Le réticulum endoplasmique rugueux (RE), assure la synthèse, le repliement et la maturation des protéines de la voie de sécrétion. Les altérations des fonctions physiologiques du RE, entrainent l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE, une condition appelée stress RE. En réponse au stress RE, un mécanisme compensatoire adaptatif appelé Unfolded Protein Response (UPR) est activé afin de restaurer l’homéostasie du RE et de permettre la survie de la cellule. Dans le cas d’un stress RE sévère ou prolongé, les altérations ne pouvant plus être compensées, la cellule est éliminée par apoptose contribuant ainsi au développement de pathologies cardiaques. Le but des recherches actuelles sur le stress RE en physiopathologie cardiaque n’est pas d’inhiber la réponse au stress RE, mais plutôt de la moduler afin de limiter l’apoptose des cardiomyocytes et de protéger le cœur. Dans ce contexte, nous avons mis en évidence que le stress RE induit une modification importante de l’architecture des cardiomyocytes associée à une altération de la fonction mitochondriale. De plus, nous avons montré que SIRT1, une désacétylase dépendante du NAD+, inhibe l’apoptose mitochondriale induite par un stress RE en limitant spécifiquement l’activation de la voie PERK de la réponse UPR via la désacétylation du facteur eIF2á sur la lysine K143. Enfin, nos résultats indiquent que SIRT1 protège les cardiomyocytes de l’apoptose induite par le stress RE en favorisant la mitophagie, via une activation de la voie de signalisation eEF2K/eEF2. Ces résultats montrent que SIRT1 est impliquée dans la régulation de la réponse autophagique et apoptotique des cardiomyocytes au stress RE et suggèrent que cette désacétylase serait une cible thérapeutique intéressante pour limiter le développement des pathologies cardiaques liées au stress RE. / The endoplasmic reticulum (ER) functions to properly synthesize, fold and process secreted and transmembrane proteins. Impairment of ER function induces an accumulation of misfolded proteins in the ER lumen, a condition termed ER stress. In response to ER stress, an adaptive compensatory mechanism called Unfolded Protein Response (UPR) is activated to restore ER homeostasis and promote cell survival. In the case of severe or prolonged ER stress, homeostasis cannot be restored and the cell is eliminated by apoptosis contributing to the development of cardiac pathologies. Currently, cardiac therapy based on ER stress modulation to conserve beneficial adaptations and to avoid cardiomyocyte apoptosis is viewed as a promising avenue towards effective therapies of ER stress-associated cardiac diseases.In this context, we demonstrated that ER stress induces architectural modifications and alterations of the mitochondrial function in cardiomyocytes. Furthermore, we showed that SIRT1, a NAD+-dependent deacetylase, inhibits mitochondrial apoptosis by modulating the activation of the PERK pathway of the UPR through deacetylation of the translation initiation factor eIF2á on lysine K143. Our results also indicate that SIRT1 protects cardiomyocyte from ER stress-induced apoptosis by activating mitophagy through eEF2K/eEF2 pathway. Collectively, these data demonstrate that SIRT1 regulates ER stress-induced autophagy and apoptosis in the heart and suggest that this deacetylase may be a therapeutic target to protect the heart against ER stress-induced injury.

Les niveaux de chlorure sont rigoureusement régulés par des canaux de chlorure tels que le régulateur transmembranaire de mucoviscidose (CFTR), la famille de canaux CLC ou les canaux de chlorure activés par le calcium. Un dérèglement des concentrations de chlorure ou du transport de ce dernier a été rapportée pour être lié à plusieurs maladies telles que la mucoviscidose, la myotonie, l'épilepsie, l'hyperekplexie ou la surdité. Toutes ces maladies appartiennent à la famille des pathologies qui présentent un déficit de la fonction lysosomale et qui sont caractérisées par un défaut du processus autophagique.Les cellules épithéliales pulmonaires des malades atteints de mucoviscidose montrent également un défaut d’autophagie. L’association de deux produits : la cysteamine et l’epigallocathecin gallate (EGCG) permet de restaurer la fonction autophagique de ces cellules et améliore les symptômes de la maladie. Nous avons tenté d'améliorer cette combinaison en criblant des inducteurs de l'autophagie pour leur capacité d’interaction avec la cystéamine et pour une meilleure efficacité de traitement. Nous avons ainsi trouvé que l'amiodarone, de manière similaire à l'EGCG, était capable d'engager une interaction coopérative avec la cystéamine pour stimuler l'autophagie dans les lignées cellulaires. De plus, l'amiodarone s’est révélé relativement efficace pour restaurer l'expression d’une protéine Del 508 CFTR mature et fonctionnelle dans les cellules épithéliales.Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons exploré les relations entre la modulation des concentrations intracellulaires des ions chlorure et l'autophagie. Trois approches complémentaires ont été utilisées (i) l’appauvrissement / réduction du chlorure dans le milieu de culture des cellulaires (ii) la réduction de l'expression du gène CLCN7 codant pour le seul transporteur de chlorure connu pour être présent dans les lysosomes et (iii) l’utilisation de transporteurs synthétique des ions chlorure. Nous avons montré que la modulation de la concentration des ions Cl- régulait l'autophagie. Cela a été observé lorsque nous avons déplété le chlorure du milieu de culture cellulaire ou lorsque nous avons aboli le gradient de chlorure en utilisant des transporteurs de chlorure synthétique (SCTs). Nous avons également montré que les STCs modifiaient la structure et la fonction des mitochondries. De plus, nous avons montré que les antioxydants restauraient la fonction mitochondriale et inhibaient la stimulation de l'autophagie, ce qui permet de voir sous un jour nouveau le rôle que le chlorure pourrait jouer dans la signalisation de différentes voies cellulaire de réponse au stress. / Chloride levels are stringently regulated by chloride channels such as cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR), the CLC family of channels or calcium activated chloride channels. A dysregulation of chloride concentrations or transport has been reported to be linked to several diseases including cystic fibrosis (CF), myotonia, epilepsy, hyperekplexia or deafness. All these diseases belong to the family of lysosomal storage pathologies which are characterized by a defect in the autophagic process.The pulmonary epithelial cells of CF patients show a defect of autophagy. The combination of two products: cysteamine and epigallocathecin gallate (EGCG) has been shown to restore the autophagic function of these cells and to improve the symptoms of the disease. We have tried to enhance this combination by screening inducers of autophagy for their ability to interact with cysteamine and for better treatment efficacy. We found that amiodarone, similarly to EGCG, was able to engage in a cooperative interaction with cysteamine to stimulate autophagy in cell lines. In addition, amiodarone has been found to be relatively effective in restoring expression of a mature and functional Del F508 CFTR protein in epithelial cells.In the second part of this thesis, we explored the relationships between the modulation of intracellular chloride concentration and autophagy. Three complementary approaches were used (i) the depletion/reduction of chloride in the cell culture medium (ii) the reduction of the expression of the CLCN7 gene encoding the only chloride transporter known to be present in lysosomes and (iii) the use of synthetic carriers of chloride ions. We have shown that the modulation of the concentration of Cl- modulates autophagy. This was observed when we depleted chloride from the cell culture medium or when we abolished the chloride gradient using Synthetic Chloride Transporters (SCTs). We have also shown that SCTs modify the structure and function of mitochondria. In addition, we have shown that anti-oxidants restore mitochondrial function and inhibit the stimulation of autophagy, allowing us to see in a new light the role that chloride could play in different stress response pathways.

Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs de l’immunité innée qui jouent un rôle important dans la surveillance immunitaire anti-tumorale. Le concept d’immunothérapie basée sur l’activation des cellules NK a ainsi émergé comme une approche thérapeutique convaincante. Malgré les avancées spectaculaires réalisées ces dernières décennies, les connaissances concernant la biologie des cellules NK restent largement fragmentées. La mise en place de stratégies thérapeutiques anti-tumorales utilisant les cellules NK nécessite donc une compréhension approfondie des mécanismes de résistance développés au sein du microenvironnement tumoral. Les travaux menés au laboratoire ont révélé que certains mécanismes de résistance intrinsèque développés par les cellules tumorales dépendent de l’activation de l’autophagie en réponse à un stress hypoxique. Ces travaux ont démontré que l’activation de l’autophagie en condition de stress hypoxique, diminue la susceptibilité des cellules tumorales à la lyse par les cellules NK, qui peut être restaurée par l’inhibition de Beclin1. Ces mêmes travaux ont également démontré in vivo que l’inhibition de Beclin1 diminue la progression tumorale dans des modèles syngéniques murins de cancer de sein et de mélanome.Dans cette étude, nous avons montré dans un modèle murin de mélanome, que la régression des tumeurs déficientes en Beclin1 était corrélée à une augmentation significative d'infiltration des cellules NK. Nous avons établi que cette infiltration accrue est due à une augmentation d'expression et de sécrétion de la chémokine CCL5. De plus, dans les tumeurs déficientes en Beclin1, ayant une forte expression de CCL5, l’inhibition de CCL5 était suffisante pour diminuer l'infiltration des cellules NK et bloquer la régression tumorale.Ayant établi le rôle majeur de CCL5 dans l'infiltration des cellules NK dans les tumeurs de mélanome déficientes en Beclin1, nous avons étudié, dans la deuxième partie, le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) impliqué(s) dans la régulation de CCL5. Nous avons démontré que l’inhibition génétique ou pharmacologique de l’autophagie induit la voie SAPK/JNK dans les cellules tumorales et active par conséquence le cofacteur de transcription c-Jun impliqué dans l'expression de CCL5. Plus précisément, nous avons établi que l'induction de SAPK/JNK est due à un défaut de l'activité phosphatase de la protéine phosphatase 2A (PP2A).Dans la dernière partie, nous avons étudié l'impact clinique de l’expression de CCL5 dans le cas du mélanome. L’analyse de différentes biopsies de mélanomes a montré une corrélation positive et significative de CCL5 avec l’expression du marqueur des cellules NK NKp46. Ce résultat a été validé sur une large collection de mélanomes, disponible dans la base de données TCGA (The Cancer Genome Atlas). La survie à long terme de patients atteints de mélanome ayant une expression élevée de CCL5 est significativement améliorée par rapport à ceux ayant une faible expression de cette chémokine.L'ensemble de nos résultats démontre pour la première fois que la diminution de la croissance tumorale suite l’inhibition de l'autophagie est étroitement liée à une amélioration de l'infiltration des cellules NK dans les tumeurs. Cette infiltration résulte d'une augmentation de l'expression la chémokine CCL5 par les cellules tumorales déficientes en Beclin1. Cette étude souligne l’intérêt de cibler l'autophagie afin d’établir un microenvironnement tumorale favorable à l'infiltration des cellules NK. Ainsi, l'inhibition sélective de l'autophagie dans les cellules tumorales pourrait améliorer les stratégies thérapeutiques anti-tumorales basées sur les cellules NK. / One of the major obstacles to define an efficient cancer immunotherapy protocol is the capacity of hypoxic tumor microenvironment to inhibit the host immune response. In line with this concept, we have shown that hypoxia impairs natural killer (NK) cell-mediated killing of cancer cells. This impairment was not related to a defect in NK cell function, but was strikingly dependent on the induction of the autophagic degradation process in hypoxic tumor cells. Genetic or pharmacological inhibition of autophagy restored NK-mediated killing of hypoxic tumor cells. . We have validated this concept in vivo by showing that targeting autophagy enhanced the NK-mediated regression of breast and melanoma tumors in mice. This regression was related to an increase in NK cells infiltrating autophagy defective tumor as demonstrated by immunohistochemistry staining of NK cells. The present project aims to investigate how autophagy inhibition increases tumor infiltration by NK cells leading to an improvement of NK-mediated anti-tumor immune response et to identify fectors which may be implicated in the infiltration of NK cells into the tumors.

Le renouvellement de l’épithélium intestinal repose sur la prolifération incessante de cellules souches intestinales (CSI) capables de régénérer l’intégralité de l’épithélium en 3 à 5 jours. Des altérations de ces dernières sont à l’origine de la transformation tumorale. L’étude des mécanismes impliqués dans la protection des CSI face à différents stress est donc essentielle pour mieux comprendre l’homéostasie et les pathologies intestinales. Dans un modèle de souris prédisposées à développer des tumeurs suite à la perte du gène Apc, notre équipe a pu précédemment démontrer une activation de l’autophagie nécessaire à la croissance tumorale. Nos travaux visent à étudier le rôle de ce processus catabolique dans l’homéostasie des CSI. Pour ce faire, nous utilisons des modèles murins génétiquement modifiés et des cultures d’organoïdes afin d’étudier les effets de l’inhibition de l’autophagie dans l’homéostasie intestinale et en particulier dans les CSI.Nos travaux indiquent que l’inhibition de l’autophagie par l’invalidation du gène Atg7 conduit à une activation de p53 et de l’apoptose spécifique des CSI. L’invalidation simultanée du gène Tp53 empêche la mort des CSI déficientes en autophagie. De plus, au long terme, ces souris développent des tumeurs, contrairement aux souris invalidées uniquement pour les gènes Atg7 ou Tp53. Nous avons donc émis l’hypothèse que l’inhibition de l’autophagie sensibilisait les CSI à l’apoptose suite à une accumulation de dommages cytotoxiques. Par une analyse d’expressions géniques des CSI issues de cryptes contrôles et invalidées pour le gène Atg7, nous avons mis en évidence une altération des réponses associées au stress oxydant et à la réparation de l’ADN. Confirmant ces signatures, nous avons observé des dommages de l’ADN dans les cryptes déficientes en autophagie et un défaut de réparation de ces dommages suite à une irradiation. Nous observons également une accumulation d’espèces réactives de l’oxygène dans les CSI déficientes en autophagie associée à une atténuation de la réponse antioxidante médiée par NRF2. Des traitements antibiotiques à large-spectre ou antioxydants améliorent la survie des CSI déficientes en autophagie et soutiennent l’influence des espèces réactives de l’oxygène et de la flore intestinale sur la mort des CSI. Nos travaux indiquent donc un rôle important de l’autophagie dans la protection et le maintien des CSI, de par son contrôle des espèces réactives de l’oxygène, du microenvironnement bactérien et des voies de réparation de l’ADN. / The renewal of the intestinal epithelium relies on the continuous proliferation of stem cells capable of regenerating the entire epithelium every 3 to 5 days. These intestinal stem cells (ISC) are thought to be the cell of origin for colorectal cancer. Thus, characterizing the mechanisms involved the protection of ISC against different stresses is key to understanding both intestinal homeostasis and tumor development. In tumoral tissue from mice predisposed to intestinal tumor development following the loss of the tumor suppressor gene Apc, our laboratory previously showed an upregulation of autophagy required for tumor growth. Our work aims to understand the role this catabolic mechanism in the homeostasis of ISC. To this end, we use genetically modified mouse models and intestinal organoid culture to study the effects of autophagy inhibition in intestinal homeostasis and in particular in ISC.We found that the inhibition of autophagy upon deletion of the gene Atg7 results in p53 activation and apoptosis of ISC specifically. The simultaneous deletion of Tp53 prevents the death of autophagy-deficient ISC. Moreover, over time, mice deficient for both Atg7 and Tp53 develop tumors, contrary to those deficient for either Atg7 or Tp53 alone. We therefore hypothesized that the inhibition of autophagy sensitizes ISC to p53-mediated apoptosis as a result of accumulated pro-tumorigenic damages. Transcriptomic analysis on sorted control or Atg7-deficient ISC revealed aterations in oxidative stress and DNA damage responses. Confirming these signatures, we observed DNA damages in autophagy-deficient crypts along with a defect in the repair of induced damages following irradiation. We additionally observed an accumulation of reactive oxygen species in autophagy-deficient ISC linked to a downregulation of the NRF2-mediated antioxidant response. Wide-spectrum antibiotic or antioxidant treatments improve the survival of autophagy-deficient ISC and support the contribution of both reactive oxygen species and the intestinal microbiota to the death of ISC. Our work therefore reveals we find an important function of autophagy in the integrity and maintenance of ISC by controlling reactive oxygen species, the microbial microenvironment and DNA repair pathways.

Résumé : L’autophagie est un mécanisme constitutif et inductible de dégradation des composants cytoplasmiques afin de maintenir l’homéostasie cellulaire. Elle est souvent modulée par les virus car il s’agit également d’un mécanisme de défense antiviral. Elle peut avoir un rôle proviral quand elle est détournée et régulée par les virus. Nous avons précédemment observé au laboratoire que le cytomégalovirus humain (HCMV) stimule la formation des autophagosomes de manière précoce indépendamment de l’expression des protéines virales, puis qu’il entraine un blocage de l’autophagie aux temps tardifs. Dans ce travail, nous avons montré que ce virus a développé des stratégies impliquant la synthèse de deux protéines virales, IRS1 et TRS1, pour inhiber l’autophagie. De façon surprenante, nous avons également mis en évidence un rôle proviral de l’autophagie aux temps tardifs de l’infection par le HCMV. Nous avons pu montrer par des techniques de biochimie et d’imagerie cellulaire que l’expression aussi bien de TRS1 que d’IRS1 est capable de bloquer la formation des autophagosomes dans les cellules. Nous avons identifié le mécanisme d’action de ces protéines. Il est indépendant de la protéine kinase PKR mais nécessite une interaction avec Beclin 1, une protéine de la machinerie autophagique. Nous avons localisé le site d'interaction de Beclin 1 avec IRS1 et TRS1 (BBD pour Beclin 1 binding domain) au niveau de leur région N-terminale. Ce domaine, conservé entre les deux protéines, est nécessaire pour l’inhibition de l’autophagie. Le site d’interaction d’IRS1 a été identifié dans le domaine en superhélice (coiled-coil domain) CCD de Beclin 1. Nous avons caractérisé le rôle de TRS1 et IRS1 dans la modulation de l’autophagie dans le contexte de l’infection virale, en utilisant différents virus mutants : des virus dans lesquels on a supprimé soit le gène IRS1, soit le gène TRS1 et un virus dans lequel il manque les deux gènes IRS1 et TRS1. Les résultats obtenus suggèrent qu’IRS1 et TRS1 sont effectivement toutes les deux impliquées dans ce processus. Afin de mieux comprendre le rôle de l’interaction de ces protéines avec Beclin 1, nous avons étudié le phénotype d’un virus mutant qui n’exprime pas IRS1 et qui contient une délétion de la région BBD de TRS1. Nous avons montré que ce virus mutant ne se lie pas à Beclin 1 et qu’il ne bloque pas l’autophagie. De manière surprenante, il n’a pas de défaut de production virale, suggérant que l’inhibition de l'autophagie ne serait pas essentielle pour la réplication virale. Nous avons développé d’autres approches, comme l’utilisation de modulateurs pharmacologiques de l’autophagie ou de lentivirus hébergeant des shRNA, qui montrent que l’inhibition de l’autophagie est capable de diminuer la production virale et au contraire que sa stimulation l’augmente. Ces derniers résultats suggèrent que l’autophagie pourrait être bénéfique au HCMV dans certaines conditions. / Abstract: Autophagy is a constitutive and inducible mechanism of degradation of cytoplasmic components, in order to maintain the cellular homeostasis. Autophagy is often modulated by viruses, because it is also considered as an antiviral defense mechanism. It can have a beneficial role, when it is hijacked and regulated by viruses. We have previously observed in our laboratory that the human cytomegalovirus (HCMV) stimulates autophagosome formation, at the early stage of infection, independently of viral protein expression then, later on, it blocks autophagy. In this work, we showed that this virus has developed strategies involving the synthesis of several viral proteins, such as IRS1 and TRS1, to inhibit autophagy. Surprisingly, we also demonstrated a proviral role of autophagy at late stages of infection with HCMV. We showed, through biochemical and cellular imaging technologies, that expression of both TRS1 and IRS1 is able to block the formation of autophagosomes. We identified the mechanism of action of these proteins. It is independent of the protein kinase PKR but requires interaction with Beclin 1, a protein of the autophagic machinery. We mapped the interaction site of Beclin 1 with IRS1 and TRS1 in their N-terminal region and called it BBD for Beclin 1-binding domain. This domain (BBD)is conserved between the two proteins and essential to inhibit autophagy. We also identified the site of interaction of IRS1 in the coiled-coil domain (CCD) of Beclin 1. We characterized the role of IRS1 and TRS1 in the modulation of autophagy, in the context of viral infection, using different mutant viruses: viruses in which either the IRS1 or the TRS1 gene has been removed and a mutant virus lacking both IRS1 and TRS1 genes. Our results suggest that both IRS1 and TRS1 are involved in the regulation of this process. To better understand the role of the interaction of these proteins with Beclin 1, we studied the phenotype of a mutant virus that does not express IRS1 and which contains a deletion of the N-terminal region of TRS1. We showed that this mutant does not bind to Beclin 1 and is not able to block autophagy. Surprisingly, it has no defects in viral production, suggesting that inhibition of autophagy is not essential for viral replication. We developed other approaches, including the use of pharmacological modulators of autophagy or shRNA knockdown, which show that the inhibition of autophagy is able to reduce viral production and, on the contrary, that its stimulation increases it. These results suggest that autophagy may be beneficial to HCMV in certain conditions.

La macroautophagie est un processus cellulaire qui permet la dégradation et le recyclage de constituants cytoplasmiques par formation de vésicules à double membrane, les autophagosomes qui fusionnent ensuite avec les lysosomes. Ce processus intervient dans divers processus physiologiques tels que le développement, la longévité, la mort cellulaire et dans des pathologies humaines comme des cancers ou maladies neurodégénératives. Mes travaux de thèse ont révélé l’existence de rôles séquentiels et spécifiques des protéines autophagiques, LGG-1 et LGG-2, homologues d’Atg8/LC3 chez le nématode Caenorhabditis elegans. Cette étude a été réalisée dans l’embryon précoce sur une population particulière d’autophagosomes responsables d’un processus physiologique stéréotypé : la dégradation des mitochondries paternelles au moment de la fécondation. Nous avons montré que LGG-1 est recruté au niveau des autophagosomes précoces et permet le recrutement de LGG-2 qui intervient plus tardivement dans le processus autophagique pour permettre la fusion des autophagosomes avec les lysosomes. De plus, la fonction de LGG-1 peut être complémentée par son homologue humain témoignant de l’intérêt du système modèle C. elegans pour l’analyse des homologues d’Atg8.Par ailleurs, des études récentes ont démontré que la protéine autophagique LC3 était recrutée au cours de la phagocytose des corps apoptotiques. Ce processus a été appelé LAP pour LC3-associated phagocytosis. Par des approches génétiques et cellulaires, utilisant la microscopie optique et électronique, j’ai montré qu’il existait une implication différente de protéines autophagiques LGG-1 et LGG-2 dans la dégradation des corps apoptotiques chez C. elegans. La protéine LGG-2, spécifiquement, joue un rôle dans la cellule phagocytaire afin de dégrader le corps apoptotique. Ces travaux suggèrent également une implication de l’autophagie dans le corps apoptotique pour permettre la phagocytose. / Macroautophagy is a major ubiquitous catabolic process which allows the bulk degradation and recycling of cytoplasmic constituents by formation of double membrane vesicles called autophagosomes which then fuse with lysosomes. This process is involved in a large variety of physiological processes such as development, anti-aging, cell death and in human pathologies like cancers or neurodegenerative diseases. My thesis work revealed the existence of sequential and specific roles of autophagic proteins LGG-1 and LGG-2, homologs of Atg8/LC3 in Caenorhabditis elegans. In this study, we focused on a particular population of autophagosomes involved in a physiological process in early embryos: the degradation of paternal mitochondria during fertilization. We showed that LGG-1 is recruited at the early autophagosomes and allows LGG -2 recruitment which acts later in the autophagic process to allow the fusion of autophagosomes with lysosomes. Moreover, the function of LGG -1 can be complemented with its human homologs revealing the interest of the C. elegans model system for analyzing Atg8 homologs.Furthermore, recent studies have identified the recruitment of autophagic proteins during phagocytosis of apoptotic cells in the so called LC3-associated phagocytosis (LAP). By genetic and cellular approaches, using optical and electron microscopy, I showed that there is a different involvement of autophagic proteins, LGG-1 and LGG-2 in the degradation of apoptotic cells in C. elegans. LGG-2 protein, specifically, plays a role in phagocytic cell to degrade apoptotic corpses. Moreover, this work suggest a function of autophagy in the apoptotic corpses to allow phagocytosis.

Le virus Epstein-Barr (EBV), un membre de la famille des Herpesviridae, est associé à la mononucléose infectieuse et à différents types de cancers comme le lymphome de Burkitt, les lymphomes post-transplantation ou encore le carcinome du nasopharynx. Ce virus est capable de persister à vie dans l’organisme en combinant des phases de latence et des phases de multiplication active. L’autophagie est un processus cellulaire primordial qui conduit à la dégradation et au recyclage de protéines à longue durée de vie et d’organites endommagés ou vieillissants. Elle contribue non seulement à maintenir l’homéostasie cellulaire mais aussi à s’adapter aux conditions environnementales. Souvent décrite comme un mécanisme antiviral, l’autophagie est contrecarrée par de nombreux virus. Elle peut également être détournée à leur profit. Il a été démontré que l’EBV est capable de stimuler l’autophagie durant le cycle lytique et d’échapper à la dégradation dans les autolysosomes en bloquant la maturation des autophagosomes. Le but de cette étude était d’identifier des protéines virales impliquées dans la modulation du processus autophagique par l’EBV. Nous avons démontré que l’expression ectopique de BHRF1, une protéine transmembranaire de 17kDa orthologue de la protéine cellulaire Bcl-2, module l’autophagie.Alors que Bcl-2 est une protéine anti-autophagique, nous avons établi par différentes approches que l’expression de BHRF1 conduit à l’accumulation d’autophagosomes. De plus, en utilisant une sonde tandem bifluorescente LC3 (mRFP-GFP-LC3) pour étudier le flux autophagique, nous avons montré que BHRF1 stimule l’autophagie. BHRF1 est engagée dans un complexe avec Beclin1, une protéine de la machinerie autophagique. Nous avons établi que BHRF1 est localisée au niveau des membranes mitochondriales et du réticulum endoplasmique (RE). L’expression de BHRF1 est associée à une réorganisation du réseau mitochondrial conduisant à la formation d’agrégats mitochondriaux juxta-nucléaires. Considérant l’importance des microtubules dans l’autophagie et le transport des mitochondries, nous avons exploré la dynamique des microtubules et les modifications post-traductionnelles de la tubuline après expression de BHRF1. Nous avons observé un recrutement d’acétyl-tubuline autour des mito-aggresomes associé à un réseau intact de microtubules. Nos résultats ont montré que le réseau de microtubules et l’hyper-acétylation de l’alpha-tubuline sont nécessaires pour former les mito-aggrésomes induits par BHRF1. Par différentes approches, nous avons démontré le rôle de BHRF1 dans l’induction de la mitophagie, un processus qui entraine la clairance des mitochondries endommagées par autophagie. Considérant le rôle des mitochondries endommagées dans l’induction de l’apoptose, nous suggérons que le rôle anti-apoptotique de BHRF1 pourrait être associé à l’induction de la mitophagie. / Epstein-Barr virus (EBV), a member of the Herpesviridae family, is associated with infectious mononucleosis and with several types of cancers including Burkitt’s lymphoma, post-transplant B-cell lymphoma disease and nasopharyngeal carcinoma. This virus is able to establish persistent infection and to undergo lytic cycle after reactivation. Autophagy is a critical cellular process leading to degradation of long lasting proteins and damaged or aging organelles. It contributes not only to maintain cell homeostasis but also to the adaptation to environmental stresses. Sometimes, autophagy is described as an antiviral mechanism, and viruses have evolved multiple strategies to subvert it or to hijack it to their own profit. It has been reported that EBV is able to stimulate autophagy during lytic cycle and then to escape degradation within autolysosomes by blocking autophagosomes maturation. The aim of my study was to identify EBV viral proteins involved in this modulation. Among the numerous viral proteins encoded by EBV, we have identified BHRF1, a transmembrane protein homolog of cellular protein Bcl-2, which was able to modulate autophagy by ectopic expression.Whereas Bcl-2 is an anti-autophagic protein, we demonstrated by different approaches that BHRF1 expression leads to accumulation of autophagosomes. Moreover, using tandem-fluorescent-tagged LC3 (mRFP-GFP-LC3), which is based on different pH stability of GFP and mRFP fluorescent proteins, for monitoring autophagic flux, we clearly confirmed that BHRF1 stimulates autophagy. By co-immunoprecipitation we demonstrated that BHRF1 is part of acomplex including Beclin1, a protein of the autophagic machinery. We characterized the subcellular localization of BHRF1, and report that BHRF1 is localized in mitochondria and ER membranes. Expression of BHRF1 leads to a complete reorganization of the mitochondria network to form juxtanuclear mitochondrial aggregates. Based on the importance of microtubules on both autophagy and mitochondria transport, we explored microtubule dynamics and tubulin post-translational modifications after BHRF1 expression. We observed a clustering of acetyl-tubulin around the mito-aggresomes associated with an intact microtubules network. Our results showed that the microtubules network and the hyperacetylation of alpha-tubulin were both required to form BHRF1-induced mito-aggresomes.By different approaches, we demonstrated the role of BHRF1 in the induction of mitophagy, a process which promotes the clearance of impaired mitochondria by autophagy. We hypothesized that the role of BHRF1 to protect against apoptosis and to promote cell survival is related to the induction of selective autophagy.

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), qui comprennent les deux principales formes, la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH), sont caractérisées par une inflammation chronique et récurrente de la muqueuse intestinale, ayant un impact considérable sur la qualité de vie. À l'heure actuelle, la prise en charge thérapeutique de la MC n'est pas curative et un tiers des patients ne réagissent pas aux traitements biologiques et aux immunosuppresseurs. Par conséquent, de nouvelles stratégies pour traiter cette maladie sont fortement attendues. La dérégulation de l'interaction entre d'une part les facteurs génétiques et le système immunitaire de l'hôte, et d'autre part le microbiote intestinal et les facteurs environnementaux, est impliquée dans le développement des MICI. Cette perturbation entraîne effectivement une augmentation de la perméabilité intestinale et une inflammation persistante. Restaurer le microbiote «dysbiotique» et les fonctions intestinales altérées représentent donc une thérapeutique alternative intéressante. De ce fait, les probiotiques sont une option intéressante et ont été utilisés avec succès chez des patients souffrant de pouchite et de RCH. Cependant, leur effet protecteur est clairement souche-dépendant et plusieurs souches probiotiques bien connues n’ont pu conduire à un résultat clinique probant, en particulier chez les patients souffrant de MC. Le décryptage des mécanismes moléculaires sera donc la clé pour permettre une recommandation efficace des probiotiques dans le traitement ou la prévention des MICI. La sélection de souches basée sur des critères de sélection bien définis et en utilisant des modèles bien maitrisés est indispensable à ce processus. L'objectif principal de cette thèse était de sélectionner des lactobacilles et des bifidobactéries parmi une collection de souches françaises et libanaises, capables de présenter des propriétés protectrices contre les MICI, en se concentrant sur leurs capacités immuno-régulatrices et leurs capacités à renforcer la barrière épithéliale. Des approches in vitro ont été utilisées pour sélectionner des souches ayant une activité anti-inflammatoire et également capables d'améliorer la fonction de la barrière intestinale. Cinq souches ont été identifiées présentant des caractéristiques différentes, mais avec un potentiel thérapeutique élevé. Deux souches se sont révélées hautement protectrices dans deux modèles différents de colite aiguë et de colite de bas grade. Nos résultats ont confirmé en outre l'hypothèse selon laquelle la capacité des souches à atténuer l'inflammation est en partie due à l'amélioration de la barrière intestinale et à la restauration des protéines de jonction serrés.Un nombre croissant d’études génétiques ont prouvé que l’autophagie peut affecter plusieurs aspects de la réponse immunitaire des muqueuses, notamment via l’élimination de bactéries intracellulaires, la sécrétion de peptides antimicrobiens, la production de cytokines pro-inflammatoires et la présentation des antigènes. Par conséquent, l'autophagie peut être considérée comme un mécanisme de régulation clé impliqué dans la physiopathologie de la MC. Nous avons donc évalué la capacité des souches à activer cette voie et montré que les souches sélectionnées étaient en effet capables d’induire une activation de l’autophagie dans des cellules dendritiques murines. Nous avons démontré in vitro que le blocage de l'autophagie pouvait diminuer la capacité des souches à induire la sécrétion d'IL-10, cytokine anti-inflammatoire et, inversement, à exacerber la sécrétion d'IL-1β, cytokine pro-inflammatoire. Nous avons pu confirmer, à l'aide d'un modèle murin de colite, que la capacité protectrice d’une souche impliquait la machinerie autophagique, et nous avons pu mettre en évidence le rôle des cellules dendritiques dans ce processus [...] / Inflammatory bowel disease (IBD), including the two main types, Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC), is characterized by chronic, relapsing inflammation of the gut mucosa with considerable impact on the quality of life. At present, the therapeutic management of CD is not curative and one third of patients fails to respond to current biologicals and immunosuppressive drugs. Therefore new strategies for treating this disease are imperative.The deregulation of the normal interplay between the genetics and immune system of the host on the one hand, and the gut microbiota and environmental factors on the other hand, is known to be associated with the development of IBD, as this disturbance is leading to increased intestinal permeability and persistent inflammation. Restoring the “dysbiotic” microbiota and the impaired intestinal functions represent an attractive therapeutic alternative. Probiotics represent therefore an interesting option and have been used quite successfully in patients suffering from pouchitis and UC. However, their protective effect is clearly strain-dependent and several well-known probiotic strains failed to fulfill the expected clinical outcome, especially when applied in CD. Deciphering the molecular mechanisms will be the key to the recommendation of probiotics for the treatment or prevention of IBD. Selecting strains on well-defined selection criteria and using well-studied models is indispensable to this process.The main objective of this thesis was first to select lactobacilli and bifidobacteria from a collection of French and Lebanese strains that exhibited protective properties against IBD, focusing on their immunoregulatory capacities and their capacities to strengthen the epithelial barrier.In vitro approaches were used to select strains with anti-inflammatory activity and also able to enhance intestinal barrier function. Five strains were identified with different characteristics, but entailing a high potential for the management of IBD. Two strains, e.g. were found to be highly protective in two different models of acute and low grade colitis. Our results furthermore support the hypothesis that the capacity of the strains to alleviate inflammation is in part mediated by the improvement of the intestinal barrier and the restoration of tight junction proteins.A growing number of genetic studies provided strong evidence that autophagy machinery can affect several aspects of the mucosal immune response, including intracellular bacterial killing, antimicrobial peptide secretion, pro-inflammatory cytokine production and antigen presentation. Therefore, autophagy can be considered as a key regulator mechanism most likely involved in the physio-pathogenesis of CD.We therefore evaluated the capacity of the strains to activate this pathway and showed that the selected strains were indeed able to induce autophagy activation in dendritic cells. We demonstrated in vitro that blocking the autophagy machinery can abolish the capacity to induce the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 after immune cell stimulation, while exacerbating the secretion of the pro-inflammatory cytokine IL-1β. We could confirm, using a murine model of colitis, that the protective capacity of the selected strains indeed involves autophagy mechanisms, and we could highlight the role of dendritic cells in this process. We therefore propose here that autophagy is a novel mechanism through which probiotics can exhibit their immunoregulatory capacities.

Le cancer colorectal (CCR) est le premier cancer digestif dans les pays occidentaux. Malgré les progrès thérapeutiques réalisés au cours des deux dernières décennies, la survie relative à 5 ans ne dépasse pas 56%, et s’abaisse à 11,3% pour les patients métastatiques. Le pronostic est lié au stade de développement de la maladie au moment du diagnostic. Les décès sont en rapport avec une résistance primaire de la masse tumorale aux thérapies, ou la survenue de récidive, en rapport avec une maladie microscopique résiduelle, non contrôlée par les thérapies systémiques adjuvantes. Le travail réalisé au sein de notre laboratoire portant sur deux voies de signalisation met en leurs rôles dans le CCR : les neurotrophines (NTs, facteurs de croissance impliqués dans la survie des cellules cancéreuses) et l’autophagie (processus de recyclage cellulaire impliqué dans la résistance au stress). Le but de cette étude a été d’analyser la part de ces deux voies dans la survie des cellules du cancer colo-rectal et l’impact de leur inhibition sur le devenir cellulaire et l’évolution tumorale. L’étude a été menée sur deux lignées cellulaires provenant du même patient : SW480 (tumeur primaire) et SW620 (invasion ganglionnaire), aussi utilisées pour la réalisation de greffes sous cutanées sur le modèle murin Nude. De plus, la présence de principales protéines des NTs (TrkB) et de l’autophagie (LC3) a été analysée dans les tissus de patients. Des travaux précédents menés sur des cultures de CCR ont montré que la surexpression de TrkB était associée à la survie cellulaire. Nous avons donc choisi d’inhiber la voie des NTs avec le K252a (100nM). Sur culture cellulaire de CCR, in vitro, l’inactivation de la voie PI3K / AKT, induit une activation de l’autophagie. A l’opposé, le blocage du flux autophagique par une approche pharmacologique (avec la chloroquine, CQ ; 25µM) ou par une approche transcriptomique (siRNA anti-ATG5) induit une suractivation de la signalisation des NTs, via le couple TrkB/BDNF. Ainsi, les deux voies de survie se compensent mutuellement et la double inhibition permet l’amélioration de l’effet des simples traitements. L’utilisation des deux inhibiteurs in vivo induit une réduction spectaculaire du volume tumoral (voire même la disparition dans certains cas). Finalement, la présence de la forme active du TrkB (phospho TrkB) et de la forme active de la LC3 (LC3II), démontrant l’activation de ces deux voies dans les tissus de patients, a été observée. L’ensemble de ces résultats montre que l’activation des voies des NTs et de l’autophagie contribue à la survie des cellules de CCR. L’approche qui consiste à la double inhibition des NTs et de l’autophagie pourrait être un point majeur pour le développement de nouvelles thérapies dans le CCR. / Colorectal cancer (CRC) is the first digestive cancer in occidental countries. Despite effective therapies, cases of resistance and/or recurrence exist. Our laboratory works on two signaling pathways regulating balance between survival and cell death: neurotrophins (NTs, growth factors involved in cancer cells survival) and autophagy (cellular recycling involved in stress resistance). The aim of this study was to investigate relationship between these two pathways and the impact of their inhibition on cell fate and tumor evolution.Studies were performed on two CRC cell lines derived from the same patient: SW480 (primary tumor) and SW620 (node invasion), also used for subcutaneous xenografts on Nude mouse model. In addition, presence of major proteins of NTs (TrkB) and autophagy (LC3) were assessed in patient’s tissues.Previous work showed that TrkB overexpression is associated with pro-survival signaling in CRC cell. So, we choose to inhibit NTs pathway with K252a (100 nM). As expected, inactivation of the PI3K / AKT pathway was observed and CRC cells were able to activate autophagy. At the opposite, blocking autophagic flux by pharmacologic approach (chloroquine; CQ; 25µM) or by transcriptomic approach (siRNA against ATG5) induced over-activation of the NTs pathway, via TrkB/BDNF. Thus, both survival pathways compensate each other. Moreover, dual inhibition allowed improving the effect of single treatment through a significant reduction of metabolic activity. The using of both inhibitors in vivo induces a spectacular reduction of tumor volume (or even disappearance in some cases). Presence of active form of TrkB (phospho TrkB) and active form of LC3 (LC3-II) demonstrating activation of these two pathways, in patient’s tissues have been observed. Taken together, our results showed that activation of NTs and autophagy contribute to CRC cell survival. The approach consisting of dual inhibition of NTs and autophagy could be a major point for new CRC therapies development.

Charcot-Marie-Tooth (CMT) Neuropathien stellen als häufigste erblich bedingte neurologische Erkrankungen eine Gruppe genetisch heterogener, chronisch progredienter peripherer Polyneuropathien dar. Die Lebensqualität der Patienten ist bei fehlender kurativer Therapieoption vor allem durch motorische und sensorische Defizite deutlich eingeschränkt. In verschiedenen Studien konnte die pathophysiologische Relevanz einer sekundären Entzündungsreaktion, insbesondere durch Makrophagen und Lymphozyten vermittelt, in Mausmodellen dreier CMT1 Subtypen (CMT1A, CMT1B, CMT1X) aufgezeigt werden. Auch in Folge einer Läsion peripherer Nerven ist eine akute Entzündungsreaktion von entscheidender Bedeutung, wobei sich bereits Gemeinsamkeiten zwischen der postläsionalen Waller´schen Degeneration (WD) und CMT1 Neuropathien identifizieren ließen. Während die aktive Beteiligung der Autophagie Schwann´scher Zellen (hier kurz SZ Autophagie genannt) an der Myelindegradation im Falle einer WD jedoch vielfach beschrieben wurde, ist Ähnliches in CMT1 Neuropathien bisher nur unzureichend untersucht. Da in einer Studie in Cx32def Mausmodellen der CMT1X Erkrankung auch nach Reduktion endoneuraler Makrophagen anhaltende Demyelinisierung beobachtet werden konnte, sollte das Vorkommen von SZ Autophagie sowie deren mögliche Beeinflussung durch Makrophagen in diesen Myelinmutanten untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl Wildtyp (Wt) Mäuse in ex vivo und in vivo Modellen einer WD als auch Cx32def Myelinmutanten zweier Altersstufen (4 und 12 Monate) mit einem niedermolekularen CSF1-Rezeptor-Inhibitor (CSF1RI) zur Reduktion endoneuraler Makrophagen behandelt, wobei sich vergleichende histochemische bzw. immunhistochemische Analysen peripherer Nerven behandelter und unbehandelter Tiere anschlossen. Im Rahmen der Etablierung immunhistochemischer Methodik zeigte sich hierbei unter den kontrollierten Bedingungen einer ex vivo Ischiasnervenkultur eine vermehrte Aktivierung der SZ Autophagie in behandelten Wt Mäusen. Auch 4 Monate alte behandelte Cx32def Tiere wiesen, verglichen mit unbehandelten Myelinmutanten bzw. Wt Mäusen derselben Altersstufe, eine vermehrte autophagische Aktivität in SZ auf. Diese scheint sich jedoch im weiteren Verlauf der Erkrankung zu reduzieren, da im Falle der 12 Monate alten Cx32def Modelltiere weniger autophagisch aktive SZ Profile bzw. kaum Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Tieren beobachtet werden konnten. Die Ergebnisse lassen somit eine mögliche aktive Beteiligung von SZ Autophagie insbesondere in der Pathophysiologie der frühen Phase einer CMT1X Erkrankung sowie deren Beeinflussung durch endoneurale Makrophagen vermuten. Dies sollte vornehmlich in der Entwicklung von Therapiestrategien der CMT1X bedacht werden, da sich eine frühe Reduktion pathophysiologisch relevanter endoneuraler Makrophagen somit auch nachteilig auf die Myelinintegrität auswirken könnte. / Charcot-Marie-Tooth (CMT) neuropathies are the most common hereditary neurological diseases and represent a group of genetically heterogeneous, chronically progressive peripheral polyneuropathies. In the absence of curative treatment options, patients' quality of life is significantly impaired, primarily due to motor and sensory deficits. Various studies have demonstrated the pathophysiological relevance of a secondary inflammatory reaction, in particular mediated by macrophages and lymphocytes, in mouse models of three CMT1 subtypes (CMT1A, CMT1B, CMT1X). An acute inflammatory reaction is also of crucial importance following a lesion of peripheral nerves, whereby similarities between postlesional Wallerian degeneration (WD) and CMT1 neuropathies have already been identified. However, while the active involvement of Schwann cell autophagy (here referred to as SC autophagy) in myelin degradation in WD has been widely described, a similar involvement in CMT1 neuropathies has been insufficiently studied. Since in a study in Cx32def mouse models of CMT1X disease persistent demyelination could be observed even after reduction of endoneural macrophages, the occurrence of SC autophagy and its possible influence by macrophages in these myelin mutants should be investigated. In the present study, both wild-type (Wt) mice in ex vivo and in vivo models of WD and Cx32def myelin mutants of two ages (4 and 12 months) were treated with a small molecule CSF1 receptor inhibitor (CSF1RI) to reduce endoneural macrophages, followed by comparative histochemical and immunohistochemical analyses of peripheral nerves of treated and untreated animals, respectively. During the establishment of immunohistochemical methods, an increased activation of SC autophagy was shown in treated Wt mice under the controlled conditions of ex vivo sciatic nerve culture. Even 4-month-old treated Cx32def animals showed increased autophagic activity in SC compared to untreated myelin mutants or Wt mice of the same age. However, this appears to be reduced as the disease progresses, since in the case of the 12-month-old Cx32def model animals fewer autophagically active SC profiles or hardly any differences between treated and untreated animals could be observed. The results thus suggest a possible active involvement of SC autophagy, particularly in the pathophysiology of the early phase of CMT1X disease and its influence by endoneural macrophages. This should primarily be considered in the development of therapeutic strategies for CMT1X, as an early reduction of pathophysiologically relevant endoneural macrophages could therefore also have a detrimental effect on myelin integrity.