Objectifs : Il n’existe pas de valve de remplacement idéale à l’heure actuelle. L’utilisation du péricarde autologue pour confectionner une valve de remplacement dans le même temps opératoire est une alternative intéressante. Le but de cette étude est de mettre au point une nouvelle méthode de préparation des tissus utilisant un gel polysaccahridique et de standardiser les techniques de préparation, de fabrication et d’implantation de la néo-valve péricardique. Méthodes : Au total 18 moutons ont été opérés pour un remplacement valvulaire aortique par autogreffe péricardique traitée par gel de polymère ou glutaraldéhyde dans les conditions physiologiques d’une chirurgie à coeur ouvert sous circulation extra-corporelle. La néo-valve a été implantée au niveau de l’anneau valvulaire natif par 3 hémi-surjets au Prolène 5/0 avec l’utilisation d’instruments dédiés conçus grâce à l’étude ex-vivo. Les moutons survivants sont sacrifiés à un an pour une évaluation histologique de l’implant tissulaire péricardique.Résultats : Le temps moyen de confection de l’autogreffe péricardique est de 15.68 +/- 4.84 mn, pour un temps de CEC moyen de 136.17 +/- 27.46 mn. Le temps de clampage aortique moyen est de 85.61 +/- 12.21mn. Le gradient moyen trans-valvulaire est de 4,1 mmHg. Les valves prétraitées au glutaraldéhyde sont plus massivement calcifiées que celles traitées par le gel de polymère.Conclusion : L’utilisation du péricarde autologue dans la reconstruction valvulaire aortique est une alternative intéressante surtout chez l’enfant et sur les petits anneaux. L’utilisation d’instruments dédiés permet de rendre la fabrication et l’implantation de la néo-valve plus simple et plus reproductible avec des temps de CEC et de clampage raisonnables. Le gel de polymère donne de meilleurs résultats histologiques que le glutaraldéhyde. / Objective: Ideal prosthetic heart valve is not available. The use of the patient own pericardium for construction heart valve prosthesis is an interesting alternative and has several potential advantages. The aim of our study is to set up a new method for pericardium preparation with polysaccharide hydrogel and standardize the valve treatment processing and implantation.Méthods: Eighteen sheep underwent aortic valve replacement with autologous pericardium valve traited with polymeric gel or glutaraldéhyde using cardio-pulmonary bypass. The pericardial prosthesis was implanted with a proximal running 5/0 Prolène sutures placed along the aortic annulus and utilization of specially designed instruments. Survival sheep were euthanized after 12 months for histologic evaluation of the pericardial valvular implant.Results: Cardiopulmonary bypass and cross-clamp mean time was 136.17 +/- 27.46 mn and 85.61 +/- 12.21mn respectively. The prosthesis mean time construction was 15.68 +/- 4.84 mn. The mean transvalvular gradient after implantation was 4,1mmHg. The autologous pericardial valves treated with glutaraldehyde tended to show more extensive calcification than pericardial valves treated with polymeric gel.Conclusion: Truly stenless aortic valve replacement using autologous pericardium is feasible with cross clamping time acceptable and technically reliable with the use of specially designed instruments. The use of polymeric gel for treatment of autologous pericardial valve is less aggressive than glutaraldéhyde.

In vivo, l'épiderme se régénère en continu à travers la prolifération des cellules souches basales. Celles-ci obtenues à partir d'une biopsie cutanée, peuvent être greffées pour régénérer la peau. En vue de la transplantation kératinocytaire, nous avons étudié in vitro leur capacité à régénérer un épithélium en fonction de leur origine anatomique, et précisé leur phénotype. Par rapport aux différents sites étudiés, nous montrons que les kératinocytes issus de prépuce ont la plus grande capacité proliférative et régénérative, associée à une expression exacerbée de marqueurs d'immaturité, la p63 et la kératine 19 et une faible expression des marqueurs de la différenciation (involucrine et filagrine). Ces résultats nous ont amené à utiliser ces kératinocytes préputiaux en suspension pour transplanter les enfants brûlés, ce qui évite l'utilisation d'une membrane de transfert, source potentielle d'inefficacité. La transplantation des brûlures avec ces cellules autologues conduit à une épithélialisation accélérée avec une cicatrice de grande qualité. Ces résultats et la facilité de la procédure nous permettent de proposer la greffe autologue kératinocytaire de prépuce comme une procédure standard, qui peut être ajoutée à l'arsenal thérapeutique des équipes prenant en charge les enfants brûlés. / In vivo, the skin regenerates continuously through the proliferation of basal stem cells. That can be obtained from a skin biopsy and may be grafted to regenerate skin. In vitro, we studied the regenerative keratinocyte capacities according to site donors, and we noted that keratinocytes from foreskin have the greatest proliferative and regenerative capacities, combined with expression of progenitor cell markers (p63 and keratin 19) and low expression of epidermal differentiation markers (involucrin and filaggrin). These results led us to use these preputial keratinocytes in suspension for graft in burned children. Apply directly cells with a suspension device, eliminates the use of a transfer membrane and a potential source of inefficiency. In our study, boys grafted with autologous keratinocytes isolated from foreskin leads to epithelialization with a high quality of scar. This technique is easily applicable to a large number of pediatric surgery teams. Our clinical success and the safety of the procedure in the operating room enable us to propose the kératinocyataire autologous transplantation as a standard procedure, which can be added to the therapeutic armamentarium in burns.

La reconstruction trachéale autologue a pu être standardisée et optimisée grâce au développement d’untravail de recherche expérimentale. Ce travail a permis d’améliorer la technique chirurgicale et les résultatscliniques. C’est une solution thérapeutique qui permet de remplacer de façon reproductible plus de 50 % delongueur de trachée. Toutes les autres techniques de remplacement trachéal développées par denombreuses équipes, ainsi que leurs résultats expérimentaux et cliniques, ont été étudiés et classés enfonction du substitut utilisé.Après de nombreuses publications du Laboratoire de Recherche du Centre Chirurgical Marie Lannelonguesur ce sujet, nous nous sommes orientés vers l’utilisation des tissus autologues (lambeau libre et cartilagescostaux) en collaboration avec les chirurgiens plasticiens. Cela a permis grâce aux avancées techniques etnotamment de microchirurgie de réaliser un nouveau conduit trachéal. Ce substitut ne contient aucunmatériel prothétique et il peut donc résister aux infections. Malgré l’absence de renfort prothétique, il résisteaux pressions et surtout à la dépression respiratoire.Le développement de cette technique chirurgicale a été obtenu grace à ces travaux de recherche qui ontpermis d’optimiser la procédure, de l'améliorer et de la répéter.Le premier travail expérimental a été la création d'un modèle animal de remplacement trachéal autologuepar un lambeau pédiculé armé. Nous avons ainsi confirmé la résistance mécanique et la viabilité descartilages, ainsi que la durabilité de ce type de reconstruction.Les travaux suivants ont été réalisés en collaboration avec des équipes spécialisées en Ingénierie tissulaire.Le premier travail expérimental d’Ingénierie tissulaire a consisté en la réalisation d’anneaux de cartilage àpartir de cellules souches. L'objectif était d'obtenir des anneaux cartilagineux préformés, que l'on pourraitinsérer dans l'épaisseur du lambeau.Le deuxième travail a été de développer une technique permettant de transformer le revêtement cutané dulambeau en une muqueuse respiratoire. Quatre techniques d'ingénierie tissulaire ont été utilisées et testées :la greffe de péritoine, la greffe de muqueuse buccale expansée, l’ensemencement de cellules de lamuqueuse trachéale et la greffe de cellules épithéliales respiratoire de culture.Malgré les avancées technologiques, la culture de cellules cartilagineuses en trois dimensions sur desmoules en Silicone ne s’est pas avérée satisfaisante.Les différents procédés de remplacement du revêtement cutané ont confirmé la nécessité de réaliser desétapes supplémentaires au préalable de l'intervention chirurgicale. Parmi les techniques de remplacementde l'épithélium, la greffe de muqueuse buccale expansée et la greffe d’épithélium respiratoire de culture ontété les plus fiables.La reconstruction autologue est à ce jour la meilleure alternative pour le remplacement trachéal étendu enutilisant des tissus autologues. La poursuite d’une approche expérimentale est fondamentale pourl’amélioration de nos résultats. Ainsi, ces travaux vont être poursuivis par un travail expérimental sur leremplacement des anneaux de cartilages par des anneaux de Titane poreux sur un modèle animal. / Autologous tracheal reconstruction has been standardized and optimized in parallel with the development of experimental research and clinical practice. This is a therapeutic solution that replaces reproducibly more than 50% of tracheallength. All the other tracheal replacement techniques, developed by many teams and their experimental and clinical results, were studied and classified according to the substitute used.After an experimental study at the Laboratory of Surgical Research in the Marie Lannelongue, center, we started to work towards the use of autologous tissue (free flaps and costal cartilages). Thoses tissues were shaped using technical advances including microsurgery to create a new tracheal conduit.This tracheal substitute does not contain any prosthetic material. It may therefore resist to infection and it resists to respiratory pressures and especially respiratory depression.The development of this technique was conducted in parallel with research studies, that improved and optimized the surgical process and the results.The first experimental work was the creation of an animal model tracheal replacement using an armed autologous pedicle flap. We confirmed the strength and viability of the cartilage strip inserted between the dermal layers and the sustainability of this type of reconstruction.The following work was carried out in collaboration with two other teams specialized in Tissue Engineering.The first experimental work of tissue engineering tried to produce cartilage rings from stem cells. The objective was to obtain complete cartilaginous rings that could be inserted into the thickness of the flap.The next objective was to develop a technique to transform the superficial layer of the skin in a respiratory epithelium. Four tissue engineering techniques were used and tested: peritoneum of the graft, oral mucosa transplant, seeding cells from the tracheal mucosa and graft culture respiratory epithelial cells.Despite advances in technology, the culture of cartilage cells in three dimensions on Silicone mold were not viable and could not be used in clinical practice.The various alternative processes of skin covering highlighted the need for additional steps in advance of surgery.Among the techniques used to replace the epithelium with an expanded graft buccal mucosa, transplantation of culture respiratory epithelium is the most reliable.Autologous reconstruction is so far the best alternative for extended tracheal replacement using only autologous tissue. The pursuit of an experimental approach is fundamental to improve our results.Thus, this work will be pursued by an experimental work on the replacement of cartilage rings using porous titanium ring on an animal model.

Purpose of this study was to show the efficacy and safety of the investigational product co.don chondrosphere® (ACT3D-S). ACT3D-S is a product for autologous chondrocyte transplantation that we used in an animal model, the merino land sheep. We compared the treatment of ACT3D-S (Group A: Investigational product) with an untreated control (Group B: Control Intervention) in a bilateral model, what means that by randomization one hind limb was chosen to be treated with ACT3D-S while the remaining hind limb was left without treatment.

Reproduction de : Thèse d'exercice : Médecine : Nancy 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre.

Introduction : La fécondation in vitro est de mieux en mieux connue et en amélioration constante, cependant les taux d’implantation et de grossesse sont encore bas (environ 35% par fécondation in vitro). Un des enjeux de l’amélioration de la fécondation in vitro est le développement embryonnaire et l’implantation. Pour cela, la co-culture des embryons sur un tapis de cellules endométriales maternelles autologues peut être utilisée pour améliorer le développement embryonnaire (taux d’embryon se développant jusqu’à J5 : blastocyste) et l’implantation. L’objectif de l’étude est d’étudier le lien entre la qualité du tapis cellulaire et le développement embryonnaire. Matériel et méthodes : Cette étude est une sous analyse de l’essai clinique randomisé en double aveugle OvoGen, comparant le taux de blastulation et de grossesse dans deux groupes randomisés : le groupe étude, dans lequel les embryons se développent sur un tapis cellulaire endométrial maternel et le groupe contrôle, dans lequel les embryons sont cultivés dans du milieu conventionnel. Nous avons analysé la qualité des tapis cellulaire du groupe étude (confluence des cellules, taux de cellules épithéliales et vitalité des cellules stromales) par rapport au développement embryonnaire et au taux de grossesse. Résultats : 50 tapis de cellules endométriales maternelles et 291 embryons sur les puits ont été analysés de 2012 à 2015 à la clinique ovo (Montréal, Québec). La qualité des embryons n’était pas changée par la qualité des tapis (p=0,65 pour la confluence, p=0,25 pour le taux de glande et p=0,92 pour la viabilité des cellules). En revanche, le taux de grossesse augmentait quand la confluence diminuait (p=0,022) et lorsque la viabilité des cellules stromales augmentait (p=0,001). De plus, la qualité des tapis était dépendante de la date de la biopsie : la biopsie faite à J7 après l’ovulation permettait une meilleure qualité de puits (confluence augmentée, p=0,045, taux de glande augmenté p=0,004 et viabilité stromales augmentée p=0,001) que la biopsie faite à J5 post ovulation. Discussion : Aucune des nombreuses études sur la co-culture ne porte sur la qualité des tapis cellulaire. Il est intéressant de noter que le taux de grossesse augmente avec la diminution de la confluence et l’augmentation de la viabilité des cellules stromales dans les puits contenant les embryons transférés. Comme il a déjà été démontré, (1)le jour de la biopsie endométriale influe sur la qualité du tapis cellulaire en coculture et pour que celui-ci soit de bonne qualité, il faut que l’endomètre soit réceptif (après J19 du cycle). Conclusion : Nous avons montré que la qualité des tapis cellulaires dépendait du jour de la biopsie d’endomètre et que cette qualité pouvait influencer le bénéfice de la co-culture. Il serait intéressant d’étudier la réceptivité de l’endomètre au moment de la biopsie avant utilisation des cellules en co-culture pour optimiser la qualité du tapis cellulaire. / Introduction: Lot's of progress has been made in the process of in vitro fertilization (IVF) in the last years. However, the pregnancy rate is still low. There are two important issues in IVF: embryo development and implantation. One answer may be the endometrial autologue co-culture which could improve the embryo development and the implantation rate in many ways. The aim of this study is to assess the effect of co-culture quality on human embryo development and implantation rate. Materials and methods: The ovogen study was a randomized, double blind trial analysis. OvoGen compared the blastulation and the pregnancy rate in two randomized groups: the study group, with autologous endometrial co-culture and the control group, with conventional media. The outcome of our study was to assess the correlation between the quality of autologous endometrial co-culture (cells confluence, rate of epithelials cells and stromals cells viability) and the embryo development. Results: FIfty patients in the co-culture group were analyzed between 2012 to 2015 at the ovo clinic (Montreal, Quebec). 291 embryos were analyzed, each cocultured on a monolayer endometrial cells. The embryo quality was not significantly linked with the co-culture quality (p=0,65 for the cells confluence, 0,25 for the epithelial cells rate and 0,92 for the stromal cells viability). On the other hand, the 11 pregnancy rate increased in correlation with the decreasing of the confluence (p=0,022) and the increase of stromal cells (p=0,001). Moreover, the moment of the biopsy had an effect on the co-culture: when the biopsy was performed seven days after the ovulation, the quality of the co-culture was better (confluence increased p=0,045, epithelials cells increased p= 0,004 and stromal cells viability increased p=0,001) than when the biopsy was done five days after the ovulation. Discussion: There were no previous study on the quality of the co-culture and its effect on the embryo development. The fact that the pregnancy rate increased with the decrease of the confluence in the co-culture is interesting. Indeed, we could easily explain why a huge confluence could be prejudicial for the dialog between embryo and endometrium. Moreover, in accordance with previous experience, the day of the biopsy in the cycle is important for the quality of the endometrium. This is why the day of the biopsy may have an effect on the co-culture quality. Conclusion: Our results show that the moment of the biopsy has an effect on the quality of the co-culture and that the quality of the co-culture has an effect on the pregnancy rate. It could be interesting to study the endometrium receptivity on the biopsy before the co-culture to optimize the quality and the benefit of the co-culture.

Les brûlures cutanées graves dont les lésions profondes et étendues des tissus ne permettent pas d’envisager un traitement classique par autogreffes, bénéficient aujourd’hui de substituts épidermiques autologues pour leur recouvrement. En effet l’ingénierie tissulaire permet l’obtention d’épiderme de culture autologue (CEA) par l’amplification in vitro de kératinocytes à partir d’une petite biopsie de peau saine. Si ces CEAs ont permis la survie de nombreux patients depuis les années 1980, ils n’en restent pas moins largement perfectibles du point de vue de l’esthétique et de la fonctionnalité de l’épiderme et de la jonction dermo-épidermique régénérés mais aussi en termes de coûts et de prévention des zoonoses.Ainsi, ce travail de thèse s’inscrit dans le cadre d’une recherche translationnelle et porte sur l’élaboration d’un épiderme de culture par ingénierie tissulaire en vue d’une application clinique chez les grands brûlés, afin de favoriser la cicatrisation et la régénération épidermique. Ce travail porte également sur l’évaluation non clinique de notre substitut épidermique sur un modèle animal de brûlure cutanée.Après avoir développé un nouveau substitut épidermique sur fibrine de plasma humain (hPBES : human Plasma-Based Epidermal Substitute), nous avons procédé à l’évaluation détaillée de ses caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles en comparaison au substitut épidermique de référence Epicel® (Genzyme, US). Nous avons montré des propriétés plus intéressantes en termes de clonogénicité et de caractère souche, de prévention de la différenciation, de prolifération, de potentiel de migration, et de conservation des protéines de la membrane basale avec notre produit par rapport à Epicel®.L’apport de la matrice de fibrine de plasma sur la culture des kératinocytes en comparaison à une matrice de fibrine issue de fibrinogène purifié et à une culture sans matrice a été étudié notamment sous l’angle des facteurs libérés par les matrices. Nous avons observé une amélioration des propriétés des substituts épidermiques par la fibrine : diminution de la différenciation terminale, augmentation du potentiel migratoire et sécrétion de facteurs pro-cicatrisants (GM-CSF et PDGF-BB). En outre, la fibrine de plasma améliore spécifiquement la morphogénèse épidermique, la prolifération kératinocytaire et la clonogénicité.Le procédé de culture de ce nouveau substitut a été adapté aux exigences réglementaires sans altération du potentiel régénératif: remplacement des cellules nourricières murines par des fibroblastes dermiques humains, adaptation du milieu de culture et sécurisation du plasma par traitement à l’amotosalen.Toutes les étapes d’un modèle de brûlure chez le rat nude reproduisant la technique chirurgicale employée pour la greffe de CEA ont été mises au point, mais un rejet du greffon épidermique n’a pas permis l’évaluation d’hPBES sur ce modèle. Nous avons donc évalué le substitut épidermique développé hPBES chez la souris NOD-SCID après greffe au fascia et mis en évidence une bonne prise de greffe épidermique permettant la régénération d’un épiderme humain aux caractéristiques proches d’une peau saine avec une réorganisation de la jonction dermo-épidermique des 2 semaines après greffe. / The deep and large injuries caused by massive burns prevent the use of split-thickness skin autografts. Today, autologous epidermal substitutes constitute an alternative treatment for skin regeneration. In fact tissue engineering allows the production of Cultured Epithelial Autografts (CEA) by in vitro keratinocyte amplification from a small healthy skin biopsy. The clinical use of CEA since the 1980’s has allowed an increase in the survival rate of burnt patients. However, CEAs present numerous drawbacks, among them the high fragility of keratinocyte sheets, and the immaturity of the dermal-epidermal junction leading to heavy cosmetic and functional sequelae.This thesis focuses on the bioengineering of epidermal substitute for clinical burn treatment to enhance wound healing and skin regeneration, from a translational research point of view. This work also includes the development of an animal model of third degree burn for the evaluation of epidermal substitute.We first developed a new epidermal substitute cultured on a fibrin matrix from human plasma (hPBES: human Plasma-Based Epidermal Substitute). Then we characterized this new substitute with phenotypical and functional analyses, using as a reference the epidermal substitute Epicel® (Genzyme, US). We observed properties more favorable with hPBES than with Epicel® in terms of clonogenicity, stemness, differentiation level, proliferation, migration potential and basement membrane protein conservation.The influence of the plasma-based fibrin matrix on keratinocytes was studied in comparison with a culture on a fibrin from purified fibrinogen, and with a culture with no matrix. For this study we focused our analysis on the role of the released factors from fibrin matrices during epidermal substitute culture. Both fibrin matrices improved epidermal substitute properties: reduction of terminal differentiation, enhancement of migration potential, secretion of wound healing enhancing factors. Besides, plasma-based fibrin specifically promote epidermal morphogenesis, keratinocyte proliferation and clonogenicity.The culture process was adapted to European regulation requirements without diminishing its regenerative potential: substitution of murine feeder cells by human dermal fibroblasts, adaptation of culture medium and plasma viral inactivation using amotosalen treatment.A burn model including all the surgical steps used in clinics for CEA grating was developed on nude rats. However the evaluation of hPBES on this model could not be achieved due to graft rejection. Therefore we evaluated epidermal regeneration after hPBES graft on acute wounds on NOD-SCID mice. We showed a good graft rate, with the regeneration of a human epidermis close to healthy epidermis with a well-organized dermal-epidermal junction two weeks after hPBES grafting.

Environ 30% des patients infectés par le virus de l’hépatite C guérissent spontanément. Le but de ce travailétait (i) d’examiner l’évolution des protéines d’enveloppe en cas de guérison spontanée (ii) de comparerl’infectivité des variants présents aux stades précoces (iii) d’explorer la capacité neutralisante des anticorps(Ac) vis-à-vis des variants majoritaires et minoritaires. Nous avons sélectionné 2 patients avec une hépatiteaigue C suivie d’une guérison très rapide. Pour explorer la capacité d’entrée de ces variants et leur aptitude àêtre neutralisés, nous avons produit des pseudo-particules rétrovirales portant les enveloppes de différentsvariants. Pour le 1er patient, une réponse neutralisante autologue était détectable précocement, avec unmaximum entre le 2ème et le 3èmemois suivant la cytolyse. Elle était encore détectable au 30ème mois. Pourle 2ème patient, des Ac vis-à-vis du variant majoritaire étaient détectés dans le sérum prélevé 4 jours après lacytolyse et dans les sérums plus tardifs. Le titre des Ac était maximum au 5ème mois. La réponse neutralisanteest d’apparition précoce et persiste même après l’élimination virale. Ces observations nous questionnent parrapport au rôle éventuel joué par ces Ac dans les cas de recontamination. / Only 30% of Hepatitis C virus infected individuals recover spontaneously. We investigated the mechanismsleading to early HCV clearance. The purpose of this work was: (i) to explore the diversity and the early geneticevolution of the HCV envelope glycoproteins, and the infectivity spectrum of isolated variants and (ii) toanalyze the ability of the autologous neutralizing response to control these variants. We selected two patientswho developed an acute HCV infection. To explore the impact of mutations on infectivity and neutralization,retroviral pseudoparticules were produced with representative E1 and E2 sequences. For the first case, themaximum neutralizing activity was observed in the serum collected between 2 and 3 months post ALT peak,the activity was still detectable after 30 months. For the second case, autologous neutralizing activity wasdetected in every serum collected between 4 days and 13 months after. A gradual increase of neutralizationactivity was observed over time with a maximum 5 to 6 months. We have shown that the neutralizing responsewas detectable at early stages of primoinfection and was sustained beyond the time at which the virus wascleared. These observations raise interesting questions about the role of such antibodies in case of re-exposure.

Introduction :Les adhérences abdominales post-opératoires représentent les complications les plus fréquentes de la chirurgie abdominale et sont un enjeu de santé publique– douleurs abdominales chroniques, occlusions intestinales et infertilité féminine- et coût de prise en charge. Elles se développent après une mauvaise cicatrisation du péritoine –séreuse composée d’une monocouche de cellules mesothéliales. Leur prévention pourrait passer par des techniques de thérapie cellulaire ou tissulaire, visant à fabriquer un « néo »peritoine alliant des cellules du patient à une « scaffold » ou « échaffaudage ». Les cellules mesothéliales, différenciées, fonctionnelles sont indispensables, mais en nombre limité, potentiellement malades et leur prélèvement invasif. Elles pourraient être remplacées par des cellules souches adipocytaires qui ont un potentiel de différenciation. D’autre part, les polymères d’hydrogels comme biomatériau pour notre substitut sont attractifs par leur tolérance et leurs propriétés de ressemblance à la matrice extra cellulaire native.Les étapes majeures de notre projet de médecine régénérative sont de comparer la thérapie cellulaire à la thérapie tissulaire utilisant une « scaffold », de comparer les deux cellules sources potentielles, d’étudier les qualités de l’hydrogel BD-Purastat® et enfin de transplanter notre substitut cellularisé dans un modèle préétabli d'adhérences chez le rat.Matériel et méthode :La première étape validait le modèle animal d’adhérences post opératoires comparant plusieurs dommages péritonéaux. Puis les cellules étaient comparées en terme d'isolement, de culture, de caractérisation et de différenciation. Une étude de preuve de concept était réalisée afin de comparer les techniques de thérapie cellulaire aux techniques de thérapie tissulaire avec la greffe de péritoine lui-même. Ensuite, BD-Purastat® était testé grâce à une collaboration avec le laboratoire 3D Matrix. Enfin l’implantation in vivo d’une plaque d’hydrogel chargée de cellules autologues était évaluée sur le modèle de rat mis au point.Résultats :Deux modèles d'adhérences post-opératoires étaient validés chez le rat. Les deux techniques étaient efficaces et pertinentes pour l'application clinique. Les cellules mésothéliales présentaient un aspect typique polygonal avec des bords brillants et exprimaient les marqueurs intra-cellulaires de la vimentine et des cytokeratines. Elles présentaient une sénescence précoce comme attendu pour des cellules adultes bien différenciées. Les cellules souches adipocytaires étaient allongées et fines, stellaires, avec une bonne capacité d'expansion, se différenciaient en ostéocytes et en adipocyte et formaient des colonies comme attendu pour des cellules souches. L'étude de preuve de concept a permis de montrer que les cellules mésothéliales contribuaient à la repéritonéalisation seulement si elles étaient bien orientées et transplantées au sein d’un tissu. Ainsi, l’ajout d'une « scaffold » était crucial. Concernant le choix des biomatériaux, BD-Purastat® présentait de bonnes propriétés mécaniques, de biocompatibilité et implanté seul permettait déjà une réduction des adhérences postopératoires. L'implantation du substitut cellularisé n'avait pas permis d’améliorer les résultats obtenus avec le gel seul.Conclusion et perspectives :Notre étude permettait de montrer que des cellules mésothéliales au sein d'une « scaffold » étaient la clé du succès de la repéritonéalisation pour la prévention des adhérences postopératoires en charge abdominale. La différenciation des cellules souches adipocytaires vers le phénotype mésothélial avait encore besoin d'être prouvée. BD-Purastat® diminuait l’étendue des adhérence postopératoires. Le comportement des cellules dans cette « scaffold » nécessitait d'être étudié pour pouvoir obtenir l'efficacité clinique du substitut péritonéal de cellules autologues et d'hydrogel. / Introduction: Postoperative abdominal adhesions are a major complication leading to medical and economical problems. Replace injured peritoneum, which is composed of a monolayer of mesothelial cells (MC), using cell-therapy or cell-laden scaffold are two promising strategies to prevent adhesions. MC as functional and differentiated cells are crucial. However, adipose stem cells (ASCs) could replace MCs thanks to their potential of differentiation. Furthermore, hydrogel polymers are attractive scaffolds mimicking the properties of the native ECM. So, milestones of our project of regenerative medicine are comparison of cell-laden scaffolds and cell-therapy, choice of cell source and biomaterial, and finally transplantation of the cell-laden hydrogel scaffold, in a pre-established rat model of adhesion.Materiel and Method: Firstly, models of adhesion were compared usingdifferent peritoneal injuries. Then, MCs and ASCs were compared for isolation, culture, characterization, and differentiation. Nextly, cell-therapy using MC intra peritoneal injection (IP) or cell-sheet technology was compared with tissue-therapy using peritoneal grafts through a proof of concept study. BD-Purastat® hydrogel was tested in collaboration with 3D Matrix firm. Cell-laden hydrogel gels were implanted and assessed on adhesion prevention.Results: Two animal models of adhesion were validated and both techniques were effective and clinically relevant. MCs and ASCs were isolated from respectively tunica vaginalis and subcutaneous inguinal fat pad. MCs, with typical cobble-stone morphology and bright edges, were positively stained for vimentin and cytokeratin. Senescence arrived after only three passages for these adult well-differentiated cells. Spindle-shaped ASCs had a good capacity of expansion, were able to differentiate in osteocytes and adipocytes, and to form colonies as expected for stem cells. Autologuous peritoneal grafts prevented postoperative abdominal adhesions in the rat model. As the mechanism of this prevention, the MC survived and contributed to reperitonealization, only when they were transplanted as a part of the autologous peritoneal grafts and were located on the surface exposed to the abdomen. Cell sheet technology and MCs IP injection failed in the adhesion prevention. BD-Purastat® presented good mechanical properties and biocompatibility. Alone, it reduced significantly adhesion extent. But, cell encapsulation into BD-Purastat® did not improve this prevention.Conclusion and perspectives: Our study supported that MCs and scaffold are both needed to succeed in peritoneum’s engineering to prevent adhesion. ASCs differentiation into MCs phenotype has still to be shown. BD- Purastat® decreases adhesion extent and behavior of the cell into this scaffold needs to be studied to improve the effectiveness of the cell-laden hydrogel application.

Malgré l’évolution des outils de bio-ingénierie tissulaire et la sophistication des recherches visant à développer de nouveaux substituts cutanés, la prise en charge clinique des brûlures sévères a relativement peu évolué depuis plus de 30 ans. Si la survie est quasiment garantie par l’utilisation de cultures d’épidermes autologues (CEA), le traitement des grands brûlés n’en reste pas moins traumatisant, avec l’émergence de séquelles physiques (cicatrices hypertrophiques, dyschromies, fragilité cutanée), pathophysiologiques (désordres métaboliques et immunitaires), et neuropsychologiques (neuropathies, douleurs chroniques, syndrome de stress post-traumatique). Depuis leur découverte dans les années 1960, les Cellules Stromales Mésenchymateuses (CSM) ont suscité un intérêt grandissant dans le domaine de la thérapie cellulaire, en raison de leurs propriétés trophiques et immunomodulatoires. La découverte de leur haute plasticité face à divers stimuli environnementaux a plus récemment ouvert le champ de nouvelles stratégies de thérapie ciblée appelées « préconditionnement ». Ainsi, cette thèse a pour objet l’évaluation d’une stratégie de préconditionnement de CSM, afin d’en potentialiser l’action thérapeutique, dans le cadre du traitement de brûlures par CEA. Ce travail de thèse a été partagé en trois unités expérimentales. Tout d’abord la stratégie de préconditionnement a été mise au point sur des modèles de cicatrisation in vitro, permettant ainsi de souligner le rôle intéressant de l’interleukine-1β (IL-1β) et de la substance P (SP). Ensuite, l’efficacité et les mécanismes d’action de ces facteurs de préconditionnement ont été évalués in vitro, puis in vivo sur un modèle de plaie excisionnelle, en utilisant les CSM ou leurs produits de sécrétion. Il a ainsi pu être démontré que l’IL-1β améliorait l’efficacité des CSM en promouvant leur activité anti-inflammatoire, pro-migratoire et de remodelage. Il a également été montré que cet effet était en partie lié à un mécanisme impliquant la voie du TGF-β1. Enfin, la plus-value de cette stratégie thérapeutique a fait l’objet d’une étude in vivo sur un modèle de brûlure profonde mimant la prise en charge du patient sévèrement brûlé. Malgré divers problèmes techniques limitant la prise de greffe de CEA dans ce modèle, l’effet anti-inflammatoire et pro-angiogénique des CSM a pu être confirmé. Ces résultats semblent donc montrer l’intérêt d’une thérapie par CSM préconditionnées. Des études précliniques complémentaires sont maintenant requises pour vérifier la plus-value d’une telle thérapie dans le contexte de la brûlure cutanée. / Since the 1980’s, little progress has been made in the management of major burns, in spite of several research advances in the field of skin tissue engineering and regenerative medicine. Developed in 1975, Cultured Epithelial Autografts (CEA) are the last-in-date significant breakthrough, allowing patient survival in most critical cases. However, patients still have to cope with debilitating sequelae including hypertrophic scars, skin fragility, immunometabolic dysfunctions, chronic pain and post-traumatic stress disorder. Mesenchymal Stromal Cells (MSC) have raised an increasing interest during the past 50 years due to their trophic and immunomodulatory properties. Recent findings about their high plasticity to external stimuli have fostered the development of new targeted therapies known as “preconditioning strategies”. This PhD work thus aimed to assess a MSC preconditioning strategy for the treatment of major burns using CEA. The present work was divided into three main experimental parts. First, in vitro experiments were developed in order to set up the preconditioning strategy, and revealed the interesting role of both interleukin-1β (IL-1β) and substance P (SP). Then, both effectiveness and mechanism of action of these preconditioning modalities were assessed in vitro and in vivo, either using MSC or their secretory products. It was thus shown that IL-1β could potentiate MSC effectiveness through the promotion of pro-migratory, anti-inflammatory and pro-remodeling activities. This effect was shown to be partly mediated by the TGF-β1 signaling pathway. At last, this preconditioning strategy was evaluated in a third degree burn rat model mimicking the surgical treatment applied to severe burn patients. Despite technical hurdles limiting CEA engraftment, anti-inflammatory and pro-angiogenic properties of MSCs were confirmed in this model. These preliminary results underline the potential of a preconditioned MSC therapy in wound healing. Additional preclinical studies are now required to corroborate the benefit of such a therapy in major burns.