific methods for autophagy quantification, such as LC3-I to LC3-II conversion, SQSTM1 degradation and GFP-LC3 puncta formation assay. This new way of AO data analysis will allow this simple assay to be used as an initial and objective method for evaluating the late step of the autophagic process in individual cells, complementing other methods.

A autofagia é um processo dinâmico de degradação de componentes celulares e está reconhecidamente envolvida em processos fisiológicos e patológicos. Por isso, uma melhor compreensão do processo autofágico é necessária para permitir sua manipulação em intervenções terapêuticas. Vários métodos têm sido desenvolvidos e amplamente utilizados para a determinação de diversos aspectos do processo autofágico, porém a falta de ensaios quantitativos rápidos pode prejudicar o desenvolvimento de terapias tendo a autofagia como alvo. O marcador laranja de acridina (AO) é um fluoróforo metacromático que fluoresce vermelho em organelas vesiculares ácidas (AVOs) e verde no restante da célula, sendo assim, a marcação com AO um método rápido e barato para detecção deste tipo de organelas, que aumentam durante a indução de autofagia. Entretanto, a especificidade da marcação com AO para quantificação de autofagia tem sido questionada. Desse modo, desenvolvemos uma nova abordagem para sua análise, considerando a razão de fluorescências verde e vermelha obtida a partir de citometria de fluxo. Com essa abordagem para análise de dados de marcação com AO foi possível detectar o aumento de autofagia induzido por rapamicina, e também o bloqueio pelo inibidor de acidificação lisossomal bafilomicina A1 bem como pelo silenciamento de genes da maquinaria molecular central que controlam a autofagia em diferentes etapas. Em comparação com a forma mais comum de analisar dados de AO, que considera somente a fluorescência vermelha, os resultados obtidos com a forma de análise proposta nesse trabalho tiveram uma melhor correlação com outros métodos bem estabelecidos para quantificação de autofagia, como conversão de LC3-I/II, degradação de SQSTM1/p62 e ensaio de formação de pontos de GFP-LC3. Essa nova maneira de analisar dados da marcação com AO pode permitir que este método fácil seja utilizado como uma abordagem inicial e objetiva para a avaliação de um passo tardio do processo autofágico em células individuais, complementando a utilização de outros métodos. / Autophagy is a dynamic process of degradation of cellular components that is involved in developmental processes and various diseases. Therefore, a better understanding of autophagy is needed to allow its manipulation for therapeutic purposes. Several methods have been developed and extensively employed in determining various aspects of the autophagic process, but the lack of rapid and quantitative autophagy assays has impaired the development of autophagy-targeting therapies. Acridine orange (AO) is a cell permeable metachromatic fluorophore that fluoresces red in Acidic Vesicular Organelles (AVOs) and green in the remaining of the cell. Therefore, AO staining is a fast and cheap method to assess AVO mass in a cell, which increases upon autophagy induction. Since the specificity of AO staining for measuring autophagy has been questioned, we developed a ratiometric analysis of autophagy, considering the red-to-green fluorescence ratio to quantify data obtained from AO flow cytometry. This method measured with accuracy the increase in autophagy induced by rapamycin, which was blocked by the lysosome acidification inhibitor bafilomycin A1 as well as stable knockdown of genes that regulate different steps in the autophagy pathway. In comparison to the most-commonly used threshold, that considers only the absolute red fluorescence, the results obtained with our proposed threshold setting had higher correlation with well-established specific methods for autophagy quantification, such as LC3-I to LC3-II conversion, SQSTM1 degradation and GFP-LC3 puncta formation assay. This new way of AO data analysis will allow this simple assay to be used as an initial and objective method for evaluating the late step of the autophagic process in individual cells, complementing other methods.

Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctor en Farmacología / Doxorrubicina es un efectivo agente quimioterápico ampliamente utilizado en el tratamiento de diversos tipos de cáncer. Sin embargo, su cardiotoxicidad es el principal factor limitante y puede presentarse como una cardiomiopatía aguda o crónica. En este último caso, el paciente puede desarrollar cardiomiopatía dilatada e incluso insuficiencia cardíaca. Múltiples mecanismos participan en la cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina, entre los que se incluyen formación de especies reactivas del oxígeno (ROS), alteraciones en la estructura sarcomérica, disfunción mitocondrial, sobrecarga de calcio y un conjunto de alteraciones en diferentes procesos intracelulares que conducen a la muerte de cardiomiocitos por apoptosis y/o necrosis. Actualmente se ha propuesto a la autofagia como una forma alternativa de muerte celular. Sin embargo, para considerarla como tal, es necesario analizarla en el contexto en el cual se desarrolla y la magnitud y/o duración del estímulo que la provoca. La autofagia es un proceso fundamental para la célula. La autofagia basal degrada proteínas de vida media larga, organelos envejecidos y material intracelular, permitiendo la reutilización del material citoplasmático. Sin embargo, en condiciones desfavorables, como la privación de nutrientes o carencia de factores de crecimiento, este proceso se activa para proporcionar sustratos para la síntesis de proteínas y ATP para restablecer la homeostasis celular. La autofagia es un proceso dinámico que procede con el secuestro de material citoplasmático dentro de vacuolas de doble membrana llamadas autofagosomas, que al fusionarse con los lisosomas, degradan el material incorporado. Diferentes vías de señalización regulan la autofagia, siendo la vía de la PI3K/AKT/mTOR una de las más importantes para inhibir este proceso. En la literatura no está claro el efecto de la doxorrubicina sobre la autofagia debido principalmente a las diferencias en los modelos de estudio. Dado el papel fundamental de la autofagia basal en la homeostasis celular, es relevante investigar cómo la doxorrubicina altera este proceso y su relación con la muerte del cardiomiocito. Para realizar esta investigación, en cultivos primarios de cardiomiocitos de rata neonata se expusieron a doxorrubicina 1 μM por 24 h o curso temporal, para caracterizar el tipo de muerte celular gatillada por doxorrubicina y posteriormente determinar el efecto sobre la autofagia. Los resultados mostraron que el tratamiento con doxorrubicina 1 μM por 24 horas produjo un aumento de la muerte de los cardiomiocitos por necrosis, lo que se evidenció por incrementos en la liberación de LDH, disminución del contenido de ATP y por un aumento en la marca anexina V-FITC al compararlos con la condición control. Además se observó muerte por apoptosis, con un aumento máximo en los niveles de la proteína caspasa 3 fragmentada a las 6 horas, respecto de su condición control. Para investigar el efecto de doxorrubicina sobre la autofagia se evaluaron los niveles de las proteínas LC3 y p62 por Western blot. Los resultados mostraron menores niveles de ambas proteínas a las 24 horas de exposición con respecto de la situación control. Estos resultados no son concluyentes para establecer que la autofagia está inhibida. Por lo tanto, para aclarar este punto se determinaron los niveles de LC3 y p62 en condición de flujo autofágico, es decir utilizando el inhibidor de la fusión autofagosoma-lisosoma, bafilomicina A durante el mismo período de tiempo de exposición a doxorrubicina. Los resultados mostraron que en la condición doxorrubicina más bafilomicina A, los niveles de las proteínas LC3 y p62 fueron menores que en la situación control más bafilomicina A. De acuerdo a las condiciones en que se mantuvieron los cardiomiocitos, los resultados indican que doxorrubicina inhibió la autofagia basal. Para relacionar el efecto inhibitorio de doxorrubicina sobre la autofagia con la muerte celular, se determinó el porcentaje de muerte por liberación de LDH, inhibiendo la autofagia con bafilomicina A, 3-metiladenina y con un siRNA para beclin 1. Los resultados mostraron que al inhibir la autofagia en presencia de Doxorrubicina aumentó aún más el porcentaje de muerte de los cardiomiocitos. Por el contrario, la utilización del inductor de la autofagia rapamicina disminuyó el porcentaje de muerte. Estos resultados indican que la autofagia es importante para la sobrevida del cardiomiocito y que su inhibición con doxorrubicina favorece la muerte celular. Por último, doxorrubicina aumentó los niveles de la forma fosforilada de AKT y p70S6K y disminuyó los niveles de Beclin, sugiriendo que la doxorrubicina además activa la vía transduccional que regula negativamente a la autofagia. En conclusión, los resultados indican que la doxorrubicina inhibe la autofagia basal y contribuye a la muerte del cardiomiocito. Estos resultados se podrían postular como un nuevo mecanismo que permitiría explicar la cardiotoxicidad de este antineoplásico / Doxorubicin is an effective chemotherapeutic drug widely used in the treatment of several types of cancer. However, its cardiotoxicity represents the mayor limiting factor. Cardiotoxicity may develop as either acute or chronic cardiomyopathy. In the last case, the patient developes dilated cardiomyopathy and eventually heart failure. Multiple mechanisms have been proposed in doxorubicin-induced cardiotoxicity, including reactive oxygen species (ROS) generation, sarcomere structure alterations, mitochondrial dysfunction, calcium overload and a set of other alterations in key intracellular processes. All of them lead to the loss of cardiomyocytes by apoptosis and/or necrosis. Autophagy has been proposed as alternative form of cell death. However, it is important to bear in mind the context in which it takes place and the magnitude and/or exposure time of the stimulus. Autophagy is an essential cell process. Basal autophagy degrades long half-life proteins, aged and dysfunctional organelles and intracellular materials allowing their reutilization. However, under unfavorable conditions such as starvation or lack of growth factors, this process increases its activity by providing substrates for the synthesis of novel proteins and ATP to restore cell homeostasis. Autophagy is a dynamic process involving the engulfment of cytoplasmic materials within double membrane vacuoles called autophagosomes. Then, they fused with lysosomes to degrade the sequestered material. Different signaling pathways regulate autophagy, being the PI3K/AKT/mTOR pathway one of the most important to inhibit this process. In the literature, it remains unclear the effect of doxorubicin on cardiomyocyte basal autophagy due to the different experimental models and conditions used in those works. Given the key role of basal autophagy on cell homeostasis, it is important to investigate if doxorubicin can alter this process and its relationship with cardiomyocyte death. To this end, cultured rat neonatal cardiomyocytes were exposed to doxorubicin 1 μM per 24 hours to investigate the type of cell death triggered by doxorubicin and subsequently to determine the effect on basal autophagy. The results showed that doxorubicin treatment for 24 h stimulated cardiomyocyte death by necrosis, as evidenced by increased LDH release, a drop in ATP content and by increased annexin V-FITC staining relative to control. Cardiomyocyte apoptosis was also observed, reaching a peak in the levels of cleaved caspase 3 after 6 h treatment with doxorubicin. To study the effect of doxorubicin on autophagy, LC3 and p62 protein levels by assessed by Western blot. The results showed that doxorubicin reduced the levels of both proteins after 24 hours of exposure respect to controls. However, we cannot conclude that autophagy is inhibited. To clarify this point we determined LC3 and p62 protein levels under conditions of autophagy flux, using bafilomycin A. The results showed autophagy flux was also inhibits by doxorubicin. These results suggest that doxorubicin inhibits cardiomyocyte basal autophagy. To investigate the relationship between the inhibitory effect of doxorubicin on autophagy and cardiomyocyte death, the percentage released LDH was evaluated using bafilomycin A, 3-methyladenine or a siRNA for Beclin1. The results showed that the inhibition of autophagy with bafilomycin A, 3-methyladenine or siRNA for beclin 1 in the presence of doxorubicin increased even more the percentage of dead cardiomyocytes. On the other hand, the use of the inductor of autophagy rapamicyn decreased cardiomyocyte death triggered by doxorubicin. These data suggest that basal autophagy is important for cardiomyocyte survival and its inhibition promotes cell death. Finally, we found that doxorubicin stimulated AKT and p70S6K phosphorylation and decreased beclin 1 protein levels, suggesting that doxorubicin also activates this signaling pathway to negatively regulate cardiomyocyte autophagy. In summary, the results showed that doxorubicin inhibits basal autophagy and contributes to cardiomyocyte death and represent a new mechanism to explain doxorubicin cardiotoxicity / Conicyt; Fondap

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El receptor de ryanodina tipo 2 (RyR2) desempeña un papel crucial en el corazón ya que permite la salida de calcio desde el retículo sarcoplasmático para activar la contracción, por tanto la regulación de sus niveles es vital para el buen funcionamiento del cardiomiocito. El RyR2 cardiaco se degrada en patologías como la isquemia/reperfusión (I/R), por tanto el balance entre los diferentes sistemas de degradación de proteínas puede ser trascendental en su homeostasis. Para determinar si el lisosoma, a través de la autofagia mediada por chaperonas (AMC) participa en la degradación del RyR2 se utilizaron cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas estimuladas con geldanamicina (GA). Esta droga es un clásico inductor de esta vía degradativa. En presencia de GA, el contenido del RyR2 disminuye 50% respecto al control. La prevención del aumento de especies reactivas del oxígeno (EROs) generadas por GA evitó la degradación del RyR2. Sin embargo, esta inhibición de EROs no impidió la activación de la AMC observados previamente en presencia de GA. Por otra parte, la presencia de GA aumentó la aparición de fragmentos del RyR2 en el citosol, lo cual no se observó al inhibir la generación de EROs. A diferencia de lo observado en el modelo de I/R, las calpaínas no estarían implicadas en la proteólisis del RyR2, dado que no se observó aumento en su activación en presencia de GA. Sin embargo, se determinó la participación de las presenilinas en la proteólisis del RyR2 durante el estímulo con GA. El conjunto de estos datos sugieren que el aumento de las EROs podrían mediar la oxidación de RyR2. Las presenilinas podrían estar implicadas en la proteólisis intramembrana que permitiría la salida de los fragmentos de RyR2 al citosol para su posterior degradación a través de la autofagia mediada por chaperonas. / Ryanodine receptor type 2 (RyR2) has a key role in the heart, releasing calcium from the sarcoplasmic reticulum to activate myocardial contraction. Therefore, RyR2 level and activity are required for the proper cardiomyocyte function and an adequate balance between its synthesis and degradation is important in calcium homeostasis. Our aim was to determine the involvement of chaperone-mediated autophagy (CMA) on RyR2 degradation. To test this, primary cultured cardiomyocytes were exposed to geldanamycin (GA) to induce CMA. Our results show that GA decreased in 50% RyR2 level as compared to control. The antioxidant n-acetyl cisteine also prevented RyR2 degradation but no increase in LAMP-2A levels were observed. ROS inhibition also induced a decrease in cytosolic fragments of RyR2. No increase in calpain activity was detected using α-spectrin as specific substrate. However, the role of presenilin on RyR2 degradation was evidenced using the specific inhibitor compound E. Taken together, these data suggest that ROS increase could mediate RyR2 oxidation and presenilins could be implicated in RyR2 intramembrane proteolysis which allowed the release of RyR2 fragments to the cytosol and to induce its degradation through CMA. / FONDAP; FONDECYT

Autofagia é um processo de degradação fisiológico aumentado em diferentes condições de estresse, em que proteínas e organelas não funcionais são direcionadas ao lisossomo, onde são degradadas e os produtos da degradação reutilizados pela célula. Senescência é o processo em que as células param de dividir e entram em um estado de parada celular irreversível. Os dois processos, autofagia e senescência, podem ser induzidos na presença de dano no DNA, porém a maquinaria molecular que realiza a intermediação neste processo ainda é incerta. Temozolomida (TMZ) é um agente alquilante, usado para tratar pacientes com Glioblastoma, que induz dano no DNA. Lesões produzidas por TMZ ativam a resposta ao dano no DNA (DDR), uma sinalização complexa que medeia as respostas celulares, tais como a dinâmica do ciclo celular, autofagia, senescência e morte celular, ao dano genotóxico. Dada a importância desses mecanismos, esse trabalho objetiva avaliar o impacto da inibição da cinase Ataxia Telangiectasia mutada dependente de Rad3 (ATR), reguladora chave da DDR, na proliferação, autofagia e senescência em células de glioblastoma tratadas com TMZ. Para tal, nós utilizamos um inibidor farmacológico para ATR (VE-821), bem como shRNA para ATR com vetor lentiviral em células U87. A inibição farmacológica da proteína ATR não alterou o estado autofágico e de senescência em comparação com as células tratadas somente com TMZ. Esses resultados foram obtidos usando o método Laranja de Acridina (AO) e a ferramenta de Análise Morfométrica Nuclear (NMA). Na ausência de uma sinalização dependente de ATR, obtida pelas células shATR tratadas com TMZ, também não observamos alteração significativa em relação a esses processos. No entanto, nós observamos um acúmulo da proteína SQSTM1/p62, substrato da autofagia, nas células silenciadas para ATR. Esta alteração não se refletiu em aumento de foci intracelulares da proteína SQSTM1/p62. Em conclusão, ATR não parece participar diretamente da ativação da Autofagia e da Senescência induzidas por TMZ. / Autophagy is a catabolic process, that shows increased levels in stressful situations, whereby dysfunctional proteins and organelles are engulfed and targeted to lysosomes for degradation and recycled back to the cell. Senescence is the process by which cells stop dividing and enter a state of growth arrest. Both processes, autophagy and senescence, can be induced by DNA damage, however, the molecular machinery that mediates this process is still uncertain. Temozolomide (TMZ) is an alkylating agent, used to treat patients with Glioblastoma, that drives DNA damage. Lesions produced by TMZ activate the DNA damage response (DDR), a complex signalling pathway, that mediates cellular outcomes such as cell cycle distribution, autophagy, senescence and cellular death, to genotoxic damage. Given the importance of such mechanisms, this work aims to evaluate the impact of inhibiting the Ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) kinase, key regulator of the DDR, on cellular proliferation, autophagy and senescence, on Glioblastoma (GBM) cells treated with TMZ. In order to do that, we used a pharmacological inhibitor for ATR (VE-821) as well as shRNA to ATR, in U87 cells using lentiviral vectors. The pharmacological inhibition of ATR did not alter the autophagic or senescence status in comparison with the cells treated with TMZ only. Such results were obtained by Acridine Orange (AO) assessment and Nuclear Morphometric Analysis (NMA) tool. In the absence of an ATR dependent signalling, assessed through shATR cells treated with TMZ, no significant alteration in relation to such processes was seen. However, we observed an accumulation of the SQSTM1/p62 protein, a selective autophagy substrate, on cells silenced for ATR. This accumulation did not reflect in increased intracellular foci formation of SQSTM1/p62 protein. In conclusion, ATR doesn't seem to play a direct role in the Autophagy and Senescence induced by TMZ.

Gliomas malignos compreendem o subtipo mais comum e devastador de tumores primários do sistema nervoso central (SNC), sendo o Glioblastoma Multiforme (GBM) a forma mais agressiva e mortífera. Pacientes com este tipo de tumor apresentam um prognóstico de sobrevida que não ultrapassa os 18 meses, após o diagnóstico. Isso é decorrente do fato de que os GBMs possuem elevada resistência aos tratamentos de quimio e radioterapia, além de serem altamente infiltrativos e neurologicamente destrutivos. Um importante fator que contribui para essa resistência é a superexpressão da proteína XIAP (X-linked Inhibitor of Apoptosis), o mais potente inibidor de apoptose da família das IAPs. Este atua inibindo diretamente a ativação das Caspases 3, 7 e 9. P53 é considerada uma das mais potentes proteínas supressoras tumorais, uma vez que esta atua como reguladora central em diversas vias de sinalização de mecanismos celulares distintos, como a via de controle do ciclo celular, reparo ao DNA, apoptose, senescência, autofagia, entre outras. Isto justifica o fato de p53 estar frequentemente mutada, nos mais variados tipos de cânceres. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos resultantes da interação entre a superexpressão da proteína supressora tumoral p53 e o silenciamento da proteína anti-apoptótica XIAP na proliferação, na sobrevivência de GBMs. Quando p53 foi superexpressa (P+) na linhagem de glioma U87 silenciada para XIAP (Xi), através de RNAi, a taxa de proliferação celular reduziu significativamente em relação às células com as intervenções isoladas (U87Xi e U87wtP+) ou em relação ao controle selvagem U87wt, ao longo de dez dias. O ensaio de citotoxicidade LDH revelou um aumento na desestabilização da membrana citoplasmática nas células com a manipulação gênica combinada (U87XiP+) em relação os controles U87Xi e U87wtP+. O ensaio com AnexinaV/PI demonstrou uma elevação na marcação de células U87XiP+ com os dois marcadores, indicando uma maior indução de morte celular em relação aos controles. Além disso, como consequência da modulação combinada de p53 e XIAP, os níveis das proteínas pró-apoptóticas Bax e PUMA aumentaram tanto na linhagem U87wt, quanto na linhagem U87Xi, ao superexpressar p53. Além disso, os níveis de p21 e da proteína anti-apoptótica Bcl-xL foram reduzidos na linhagem U87Xi em relação ao controle U87wt. Outra constatação importante foi o aumento dos níveis de caspase-3 na linhagem U87Xi em relação ao controle U87wt e um aumento ainda maior nas células com a intervenção combinada (U87XiP+). Todos estes dados convergem para o fato de que a combinação do silenciamento de XIAP e superexpressão de p53 é mais efetiva na redução da proliferação e indução de morte na linhagem de glioma U87, do que as manipulações gênicas realizadas de forma isoladas, além de sugerir uma possível via de integração entre XIAP e p53, tendo como ponto de conexão o controle dos níveis citoplasmáticos da proteína p21 tanto por p53, quanto por XIAP, mostrando que a modulação combinada de proteínas da via apoptótica é capaz de potencializar os efeitos produzidos pelas intervenções de forma isoladas, representando uma nova e promissora estratégia no desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de Gliomas.

As céluals tumorais estão constantemente expostas a flutuações nas concentrações de nutrientes e oxigênio no microambiente tumoral. Através da ativação de diferentes vias de sinalização, as células tumorais sofrem uma reprogramação metabólica a fim de suportar as condições hostis impostas pelo microambiente tumoral. Uma das vias de sinalização ativada nessas condições é a autofagia, a qual tem sido considerada um dos principais mecanismos de sobrevivência celular em condições de estresse. Além disso, muitos medicamentos anti-câncer, como os agentes alquilantes, tem sido implicados na indução de autofagia. Apesar da autofagia contribuir com a sobrevivência da célula, uma superativação da via autofágica por períodos prolongados pode contribuir com a morte celular, o que faz com que o papel da autofagia no câncer seja ainda bastante debatido. Neste trabalho, buscou-se avaliar o papel da autofagia induzida em células de câncer colorretal da linhagem HCT116 continuamente cultivadas em baixa concentração de glicose e submetidas ao tratamento com o agente alquilante oxaliplatina. Os resultados demonstraram que a autofagia induzida em células HCT116 nessas condições exerce um papel citoprotetor, contribuindo para a resistência ao tratamento com oxaliplatina. A ativação da autofagia pelo tratamento com oxaliplatina em baixa concentração de glicose foi capaz de manter os níveis intracelualres de ATP e de reduzir a morte celular por apoptose. A utilização de inibidores ou de um ativador farmacológico da via autofágica, em combinação com a oxaliplatina, foi capaz de sensibilizar células HCT116 tratadas em baixa concentração de glicose, aumentando a morte celular por apoptose. Além disso, a indução de autofagia pela oxaliplatina foi mediada pela ativação de AMPK e inibição de mTOR. Estes dados demonstram que a ativação da autofagia em células de câncer colorretal HCT116 expostas a baixa concentração de glicose contribui para resistência ao tratamento com oxaliplatina. Estes dados também sugerem que a manipulação da via autofágica, pela sua inibição ou superativação, pode fornecer um maneira eficiente de limitar a progressão do tumor e aumentar a eficiência dos regimes quimioterápicos. / Tumor cells are constantly exposed to nutrients and oxygen concentration fluctuations at tumor microenvironment. Through activation of different signaling pathways, tumor cells undergo metabolic reprogramming to tolerate hostile conditions imposed by tumor microenvironment. One of the activated signaling pathways in such conditions is autophagy, which has been considered one of the central mechanisms of cell survival in stress conditions. Furthermore, many anticancer drugs, like alkylanting agents, have been implicated in autophagy induction. Despite autophagy contribution to cell survival, the autophagic pathway activation for prolonged periods may contribute to cell death, which creates extensively debates about the role of autophagy in cancer. In the present work we intended to evaluate the role of autophagy induced in colorectal cancer cells HCT116 grown continuously in low glucose concentration and treated with the alkylating agent oxaliplatin. Our results showed that autophagy induced in HCT116 cells in these conditions plays a cytoprotective role, contributing to oxaliplatin resistance. The activation of autophagy by oxaliplatin in low glucose concentration was able to maintain the intracellular levels of ATP and to reduce apoptotic cell death. The combined use of pharmacologic inhibitors or an activator of autohophagy with oxaliplatin was capable to sensitize HCT116 cells treated in low glucose concentration, increasing apoptotic cell death. Moreover, autophagy induction by oxaliplatin was mediated by the activation of AMPK and inhibition of mTOR. Our data demonstrate that autophagy activation in colorectal cancer cells HCT116 exposed to low glucose concentration contributes to the tolerance of oxaliplatin. These data also suggest that the manipulation of autophagic pathway, through its inhibition or hyperstimulation, may provide an effective manner of limiting tumor progression and increase chemotherapy effectiveness.

Doctor en Bioquímica / La macroautofagia, comúnmente referida como “autofagia” es la principal vía de degradación de proteínas, organelos y material citoplasmático, permitiendo de este modo el reciclaje del material intracelular. Este proceso consiste en el englobamiento de fracciones citosólicas por una estructura multimembranar llamada “autofagosoma”, el cual posteriormente se fusiona con el lisosoma para formar el “autofagolisosoma”. Luego el material comprendido en el autofagolisosoma es degradado por enzimas hidrolíticas. Un estudio mostró que la inhibición de la enzima inositolmonofosfatasa (IMPasa) usando litio y L690.330, inducía una disminución de los niveles basales del IP3 y en consecuencia la generación de autofagia. Nuestros resultados confirmaron estos datos previos, demostrando que el pre tratamiento con mio-inositol revierte la autofagia inducida por litio y L-690.330. Además se demuestra que el pre tratamiento con mio-inositol también revertía la autofagia inducida por privación de nutrientes. IP3 es ligando de su receptor de IP3 (IP3R), el cual es el principal canal de Ca2+ a nivel del retículo endoplásmico. El principal objetivo de esta tesis es evaluar el rol del IP3R en la regulación de la autofagia. Los resultados mostraron que la disminución de los niveles proteicos del IP3R usando siRNA específicos, así como el tratamiento con antagonistas químicos del IP3R, tales como xestosponginas B y C, estimulaban significativamente el aumento en los niveles de autofagia. Además, xestospongina B, así como también la privación de nutrientes, indujo una pérdida en la interacción entre Bcl-2 y Beclin-1, los cuales interactúan en condiciones basales. El tratamiento con xestospongina B no perturbó los niveles de Ca2+, tanto en retículo endoplásmico como en el citosol, concluyendo que la autofagia inducida por xestospongina B es independiente de una fluctuación del Ca2+. Los experimentos de inmunoprecipitación mostraron que Beclin-1 (regulador clave en la inducción de la autofagia) interactúa tanto con IP3R así como con Bcl-2 en condiciones basales, y la interacción de este complejo es atenuado bajo condiciones de privación de nutrientes o por tratamiento con ABT737, el cual es un mimetizador de dominios BH3. Este resultado sugiere la presencia de un complejo proteico en la regulación de la autofagia. El papel del retículo endoplásmico en el desarrollo de la autofagia toma gran significancia debido al reclutamiento de proteínas clave (IP3R, Beclin-1 and Bcl-2). La relación entre autofagia y estrés de retículo no es clara y por lo tanto se evaluó el efecto de agentes inductores de estrés de retículo en la inducción de la autofagia. Los resultados mostraron que tunicamicina, tapsigargina y brefeldina-A (agentes inductores de estrés de retículo) activaron el UPR (respuesta a proteínas mal plegadas) e indujeron autofagia. La disminución de los niveles de proteínas claves en el desarrollo de la autofagia (Atg5, Atg10, Atg12, Vps34 y Beclin-1) usando específicos RNAs interferentes atenuaron la autofagia inducida por agentes inductores de estrés de retículo y xestospongina B. Además, la sobreexpresión de Bcl-2 y Bcl-XL con destinación a retículo endoplásmico atenuó la autofagia inducida por xestospongina B e inhibidores de la IMPasa. Esta tesis muestra novedosos resultados, los cuales dan cuenta de un complejo proteico IP3R/Beclin-1/Bcl-2 en la regulación de la autofagia. / Macroautophagy (herein referred to as “autophagy”) is the major catabolic pathway for entire organelles, long-lived/ aberrant proteins and superfluous portions of the cytosol. It consists of the stepwise engulfment of substrate elements into distinctive multimembraned “autophagosomes”, which after fusion with lysosomes form singlemembraned autophagolysosomes. Into the autophagolysosome, the engulfed material is degradated by lisosomal hidrolytic enzymes, leading the recyclage of intracellular material. A study has suggested that myo-inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) could regulate autophagy because inhibition of inositol monophosphatase (IMPasa) by lithium or L-690.330 stimulates autophagy through the depletion of IP3. Our results have confirmed that the reduction of intracellular IP3 levels by IMPasa inhibitors (lithium and L.690.330) stimulates autophagy, whereas the enhancement of IP3 levels by pre treatment whit mio-inositol inhibits the lithium and L.690.330 effect. Moreover we have demostred that autophagy induced by nutrient privation was also inhibited by treatment with mio-inositol, but the effect of nutrient privation in the intracellular IP3 basal levels was not evaluated. IP3 acts on the IP3 receptor (IP3R), an IP3‑activated Ca2+ channel of the endoplasmic reticulum membrane and consequently we wanted to evaluate de roll of IP3R in the regulation of autophagy. The results obtained in this thesis show that knockdown of the IP3 receptor (IP3R) with specifics small interfering RNAs and pharmacological IP3R antagonist (xestospongin B and C) are a strong stimulus for the induction of autophagy, in addition, xestospongin B (like nutrient starvation) induced loss in the interaction between Beclin-1 and Bcl-2. Moreover, the autophagy promoted by xestospongin B not produced alterations in the steady-state Ca2+ levels in the ER or in the cytosol, therefore the autophagy induced by xestospongin B was Ca2+-independent. Immunoprecipitation assays shown that Beclin- 1 (key protein in the regulation of autophagy) interacts with IP3R and Bcl-2 in basal conditions, and this interaction may be attenuated both by nutrient starvation or ABT737 treatment, which is a mimetic compound of BH3. These results suggest the presence of a protein complex in the regulation of autophagy. The treatment whit ER stressors such as tunicamycin, thapsigargin and brepheldine A induced Unfolded Protein Responses (UPR) and autophagy. The autophagy induced by these agents showed to be IRE1α dependent, but the inhibition of autophagy showed an increase in the cell death, indicating a pro survival function of the autophagy upon endoplasmic reticumum stress conditions. The autophagy induced by treatment with xestospongin B and ER stressors was inhibited by knockdown of Atg5, Atg10, Atg12, Vps34 and Beclin-1, which are keys proteins in the autophagic process. We have also evaluated the roll of Bcl-2 and Bcl-XL in the inhibition of autophgy, and the results showed that Autophagy triggered by IMPasa inhibitors and xestospongin B was inhibited by Bcl-2 and Bcl-XL over expression specifically targeted to ER but not Bcl-2 or Bcl-XL proteins targeted to mitocondria. Altogether, these results suggest that IP3R form a regulator complex with Bcl-2 and Beclin-1, which exerts a major role in the physiological control of autophagy