Memoria para optar al título de Bioquímico / La industria acuícola de salmónidos, como la del salmón del Atlántico o de la trucha arcoíris, constituye una de las principales actividades económicas de Chile. Sin embargo, en su puesta en marcha enfrenta desafíos técnicos y ambientales, incluyendo la aparición de enfermedades que se transmiten rápidamente dentro de las poblaciones de cultivo. La segunda causa de pérdidas por patología infecciosa es la Necrosis Pancreática Infecciosa, causada por el virus IPNv. Se ha descrito que la citoquina IFN-I induce una potente actividad antiviral contra IPNv. Para este trabajo de investigación, se propuso clonar IFN-I de la especie Salmo salar en Bacillus megaterium, una bacteria inocua capaz de producir grandes cantidades de proteína y que ha sido utilizada exitosamente en la industria biotecnológica. Para lo anterior, se diseñó un método de clonación clásico y se logró exitosamente la transformación de Escherichia coli con el vector de B. megaterium pSSBm110 con el gen de IFN-I como inserto (pSSBm110:IFN-I). Se probaron luego dos métodos de transformación para B. megaterium, uno de electroporación que no dio resultados cuantificables y otro de creación de protoplastos libres de pared capaces de absorber ADN exógeno. Sin embargo, a pesar de lograr la transformación y la clonación exitosa del vector pSSBm110:IFN-I en B. megaterium, no se logró la detección de la expresión de IFN-I recombinante, por lo cual serán necesarios nuevos intentos para lograr su uso como sistema de expresión para esta citoquina / The salmonid aquaculture industry, such as the Atlantic salmon or the rainbow trout aquaculture, is one of the Chile’s main economic activities. However, this industry faces technical and environmental challenges, including the emergence of diseases which spread quickly through the fish populations. The infectious pancreatic necrosis, which is caused by the IPNv virus, is the second cause of fish losses related to an infectious disease. It has been described that the cytokine IFN-I induces a powerful antiviral response against IPNv. In this research, we proposed the cloning of IFN-I from Salmo salar in the harmless bacterium Bacillus megaterium, a species of high-yielding protein production, successfully used in the biotechnology industry. For this, a classic cloning method was used, obtaining transformed Escherichia coli cells with the B. megaterium pSSBm110 vector, and the IFN-I insert (pSSBm110:IFN-I). Then, two B. megaterium transformation methods were tested. The first one, an electroporation method, which did not offer quantifiable results. The second one, a method based on protoplast cells generation where foreign DNA was absorbed. Even though the transformation and cloning in B. megaterium were both successful, and verified through sequencing, the expression of the recombinant peptide was not detectable. Thus, new attempts will be necessary to use this expression system for this cytokine / FIA PYT-2012-0056

The keratinase gene (kerA) of Bacillus licheniformis ATCC®53757 was PCR amplified and subsequently cloned into Bacillus megaterium expression vector; pHIS1525.SPlipA and transformed in Bacillus megaterium ATCC®14945. The kerA gene carrying the recombinant plasmid pKERHIS1525.SPlipA was expressed in Bacillus megaterium under xylose inducible promoter, purified using Ni-NTA affinity column chromatography and consequently produced an extracellular keratinase activity of 29 U ml-1 after 18 h of incubation. The recombinant strain was further examined for feather degradation of intact chicken feathers. The chopped chicken feathers were partially degraded by the recombinant strain after 3days and the total macroscopic digestion was ultimately observed after seven days resulting in a yellowish peptide rich fermentation broth.

In order to develop a stable strain of Bacillus megaterium for Keratinase production, the Keratinase gene (KerA) of Bacillus lichiniformis ATCC 53757 and SPlipA gene from plasmid pHIS1525.SPlipA (Bacillus megaterium origin) were PCR amplified and constructed to give a gene cassette called SPK . Then the gene cassette SPK was cloned into the Integration vector, pMUTIN-GFP+ 6192bps and transformed in Bacillus megaterium ATCC 14945. The chromosomal integration was created using homologous single crossing over mechanism. The strong natural promoter from the chromosomal locus of the SPK not only produced the increased extracellular enzyme, but also functions as a non inducible promoter which does not require any inducer for the production of the enzyme in the new integrant strain. The integrant strain was subjected to feather degradation test and found that it could totally digest the feather meal in complete seven days, resulting in a rich fermentation broth.

No description available.

Hemocytes of the fifth instar European borer, Ostrinia nubilalis Hubner (Lepidoptera: Pyralidae) were examined in stained and unstained preparations. Prohemocytes, plasmatocytes, granular hemocyter, and oenocytoids, and spherule cells were found in this stage, The prohemocytes are characterized by a scant intensely basophilic cytoplasm. The highly pleomorphic plasiratocytes are characterized by a punctate nucleus and production of cytoplasmic extensions in vitro. Granular hemocytes are characterized by a small nucleus, accumulation of lipid droplets, and the production of extremely fine cytoplasmic extensions in living preparations. The oenocytoid is characterized by a small eccentric nucleus in a large amount of homogeneous basophilic cytoplasm. The spherule cell is characterized by large spherules within the cytoplasm which may tend to mask the nucleus.Treatment of larvae with per os doses of Bacillus thuringiensis did not affect the differential hemocyte count. However, there did appear to be an increase in the number of degenerating cells in Bacillus thuringiensis treated groups.Ball State UniversityMuncie, IN 47306

Increasing consumer demand for fresh fishery products with minimized loss of their nutritional properties is forcing food industry to look for alternative technologies to maintain the fresh attributes, stability and safety of foods. Demand for fresh tuna fish is no exception, being a valuable source of nutrients with immense health benefits. However, this product is highly perishable and has been commonly implicated in scombroid (histamine) poisoning caused by microbial decarboxylation of histidine contained in high levels in the tissues of scombroid fishes. Current techniques are inadequate for the prevention of histamine formation in fresh fishery products and high pressure processing is a potential alternative for it can inactivate microorganisms and enzymes, without affecting (or only minimally altering) the quality characteristics of foodstuffs. Previous studies have shown a decrease in histamine formation after a high pressure treatment and this study focuses on the effect of high pressure on the histidine decarboxylase enzyme and selected histamine forming microorganisms involved in histamine formation. / Commercial histidine decarboxylase suspended in different media (buffer solution and fish slurry with and without added histidine) was submitted to different high pressure treatments (200--400 MPa) with distinct time durations (0--60 min) at room temperature (20°C--25°C). Enzymatic activity of pressure treated and control samples were then compared by measuring histamine formation. Results were similar in all media; a 200 MPa treatment increased the enzymatic activity a little more than 20% as time increased; a 300 MPa treatment increased activity over 20% at first, followed by a decrease in activity as time increased only to reach a level of residual activity similar or only slightly lower than control samples; and a 400 MPa treatment reduced enzyme activity as time increased to a level of 55% residual activity in a buffer solution where the greatest inactivation was observed. / Enzyme activation and inactivation were affected by a dual effect attributed to a pulse effect, which caused a shift in activity and was independent of the length of the treatment, and a pressure-hold effect, during which activation or inactivation followed first order kinetics. The enzyme appeared highly resistant to pressure in all media as observed from D-values (>2700 min) and pressure sensitivity of destruction rate (zp) values (>500 MPa). / Inactivation of non-pathogen histamine forming bacteria (HFB) Escherichia coli K12 and Bacillus megaterium was evaluated by inoculating cultures in a fish tissue homogenate. Surviving colonies were enumerated after the treatments observing inactivation described by the same dual effect described earlier. Pressures above 300 MPa achieved a significant destruction of E. coli K12 (> 4 log-cycles) while B. megaterium appeared highly resistant for only a 2 log-cycle reduction was observed after at the highest pressure treatment conditions (400 MPa, 20 min). / D-values for both microorganisms decreased as pressure increased being significantly smaller for E. coli K 12, which also appeared to be more sensitive to pressure changes as observed from the zp values (zp = 151.51 MPa and zp = 909.10 MPa for E. coli and B. megaterium respectively. Inactivation caused by the pulse effect appeared very effective for both microorganisms as pressure increased, particularly at 400 MPa (PE > 1.25).

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1828.pdf: 1894013 bytes, checksum: 47084c725e570d01b5c72cabdaeed953 (MD5) Previous issue date: 2008-03-28 / Financiadora de Estudos e Projetos / The Gram-positive genus Bacillus is of great biotechnological importance. Their ability to secrete enzymes efficiently during fermentation is exploited for the production of extracellular enzymes such as penicillin G acylase (PGA). Bacillus megaterium has proven to be an excellent alternative host to Escherichia coli for heterologous gene expression. Unlike other bacilli strains, proteolytic degradation by alkaline proteases is avoided. In addition, there are no endotoxins found in the cell wall. As a result, protein yields are exceptionally high even if inexpensive substrates are used. In this work, the growth conditions of B. megaterium ATCC 14945 and its preparation for transformation by electroporation with plasmid DNA had been studied. Vegetative cells and protoplasts of B. megaterium had been used. Plasmid DNAs (pET- 32, pETduet-1, pBR322 and pHis 1522) were prepared from E. coli strains DH5α and BL21. Bacteria cultures were growth in Luria-Bertani (LB) broth, Nutrient or LBS (LB containing 0,5 M sorbitol) medium. It had been used the following Electroporation Media: 25% PEG 6000/0.1 M Sorbitol (Moro et al., 1995), 0.625 M Sacarose/1.0 mM MgCl2, pH 5.5 (Dunny et al., 1991), HEPES 10 mM, pH 7.0 (Belliveau & Trevors, 1989) and SMG (0.5 M sorbitol, 0.5 M manitol and 10% glicerol) (Xue et al., 1999). As Recovery Media after electric pulses, LB and LBSM (LB containing 0,5 M sorbitol and 0.38 M manitol) had been used. Extractions of genomic DNA of B. megaterium and plasmid DNA of E. coli had been carried through. The Colonies Forming Units method (CFU) was applied in order to analyze the B. megaterium viability before and after treatment with Electroporation Media. The biomass produced (Cx) was analyzed spectrophotometrically and by the Dry Mass method. The morphology and pureness of B. megaterium cultures had been studied by optic microscopy preparations and B. megaterium growth in liquid selective media. The best electric conditions for electroporation had been established by preliminary tests. B. megaterium transformations was performed according to protocols described by Moro et al. (1995), Dunny et al. (1991), Belliveau & Trevors (1989), Xue et al. (1999) and Romero et al. (2006). The B. megaterium growth curves in LB, Nutrient and LBS had allowed the identification of growth phases of cultures and the respective electric conditions adjustment for electroporation protocols. The cellular concentration (dry mass) found for 16 hours of culture in Nutrient, LB and LBS medium had been 1.900 g/L, 2.649 g/L and 2.320 g/L, respectively. The viable cells concentration analyses (UFC) had allowed the adjustment of plasmid DNA concentrations employed and transformation efficiencies calculation. It had been found the following cellular densities of B. megaterium grown in Nutrient, LB and LBS medium respectively after PEG/Sorbitol Electroporation Medium treatment: 8.8 x 108; 9,2 x 108 and 2.3 x 109 UFC/mL. For Sacarose/MgCl2, it had been found 2,8 x 107; 4.6 x 108 and 3.7 x 108 UFC/mL and for HEPES 5.6 x 108; 2.93 x 109 and 1.86 x 108. For SMG, it had been found 1,7 x 109; 9.4 x 109 and 1.1 x 1010 UFC/mL for Nutrient, LB and LBS medium, respectively. / Bacillus são bactérias Gram-positivas de grande importância biotecnológica. Sua habilidade para secretar enzimas eficientemente durante a fermentação é utilizada para a produção de enzimas extracelulares como penicilina G acilase (PGA). Bacillus megaterium revelou-se excelente hospedeiro alternativo à Escherichia coli para a expressão de genes heterólogos. Diferentemente de outras linhagens de bacilos, a degradação proteolítica por alcalino-proteases não é verificada. Além disso, não são encontradas endotoxinas em sua parede celular. Consequentemente, os rendimentos de produção de proteínas são excepcionalmente elevados, ainda que substratos econômicos sejam utilizados. Neste trabalho, foram estudadas as condições de crescimento de células de B. megaterium e sua preparação para transformação por eletroporação com DNA plasmidial. Foram utilizadas células vegetativas e protoplastos de B. megaterium ATCC 14945 e as linhagens de E. coli DH5α e BL21 (para amplificação e manutenção dos plasmídeos pET-32, pETduet-1, pBR322 e pHis 1522). Os meios de crescimento empregados foram Nutriente, Luria-Bertani (LB) e LBS (LB contendo 0,5 M sorbitol). Para as eletroporações, foram utilizados os Meios 25% PEG 6000/0,1 M Sorbitol (Moro et al., 1995), 0,625 M Sacarose/1,0 mM MgCl2, pH 5,5 (Dunny et al., 1991), HEPES 10 mM, pH 7,0 (Belliveau & Trevors, 1989) e SMG (0,5 M de sorbitol, 0,5 M de manitol e 10% de glicerol) (Xue et al., 1999). Como Meios de Recuperação pós-pulso elétrico, foram utilizados os Meios LB e LBSM (LB contendo 0,5 M de sorbitol e 0,38 M de manitol). Foram realizadas extrações de DNA genômico de B. megaterium e de DNA plasmidial de E. coli; ensaios de viabilidade das células de B. megaterium antes e após tratamento com os diferentes Meios de Eletroporação, pelo Método de Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFC); quantificação de biomassa produzida (Cx) nos cultivos de B. megaterium nos diferentes Meios, pelo Método da Massa Seca, e acompanhamento por leitura espectrofotométrica (DO 600 nm); análise morfológica e de pureza dos cultivos por meio de preparações permanentes e a fresco e do crescimento de B. megaterium selvagem em diferentes meios seletivos; testes preliminares de eletroporação para estabelecimento das melhores condições elétricas; ensaios de eletroporação segundo os protocolos de Moro et al. (1995), Dunny et al. (1991), Belliveau & Trevors (1989), Xue et al. (1999) e Romero et al. (2006). Foram obtidas as curvas de crescimento de B. megaterium para os Meios de Cultivo Nutriente, LB e LBS. Tais curvas permitiram a identificação da fase de crescimento das culturas e o respectivo ajuste das condições elétricas para os protocolos de eletroporação. As medidas de concentração celular (massa seca) encontradas para 16 horas de cultivo, para culturas crescidas em Meio Nutriente, LB e LBS foram 1,900 g/L, 2,649 g/L e 2,320 g/L, respectivamente. As análises de concentração de células viáveis (UFC) forneceram a densidade celular após tratamento com os diferentes Meios de Eletroporação, de modo a permitir o ajuste das concentrações de DNA plasmidial a serem empregadas e o cálculo das eficiências de transformação. Após o tratamento de células de B. megaterium, crescidas em Meio Nutriente, LB e LBS, com o Meio de Eletroporação PEG/Sorbitol, foram obtidas, respectivamente: 8,8 x 108; 9,2 x 108 e 2,3 x 109 UFC/mL; para o Meio de Eletroporação Sacarose/MgCl2, 2,8 x 107; 4,6 x 108 e 3,7 x 108 UFC/mL; para o Meio de Eletroporação HEPES, 5,6 x 108; 2,93 x 109 e 1,86 x 108; para o Meio de Eletroporação SMG, 1,7 x 109; 9,4 x 109 e 1,1 x 1010 UFC/mL, respectivamente para os Meios de Crescimento Nutriente, LB e LBS.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseVRS.pdf: 5281242 bytes, checksum: 8ae3e0f5731bedd5705926ff0020de41 (MD5) Previous issue date: 2007-08-16 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA) is an important enzyme for industry, used to produce aminopenicillanic acid, a key intermediate in the synthesis of ampicillin, among other betalatam antibiotics. The production of this enzyme by Bacillus megaterium has been studied by the research group for several years. This work advances this research, aiming not only at the enhancement of the enzyme production, but also at a better understanding of B. megaterium regulatory expression mechanisms for PGA. A systematic study of the inoculum, including conservation strategies for the microorganism, was performed. Different cultivation media and operational conditions for the production of PGA were investigated, especially temperature and dissolved oxygen concentration. Enzyme recovery was also studied, including methodologies for minimizing protein contents in whey. Cheese whey is an important nutrient for enzyme production, but its use implies the presence of contaminant proteins in the culture broth. Finally, the enzyme was kinetically characterized. During the inoculum study, PGA yields of microorganisms conserved using different techniques were compared: endospores in 20%-glycerol, -50oC (cryotubes), endospores in solid medium, in refrigerator ( slants ) and vegetative cells in 5%-glycerol, -50oC ( eppendorffs ). It was observed that cryotubes (frozen spores) preserve the enzyme production levels for 12 months, 521 IU/L ±20 IU/L with great reproducibility. Conservation in slants shows a marked fall of production after one month, with a low reproducibility along months. Freezing vegetative cells leads to the highest patterns of enzyme production, up to 900 IU/L, but preservation is sustained for only five months. Maximum specific growth rates changed according to the conservation method, with µmax eppendofor > cryotube > slant . A study of the effect of the inoculum growth period on enzyme yield has shown that, for the three conservation methods, harvesting between 8 and 12 h leaded to similar cell mass and enzyme concentrations after 24 h of cultivation. The procedure of harvesting the inoculum after 12 h, with 10%-bioreactor inoculum volume, showed to be a good method for inoculum standardization. The effect of temperature on the cultivation of B. megaterium for production of PGA was assessed in the range 24-40oC. Maximum cell concentration and maximum enzyme yield were achieved at 30oC. The effect of the concentration of dissolved oxygen on the production of PGA was studied, using air to feed the bioreactor (culture medium volume: 1.2-2.0 L). A second B. megaterium strain showed a lower growth rate than the original one, demanding 24 h for germination/propagation, while the original one requires 12 h. Thus, different oxygen (air) feeding strategies were tested for both strains. Along the years, enzyme yields in agitated flasks have been higher than in bioreactor, for almost all assays. For the second strain, sustaining the dissolved oxygen at 10% of saturation leaded to the highest enzyme productivity among all tested conditions, with a bioreactor productivity similar to the agitated flasks. For the original strain a similar production was only achieved with an increasing stirring profile, implying a very low dissolved oxygen concentration, equal to zero during long periods of the cultivation. The two strains presented different dissolved oxygen requirements. Changes in the cultivation medium also implied different dissolved oxygen requirements for a maximum enzyme yield. Cheese whey has a still no-identified substance that is an essential nutrient for enzyme production. The use of enzymatically hydrolyzed cheese whey improves the downstream process. Assays in agitated flasks, with the original strain, using hydrolyzed whey, leaded to PGA levels similar to the ones obtained using integral whey. However, in bioreactor the yield of enzyme was always lower than in agitated flasks, no matter the aeration strategy that was used. Three possible explanations for this fact were investigated: 1) microorganism preservation method; 2) changes in the time necessary for attaining and sustaining the metabolic state where enzyme expression occurs, what could be related to the ratio between vegetative cells and spores along time, in flasks and in the bioreactor; 3) increase in the production of proteases in the bioreactor, compared to the flasks. The lower yield using hydrolyzed whey does not seem to be related to none of these hypotheses, and up to now it was not possible to generalize the study of the effect of this variable on the PGA production by B. megaterium. Enzyme purification and concentration, via ultra-diafiltration, in the presence of integral and hydrolyzed whey was another subject for research. The effect of pH and of the number of washing cycles on enzyme recovery was assessed. Results showed that this technique is efficient, provided it is run at low temperatures. Hydrolyzed whey indeed eases the purification of the enzyme using membranes, and great part of the contaminant whey proteins can be removed. However, an expressive loss of PGA occurs during the diafiltration stages, which must be minimized. pH did not influence enzyme recovery. The kinetic characterization of the produced enzyme, using the hydrolysis of penicillin G as standard reaction, has showed that maximum PGA activity is at pH 8 and 37oC. Estimated Michelis-Menten parameters were Vmax= 0.0344 mMPenG/min and Km=1.83 mM, with activation energy equal to 27.12 KJ/mol. / Penicilina G acilase (PGA) é uma importante enzima industrial usada para produção do ácido 6-aminopenicilânico, intermediário chave na produção de ampicilina e outros antibióticos β- lactâmicos semi-sintéticos. A produção dessa enzima por Bacillus megaterium vem sendo estudada no grupo há muitos anos. Esta tese dá continuidade a esse estudo visando não só aumento da produção da enzima, mas também um melhor entendimento dos mecanismos regulatórios da expressão de PGA por B. megaterium. Neste trabalho foi realizado um estudo sistemático do inóculo, incluindo estratégias para conservação do microrganismo. Foram investigados diferentes meios de cultura e condições operacionais de cultivo na produção de PGA, em especial temperatura e concentração de oxigênio dissolvido. A recuperação da enzima foi também estudada, incluindo metodologias para minimização do conteúdo de proteínas presentes no soro de queijo, um nutriente importante na produção da enzima, mas cujo uso implica também a presença de proteínas contaminantes no meio de cultivo. Finalmente, a enzima foi caracterizada cineticamente. No estudo do inóculo foram comparados, ao longo do tempo, os desempenhos na produção de PGA de microrganismos conservados como endósporos em glicerol 20% v/v, a -70°C (criotubos), como endósporos conservados em meio sólido a 4ºC ( slants ) e como células vegetativas em glicerol 8% v/v, a -70°C ( eppendorfs ). Verificou-se que sob a forma de esporos congelados (criotubos) há preservação dos níveis de produção da enzima até 12 meses, 521 UI/L ± 20 UI/L, com grande reprodutibilidade. Conservação como slants além de mostrar variabilidade ao longo dos meses, apresenta queda acentuada desde o primeiro mês de conservação. Congelamento de células vegetativas conduz a níveis mais altos de produção da enzima, 900 UI/L, mas preserva atividade apenas durante cinco meses. Velocidades específicas máximas de crescimento dos microrganismos variaram com a forma de conservação, com µmáx eppendorf > criotubo > slant . Estudo do efeito do tempo de crescimento do inóculo na produção da enzima mostrou que, para as três formas de conservação estudada, a colheita do microrganismo entre 8 e 12 horas de cultivo conduzia a produções de enzima e concentração do microrganismo similares após 24 horas de produção. O procedimento de colheita após 12 horas de cultivo, com inoculação de 10% do volume de biorreator, mostrou-se, assim, um bom critério para padronização do inóculo. Foi estudada a influência da temperatura no cultivo de B. megaterium para produção de PGA na faixa entre 25-40°C. Os resultados mostraram que a máxima concentração celular e a máxima produção da enzima ocorrem no cultivo a 30°C. O efeito da concentração de oxigênio dissolvido na produção de PGA foi extensamente estudado, sendo o biorreator (volume de meio: 1,2-2,0 L) alimentado com ar. Uma segunda linhagem de B. megaterium mostrou crescimento mais lento que a original, requerendo 24 horas para a fase de germinação/propagação, enquanto que a original requer 12 horas. Foi, assim, efetuado estudo em biorreator com diferentes estratégias de fornecimento de oxigênio (ar) para as duas linhagens. Ao longo dos anos, a produção de enzima em frascos agitados vem se mostrando maior que a obtida em biorreator em quase todos os ensaios realizados. A segunda linhagem mostrou de forma clara que a manutenção da concentração de oxigênio dissolvido em 10% da saturação conduzia à maior produção da enzima dentre todas as condições testadas, com produção em biorreator similar à obtida em frasco agitado, 450 UI/L. Entretanto, produção em biorreator similar à obtida em frasco agitado, 550-600UI/L, só foi obtida com a linhagem original usando-se um perfil crescente de agitação, que implicava concentração de oxigênio dissolvido muito baixa, permanecendo em zero por vários períodos ao longo do cultivo. As duas linhagens apresentaram, portanto, requerimentos diferenciados para o oxigênio dissolvido. Alterações no meio de cultivo também alteram o requerimento de oxigênio dissolvido para obtenção da máxima produção da enzima. Soro de queijo possui um fator que ainda não foi possível identificar que é nutriente essencial para a produção da enzima. O uso de soro hidrolisado permite melhor recuperação da enzima. Ensaios em frascos agitados, com a linhagem original, na presença de soro hidrolisado, conduziram a níveis de PGA similares aos obtidos com soro integral. Contudo, em biorreator, para todas as condições de oxigênio dissolvido testadas a produção da enzima era inferior à obtida em frascos agitados, qualquer que fosse a estratégia de aeração usada. Foram investigadas três possíveis explicações para esse fato: 1) forma de preservação do microrganismo; 2) alteração no tempo para se atingir e/ou manter o estágio metabólico onde ocorre expressão da enzima, o que poderia estar relacionado com a proporção entre células vegetativas/esporos ao longo do tempo em frascos agitados e biorreator; 3) aumento na produção de proteases no ensaio em biorreator em relação ao ensaio em frasco agitado. A menor produção com soro hidrolisado não parece estar relacionada com nenhuma dessas hipóteses, não tendo sido possível, portanto, até o momento, generalizar o estudo do efeito dessa variável na produção de PGA por B. megaterium. Foi efetuado estudo da concentração e purificação da enzima produzida na presença de soro integral e hidrolisado, através de ultra-diafiltração. Foi estudado o efeito do pH e do número de lavagens na recuperação da enzima. Resultados obtidos mostraram eficiência da técnica para concentração da enzima, se realizada a baixa temperatura. Mostraram também que soro hidrolisado realmente facilita a purificação da enzima através da filtração em membrana, permitindo remoção de grande parte das proteínas contaminantes introduzidas no meio com o soro de queijo. Contudo, ocorre expressiva perda de PGA durante as etapas de diafiltração, que devem ser minimizadas. O pH não influenciou na recuperação da enzima. Caracterização cinética da enzima produzida para a hidrólise de penicilina G mostrou que a máxima atividade de PGA ocorre a pH 8 e temperatura de 37°C. Os valores estimados para os parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten foram de Vmáx e Km de 0,0344 mMPenG/min e 1,83 mM, respectivamente, com energia de ativação de 27,12 KJ/mol.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5647.pdf: 2822412 bytes, checksum: 769ca8edf54438ee75a0a4df886371c3 (MD5) Previous issue date: 2013-09-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / Penicillin G acilase (PGA) is a key enzyme in the industrial production of β-lactamic antibiotics. In this work, it was studied the production of PGA from Escherichia coli by recombinant E. coli and from Bacillus megaterium by recombinant B. megaterium. In E. coli, the enzyme accumulates in the periplasmic cell space, B. megaterium secretes PGA, what may reduce downstream costs. With E.coli, the study has begun at the expression step. Using a donated recombinant microorganism, it was studied, in shake flasks cultures, the influence of temperature (ranging from 18 to 28°C) during induction phase in the PGA production. High level expression of PGA E. coli was detected at 20°C, which was 4-fold superior than the volumetric enzymatic activity reached at 28°C. Fed-batch cultures were conducted with glycerol as carbon source, using both defined and complex media as well as IPTG and lactose as inducers. Final biomass concentrations of 100 gDCW/L and 120 gDCW/L and enzymatic activity 210000 and 80000 IU/L were achieved, for complex and defined media, respectively. The study with B. megaterium was initiated isolating the pac gene, encoding for PGA from B. megaterium ATCC14945, which was after cloned into the pLipAhp expression plasmid, together with the promoter gene and a gene codifying antibiotic resistance. This construct (pga-pLipAhp) was used to transform three different B. megaterium strain protoplasts, aiming studies to determine the best expression host in terms of PGA production. The tested strains, B. megaterium PV361, QM B1551 and ATCC 14945, have respectively shown about 95%, 95% and 10% plasmidial stability, after eight consecutive growths. The best PGA production was detected in PV361. Study of thermal and pH stability with the purified enzyme showed that PGA has a half-life of 5 min at 60° C, 20 min at 50° C, keeping 100% of activity for 1h at pH 10.0 and up to 8 h at pH 5.0. The values of temperature and pH for maximum PGA activity are 37° C and 8.0, respectively. The enzyme was stable at least for 5 hours in these conditions, with Michaelis-Menten estimated as Km=8.8 μM. A systematic study was developed to search the best condition to obtain the highest level of B.megaterium PGA production by recombinant B.megaterium. Media compositions for biomass and PGA production were evaluated using a genetic algorithm. The screening was carried out in 96 microtiter deep well plates, starting as a minimal medium and studying the concentration of 12 defined components. In 7 generations, 240 different kinds of media were tested for production and secretion and a 10-fold increase in PGA production and 5-fold increase in biomass compared to the previously used minimal medium could be achieved. It was scaled-up to shaker flasks obtaining 3-fold in PGA production and 1.8-fold in biomass. Later, it was scaled-up to bioreactors obtaining 3-fold in biomass and 8-fold in PGA production. Using glycerol as carbon source, it was tested different complex amino acids sources, using flask cultures. The best medium was scale-up in a 5 L bioreactor, in a batch culture with pulses. The highest production of PGA of recombinant B. megaterium achieved was 105600 IU/L and 36 gDCW/L. / Penicilina G Acilase (PGA) é enzima chave na produção industrial de antibióticos β- lactâmicos. Neste trabalho, foram estudadas as produções de PGA de Escherichia coli produzida por E.coli recombinante e de Bacillus megaterium produzida por B. megaterium recombinante. No primeiro, esta é acumulada no espaço periplasmático, o segundo secreta a enzima, o que pode reduzir grandemente custos de recuperação da enzima, pois não requer rompimento celular. Para E.coli, o estudo foi iniciado na etapa de expressão. Utilizando E.coli recombinante doada, foi realizado um estudo em frascos agitados da influência da temperatura (entre 18 e 28°C), durante a fase de indução, na expressão de PGA, que mostrou haver altos níveis de expressão de enzima a 20°C, com atividade volumétrica 4 vezes superior à obtida a 28°C. Foram realizados então cultivos a 20°C, em biorreator, em batelada alimentada, com glicerol como fonte de carbono, usando meio definido ou complexo, com IPTG ou lactose como indutores. Foram atingidas concentrações de biomassa finais de 100 gms/L e 120 gms/L, e atividades enzimáticas de 210000 e 80000 UI/L para meios complexo e definido, respectivamente. Para B. megaterium, o gene pac, que codifica PGA de B. megaterium ATCC14945 foi isolado e clonado no plasmídeo pLipAhp, juntamente com um gene promotor e outro codificando resistência a antibiótico (para seleção da linhagem clonada). Essa construção (pga-pLipAhp) foi usada para transformar três linhagens de protoplastos de B. megaterium, com o objetivo de determinar o melhor hospedeiro para a expressão de PGA recombinante. Foram testadas as linhagens: B. megaterium PV 361, QM B1551 e ATCC 14945, obtendo-se 95%, 95% e 10%, respectivamente, de estabilidade plasmidial, após 8 cultivos consecutivos. A melhor produção de PGA foi detectada em PV 361. Estudo de estabilidade térmica e de pH com a enzima purificada mostrou que PGA possui um tempo de meia vida de 5 min a 60°C, 20 min a 50°C, mantém 100% de atividade por 1 h, a pH 10 e por 8 horas, a pH 5. A temperatura e pH de atividade máxima é 37°C e 8,0, respectivamente, com Km=8.8 μM, com manutenção de 100% de atividade, no mínimo por 5 horas, nessas condições. Um estudo sistemático foi desenvolvido para obter um alto rendimento na produção de PGA de B. megaterium por B.megaterium recombinante. Busca da melhor composição de meio para biomassa e produção de PGA foi feita usando o algoritmo genético. A busca foi desenvolvida em placas de 96 poços, iniciando com um meio mínimo, com 12 componentes definidos. Em 7 gerações, 240 tipos de meio foram testados para a produção e secreção, conseguindo-se um incremento de 10 vezes na produção de PGA e de 5 vezes na produção de biomassa, comparando-se com o meio mínimo controle. Escalonamento para frascos agitados permitiu aumento de 3 vezes na produção de PGA e de 1.8 vezes na produção de biomassa. Escolhendo-se glicerol como fonte de carbono, foram testadas diferentes fontes complexas de aminoácidos. O meio que conduziu ao melhor resultado foi usado em cultivos em biorreator em batelada, 5L, onde se obteve como máxima produção de PGA recombinante de B. megaterium 105600 UI/L, com 36 gms/L de massa celular.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissRTO.pdf: 1502599 bytes, checksum: 74b4b7145b86c0fed8e0b1327b8aaea1 (MD5) Previous issue date: 2006-12-20 / Universidade Federal de Sao Carlos / Penicillin G acylase (PGA) is an enzyme of major impact in human health for catalyzing the deacilation of the penicillin G, to yield 6-aminopenicillanic acid (6- APA), key intermediate in the semi-synthetic antibiotics production. Several microorganisms produce PGA, but Bacillus megaterium is capable of secreting it to the medium. PGA from B. megaterium has been studied in DEQ-UFSCar. Xanthomonas campestris presents in your DNA the genetic sequence that codify acylase penicillin and tests with a strain of this microorganism from Departamento de Genética e Evolução da UFSCar showed PGA extracellular production. Studies in PGA production were initiated with the microorganism stored in DEQ-UFSCar. At the same time, strains of X. campestris from Coleção de Culturas Tropical (CCT) and Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) were tested. However, assays with these strains showed little cellular growth and no enzymatic activity. The microorganism reactivated was send to Fundação André Toselo for identification. The result showed that the microorganism was Bacillus megaterium. Therefore, at the same time that realized adaptations tries with the new strain of X. campestris, studies of production operational conditions of PGA were performed with strain of Bacillus megaterium, in shaking flasks and bioreactor, as well the enzyme characterization Germination/ propagation of B. megaterium experiments, at 30°C, carried out in shaking flasks showed that the growth time of microorganism in the inoculum step was 24 hours and maximum specific growth rate was µmáx = 0.33h-1. Assays in shaking flasks were carried out in shaker at 30ºC and 300 rpm intend to determine the most adequate pH for the enzyme production in both, microorganism propagation phase and enzyme production phase The results showed that the best pHs among the tested ones were pH 8.0 and 7.0, for the propagation and production phases, respectively, with 355 IU/L. The culture medium with preferentially consumed amino acids 20,0 g/L, potassium phenylacetate 3,5 g/L, solution with differents salts 0,22 g/L and cheese whey 20,0 g/L was the more efficient in PGA production, carried out maximum cellular growth and enzymatic activity, 4,59 g/L and 592UI/L, respectively, in 36 hours. Assays in a 2-L bioreactor, with production medium in the presence of amino acids preferably consumed 10.0 g/L, cheese whey 20.0 g/L, solution of salts 0.22 g/L and inducer potassium phenylacetate 3.5 g/L, indicated that the addition of nutrients during the fermentation is a efficient strategy, providing enzyme production increase. In the study of the influence of oxygen dissolved, carried out in bioreactor too, maximum enzymatic activity was 451 IU/L with 10% of saturation. Moreover, the maximum enzyme production was observed in the bioreactor and not in shaking flasks, like in all experiments until this. In the stage of characterization of the penicillin G acylase from Bacillus megaterium, optimum values of temperature and pH were, 47°C and 8.0, respectively. The Michaelis Menten model fitted resulting in estimated Km and Vmáx parameters values of 1.51 mM and 1.1*10-3 mmol/min*IU, respectively. The activation energy estimated was 27.12 KJ/mol.The results showed that PGA from Bacillus megaterium deactivate completely after 45 minutes of incubation at 60°C and 90 minutes in pH 11.0. / Penicilina G acilase (PGA) é das enzimas de maior impacto na saúde humana, pois catalisa a desacilação de penicilinas naturais, principalmente a penicilina G, para a obtenção do ácido 6-aminopenicilânico (6-APA), composto chave na produção de antibióticos β-lactâmicos. Ela é produzida por diferentes microrganismos, dentre os quais Bacillus megaterium, um dos poucos que secreta a enzima. A produção de PGA por esse microrganismo vem sendo estudada há tempos no DEQ-UFSCar. Xanthomonas campestris possui em seu DNA a seqüência genética que codifica PGA e teste preliminar de cultivo de linhagem desse microrganismo doada pelo Departamento de Genética e Evolução da UFSCar mostrou produção extracelular de PGA. Foi iniciado, por isso, meses depois, estudos de produção de PGA por X.campestris, reativando-se cultura do microrganismo que estava armazenada no DEQ-UFSCar. Em paralelo, foram obtidas e testadas outras linhagens desse microrganismo, procedentes da Coleção de Culturas Tropical (CCT) e do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR). Cultivos dessas novas linhagens de X. campestris mostraram crescimento celular pequeno, sem produção de PGA. Comparando-se essas novas linhagens com o microrganismo que se vinha trabalhando pode-se verificar então que este não era X. campestris. O microrganismo foi a seguir enviado para identificação na Fundação André Toselo. O laudo dessa Instituição mostrou que o microrganismo que vinha sendo cultivado era Bacillus megaterium de Bary 1884AL (ATCC 35985). Esse resultado já era esperado, pois havia muitas semelhanças entre as duas culturas. Contudo, havia também algumas diferenças, que motivaram o envio para identificação criteriosa do microrganismo produtor de PGA. Assim, ao mesmo tempo em que foram realizadas tentativas de adaptação das novas linhagens de X. campestris visando produção de PGA, foram investigadas diferentes condições operacionais de produção da enzima com o microrganismo identificado como B. megaterium, tanto em câmara rotativa shaker como em biorreator, bem como a caracterização da enzima produzida. Ensaios de germinação/propagação de Bacillus megaterium, a 30oC, realizados em shaker , mostraram que o microrganismo atinge fase estacionária em 24 horas, com velocidade máxima específica de crescimento µmáx = 0,33h-1. O pH inicial onde se obtém a maior atividade de PGA é 8,0 para o meio de crescimento (propagação) e pH 7,0 para o meio de produção. Cultivos a diferentes temperaturas mostraram que 30ºC é a temperatura ótima tanto para o crescimento do microrganismo quanto para produção da enzima. O meio de cultivo composto por aminoácidos consumidos preferencialmente pelo microrganismo - 20 g/L, fenilacetato de potássio - 3,5 g/L, solução com diferentes sais 0,22 g/L, e soro de queijo-20,0 g/L mostrou ser o mais eficiente na produção da PGA, atingindo máxima concentração celular e atividade enzimática, 4,59 g/L e 592 UI/L, respectivamente, em 36 horas de cultivo, com pHs para os meios de crescimento e produção iguais a 8,0 e 7,0, respectivamente, e temperatura controlada em 30°C. Cultivos do microrganismo em biorreator de 2 L mostraram que a adição de nutrientes na forma de pulsos é estratégia eficiente, proporcionando aumento nos níveis de produção da enzima. Estudo da influência de oxigênio dissolvido na produção de PGA mostrou que manutenção de 10% de saturação durante todo o cultivo conduz à máxima atividade enzimática, 451 UI/L. Essa deve ser realmente a condição ótima para oxigênio, pois pela primeira vez se obteve maior atividade enzimática no biorreator e não no ensaio em shaker , sempre realizado em paralelo para padronização do estudo. Resultados obtidos na caracterização da enzima confirmaram os valores já obtidos anteriormente para PGA de B. megaterium: temperatura e pH ótimos foram 47°C e 8,0, respectivamente; parâmetros cinéticos obtidos por ajuste do modelo de Michaelis-Menten a dados de velocidades iniciais de hidrólise de penicilina G catalisada por PGA, a 370C, foram: Vmáx 1,1*10-3 mmol/min*UI e Km 1,51 mM; meia-vida da enzima a 60°C é de 10 minutos, com inativação completa após 45 minutos de exposição. Quanto à estabilidade alcalina, verificou-se a completa desnaturação de PGA após 90 minutos de incubação a pH 11,0, com tempo de meia vida de 1 minuto.