Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-06-25T13:29:10Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1372442 bytes, checksum: 3068f373d5ea48eec7b669ecf2b0ed43 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-25T13:29:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1372442 bytes, checksum: 3068f373d5ea48eec7b669ecf2b0ed43 (MD5) Previous issue date: 2009-05-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi substituir as soluções de manipulação de embriões bovino em uso na rotina de TE por meios mais simples e estáveis e, que possam ser armazenados em temperatura ambiente. Na primeira etapa experimental, foram utilizados embriões de camundongas nos estádios de blastocisto inicial (Bin), mórula compacta grau I (McI) e II (McII), distribuídos aleatoriamente em três tratamentos, de acordo com o meio de manutenção: T1 - PBS modificado (Controle); T2 (MD1) e T3 (MD2). Os embriões foram mantidos durante quatro horas no meio de manutenção e, posteriormente cultivados em meio TCM 199. Após o término do tempo de cultivo, os embriões de cada tratamento foram separados aleatoriamente em amostras para avaliação da taxa de clivagem e morfometria, aspectos ultra-estruturais, detecção de apoptose celular e quantificação de expressão gênica de Hsp70.3. A taxa de desenvolvimento dos embriões após manutenção por quatro horas nos meios de manipulação foi inferior (P<0,05) para os embriões do Controle, quando comparada com os embriões do MD1 e MD2, diferença esta não observada (P>0,05) após o cultivo in vitro. Contudo, os embriões McII do MD2 tiveram um maior desenvolvimento (P<0,05), quando comparado com embriões do Controle e MD1, indicando o efeito benéfico do enriquecimento do meio MD2. Não foi verificada diferença (P>0,05) entre tratamentos no diâmetro celular, nuclear, nucleolar, na relação núcleo:nucléolo, no número de células e na percentagem de células apoptóticas. Quanto à expressão gênica de Hsp70.3, foi verificado diferença entre tratamentos (P<0,001), em embriões Bin, McI e McII após manutenção e, posterior cultivo in vitro. Na segunda etapa experimental, foram testados dois meios de manipulação utilizados para coleta e manipulação de embriões, MD1 e MD2 e como controle o PBS modificado, usualmente empregado nas rotinas de TE nas diferentes espécies animais. A transferência dos embriões bovino foi realizada a fresco, ou seja, os embriões coletados de uma determinada doadora foram inovulados no período máximo de quatro horas nas receptoras. Foram coletados e transferidos apenas os embriões de qualidade I e II. Foram utilizados 58 receptoras de embriões, distribuídas aleatoriamente em três tratamentos: T1 – PBS modificado (Controle); T2 (MD1) e T3 (MD2). As taxas de gestação observadas foram: Controle = 47,4% (9/19); MD1= 47,4% (9/19) e MD2 = 55,0% (11/20). Estes resultados demonstram que o uso de diferentes meios de manipulação não influenciou nas taxas de gestação (P>0,05). Deste modo, conclui-se que os meios de manipulação MD1 e MD2 podem ser utilizados nas rotinas de TE, em substituição a solução PBS modificado. / This work aimed substitutes the usually used manipulation solution of bovine embryos on ET routines for more simple and stable medias which could be stored at room temperature. In the first experimental stage, the mice embryos used in the experiment were all at early blastocyst (Bin), compact morula grade I (McI) and II (McII), randomly assigned in three treatments: T1 – modified PBS (Control); T2 (MD1) and T3 (MD2). In each treatment the embryos were kept in manipulation media for four hours. Finishing the manipulation period, the embryos were classified according the development stage and quality. Following, embryos were cultured in modified TCM 199. After the culture period, the embryos were being evaluated accordingly quality and development stage. Following were randomly selected embryo in each treatment and separated in samples to cleavage rate and morphometric, ultra- structural evaluation, cellular apoptosis and genetic expression quantification of Hsp70.3. The development rate for Bin, McI and McII after maintenance for four hours in manipulation media between was lower for Control (P>0.05) when compared with MD1 and MD2. However, after in vitro culture, was not observed difference (P>0.05) on embryo development rate among Control, MD1 and MD2. Moreover, McII from MD2 had a higher development (P<0.05), when compaired with Control and MD1, indication a beneficial effect when MD2 is supplemented. It was not verified difference (P>0.05) among the treatments in relation the nucleus, nucleolus, cell diameter and on total cell number cellular and apoptosis rate. In relation of embryo morphometry (diameter), there was no difference (P>0.05) between the treatments, using embryos Bin, McI and McII after maintenance followed by in vitro culture. Otherwise, genetic expression of Hsp70.3 had difference in Bin, McI and McII after maintenance followed by in vitro culture among the treatments (P<0.001). In the second experimental stage, it was tested three different manipulation media, which were used to recovery and manipulation of the embryos. The control treatment used was the modified PBS, usually used in ET routines in different animal species. The bovine embryos were transferred freshly, i.e., they were recovered from a identified donor and transferred within less than four hours to the recipient cow. Just embryos at quality I and II were recovered and transferred. Were used 58 recipient cows randomly assigned for one of the three treatments: T1 – modified PBS (Control); T2 (MD1) and T3 (MD2). As result we observed the following pregnancy rates: Control = 47.4% (9/19); MD1 = 47.4% (9/19) and MD2 = 55.0% (11/20), which did not differ among them (P>0.05). Therefore, the manipulation media MD1 and MD2 can be used on ET routines to substitute the PBS modified solution. / Termo de autorização não encontrado, numeração das páginas em algarismos romanos difere da numeração do índice. E-mail enviado aos interessados em 25-06-2018.

Orientador: Claudio Antonio Barbosa de Toledo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-09T19:38:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santana_RenatoFigueiredode_M.pdf: 3137636 bytes, checksum: bfb0cb5b3693de7bf1e46cd7ce5de3db (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Glutamato, um dos principais neurotransmissores excitatórios do sistema nervoso central participa do tráfego de informação neural nos núcleos de base de aves e mamíferos através de receptores ionotrópicos do tipo AMPA. Investigamos a variação da expressão das subunidades que compõem esse receptor em áreas motoras telencefálicas do encéfalo de pombos (C. lívia) em diferentes idades: do nascimento até 10 dias de vida e na idade adulta. As aves foram perfundidas e seus cérebros foram processados por imunohistoquímica usando anticorpos contras as subunidades GluR1 e GluR4 e contra um epítopo comum às subunidades GluR2 e GluR3 (GluR2/3); além disso, anticorpos contra proteínas ligantes de cálcio foram utilizados como marcadores. O globo pálido (GP) apresentou marcação crescente de neurônios GluR1+ durante os primeiros dias de vida, atingindo pico em P3, decaindo em seguida e sendo novamente expresso na fase adulta. A expressão de GluR2/3 mostrou-se relativamente estável no GP durante os primeiros dias de vida, mas decaiu após P3. Células expressando GluR4 foram principalmente evidentes entre P3 e P7 no GP. Com relação ao corpo estriado, a neurópila estriatal foi intensamente marcada para GluR1 e GluR2/3, contrastando com a pobre marcação de neurópila apresentada pelo globo pálido. Nos diferentes estágios de desenvolvimento a neurópila estriatal foi pobre em GluR4. O número de células GluR1+ no corpo estriado mostrou pico máximo em P5 e o de GluR2/3+ foi crescente ao longo das idades. A região lateral do estriado lateral indicou marcação semelhante à região central em todas as idades, com padrão estável de crescimento para GluR2/3, um pico em P5 para GluR1 e escassa presença de marcação GluR4+ em todas as idades. O número de células PV+ decai durante o desenvolvimento e CB foi expressa nos gânglios da base somente na fase adulta. Nossos resultados indicam que subunidades do receptor de glutamato do tipo AMPA são diferencialmente expressas durante o crescimento pós-natal. Estas alterações podem estar relacionadas com mudanças funcionais que conduzem à estruturação final da circuitaria sináptica envolvida nas respostas motoras desta espécie, cujo desenvolvimento até o estágio de auto-suficiência depende dessa habilidade / Abstract: AMPA-type glutamate receptors mediate the responses of neurons of the striatal part of the basal ganglia to excitatory cortical input in both birds and mammals. We have investigated the maturation of the expression of the four AMPA receptor subunits in 42 pigeons (C. livia) at different stages, from hatching (P0) to 1, 3, 5, 7, or 10 days posthatch (P1-10), to adulthood. Pigeons are altricial, become relatively mobile by 12 days, and independent by one month. The birds were perfused and their brains processed by standard immunolabeling using antibodies against the GluR1 or GluR4 subunits, or against an epitope common to both GluR2 and GluR3 (GluR2/3) subunits. Antibodies against calcium binding proteins parvalbumin (PV) and calbindin (CB) were used as neuronal marker. Globus pallidus at P0 showed labeling in neurons for GluR1 and GluR2/3, which reached its peak at P3. The GluR1 perikaryal labeling in globus pallidus decreased after P5, but was labeling another time at adulthood. GluR2/3 remained stable into early age, but decrease after P3. The perikarya of globus pallidus and their processes were also labeled for GluR4 at P0, and GluR4 cells GluR4+ was peak between P3 and P7. PV was decrease during the development. CB was expressed in basal ganglia only at adulthood. At P0, the striatal neuropil was intensely (though diffusely) labeled for GluR1 and GluR2/3, which contrasted distinctly with the poor neuropil labeling for both in globus pallidus. GluR1+ was peak at P5 and GluR2/3 increase during the time. At all stages, the striatal neuropil immunolabeling was poor for GluR4, although neurons were labeled for GluR4. GluR4 was peak at P7. PV was peak at adult age. The labeling of GluR2/3 in lateral region of lateral striatun was similar to central region, but GluR1+ was increase by ages. Our results indicate that AMPA receptor subunits was expressed differentially at the development post-hatching. This may support maturational changes that facilitate the motor development of this altricial species / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Ferramentas bioinformática têm se tornado a escolha para auxiliar pesquisadores tanto para a anotação de novos genes, como para estudar genes em condições fisiológicas de interesse. Entre essas ferramentas destacam-se os algoritmos de agrupamento filogenético e os algoritmos de predição de padrões curtos de DNA, como, por exemplo, predições de sítios para ligação de fatores de transcrição. Desenvolver uma abordagem mista com o objetivo de agrupar genes baseando-se unicamente nos sinais transcricionais preditos em suas seqüências é um desafio de difícil transposição. No presente trabalho, apresentamos nossos resultados para tentar superar tal limitação que podem ser subdividos em duas seções: a primeira aonde desenvolvemos uma abordagem para a melhoria das predições computacionais de sítios de ligação e a segunda, onde passamos a agrupar genes com base nos seus sinais transcricionais preditos em seqüências conservadas flanqueadoras. A primeira seção de nosso trabalho foi focada no estudo de uma seqüência de indução de transcrição próxima ao gene Aldh1a2 de camundongo aonde foram preditos sítios para fatores de transcrição que foram posteriormente testados biologicamente e se mostraram associados ao controle da expressão desse gene. A partir de uma profunda pesquisa bibliográfica, nós determinamos um grupo de 57 fatores de transcrição já associados com a especialização de subpopulações de neurônios durante o desenvolvimento neuroembrionário de vertebrados. Nossa abordagem de seleção de sítios de alto valor biológico foi agora testada em seqüências conservadas próximas a cada um desses genes que codificam esses fatores de transcrição associados e os sítios de ligação para fatores de transcrição foram preditos. Tais sítios foram contabilizados e utilizados com entrada para nossa abordagem de agrupamento. A análise dos resultados do agrupamento determinou que, nossa abordagem se mostrou suficientemente sensível para construir uma árvore solução com boas relações com os padrões, já conhecidos, de expressão para esses genes agrupados. Essa abordagem poderá ser utilizada tanto para anotar funcionalmente genes de interesse quanto para minerar informações dentro de um grupo de genes previamente selecionado. / Bioinformatics tools are becoming the choice for aiding scientists for gene annotation and for studying gene in physiological conditions of interest. Among those efforts, phylogenetics clustering algorithms and tools for predicting short DNA patterns, such as binding sites for transcription factor, are outlined as essential. To develop a mixture procedure merging this two distant fields of bioinformatics research is a challenge hard to overcome. In the present study, we present our results of trying to overcome such limitation and it be easily subdivided in two distinct sections: initially we develop a procedure to improve the computational prediction of binding site for transcription factors and the second one where genes were grouped based solely in their transcriptional patterns predicted in conserved flanking sequences. The first section of the present study was focused in the study of an enhancer near Aldh1a2 gene in mouse where binding sites were predicted and latter biologically tested and showed strong influence in expression control of this gene. By a comprehensive bibliographic research we determined a group of 57 transcription factors which were already associated with neuron subpopulations specialization during the neuroembryonary development in vertebrates. Our computational procedure for selection of high biological value binding sites was applied in conserved flanking sequence in each of these genes encoding these associated transcription factors and a large group of binding sites were predicted. This sites were counted and use as an input for our clustering procedure. Clustering results analyses determined that our procedure showed to be sufficiently sensible to construct a solution tree showing good relations with, already determined, expression patterns of grouped genes. This procedure could be for functionally annotation of genes and for data mining in a group of already determined genes of interest.

O ácido retinóico (AR) é essencial para a embriogênese. A principal enzima sintetizadora de AR durante o desenvolvimento é a ALDH1A2 (RALDH2), uma retinaldeído desidrogenase que converte retinaldeído a AR. Para entendermos como o gene da aldh1a2 é regulado identificamos regiões evolutivamente conservadas (ECRs) em vertebrados e testamos seu potencial regulatório. Identificamos uma ECR localizada no intron1 da aldh1a2, conservada em anfíbios, aves e mamíferos que atua como um enhancer em estruturas derivadas de ectoderme, endoderme e mesoderme. Animais transgênicos transientes e permanentes mostram a ativação desse enhancer na região da placa do teto do tubo neural e epicárdio, local onde esse enhancer é ativado em células derivadas do órgão pro-epicárdico após o contato e/ou proximidade com células do miocárdio. A identificação de um enhancer conservado no gene da aldh1a2 suporta a idéia de que esse gene possui uma regulação modular e mostra que a abordagem evolutiva é uma eficiente ferramenta para a identificação de mecanismos de controle desse gene. / Retinoic acid (RA) is essential for embryogenesis. The key RA synthetic enzyme during early development is ALDH1A2 (RALDH2), a retinaldehyde dehydrogenase that converts retinaldehyde into RA. To understand how aldh1a2 is regulated we screened the gene for evolutionary conserved regions (ECRs) among vertebrates and assayed their regulatory potential. We describe an aldh1a2 intron 1 ECR (identified as RALDH2.2) that is conserved in amphibians, avians and humans and acts as an enhancer in derivatives of ectoderm, endoderm and mesoderm. Transient and stable transgenesis in mice reveal strong activity of the raldh2 intron 1 enhancer at the roof plate of the neural tube and at the growing epicardium. Transgenic mice indicate that the enhancer is activated in proepicardium-derived cells by contact and/or close proximity to the myocardium. The identification of an aldh1a2 conserved enhancer supports the idea of a modular regulation and shows that the evolutionary approach is an efficient tool to identify control mechanisms of the aldh1a2 gene.

A sinalização pelo ácido retinóico (AR) é fundamental para o correto desenvolvimento embrionário. A principal enzima responsável pela síntese do AR durante o desenvolvimento é a Raldh2 (Aldh1a2), cujo padrão de expressão é bastante dinâmico. Apesar dos padrões de expressão da raldh2 e seus papéis durante o desenvolvimento já estarem bem estabelecidos, pouco se conhece sobre sua regulação. Estudos de bioinformática identificaram no gene raldh2 um elemento não-codante conservado (CNE), presente de anfíbios até humanos, denominado Raldh2.2. Utilizando ensaios de eletroporação e análise de camundongos transgênicos, nós mostramos que o CNE Raldh2.2 é um enhancer responsável por ativar a expressão da raldh2 na medula espinhal dorsal de tetrápodes e que seu padrão de atividade coincide em aves e camundongos. Através de ensaios de deleções e mutações sítio-direcionadas desse enhancer, identificamos quatro elementos cis regulatórios responsáveis por ativá-lo na placa do teto e em interneurônios dorsais da medula espinhal. A regulação positiva da atividade desse enhancer ocorre de maneira redundante por três sítios Tcf-homeobox, enquanto sua inibição nos interneurônios ventrais da medula espinhal se dá por dois sítos repressores, um Lim-homeodomínio e um Tgif. Neste trabalho, utilizando hibridação in situ dupla para raldh2 e math1/cath1, descrevemos um novo território transiente de expressão da raldh2, os interneurônios dorsais 1. Esses interneurônios dão origem a circuitos ascendentes e a interneurônios comissurais intraespinhais, sugerindo papéis para a sinalização pelo ácido retinóico na ontogenia dos circuitos proprioceptivos espinocerebelar e intraespinhal. / Retinoic acid (RA) signaling is crucial for correct embryonic development. Raldh2 is the major enzyme involved in retinoic acid synthesis during early development and its expression pattern is dynamic. Raldh2 expression patterns and its roles during development are well known, but little is known about its regulation. Bioinformatic analysis identified a conserved non-coding element (CNE) in the raldh2 gene conserved from amphibians to humans, called Raldh2. Using electroporation assays and transgenic mice analysis we showed that CNE Raldh2.2 is an enhancer that activates raldh2 in the dorsal spinal cord in tetrapods and that its activity pattern is the same in chicken and mice. Using deletions assays and site-directed mutagenesis, we identified four cis regulatory elements that activate this enhancer in the roof plate and dorsal interneurons of the spinal cord. This enhancer is activated by a redundant mechanism through three predicted Tcf-homeobox biding sites and it is repressed in ventral interneurons via two repressors sites, a Lim-homeodomain and a Tgif. In this thesis, using in situ hybridization, we described a new transient territory of raldh2 expression, the dorsal interneurons 1. These interneurons give rise to ascending circuits and intraspinal commissural interneurons, suggesting roles for retinoic acid signaling in the ontogeny of spinocerebellar and intraspinal proprioceptive circuits.

Orientador: Maria Lucia Negreiros Fransozo / Coorientador: Álvaro Montenegro Neto / Banca: Sérgio Luiz de Siquiera Bueno / Banca: Marcos Domingos Siqueira Tavares / Banca: Sandro Santos / Banca: Roberto Munehisa Shimizu / Resumo: Avaliações sobre os possíveis impactos das crescentes emissões de CO2, por ação antrópica, nos oceanos e as consequentes alterações sobre a biota marinha, são indispensáveis para elaboração de medidas mitigatórias. Deste modo, torna-se imprescindível o desenvolvimento de sistemas aquáticos, cujas variáveis abióticas se assemelhem ao máximo às condições marinhas previstas para o futuro. Apresenta-se aqui a descrição de um novo modelo de sistema recirculante, capaz de proporcionar controle e estabilidade de condições préestabelecidas para o pH, temperatura e salinidade, em conjunto com a manutenção individual de organismos para investigações experimentais de curta ou longa duração. Este sistema apresenta 2 aquários interligados ao sistema de filtragem, perfazendo um total de 70 litros de água marinha. Para avaliação da estabilidade e eficiência do sistema, foram utilizados os resultados obtidos nas criações larvais do caranguejo Eriphia gonagra, durante toda fase zoeal (~30 dias), em diferentes cenários realísticos previstos pelo Painel Intergovernamental sobre Mudanças Climáticas - IPCC. Verificou-se que o sistema manteve a temperatura, pH, salinidade, oxigênio dissolvido, amônia, nitrito e variáveis do sistema carbonato estáveis e nos níveis desejados. Verificou-se que a independência dos componentes deste sistema permite sua fácil adaptação para outros tipos de estudo ou organismos. O sistema demonstrou ser útil em experimentos laboratoriais de pequena escala e possibilita estudos adicionais com grande replicação, principalmente nesta área de pesquisa ainda com alta carência de dados fundamentais / Abstract: Not available / Doutor

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 432086.pdf: 1674235 bytes, checksum: 2ed5ea531f6750c937a1c83b125d4be9 (MD5) Previous issue date: 2011-03-17 / L?tio tem sido o principal tratamento para desordens bipolares desde 1950, oferecendo um efeito profil?tico e agudo contra os epis?dios man?acos e depressivos, apesar dos desafios encontrados na sua administra??o durante a gravidez e o per?odo perinatal. Os mecanismo por tr?s dos efeitos do l?tio ainda n?o foram descritos completamente mas existem evidencias de um efeito sobre a via Wnt-?-catenina devido a sua capacidade de inibi??o sobre a GSK-3?. Neste estudo n?s avaliamos os efeitos da exposi??o ao l?tio durante o desenvolvimento inicial de Zebrafish incluindo caracteriza??es comportamentais e moleculares do sistema Wnt-?-catenina-Caderina. Embri?es foram tratados individualmente por 72hpf com LiCl 0.05, 0.5 e 5 mM. N?o foram observadas malforma??es significativas nem efeitos embriot?xicos. Em 10 dpf animais tratados com 0.5 e 5 mM de l?tio demonstraram habilidades locomotoras similares a s?ndrome induzida por l?tio em humanos Floppy baby syndrom. An?lises atrav?s da t?cnica de Western blot demonstraram uma express?o aumentada nos n?veis de ?-catenina e diminu?da para N-caderina. Animais com 10dpf reestabeleceram seus n?veis de express?o proteica de acordo com o controle. An?lises atrav?s da t?cnica de qPCR n?o demonstraram nenhum efeito sobre os n?veis de ?-catenina ou N-caderina, sugerindo a ocorr?ncia de mudan?as p?s-transcricionais. Enquanto os n?veis de c-myc n?o foram alterados, houve uma diminui??o nos n?veis de Cyclin D1 em larvas de 3dpf, enquanto os n?veis de CamkIV ocilaram

O Proepicárdio (PE) é uma estrutura transitória que dá origem aos componentes dos vasos coronários. Para avaliar seu potencial vascular em sítio adulto, transplantamos um coração neonatal para o pavilhão auricular de um animal adulto. Duas semanas depois, 2 PEs de embriões GFP+ foram transferidos para a superfície deste coração. Em outro grupo, transferimos os PEs diretamente para o pavilhão auricular. Para avaliar a incorporação de células GFP, e investigar sua diferenciação realizamos ensaios de imunofluorescência (IF) para GFP em combinação com outros marcadores. A adição do PE em sítio adulto teve como resultado a participação deste em processos de vasculogênese, iniciando a formação de novos vasos sanguíneos via formação de ilhotas sanguíneas e em um processo angiogênico, diferenciando-se em células endoteliais que se incorporaram aos vasos já existentes. Baseados nisso podemos afirmar que o PE possui potencial vasculogênico/angiogênico em sítio adulto, podendo ser exploradas como modelo para revascularização cardíaca e recuperação de tecidos vasculares. / The Proepicárdio (PE) is a transient structure giving rise to all components of the coronary vessels. To evaluate the vasculogenic potential of the PE in an adult site, a neonatal heart was transplanted into the subcutaneous of an adult ear Later, two PE from GFP-transgenic mice were transferred to the surface of this heart. In another group, we transferred the PEs directly into the ear pinna. To evaluate the incorporation of GFP cells derived from the PE, and to investigate their possible differentiation, we performed immunofluorescence (IF) for GFP in combination with other markers. The addition of PE in an adult site resulted in its participation in a vasculogenic and in an angiogenic processes. Based on this we conclude that PE cells can differentiate and likely participate in a neovascularization process when transplanted to adult sites. These findings demonstrate that the vasculogenic potential of the PE cells is conserved in an adult site and our model is adequate to study the mechanisms involved in the development and regeneration of vasculature.

Várias evidências, incluindo as originadas de estudos anteriores do LBR&MEC, sugerem que condições adversas durante o desenvolvimento intrauterino promovam alterações moleculares e estruturais em órgãos e sistemas vitais podendo comprometer o seu funcionamento no indivíduo adulto. A hiperglicemia é um fator que influencia negativamente o desenvolvimento fetal, modificando processos biológicos importantes, como o padrão de síntese e deposição dos componentes da matriz extracelular (MEC). A MEC participa diretamente do processo de ramificação e morfogênese do pâncreas, e pouco é conhecido a respeito dos efeitos da hiperglicemia materna sobre a MEC desse órgão durante seu desenvolvimento. Investigamos por meio de imuno-histoquímica como a hiperglicemia materna severa modifica a distribuição de panlaminina, das cadeias &#945 1 ey1 das lamininas e da integrina &#945 3, moléculas da MEC que desempenham um papel chave na diferenciação do pâncreas endócrino. Avaliamos o perfil proliferativo das células presentes nas ilhotas e ainda, a distribuição das células &#945 e &#946 por meio da marcação de glucagon e insulina no pâncreas de fetos de 19 dias. Analisamos por RT-qPCRa expressão dos fatores de transcrição Pdx1 e Pax4 que controlam o desenvolvimento e diferenciação das células &#946 pancreáticas. O modelo utilizado foi o de gestação complicada por diabetes mellitus do tipo 1 (DM1), desenvolvido por nosso grupo, quimicamente induzido por aloxana sem tratamento de reposição insulínica, em camundongos. Observamos que a marcação de panlaminina e das cadeias &#945 1 e y1 das lamininas é mais fraca no pâncreas endócrino dos fetos de mães hiperglicêmicas, quando comparado ao grupo controle. Por outro lado, vimos um aumento na deposição da integrina &#945 3 na membrana basal das ilhotas pancreáticas dos fetos gerados sob condições de hiperglicemia materna. O índice proliferativo das células endócrinas, observado por imuno-histoquímica para PCNA, também é menor nesse grupo. Observamos um aumento da área de ilhotas fetais imunomarcadas para a insulina, indicando aumento na massa de células &#946 nessas ilhotas, enquanto que a área imunomarcada para glucagon estava com marcação menos intensa no grupo experimental comparado ao controle. Identificamos que a expressão relativa de Pdx1 é menor no pâncreas do grupo experimental comparado a expressão nos animais do grupo controle, enquanto a expressão de Pax4 está aumentada. Concluímos por meio de nossas abordagens histoquímicas que a hiperglicemia materna altera a morfogênese do pâncreas endócrino fetal modificando o padrão de deposição de moléculas da membrana basal peri-ilhotas, promovendo uma diminuição da atividade proliferativa das células endócrinas, associada a alterações na expressão de fatores de crescimento importantes para o estado diferenciado e proliferativo das células &#946. Essas células apresentam aumento da massa funcional identificada pelo aumento da deposição de insulina no tecido pancreático. / Previous studies from our lab and others have shown that adverse conditions during intrauterine development promotes molecular and structural changes in vital organs and systems which may alter on their function in the adult individuals. Hyperglycemia impacts on fetal development by modifying important biological processes, such as the pattern of synthesis and deposition of extracellular matrix (ECM) components. ECM cooperates in pancreatic branching and morphogenesis and little is known about the effect of maternal hyperglycemia on the pancreas ECM during development. We investigate through immunohistochemistry, how severe maternal hyperglycemia modifies the distribution of panlaminin, laminins &#945 1 and &#9781 chains and integrin &#945 3, ECM molecules that play a key role in the differentiation of the endocrine pancreas. We evaluate the proliferative index of islet cells and, &#945 and &#946 cells distribution, by insulin and glucagon fetal (E19.0) pancreas staining. We analyzed by RT-qPCR the expression of the Pdx1 and Pax4 transcription factors that control the development and differentiation of pancreatic &#946 cells. The model used was created by our group, a pregnancy model complicated by type 1 diabetes mellitus (T1D) chemically induced by alloxan without treatment of insulin replacement, in mice. We observed that the labeling of panlaminin and laminins &#945 1 and y1 chains is weaker in the endocrine pancreas of the fetuses from hyperglycemic mothers. On the other hand, integrin &#945 3 deposition increased in the basement membrane of the pancreatic islets of the fetuses generated under maternal hyperglycemia. Immunohistochemistry for PCNA showed lower proliferative index of endocrine cells. There was an increase in the area of immunolabeled fetal islets indicating an increase in &#946-cell mass in these islets; whereas the glucagon-immunolabeled area was smaller in the experimental group compared to the control group. The relative expression of Pdx1 was lower in the pancreas from the experimental group, and the Pax4 expression was increased. We conclude from our histochemical approaches that maternal hyperglycemia alters fetal endocrine pancreas morphogenesis by modifying the pattern of peri-islet basement membrane molecules, promoting a decrease in endocrine cell proliferative activity associated with changes in the expression of important growth factors for the differentiated and proliferative state of the &#946-cells. These cells have increased functional mass identified by increased insulin deposition in pancreatic tissue.

O Proepicárdio (PE) é uma estrutura transitória que dá origem aos componentes dos vasos coronários. Para avaliar seu potencial vascular em sítio adulto, transplantamos um coração neonatal para o pavilhão auricular de um animal adulto. Duas semanas depois, 2 PEs de embriões GFP+ foram transferidos para a superfície deste coração. Em outro grupo, transferimos os PEs diretamente para o pavilhão auricular. Para avaliar a incorporação de células GFP, e investigar sua diferenciação realizamos ensaios de imunofluorescência (IF) para GFP em combinação com outros marcadores. A adição do PE em sítio adulto teve como resultado a participação deste em processos de vasculogênese, iniciando a formação de novos vasos sanguíneos via formação de ilhotas sanguíneas e em um processo angiogênico, diferenciando-se em células endoteliais que se incorporaram aos vasos já existentes. Baseados nisso podemos afirmar que o PE possui potencial vasculogênico/angiogênico em sítio adulto, podendo ser exploradas como modelo para revascularização cardíaca e recuperação de tecidos vasculares. / The Proepicárdio (PE) is a transient structure giving rise to all components of the coronary vessels. To evaluate the vasculogenic potential of the PE in an adult site, a neonatal heart was transplanted into the subcutaneous of an adult ear Later, two PE from GFP-transgenic mice were transferred to the surface of this heart. In another group, we transferred the PEs directly into the ear pinna. To evaluate the incorporation of GFP cells derived from the PE, and to investigate their possible differentiation, we performed immunofluorescence (IF) for GFP in combination with other markers. The addition of PE in an adult site resulted in its participation in a vasculogenic and in an angiogenic processes. Based on this we conclude that PE cells can differentiate and likely participate in a neovascularization process when transplanted to adult sites. These findings demonstrate that the vasculogenic potential of the PE cells is conserved in an adult site and our model is adequate to study the mechanisms involved in the development and regeneration of vasculature.